CN112546241B - 基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统制备方法和应用 - Google Patents

基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法，具体包括以下步骤：1)纳米血小板膜液的制备：2)基因复合物的制备：3)按样品4和BSA‑PEI以1‑8微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中，得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。以上制备方法制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统在制备基因递送药物的应用。本发明优点在于：显著提升材料生物相容性及基因负载能力，大大降低细胞毒性，在基因复合物表面包裹血小板膜，用作基因递送系统，提高其免疫规避能力、体内稳定性及基因递送效率，大大提升内皮细胞迁移和增殖能力，从而达到更好地治疗疾病的目的。

Description

基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物领域，涉及一种基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统及其应用。
背景技术
术后血管再狭窄在经皮冠状动脉介入术(PCI)治疗心血管疾病中难以避免，已成为目前最关键的问题。由于血管内皮损伤是术后血管再狭窄的主要原因，单纯的抗凝、抗炎和抗增殖策略不能完全抑制血管再狭窄。因此，促进损伤血管的快速内皮化是抑制术后血管再狭窄发生的一种非常有前途的策略。
随着基因治疗在疾病治疗中的发展，在改善血管再内皮化方面具有很大的发展潜力。近年来，基因递送领域研究非常广泛。安全有效的基因载体可以高效递送治疗基因，且能避免对正常组织和细胞的损伤。然而，基因载体在实际应用中仍然面临着很多问题包括生物相容性差、体内稳定性及免疫规避能力差等，难以获得性能优良的基因递送系统。目前，基因载体的材料主要是一些阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸-N、N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)等。一般来说，为了获得高转染效率，需要高分子量的阳离子聚合物，但高分量的阳离子聚合物会显著增加细胞毒性，很难到达基因递送并治疗疾病的目的。因此，安全、高效、稳定且具有免疫规避能力的基因递送系统的设计仍面临着很大的挑战。随着仿生纳米载体的出现及研究的不断深入，很多种细胞膜可以用于纳米载体表面修饰，赋予其更好的生物相容性及稳定性等。针对血管类疾病设计的载体材料来说，血小板膜表面修饰成为一种提高载体性能的有效策略，常用作药物载体。并且，由于血管内皮损伤会导致血小板聚集这一特点，能够赋予其对血管内皮损伤局部靶向性，有利于提高药物在损伤部位的累积，提高药物递送效果。但是，在促内皮化及内皮细胞迁移和增殖方面，血小板膜修饰研究较少，且很少用于制备基因递送系统，进行基因治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统、制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
1、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法，具体包括以下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品，将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲液中，得到血小板悬浮液，为样品1；所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:8-1:10；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100细胞裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声1-2小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)将50毫克牛血清蛋白溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入PEI，继续反应4小时，将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析2-4天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物BSA-PEI；所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述的PEI为聚乙烯亚胺；所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:5-50:5-50:10-100；所述PEI分子量为0.6-10kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制浓度为0.1-2毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲液配制基因溶液，搅拌后将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育1-2小时，得到基因复合物；所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为0.01-10；
3)按样品4和BSA-PEI以1-8微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中，得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
作为一种优选方案，所述的基因溶液为VEGF质粒溶液或Cy5标记的寡核苷酸溶液。
基因优选VEGF质粒或Cy5标记的寡核苷酸，还可以采用其他的基因。
以上制备方法制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统在制备基因递送药物的应用。
本发明优点在于：本发明基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统，引入蛋白并接枝低分子量PEI，显著提升材料生物相容性及基因负载能力，大大降低细胞毒性，本发明的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统，在基因复合物表面包裹血小板膜，用作基因递送系统，提高其免疫规避能力、体内稳定性及基因递送效率，大大提升内皮细胞迁移和增殖能力，从而达到更好地治疗疾病的目的。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳图。
图2为红细胞溶血图。
图3为相对细胞活性图。
图4为巨噬细胞摄取图。
图5为内皮细胞划痕愈合图。(显微镜下照片)
图6为内皮细胞划痕愈合表。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。应理解，本发明的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做改动或修改,该等价形式同样落于本申请的权利要求所限定的范围。
EA.hy926细胞和RAW264.7细胞购于中国科学院细胞库(上海研发公共服务平台)。
BSA(商品)；
PEI重均分子量为0.6-10kDa(商品)；
脂质体挤出器型号为Avanti Polar Lipids,USA。
实施例1
对照组1：
1)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析2-4天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:10:10:20；
所述PEI分子量为1.8kDa；
2)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为0.1毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
3)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育1小时,得到基因复合物；
所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
实施例2
对照组2：
1)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析2-4天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:50:50:100；
所述PEI分子量为1.8kDa；
2)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为0.5毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
3)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育2小时,得到基因复合物；
所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
实施例3
基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法包括如下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品。将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:8；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以
20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，
反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过400纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声1小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析2天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:10:10:20；
所述PEI分子量为1.8kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为0.1毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育1小时,得到基因复合物；所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
3)按样品4和BSA-PEI以1微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中,得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
实施例4
基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法包括如下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品。将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:8；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过400纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声1小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析2天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:10:10:20；
所述PEI分子量为1.8kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为0.5毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，
孵育1小时,得到基因复合物；
所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
3)按样品4和BSA-PEI以2微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中,得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
实施例5
基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法包括如下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品。将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:9；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声1小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析3天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:10:10:20；
所述PEI分子量为1.8kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为0.5毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育1小时,得到基因复合物；
所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
3)按样品4和BSA-PEI以4微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中,得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
实施例6
基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法包括如下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品。将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:10；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声2小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析3天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:10:10:20；
所述PEI分子量为1.8kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为0.5毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育2小时,得到基因复合物；
所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
3)按样品4和BSA-PEI以8微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中,得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
实施例7
基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法包括如下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品。将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:10；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声2小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析3天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:50:50:100；
所述PEI分子量为1.8kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为2毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育2小时,得到基因复合物；
所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
3)按样品4和BSA-PEI以1微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中,得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
实施例8
基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法包括如下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品。将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:10；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声2小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析4天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:50:50:100；
所述PEI分子量为1.8kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为2毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育2小时,得到基因复合物；
所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
3)按样品4和BSA-PEI以2微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中,得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
实施例9
基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法包括如下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品。将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:10；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声2小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析4天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:50:50:100；
所述PEI分子量为1.8kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为2毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育2小时,得到基因复合物；
所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
3)按样品4和BSA-PEI以4微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中,得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
实施例10
基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法包括如下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品。将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:10；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声2小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)50毫克牛血清蛋白(BSA)溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时。然后，加入聚乙烯亚胺(PEI)，继续反应4小时。将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析4天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物，简称BSA-PEI；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；
所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:50:50:100；
所述PEI分子量为1.8kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂，配制浓度为2毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制基因溶液，在搅拌下，将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育2小时,得到基因复合物；
所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为1。
3)按样品4和BSA-PEI以8微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中,得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
实施例11
实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2的基因负载能力通过琼脂糖凝胶电泳实验进行评价，包括如下步骤：
首先将实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2加入到含有0.5微克/毫升溴化乙锭(EB)的琼脂糖凝胶(0.8％)的孔道中。电泳实验在1×TAE溶液、100伏条件下进行40分钟。LUV-260型双波长紫外线透射台用于观察质粒在琼脂糖凝胶中的阻滞位置并记录拍照。
分析结果：图1为琼脂糖凝胶电泳图。为了研究实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2对VEGF质粒的压缩及包裹能力，对照组1和对照组2进行了琼脂糖凝胶电泳测试。结果表明，对照组1和对照组2分别在质量比为0.5和0.2时能够完全负载并包裹基因。相对于对照组1来说，对照组2能够在更低的质量比条件下完全负载基因，说明它接枝PEI数目更多，具有更好的基因负载能力。
实施例12
实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的溶血率通过溶血实验进行评价，包括如下步骤：
取新鲜小鼠血液1毫升，加入2毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，1500rpm离心10分钟，倒掉上清液，重复5次后，得到红细胞。然后，用pH＝7.4的PBS缓冲溶液稀释红细胞至2％(v/v)的悬液。取多组红细胞悬液，每组1毫升，摇匀，再加入实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。最后，置于37°C恒温水浴3小时后，于1000rpm离心5分钟，取上清在540纳米处测其吸光度(A)。平行操作三次。设置阳性对照组(超纯水)和阴性对照组(pH＝7.4的PBS缓冲溶液)。按下面公式计算溶血率。
Figure BDA0002813199630000121
A540样品组为实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统溶液组的吸光度值。
分析结果：图2为红细胞溶血率，分别测定了实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。溶血率越低代表材料血液相容性越好，且低于5％时被认定为可以用作生物材料的标准。从图中可以看出，所有样品的溶血率均低于5％。并且，与对照组1和对照组2相比，实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统具有更低的溶血率，更好的血液相容性，说明血小板膜修饰有利于提高血液相容性。
实施例13
实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统对内皮细胞(EA.hy926细胞)活性的影响通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)比色法进行评价，包括如下步骤：
EA.hy926细胞接种到96孔板(1×104细胞/孔)DMEM细胞培养基中，细胞生长到90％后，将DMEM细胞培养基换为无血清DMEM培养基，进行饥饿处理12小时。之后培养基换为新鲜的10％FBS DMEM生长培养基。将不同浓度的实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统水溶液加入到10％FBS DMEM生长培养基中，混合均匀。24小时后弃去上层清液，向每个孔中加入5毫克/毫升的MTT溶液(pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂)20微升，继续培养4小时，使甲瓒结晶。培养，小心弃去孔内培养基，而后向孔内加入150微升DMSO，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490纳米波长处测量各孔的光密度值(OD)。利用如下公式计算相对细胞活性(％)：
Figure BDA0002813199630000131
其中，OD：实验组的吸光度值，ODblank：调零组的吸光度值，OD0：对照组的吸光度值。
分析结果：图3为内皮细胞相对细胞活性，分别测定了实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。图中结果表明，所有样品均具有很高的细胞活性，且随着浓度的提升，相对细胞活性不仅没有明显下降的趋势，而且有一定的提升，说明样品更有利于提高内皮细胞活性。
实施例14
利用巨噬细胞摄取实验来评价实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统在巨噬细胞内的摄取效果。
步骤如下：将脂多糖刺激后的RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度约为105个/孔，在37℃、5％CO2条件下培养24小时，弃去上清，加入500微升无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下饥饿处理12小时，弃去500微升无血清DMEM培养基，分别加入300微升实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统，37℃、5％CO2孵育4小时，弃去上清液，用PBS缓冲溶液洗三次。用200微升pH＝7.4的PBS缓冲溶液重悬细胞，获得细胞悬液，通过流式细胞仪检测分析。
分析结果：图4为RAW264.7巨噬细胞摄取结果，分别测定了实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。平均荧光强度代表细胞摄取率，摄取率越低说明药物递送系统生物相容性越好。从图中可以看出，所有样品的平均荧光强度值都很低，具有低的巨噬细胞摄取率，因而具有更好的生物相容性。
实施例15
实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统促EA.hy926细胞迁移和增殖效果通过划痕实验测定，包括如下步骤：
在24孔板内利用VEGF质粒、实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统转染EA.hy926细胞，转染48小时后，利用200微升移液器枪头在每个孔内轻轻地划出一条连续的细胞层断面。用D-hanks缓冲液(pH＝7.4)洗掉孔内的细胞碎屑。利用倒置显微镜观察划痕处细胞的迁移过程，在确定的时间间隔0、6、12、24小时对其拍照。利用Image J 2.1软件计算照片中细胞的迁移面积。划痕处细胞的迁移面积百分比按照如下公式计算：
Figure BDA0002813199630000141
分析结果：图5和图6为不同时间点EA.hy926细胞的迁移图和由Image J 2.1计算的6、12和24小时后的相对愈合面积。从图中结果可以看出，与VEGF质粒相比，其他所有样品均具有快速愈合能力，即具有显著增强的内皮细胞迁移和增殖能力。此外，随着基因递送系统中血小板膜量的增多，创伤愈合能力逐渐增强，即内皮细胞迁移和增殖能力增强。此外，具有血小板膜量最多且接枝PEI量最多的实施例10具有最强的内皮细胞迁移和增殖能力。
VEGF基因购于生工生物工程(上海)股份有限公司
Cy5标记的寡核苷酸购于生工生物工程(上海)股份有限公司
人工合成序列如下：
1atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agcctcgcct tgctgctcta cctccaccat
61gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg
121gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac
181atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg
241atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc
301aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg
361agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa
421aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg
481tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac
541gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)纳米血小板膜液的制备：
(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000×g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品，将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000×g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲液中，得到血小板悬浮液，为样品1；所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:8-1:10；
(1b)向样品1中滴加5微升TritonX-100细胞裂解液，裂解血小板；然后以20000×g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000×g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2；
(1c)用pH＝7.4的PBS缓冲液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
(1d)将样品3超声1-2小时，得纳米血小板膜液为样品4，备用；
2)基因复合物的制备：
(2a)将50毫克牛血清蛋白溶于40毫升超纯水中，加入NHS和EDC，室温反应2小时； 然后，加入PEI，继续反应4小时，将混合溶液转移至截留分子量为14000的透析袋中透析2-4天，冻干，得到接枝PEI的BSA聚合物BSA-PEI；所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；所述EDC为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述的PEI为聚乙烯亚胺；所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例为1:5-50:5-50:10-100；所述PEI分子量为0.6-10kDa；
(2b)以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制浓度为0.1-2毫克/毫升的BSA-PEI溶液；
(2c)用pH＝7.4的PBS缓冲液配制基因溶液，搅拌后将基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育1-2小时，得到基因复合物；所述BSA-PEI聚合物与基因的质量比为0.01-10；
3)按样品4和BSA-PEI以1-8微升:10微克的比例，将样品4滴加到基因复合物中，得到基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
2.根据权利要求1所述的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统的制备方法，其特征在于：所述的基因溶液为VEGF质粒溶液或Cy5标记的寡核苷酸溶液。
3.权利要求1或2的制备方法制备的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统。
4.权利要求3的基于蛋白和血小板膜修饰的基因递送系统在制备基因递送药物的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108136023A (zh) * 2015-08-12 2018-06-08 北卡罗莱纳州立大学 血小板膜包覆的药物递送系统
CN109364263A (zh) * 2018-10-31 2019-02-22 南京医科大学 一种功能化的血小板仿生智能载体及其抗缺血性脑卒中应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108136023A (zh) * 2015-08-12 2018-06-08 北卡罗莱纳州立大学 血小板膜包覆的药物递送系统
CN109364263A (zh) * 2018-10-31 2019-02-22 南京医科大学 一种功能化的血小板仿生智能载体及其抗缺血性脑卒中应用
WO2020199788A1 (zh) * 2019-04-01 2020-10-08 东南大学 一种血小板膜自组装纳米气泡及其制备方法和应用

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