CN114504654A - 一种用于药物递送的血小板制剂及其制备、检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于药物递送的血小板制剂及其制备、检测方法。本发明的用于药物递送的血小板制剂包括：带有连接子的药物，与药物偶联的血小板，血小板制剂上偶联的药物包括至少一种，血小板制剂上药物与血小板连接的连接子包括至少一种。本发明通过质谱检测的方式确定了偶联剂与药物最优的修饰比例，提高了药物的偶联效率，并为与血小板结合提供准确的数值参考。利用本发明的方法制备得到血小板制剂能同时偶联两种药物，其呈递效果好，生物活性高。

Description

一种用于药物递送的血小板制剂及其制备、检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，特别涉及一种用于药物递送的血小板制剂及其制备、检测方法。
背景技术
目前，临床使用较为广泛的药物包括蛋白质类、活性肽类、有机药物、生物活性因子等多种。许多药物都存在体外实验效果好，但是活体实验效果差的问题，这是由于许多药物在进入活体后存在被分解或无法精准靶向病灶所造成的。因而，需要借助呈递系统将药物精准而高效的递送至病灶区域。
已公开的呈递系统大多分为泵入呈递系统，胶囊呈递系统以及借助于可生物降解的生物材质(如囊泡，细胞膜或血小板等)的呈递系统。
血小板，作为血液系统中最小的细胞，由于其重要的凝血作用而被熟知。然而，血小板在血栓形成、肿瘤发生发展以及疾病的炎症反应中也发挥着重要的作用。血小板体积小、无核、炎症性疾病的靶向性以及在病理环境中能够被激活并释放血小板粒子的特点使其成为药物载体的理想候选。
血小板偶联药物技术是通过化学方法，利用化学连接子将大分子药物连接到未活化的血小板上，利用血小板的靶向性将药物运送到病灶部位并通过激活释放药物，达到治疗目的。这一技术的优势在于，利用血小板的自身特点，①可降低大分子药物的免疫原性，避免在血液运输过程中被免疫系统清除失活；②提高药物的靶向性，特异性增加病灶部位的药物浓度，在减少药物用量的同时减少药物副反应的发生；③由于血小板的体内寿命10-14天，因此可减少药物在体内的非必要的累积。
目前，已有报道利用血小板作为免疫检查点抑制剂(如PD1)的呈递介质，为了确保血小板与免疫检查点抑制剂的有效结合，首先需要对药物进行偶联剂的连接后再与经巯醇化处理的血小板进行偶联。
但是，由于药物与偶联剂的连接应用的是非定点偶联技术，因而，在药物上偶联的偶联剂的量不能准确确定，进而，会对后期与血小板偶联的数量的准确控制和连接稳定性造成较大影响，故无法在过程中控制最后的血小板偶联抗体质量。此外，在现有技术中，对血小板偶联药物的定量方法，大多采用传统的Elisa检测方法，该方法不能明确偶联到血小板上的抗体是否损失抗原抗体的结合活性，同时由于需要超声破碎血小板释放抗体，血小板破碎程度的差异性也会影响对药物浓度的准确定量。
发明内容
为克服上述缺点，本发明的目的在于提供一种用于药物递送的血小板制剂及其制备方法和应用。
本发明提供了一种用于药物递送的血小板制剂，通过将药物偶联于血小板得到，包括：药物，所述药物上具有经过偶联剂处理后连接的连接子；血小板，所述血小板经过预处理后与带有连接子的药物进行偶联，所述连接子通过偶联剂与药物进行连接；所述血小板制剂上偶联的药物包括至少一种，所述血小板制剂上药物与血小板连接的连接子包括至少一种，血小板与药物的偶联比例按照如下方法确定：比较偶联剂与药物在不同摩尔比的条件下偶联效率的差异性，并通过质谱检测的方式来确定最优的修饰比例，偶联剂与药物的偶联效率通过质谱检测得到的谱图丰度值计算得到。利用本发明的方法，通过质谱的分析结果对药物与偶联剂的连接效率进行计算，结果准确度高。
在本发明的一些实施方式中，所述血小板制剂上同时偶联至少两种药物。通过在血小板上同时偶联两种及以上的药物，能实现联合负载，并完成联合给药，提高了药物的治疗效果。
在本发明的一些实施方式中，同一血小板制剂的药物与血小板通过相同种类的偶联剂进行偶联。
在本发明的一些其他的实施方式中，同一血小板制剂的药物与血小板通过不同种类的偶联剂进行偶联。本发明分别采用SMCC连接子或通过双链接子的click反应，对药物进行与偶联剂的偶联，增加了药物偶联的多样性和灵活性，经过实验验证，均能实现药物与偶联剂的高效偶联。
在本发明的一些其他的实施方式中，所述偶联剂选自单功能偶联剂、双功能偶联剂或三功能偶联剂中的至少一种。在一些实施方式中，偶联剂上具有能通过氨基反应，并与-NH2发生反应的基团，如NHS酯、亚氨酸酯、五氟苯酯、羟甲基膦、芳香叠氮；在其他可能的实施方式中，偶联剂上具有能通过巯基反应，并与-SH发生反应的基团，如碘乙酰基(Iodoacetyl)、马来酰亚胺(Maleimide)、吡啶二巯基(Pyridyl disulfide)、乙烯基砜(HBVS)；在其他可能的实施方式中，偶联剂上具有能通过羧基-氨基反应，并与-COOH发生反应的基团，如碳二亚胺(EDC)；在其他可能的实施方式中，偶联剂上具有能通过醛基反应，并与-CHO基团发生反应的基团，如酰肼、烷氧基胺、NHS酯；在其他可能的实施方式中，偶联剂上具有能通过光反应与药物和(或)血小板进行偶联的基团，如双吖丙啶、芳香叠氮；在其他可能的实施方式中，偶联剂上具有能通过羟基反应，并与-OH进行偶联的基团，如异氰酸盐类偶联剂；在其他可能的实施方式中，偶联剂上具有能通过叠氮反应，并与-N3进行偶联的偶联剂，如炔烃类、膦类。
在本发明的一些实施方式中，所述异型双功能偶联剂选自以下偶联剂中的至少一种：通过氨基-巯基反应的NHS-卤代乙酰基类偶联剂；通过氨基-巯基反应的NHS-马来酰亚胺类偶联剂；通过氨基-巯基反应性的NHS-吡啶二巯基类偶联剂；通过羧基-氨基反应的碳二亚胺或NHS酯类偶联剂；通过化学选择性连接的NHS酯和叠氮化物-膦或炔烃类偶联剂；通过光反应性连接的NHS酯和芳香叠氮化物、苯基叠氮化物类、双吖丙啶类、补骨脂或光反应氨基酸类偶联剂。
在本发明的一些实施方式中，所述异型双功能偶联剂为通过氨基-巯基反应的NHS-卤代乙酰基类偶联剂，包括但不限于以下偶联剂：SIA(碘代乙酸琥珀酰亚胺酯)、SBAP(琥珀酰亚氨基3-(溴乙酰氨基丙酸酯)、SIAB(N-琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸甲酯)、Sulfo-SIAB(磺基琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸甲酯)。
在本发明的一些实施方式中，所述异型双功能偶联剂为通过氨基-巯基反应的NHS-马来酰亚胺类偶联剂，包括但不限于以下偶联剂：AMAS(N-α-马来酰亚胺乙酸琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-β-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯)、GMBS(N-γ-马来酰亚氨基丁酸琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-GMBS(N-γ-马来酰亚氨基丁酸磺基琥珀酰亚胺酯)、MBS(m-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-MBS(m-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、SMCC(4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-SMCC(磺基琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)、EMCA(N-ε-马来酰亚胺己酸)、EMCS(ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-EMCS(ε-马来酰亚胺己酸N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、SMPB(4-(p-马来酰亚氨基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-SMPB(磺基琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基苯基)丁酸酯)、SMPH(6-(β-马来酰亚氨基丙酰氨基)己酸琥珀酰亚胺酯)、LC-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯-(6-氨基己酸酯)、Sulfo-KMUS(N-κ-马来酰亚胺-十一酰酸磺基琥珀酰亚胺酯)、SM(PEG)n(聚乙醇化SMCC偶联剂，n为2-24)。
在本发明的一些实施方式中，所述异型双功能偶联剂为通过氨基-巯基反应性的NHS-吡啶二巯基类偶联剂，包括但不限于：SPDP(3-(2-吡啶二硫代)丙酸-琥珀酰亚胺酯)、LC-SPDP(琥珀酰亚氨基6-(3(2-吡啶二硫代)丙酰氨基)己酸)、Sulfo-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚氨基6-(3'-(2-吡啶二硫代)丙酰氨基)己酸)、SMPT(4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶二硫代)甲苯)、PEGn-SPDP(聚乙二醇化长链SMCC偶联剂，n为2-24。
在本发明的一些实施方式中，所述异型双功能偶联剂为通过羧基-氨基反应的碳二亚胺或NHS酯类偶联剂，包括但不限于：EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)。
在本发明的一些实施方式中，所述异型双功能偶联剂为通过化学选择性连接的NHS酯和叠氮化物-膦或炔烃类偶联剂，包括但不限于：叠氮-NHS酯、叠氮-PEG4-NHS、NHS-膦、炔烃，琥珀酰亚胺酯(3-炔丙氧基丙酸，琥珀酰亚胺酯)、碘乙酰胺炔烃、Click-iT AHA(L-叠氮基高丙氨酸)、Click-iT HPG(L-高炔丙基甘氨酸)。
在本发明的一些实施方式中，所述异型双功能偶联剂为通过光反应性连接的NHS酯和芳香叠氮化物、苯基叠氮化物类、双吖丙啶类、补骨脂或光反应氨基酸类偶联剂，包括但不限于：ANB-NOS(N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酸琥珀酰亚胺直)、Sulfo-SANPAH(磺基琥珀酰亚氨基6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯氨基)己酸酯)、SDA(NHS-双吖丙啶)(琥珀酰亚氨基4，4'-叠氮戊酰胺)、Sulfo-SDA(Sulfo-NHS-双吖丙啶)(磺基琥珀酰亚氨基4，4’-叠氮戊酰胺)、LC-SDA(NHS-LC-双吖丙啶)(琥珀酰亚氨基6-(4，4'-叠氮戊酰胺)己酸酯)、Sulfo-LC-SDA(Sulfo-NHS-LC-二嗪)(磺基琥珀酰亚氨基6-(4，4'-叠氮戊酰胺)己酸酯)、Sulfo-SDAD(Sulfo-NHS-SS-双吖丙啶)、(磺基琥珀酰亚氨基2-((4，4'-叠氮戊酰胺)乙基)-1，3'-二硫代丙酸酯)、SPB(琥珀酰亚氨基-(4-(补骨脂素-8-基氧基))-丁酸酯)、L-Photo-亮氨酸、L-Photo-甲硫氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述同型双功能偶联剂选自以下偶联剂中的至少一种：通过氨基-氨基反应分别与血小板和药物的NHS酯类偶联剂；通过氨基-氨基反应分别与血小板和药物的亚氨酸酯或二氟类偶联剂；通过巯基-巯基反应分别与血小板和药物的马来酰亚胺类偶联剂。
在本发明的一些可能的实施方式中，所述同型双功能偶联剂为通过氨基-氨基反应分别与血小板和药物的NHS酯类偶联剂，包括但不限于以下偶联剂：DSG(二琥珀酰亚氨基戊二酸酯)、DSS(二琥珀酰亚氨基辛二酸酯)、BS3(双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯)、BS(PEG)n(聚乙二醇化双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯)(n为5-9)、DTSSP(3，3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)、DST(酒石酸二琥珀酰亚胺酯)、BSOCOES(双(2-(琥珀酰亚氨基-氧羰基氧)乙基)砜)、EGS(乙二醇双(丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-EGS(乙二醇双(磺基丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺酯))、TSAT(Tris-(琥珀酰亚胺酯)氨基三乙酸)、BSG-d0(双(磺基琥珀酰亚氨基)戊二酸酯-d0)、BS2 G-d4(双(磺基琥珀酰亚氨基)2，2，4，4-戊二酸酯-d4)、BS3-d0(双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯-d0)、BS3-d4(双(磺基琥珀酰亚氨基)2，2，7，7-辛二酸酯-d4)、DSSO(二琥珀酰亚氨基亚砜)、DSBU(二琥珀酰亚氨基二丁基脲)。
在本发明的一些其他的可能的实施方式中，所述同型双功能偶联剂为通过氨基-氨基反应分别与血小板和药物的亚氨酸酯或二氟类偶联剂，包括但不限于以下偶联剂：DMA(己二酸二甲酯)、MP(庚二亚氨酸二甲酯)、DMS(二甲基辛二硝酸)、DTBP(Wang andRichard’s试剂)、DFDNB(1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
在本发明的一些其他的可能的实施方式中，所述同型双功能偶联剂为通过巯基-巯基反应分别与血小板和药物的马来酰亚胺类偶联剂，包括但不限于以下偶联剂：BMOE(双马来酰亚胺乙烷)、BMB(1，4-双马来酰亚胺丁烷)、BMH(双马来酰亚胺己烷)、BM(PEG)2(1，8-双马来酰亚胺-二乙二醇)、BM(PEG)3(1，11-双马来酰亚胺-三乙二醇)、DTME(二硫代马来酰亚胺乙烷)、TMEA((tris(2-马来酰亚氨基乙基)胺)。
在本发明的一些实施方式中，所述药物选自以下药物中的至少一种：细胞因子类药物、蛋白质类药物、多肽药物、多糖药物、有机药物、核酸分子。本发明的蛋白质类药物包括但不限于抗体类药物、
在本发明的一些其他可能的实施方式中，所述药物选自以下药物中的至少一种：抗肿瘤药物、抗生素药物、心血管药物、抗糖尿病药物和非甾体抗炎药物。在本发明的一些实施方式中，抗肿瘤药物包括但不限于紫杉醇、巯嘌呤、多烯紫杉醇、卡巴他赛、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、甲氨碟呤、甲环亚硝脲、柔红霉素、去甲长春花碱、替尼泊苷、高三尖杉酯碱、L-门冬酰胺酶等；在本发明的一些实施方式中，抗生素药物包括但不限于：氯霉素、红霉素、依托红霉素、琥乙红霉素、麦迪霉素、交沙霉素、克拉霉素、罗他霉素、磺胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、呋喃妥因、利副平、利福昔明、异丁呱利福霉素、氨苯砜、醋氨苯砜、眯康唑等；心血管药物包括但不限于：硝苯地平、尼卡地平、尼群地平、尼伐地平、桂利嗪、呱克昔林、吗多明、洋地黄毒甙、地高辛、毛花甙丙、去乙酰毛花甙、普罗帕酮、胺碘酮、硝酸甘油、戊四硝酯、环扁桃酯、烟酸生育酚酯等；抗糖尿病药物，包括但不限于：二甲双胍、甲苯黄丁脲、格列本脲、格列吡嗪等；非甾体抗炎药物，包括但不限于：氯马斯汀、赛庚啶、苯噻啶、酮替芬、曲尼司等。
在本发明的一些实施方式中，待偶联的所述药物选自细胞因子、免疫检查点抑制剂和抗体中的至少一种。所述细胞因子可以选自白细胞介素(包含39种白细胞介素，即IL-1-IL-39)、干扰素、生长因子、趋化因子家族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子中的任意一种；所述免疫检查点阻断剂选自PD-1/PD-L1通路、CD80/CTLA-4、MHCⅡ/LAG-3、4-1BBL/4-1BB等免疫抑制通路的免疫检查点抑制剂中的任意一种，包括但不限于PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体、CTLA-4抗体和VISTA抗体中的至少一种，抗体选自OX40抗体、4-1BB抗体、ICOS抗体和GITR抗体中的至少一种，在本发明的一些其他的可能的实施方式中，抗体也可以为单克隆抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述血小板制剂上偶联的药物选自以下药物中的至少两种：IL-2、4-1BBL、4-1BB抗体、aPD-1。在大分子蛋白药物的递送过程中，目前，大多只能实现单一的大分子药物的负载，因而，对药物的应用效果影响较大，本发明通过将两种或以上的大分子药物进行联合负载和呈递，经过实验结果证明，取得了良好的效果。
本发明还提供了一种用于药物递送的血小板制剂的制备方法，包括如下步骤：血小板的获取步骤；血小板表面修饰步骤；药物的偶联剂修饰步骤，按照如下方法进行：将药物溶液与偶联剂分别按照不同添加比例进行反应后，去掉多余的偶联剂，获得连接有连接子的药物；偶联剂与药物的偶联效率检测步骤，将修饰后的药物进行质谱检测，确定蛋白药物上连接的偶联剂数量以及分布情况；药物与血小板的偶联步骤：在本步骤中，血小板上偶联的药物包括至少一种，药物与血小板的偶联步骤中还包括血小板负载药物的偶连效率检测步骤，通过制备不同浓度的荧光标记的药物抗体溶液，并制备抗体浓度与荧光强度的标准曲线后经过检测计算得到。利用本发明的偶联剂与药物的偶联效率检测，能实现对偶联剂与药物的实际偶联结果进行有效检测，进而能实现对药物与偶联剂的添加比例进行筛选，并确定药物与偶联剂的最佳添加比例。
在本发明的一些实施方式中，偶联剂与药物的偶联效率检测步骤如下：分别获取药物以及偶联了偶联剂的药物的质谱图；识别出偶联了偶联剂的质谱图相比较于药物的质谱图增加的出峰区域；根据药物的原始峰的丰度比例计算出偶联剂与药物的连接数量及连接了连接子的药物的相对比例。本发明通过质谱检测的方式来确定偶联剂与药物的最优的修饰比例，结果准确度高，也确保在后续与血小板进行偶联时效果好。
在本发明的一些实施方式中，连接于同一血小板制剂上的药物至少包括两种。
在本发明的一些实施方式中，同一血小板制剂的药物与血小板通过相同种类的偶联剂进行连接。
在本发明的一些其他实施方式中，同一血小板制剂的药物与血小板通过不同种类的偶联剂进行连接。
本发明还提供了一种药物组合物，其含有有效量的前述的血小板制剂及药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种前述的血小板制剂在制备抗肿瘤的药物中的用途。本发明血小板制剂是以药物组合物的形式向受试者施用的，其可采用非口服给药方式使用，非口服给药优选为注射给药，并将本发明的血小板制剂制备成注射制剂，注射制剂中的药用辅料可以选用生理盐水、血浆、甘露醇、葡萄糖、山梨醇或PEG。
本发明还提供了一种前述的血小板制剂在制备用于预防肿瘤复发和转移的药物中的用途。本发明的肿瘤包括但不限于肠道肿瘤、肺部肿瘤、肝脏肿瘤、乳腺肿瘤、鼻咽肿瘤、胃部肿瘤、膀胱肿瘤以及尿道肿瘤或者是肾部肿瘤。
附图说明
图1(a)-(e)为不同摩尔比反应的SMCC与IL-2的偶联效果；
图2(a)-(j)为血小板偶联IL-2对血小板表型的影响；
图3为IL-2的质谱分析谱图；
图4为SMCC-IL-2的质谱分析谱图；
图5为对SMCC与IL-2偶联的效率分析对比图；
图6为IL-2与SMCC的偶联比例(LAR)以及分布；
图7为IL-2荧光抗体浓度与荧光强度的标准曲线；
图8为血小板同时偶联IL-2和4-1BBL与血小板的细胞流式对比图；
图9为血小板同时偶联4-1BB抗体及IL-2的细胞流式对比图；
图10为更换连接子后血小板同时偶联4-1BB抗体及IL-2的细胞流式对比图；
图11为血小板同时偶联aPD1及IL-2的细胞流式对比图；
图12为血小板偶联IL-2对NK细胞增殖的影响；
图13为IL-2和4-1BBL偶联血小板对NK细胞的增殖影响；
图14为IL-2和4-1BBL偶联血小板对NK细胞活性的影响；
图15为P-IL-2-4-1BB抗体对NK细胞增殖的影响；
图16为P-IL-2-4-1BB抗体对NK细胞活力的影响；
图17为血小板偶联IL-2对T细胞增殖的影响；
图18为血小板偶联IL-2对T细胞表型的影响；
图19为P-IL-2-4-1BB抗体对T细胞增殖的影响；
图20为P-IL-2-4-1BB抗体对T细胞活性的影响；
图21为血小板偶联IL-2对肿瘤细胞转移灶形成的影响；
图22为血小板同时偶联IL-2和4-1-BB抗体对肿瘤细胞转移灶形成的影响；
图23为血小板偶联IL-2对原位瘤的抑制作用的影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
术语“4-1BBL”，指4-1BB配体，属肿瘤坏死因子超家族成员，Tumor NecrosisFactor Ligand Superfamily Member 9；
术语“偶联剂”，在本文中指对药物进行修饰的试剂；
术语“连接子”，为linker，在本文中指利用偶联剂对药物进行修饰后连接于药物上的连接基团，连接子用于将药物与血小板细胞进行偶联；
术语“4-1BB”，又名CD137，和OX40同属肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员；
术语“DBCO-maleimide”，指二苯并环辛炔-马来酰亚胺。
术语“同型双功能偶联剂”，指具有两个相同反应基团，并能分别连接两个分子或残基的试剂。
术语“异型双功能偶联剂”，指具有两个不同反应基团，并能分别连接两个分子或残基的试剂。
术语“三功能偶联剂”，指具有三个反应基团，并能与三个分子或残基连接的试剂。
术语“P-IL-2-a4-1BB”，指在血小板上同时偶联IL-2和4-1BB抗体两种治疗剂。
本发明的血小板细胞可以选自人血小板细胞或动物血小板细胞，血小板细胞可以为自体细胞或异体细胞。
实施例一：血小板的提取
在本发明的一些实施方式中，血液中血小板的提取可采用如下方法进行：
1、用枸橼酸钠处理过的管收集C57BL/6J小鼠(眶窦非末端收集)的全血。
2、在15ml离心管中，首先取步骤1的抗凝血加于分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：PLA2011M)的液面上(抗凝血与分离液最佳比例1：2)，270g，离心15min，升速3档，降速1档，用于保护血小板，防止激活。
3、用移液器小心吸取第一层血小板血浆层(富血小板血浆，PRP)到另一离心管中，加入PGE1，终浓度为1μM。
4、1000g，离心20min，升速9档，降速5档。离心后沉淀用800μlPBS重悬，获得血小板悬液。
实施例二：血小板的表面修饰
在本发明的一些实施方式中，为了确保与药物的结合效果，将血小板按照如下方法进行修饰：
1、取实施例一提取的血小板，并计数，取1×108个血小板，放入血清预处理的EP管(低结合率)中，用495μl含有PGE1(1μM)的PBS(pH8)重悬，加入5μl 10mg/ml的Traut’s试剂(终浓度0.1mg/ml)，在室温下万向摇床缓慢震摇，孵育30min。
2、反应30min后，多余的Traut’s试剂通过1000g转速离心20min去除，并用500μl含有PGE1(1μM)的PBS清洗1次，1000g转速离心20min(不需要重悬，避免血小板的活化)。
3、清洗后，用800μl含有PGE1(1μM)的PBS(pH7.2)重悬，获得经修饰后的血小板悬液。
实施例三：对药物进行连接子的偶联
在本发明的一些实施方式中，药物可以选自细胞生长因子和药物中的至少一种。细胞生长因子可以选自白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子。在本发明的一些实施方式中，药物也可以选自免疫检查点抑制剂中的至少一种，免疫检查点抑制剂可以为PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂aPDL1，本发明的免疫检查点抑制剂也可以为aPD1，或是CD80/CTLA-4、MHCⅡ/LAG-3、4-1BBL/4-1BB等免疫抑制通路的免疫检查点抑制剂。
3.1药物IL-2的修饰(SMCC-IL-2的制备)
在本发明的一些实施方式中，IL-2与偶联剂Sulfo-SMCC的偶联和修饰方法如下：
1、配制Sulfo-SMCC溶液，并配制成0.458mM的sulfo-SMCC溶液。
2、控制最终的反应体系中IL-2的浓度为500μg/ml，在4℃条件下，分别将IL-2与Sulfo-SMCC的摩尔比控制为1:3，1:6，1：12，1：24和1：120，反应2小时。
3、反应完成后，分别将步骤2的反应混合物转移到超滤管(分子量cut-off＝3kDa)中，加入PBS，控制体积为400μl，将混合物离心，去掉多余的Sulfo-SMCC偶联剂，确保得到产物的体积少于100μl，加入300μl PBS进行二次离心，最终进行反向离心，获得修饰后的IL-2。不同摩尔比反应的SMCC与IL-2的偶联效果如图1(a)-(e)所示，血小板偶联IL-2对血小板表型的影响如图2(a)-(j)所示。结果表明，IL-2可以通过化学方法经过偶联剂偶联到血小板表面，实验药物的负载，药物负载量的与偶联剂的使用浓度相关，在IL-2与Sulfo-SMCC的摩尔比控制为1:6时偶联效果较好。负载IL-2对血小板的表面活性蛋白以及激活效应影响不大，即负载IL-2不影响血小板的功能。
将经Sulfo-SMCC修饰后的IL-2进行质谱检测，确定IL-2上连接的连接子的数量以及分布情况。对IL-2和SMCC-IL-2分别进行质谱分析，结果分别如图3和4所示。通过将SMCC-IL-2的质谱谱图与IL-2的质谱谱图进行对比，将与原始的IL-2的出峰位置一样的峰定义为L0，其代表位于该处出峰的IL-2分子未成功连接SMCC，随后，顺次将向远离L0的各个峰依次命名为L1，L2，L3，L4，且其分子量依次增加。
如图5所示，在IL2-SMCC样品中，由于在分子量16073.60Da处的峰既有LAR3(L3)的贡献也有LAR0(L0)的贡献，在分子量16292.51Da处的峰既有LAR4(L4)的贡献也有LAR1(L1)的贡献，因而，基于单纯的IL-2的原始峰的丰度的比例计算了各自的可能比例，进而得到了如图6和表1所示的分析结果。图中，LAR0，LAR1，LAR2，LAR3，LAR4，LAR5分别代表IL-2分子上所偶联的SMMC的个数分别是0个，1个，2个，其用于表征每个IL-2分子上能够修饰上的SMCC连接子的数量，只有偶联上SMCC的IL-2才能够连接到血小板上，纵坐标代表的是不同偶联个数的IL-2占全部IL-2的百分比。图6的结果表明，有约70％的IL-2被修饰上SMCC基团，能够与血小板偶联。
表1 IL-2偶联SMCC的数量以及分布情况表
L0 L1 L2 L3 L4 L5
％ 29.71 42.46 19.43 6.53 1.87 0
3.2对药物4-1BBL进行连接子的偶联修饰(SMCC-4-1BBL的制备)
在本发明的一些实施方式中，以4-1BBL作为药物，对其按如下步骤进行修饰：
1、配制Sulfo-SMCC溶液，配成0.458mM的Sulfo-SMCC溶液。
2、控制最终的反应体系中4-1BBL的浓度为500μg/ml。在4℃条件下，以1:6的摩尔比，将4-1BBL与Sulfo-SMCC反应2小时。
3、反应完成后，将反应混合物转移到超滤管(分子量cut-off＝3kDa)中，加入PBS，体积达到400μl。将混合物离心，去掉多余的Sulfo-SMCC偶联剂，得到产物体积要少于100μl。加入300μl PBS进行二次离心，最终进行反向离心，获得修饰后的4-1BBL。
本实施例中的4-1BBL的浓度及其与Sulfo-SMCC反应时的摩尔比，均为示例性的，可根据需要对相应的4-1BBL的浓度和摩尔比进行调整。
3.3药物4-1BB抗体进行连接子的偶联修饰(SMCC-4-1BB抗体的制备)
在本发明的一些实施方式中，以4-1BB抗体作为药物，对其按如下步骤进行修饰：
1、配制Sulfo-SMCC溶液，配成0.458mM的Sulfo-SMCC溶液。
2、控制最终的反应体系中4-1BB抗体浓度为1mg/ml。在4℃条件下，以1:6的摩尔比，将4-1BB抗体与Sulfo-SMCC反应2小时。
3、反应完成后，将反应混合物转移到超滤管(分子量cut-off＝3kDa)中，加入PBS，体积达到400μl。将混合物离心，去掉多余的Sulfo-SMCC偶联剂，得到产物体积要少于100μl。加入300μl PBS进行二次离心，最终进行反向离心，获得修饰后的4-1BB抗体。
本实施例中的4-1BB抗体的浓度及其与Sulfo-SMCC反应时的摩尔比，均为示例性的，可根据需要对相应的4-1BB抗体的浓度和摩尔比进行调整。
3.4对药物4-1BB抗体进行连接子的偶联修饰(更换偶联剂)
药物4-1BB抗体的连接子的偶联修饰所采用的偶联剂不局限于上述的Sulfo-SMCC偶联剂，其也可根据需要更换为其他偶联剂，如利用click反应连接连接子，具体步骤如下：
1、新配制DBCO-maleimide和N3-NHS溶液。
2、控制最终的反应体系中4-1BB抗体的浓度为1mg/ml。在4℃条件下，将4-1BB抗体与N3-NHS溶液反应2小时，再将DBCO-maleimide加入到N3-NHS修饰的4-1BB抗体溶液中，进一步反应1小时。
3、反应完成后，将反应混合物转移到超滤管(分子量cut-off＝3kDa)中，加入PBS，体积达到400μl。将混合物离心，得到产物体积要少于100μl。加入300μl PBS进行二次离心，最终进行反向离心，获得修饰后的4-1BB抗体。
3.5对药物aPD-1进行连接子的偶联修饰
1、配制Sulfo-SMCC溶液，配成0.458mM的Sulfo-SMCC溶液。
2、控制最终的反应体系中aPD-1的浓度为1mg/ml。在4℃条件下，以1:6的摩尔比，将aPD-1与Sulfo-SMCC反应2小时。
3、反应完成后，将反应混合物转移到超滤管(分子量cut-off＝3kDa)中，加入PBS，体积达到400μl。将混合物离心，去掉多余的Sulfo-SMCC偶联剂，得到产物体积要少于100μl。加入300μl PBS进行二次离心，最终进行反向离心，获得修饰后的aPD-1。
本实施例中的aPD-1的浓度及其与Sulfo-SMCC反应时的摩尔比，均为示例性的，可根据需要对相应的4-1BB抗体的浓度和摩尔比进行调整。
实施例四：将连接有连接子的药物与血小板偶联
与血小板偶联的连接有连接子的药物可以为实施例三中的偶联有连接子的药物中的任意一种，或至少两种。在选用两种及以上的药物时，将已经偶联了连接子的两种或更多种的药物同时与血小板进行偶联。
在本发明的一些实施方式中，选择已经偶联IL-2的药物与血小板偶联。
4.1制备P-IL-2及其血小板与药物IL-2偶联效率的验证：
1、取实施例三中的3.1制备得到的SMCC-IL-2 50μg加入实施例二制备得到的经处理的血小板(1×108/ml)中，室温孵育1小时，摇床缓慢摇动，获得P-IL-2。
2、反应混合物室温下1000g离心20分钟，去除多余的细胞因子，用400μl重悬，获得血小板原液。
3、利用IL-2荧光抗体对血小板与药物IL-2的偶联效率检测：
(1)制备不同浓度的IL-2荧光抗体溶液，应用酶标仪检测，制备IL-2荧光抗体浓度与荧光强度的标准曲线，结果如图7所示：
(2)取一定量的步骤2制备的血小板负载药物(血小板计数)与过量的荧光标记药物抗体进行孵育，通过离心方法去除未结合抗体，并计数血小板数量。
(3)取100μl步骤(2)的血小板样品，加入酶标板中，通过酶标仪检测荧光强度，应用标准曲线确定抗体浓度，通过抗体浓度确定负载IL-2的浓度。
检测结果如下表2所示：
表2 P-IL-2样品的偶联结果对比表
Figure BDA0003499686100000181
结果表明，本实施例制备的负载IL-2的血小板药物负载量达到1×108血小板负载IL-2约0.5μg。
4.2IL-2和4-1BBL与血小板的偶联(P-IL-2-4-1BBL的制备)
1、将50μg的实施例三的3.1制备得到的SMCC-IL-2和20μg的实施例三的3.2制备得到的连接有连接子的4-1BBL加入已处理的血小板(1×108/ml)中，室温孵育1小时，摇床缓慢摇动，获得P-IL-2-4-1BBL。
2、反应混合物室温下1000g离心20分钟，去除多余的细胞因子，用400μl重悬，获得血小板原液。
3、应用IL-2荧光抗体和4-1BBL的荧光抗体利用流式细胞仪进行偶联效率检测，结果如图8所示。
结果表明，P-IL-2-4-1-BBL同时偶联IL-2和4-1BBL的效率为94.1％，IL-2和4-1BB配体(4-1BBL)能够同时偶联到同一血小板，这样不仅能有效的负载IL-2，并且能同时将4-1BBL负载在同一血小板上能够进一步增加药物的协同效果。
4.3药物IL-2和4-1BB抗体与血小板的偶联
1、将50μg的实施例三的3.1制备得到的SMCC-IL-2(终体系中IL-2的浓度为500μg/ml)和40μg的实施例三的3.3制备得到的SMCC-4-1BB抗体(终体系中4-1BB抗体的浓度为1mg/ml)加入已处理的血小板(1×108/ml)中，室温孵育1小时，摇床缓慢摇动，获得P-IL-2-4-1BB抗体。
2、反应混合物室温下1000g离心20分钟，去除多余的细胞因子，用400μl重悬，获得血小板原液。
3、应用IL-2荧光抗体和人源Fc的荧光抗体进行偶联效率检测，结果如图9所示。
结果表明，P-IL-2-a4-1-BB同时偶联IL-2和4-1BB抗体的效率为94.3％，IL-2和4-1BB抗体(a4-1BB)能够同时偶联到同一血小板，说明利用本发明的方法，能使血小板同时有效的负载两种药物，且本发明所负载的两种药物均为大分子药物。
4.4药物IL-2和4-1BB抗体与血小板的偶联
用实施例三的3.4制备得到的click反应修饰的4-1BB抗体和实施例三制备得到的修饰后的IL-2与血小板进行偶联，按照如下步骤进行偶联：
1、将50μg的修饰后的IL-2和40μg修饰后的4-1BB抗体加入已处理的血小板(1×108/ml)中，室温孵育1小时，摇床缓慢摇动，获得P-IL-2-4-1BB抗体。
2、反应混合物室温下1000g离心20分钟，去除多余的细胞因子，用400μl重悬，获得血小板原液。
3、应用IL-2荧光抗体和人源Fc的荧光抗体进行偶联效率检测，结果如图10所示。
结果表明，IL-2和4-1BB抗体(a4-1BB)能够通过不同的连接子同时偶联到同一血小板，由此说明，本发明制备得到的血小板制剂分别偶联了两种不同药物，并能通过不同的连接子与血小板细胞进行偶联，给血小板制剂的制备方法提供了更多的选择性和可能性。
4.5药物aPD-1和IL-2与血小板的偶联
1、将50μg的实施例三的3.1制备得到的SMCC-IL-2和实施例三的3.5中制备的经修饰后的aPD-1 40μg加入已处理的血小板(1×108/ml)中，室温孵育1小时，摇床缓慢摇动，获得P-IL-2-aPD-1。
2、反应混合物室温下1000g离心20分钟，去除多余的细胞因子，用400μl重悬，获得血小板原液。
3、应用IL-2荧光抗体和aPD-1的荧光抗体进行偶联效率检测，结果如图11所示。
结果表明，P-aPD-1-IL-2同时偶联aPD-1和IL-2的效率为99.4％，PD-1抗体(aPD-1)与IL-2可通过相同的偶联剂(Sulfo-SMCC)同时偶联到血小板表面。
实施例五：血小板偶联药物后的体外活性测定
5.1对NK细胞扩增的影响
5.1.1血小板偶联单一药物对NK细胞增殖的影响
以血小板偶联IL-2为例进行说明，其按照如下方法进行检测：
收集NK92细胞，进行细胞计数，并用NK92完全培养基和NK92MI培养基进行重悬。按照2*105/ml的细胞浓度进行铺板，NK92完全培养基为阳性对照，NK92MI培养基为阴性对照，分别向NK92MI培养基中加入IL-2(50ng/ml)，血小板(4×106/ml)，以及实施例四制备的血小板偶联IL-2(4*106/ml)，在37℃，5％的CO2浓度下培养3天，计数，确定细胞的增殖情况，结果如图12所示。
结果表明，负载IL-2的血小板与正常IL-2相比具有相同的激活NK细胞增殖的能力。
5.1.2血小板偶联两种药物对NK细胞增殖的影响
在本发明的一些其他实施方式中，还对血小板偶联两种药物后对NK细胞增殖的影响进行了研究。
5.1.2.1血小板偶联IL-2和4-1BBL两种药物对NK细胞增殖的影响
其对NK细胞增殖的影响按照如下方法进行检测：
收集NK92细胞，进行细胞计数，并用NK92完全培养基和NK92MI培养基进行重悬。按照2*105/ml的细胞浓度进行铺板，NK92完全培养基为阳性对照，NK92MI培养基为阴性对照，分别向NK92MI培养基中加入IL-2(50ng/ml)，血小板(4×106/ml)，以及实施例四制备得到的P-IL-2-4-1BBL(4*106/ml)，在37℃，5％的CO2浓度下培养3天，在不同的时间点收取细胞，确定细胞的增殖情况(如图13所示)以及活力(如图14所示)。
结果表明，P-IL-2-4-1BBL能够有效的促进NK细胞的增殖，抑制NK细胞的凋亡。
5.1.2.2血小板偶联IL-2和4-1BB抗体两种药物对NK细胞增殖的影响
在本发明的一些其他实施方式中，利用实施例四的4.3的血小板同时偶联了IL-2和4-1BB抗体，其对NK细胞增殖的影响按照如下方法进行检测：
收集NK92细胞，进行细胞计数，并用NK92完全培养基和NK92MI培养基进行重悬。按照2*105/ml的细胞浓度进行铺板，NK92完全培养基为阳性对照，NK92MI培养基为阴性对照，分别向NK92MI培养基中加入IL-2(50ng/ml)，血小板(4×106/ml)，以及P-IL-2-4-1BB抗体(4*106/ml)，37℃，5％的CO2浓度下培养3天，在不同的时间点收取细胞，确定细胞的增殖情况(如图15和16所示)。
结果表明，P-IL-2-4-1BB抗体能够有效的促进NK细胞的增殖，抑制NK细胞的凋亡。
5.2对T细胞扩增与分化的影响：
5.2.1血小板偶联单一药物对T细胞扩增与分化的影响：
以血小板偶联IL-2对T细胞扩增与分化的影响为例进行说明，其按照如下步骤进行：
根据美天旎Pan T Cell Isolation Kit(human)试剂盒方法进行T细胞的分离，计数，并应用stem cell的CD3/CD28 T细胞激活剂进行激活刺激3天，收集细胞计数，按照2×105/ml的细胞浓度进行铺板，分别加入不同浓度的IL-2，血小板，以及实施例四制备的血小板偶联的IL-2，37℃，5％的CO2浓度下培养4天，在不同的时间点收取细胞，进行T细胞计数及表型分析，结果如图17和图18所示。
结果表明，负载IL-2的血小板与正常IL-2相比具有相同的激活T细胞增殖的能力；负载IL-2的血小板与正常IL-2相比对T细胞表型的影响有一定的差异性。
5.2.2血小板偶联两种药物对T细胞扩增与分化的影响：
5.2.2.1血小板同时偶联IL-2和4-1BB抗体对T细胞扩增与分化的影响按照如下步骤对进行：
根据美天旎Pan T Cell Isolation Kit(human)试剂盒方法进行T细胞的分离，计数，并应用stemcell的CD3/CD28 T细胞激活剂进行激活刺激3天，收集细胞计数，按照2×105/ml的细胞浓度进行铺板，分别加入不同浓度的IL-2，血小板，以及P-IL-2-4-1BB抗体，37℃，5％的CO2浓度下培养3天，在不同的时间点收取细胞，进行T细胞计数和T细胞活性进行分析，结果如图19和20所示。
上述结果表明，利用本发明的方法能将IL-2和4-1BB抗体(a4-1BB)同时偶联到同一血小板，且通过同时在血小板上偶联上述两种药物，能够进一步增加药物的协同效果，本发明的P-IL-2-4-1BB抗体能够有效的促进T细胞的增殖，说明IL-2和4-1BB抗体(a4-1BB)均被有效的负载于血小板上。
5.3血小板偶联药物的抗肿瘤活性测定
在本发明的一些实施方式中，以血小板偶联IL-2对转移瘤的影响为例进行说明：
取1×105个B16F10细胞通过尾静脉注射C57BL/6小鼠，并将小鼠分为对照组，IL-2组以及血小板偶联IL-2组，按照如下方案给药，对照组给予安慰剂(PBS)，IL-2(1mg/kg)，QD，5on/2off×2weeks，共10次，血小板偶联组(2×108P-IL-2，约含0.05mg/kg IL-2)每周给药两次，给予两周，共计4次。两周给药完成后，手术取小鼠肺脏，比较给药组与对照组的肿瘤转移灶情况，确定药物疗效，结果如图21所示。
结果表明，负载IL-2的血小板在减少IL-2使用浓度与频次的前提下能够显著抑制转移瘤病灶的形成，可见，将药物IL-2负载于血小板上后能有效对转移瘤起到抑制效果。
很显然，血小板偶联的药物种类也可以为两种，在本发明的一些实施方式中，以血小板偶联同时偶联IL-2和4-1BB抗体对转移瘤的影响为例进行说明：
取1×105个B16F10细胞通过尾静脉注射C57BL/6小鼠，并将小鼠分为对照组，P-IL-2组，P-a4-1BB以及P-IL-2-a4-1BB组，按照如下方案给药，对照组给予安慰剂(PBS)，P-IL-2(2×108血小板)，QD，5on/2off×2weeks，共10次，P-a4-1BB以及P-IL-2-a4-1BB组(2×108血小板)每周给药两次，给予两周，共计4次。两周给药完成后，手术取小鼠肺脏，比较给药组与对照组的肿瘤转移灶情况，确定药物疗效，结果如图22所示。
结果表明，P-IL-2-a4-1BB能够有效抑制小鼠肺转移病灶的形成，在将药物IL-2和4-1BB抗体同时负载于血小板上后能有效对转移瘤起到抑制效果。
5.3.2对皮下瘤的影响
在本发明的一些实施方式中，以血小板偶联IL-2对转移瘤的影响为例进行说明：
取1×106个CT26细胞给予BALB/C小鼠皮下肿瘤，当肿瘤长至50-100mm3左右时进行分组，共分为如下六组，并给予药物治疗：IL-2(1mg/kg)组：QD，5on/2off×2weeks；aPD-1(5mg/kg)组：每周两次，持续两周；P-IL-2(2×108P-IL-2，约含0.05mg/kg IL-2)组：每周两次，持续两周；IL-2+aPD1给药：分别按照IL-2和aPD-1给药方式进行；P-IL2+aPD1给药：分别按照P-IL2和aPD1的给药方式进行。其中aPD-1为上午给药，其余药物均下午给药。每周量瘤三次，在给药第十天，处死小鼠，获取原位肿瘤并称重，结果如图23所示。
结果表明，负载IL-2的血小板在减少IL-2使用浓度与频次的前提下与PD-1抗体(aPD-1)联合应用能够抑制小鼠皮下肿瘤的生长。负载IL-2的血小板能够增加体内IL-2的活性，延长体内半衰期，提高IL-2的治疗肿瘤效果。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (20)

1.一种用于药物递送的血小板制剂，通过将药物偶联于血小板得到，其特征在于，包括：
药物，所述药物上具有经过偶联剂处理后连接的连接子；
血小板，所述血小板经过预处理后与带有连接子的药物进行偶联，所述连接子通过偶联剂与药物进行连接；
所述血小板制剂上偶联的药物包括至少一种，所述血小板制剂上药物与血小板连接的连接子包括至少一种，
血小板与药物的偶联比例按照如下方法确定：比较偶联剂与药物在不同摩尔比的条件下偶联效率的差异性，并通过质谱检测的方式来确定最优的修饰比例，偶联剂与药物的偶联效率通过质谱检测得到的谱图丰度值计算得到。
2.根据权利要求1所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，所述血小板制剂上同时偶联至少两种药物。
3.根据权利要求2所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，同一血小板制剂的药物与血小板通过相同种类的偶联剂进行偶联。
4.根据权利要求2所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，同一血小板制剂的药物与血小板通过不同种类的偶联剂进行偶联。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，所述偶联剂选自单功能偶联剂、双功能偶联剂或三功能偶联剂中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，所述异型双功能偶联剂选自以下偶联剂中的至少一种：通过氨基-巯基反应的NHS-卤代乙酰基类偶联剂；通过氨基-巯基反应的NHS-马来酰亚胺类偶联剂；通过氨基-巯基反应性的NHS-吡啶二巯基类偶联剂；通过羧基-氨基反应的碳二亚胺或NHS酯类偶联剂；通过化学选择性连接的NHS酯和叠氮化物-膦或炔烃类偶联剂；通过光反应性连接的NHS酯和芳香叠氮化物、苯基叠氮化物类、双吖丙啶类、补骨脂或光反应氨基酸类偶联剂。
7.根据权利要求5所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，所述异型双功能偶联剂选自以下偶联剂中的至少一种：通过氨基-氨基反应分别与血小板和药物的NHS酯类偶联剂；通过氨基-氨基反应分别与血小板和药物的亚氨酸酯或二氟类偶联剂；通过巯基-巯基反应分别与血小板和药物的马来酰亚胺类偶联剂。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，所述药物选自以下药物中的至少一种：细胞因子类药物、蛋白质类药物、多肽药物、多糖药物、有机药物、核酸分子。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，所述药物选自以下药物中的至少一种：抗肿瘤药物、抗生素药物、心血管药物、抗糖尿病药物和非甾体抗炎药物。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，待偶联的所述药物选自细胞因子、免疫检查点抑制剂和抗体中的至少一种。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的用于药物递送的血小板制剂，其特征在于，所述血小板制剂上偶联的药物选自以下药物中的至少两种：IL-2、4-1BBL、4-1BB抗体、aPD-1。
12.一种用于药物递送的血小板制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
血小板的获取步骤；
血小板表面修饰步骤；
药物的偶联剂修饰步骤，按照如下方法进行：
将药物溶液与偶联剂分别按照不同添加比例进行反应后，去掉多余的偶联剂，获得连接有连接子的药物；
偶联剂与药物的偶联效率检测步骤，将修饰后的药物进行质谱检测，确定蛋白药物上连接的偶联剂数量以及分布情况，
药物与血小板的偶联步骤：在本步骤中，血小板上偶联的药物包括至少一种，药物与血小板的偶联步骤中还包括血小板负载药物的偶连效率检测步骤，通过制备不同浓度的荧光标记的药物抗体溶液，并制备抗体浓度与荧光强度的标准曲线后经过检测计算得到。
13.根据权利要求12所述的用于药物递送的血小板制剂的制备方法，其特征在于，偶联剂与药物的偶联效率检测步骤如下：
分别获取药物以及偶联了偶联剂的药物的质谱图；
识别出偶联了偶联剂的质谱图相比较于药物的质谱图增加的出峰区域；
根据药物的原始峰的丰度比例计算出偶联剂与药物的连接数量及连接了连接子的药物的相对比例。
14.根据权利要求12或13所述的用于药物递送的血小板制剂的制备方法，其特征在于，偶联剂与药物连接方式按照如下方法中的至少一种：
将药物溶液与N3-NHS反应后再将DBCO-maleimide加入到N3-NHS修饰的药物溶液中，反应后，获得修饰后的药物；
将药物溶液与Sulfo-SMCC混合，反应后，获得修饰后的药物。
15.根据权利要求14所述的用于药物递送的血小板制剂的制备方法，其特征在于，连接于同一血小板制剂上的药物至少包括两种。
16.根据权利要求15所述的用于药物递送的血小板制剂的制备方法，其特征在于，同一血小板制剂的药物与血小板通过相同种类的偶联剂进行连接。
17.根据权利要求15所述的用于药物递送的血小板制剂的制备方法，其特征在于，同一血小板制剂的药物与血小板通过不同种类的偶联剂进行连接。
18.一种药物组合物，其特征在于，含有有效量的权利要求1-12中任一项所述的血小板制剂及药学上可接受的载体。
19.权利要求1-12中任一项所述的血小板制剂在制备抗肿瘤的药物中的用途。
20.权利要求1-12中任一项所述的血小板制剂在制备用于预防肿瘤复发和转移的药物中的用途。
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