JP2020501646A - 生体表面のコンフォーマルコーティング - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年12月13日に出願された米国仮出願第62/433,449号の利益を主張するものである。上記出願の教示全体は、参照により本明細書に援用される。
概要
水性等張系中、中性pHで、特定の生細胞に好適な所望の温度で、特異的に1つのポリマーを別のポリマーに反応させることが可能であるマルチアームクリック反応性親水性ポリマーを利用して、極薄コンフォーマルコーティングを達成した。まず、ポリスチレン粒子(100〜125ミクロン範囲)を細胞スフェロイドのモデルとして使用し、4アームPEG−NHS及び4アームPEG−NH2からなる活性化N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルアプローチを使用して、本方法を開発した。これを達成するために、最初にFITC標識を有する4アームPEG−NH2を粒子表面上に積層した。これは当該プロセスにおいて重要な工程であることが見出された。これは、粒子を、4アーム−PEG−(NH2)3−FITC(1%溶液)でスパイクした5%4アームPEG−NH2と混合することによって遂行した。混合物を30℃で6時間真空乾燥させた。結果として得られた粉末を、4アームPEG−NHS(5%)を含有する60%スクロース溶液中に縣濁させた。混合物をボルテックスし、PBS緩衝液で洗浄して、過剰のスクロース、未反応PEG、及び過剰の蛍光PEGポリマー、及び塩を除去した。粒子を収集し、共焦点顕微鏡下で蛍光場において可視化した。顕微鏡画像により、5〜10ミクロン範囲の厚さを有する極薄コーティングが粒子表面上に均一に形成されたことが確認された(図1)。故に、水性系において2つの反応性ポリマーを使用したコンフォーマルコーティングの概念が証明されたが、この作業条件及びテトラPEG−NH2、テトラ−PEG−NHSエステルなどの試薬、ならびに真空乾燥及び高張性スクロース60%溶液の使用は、生細胞に望ましくない。
4アーム−PEG−NHSエステル(分子量5k)、4アーム−PEG−NHSエステル(分子量5k及び10k)、4アームPEG−アジド(5k及び10k)をJenKem technology USAから購入した。4アームPEG−NH2(5k及び10k)をCreative PEG Worksから購入した。DBCO試薬及び溶媒をSigma−Aldrichから購入した。ポリスチレン粒子(106〜125ミクロンサイズ)をPolysciences Inc,PA,USAから購入した。スフェロイドとして増殖させたHCT116細胞(Thermo Fisher Scientificから入手可能)を、10%ウシ胎仔血清でスパイクしたMcCoy 5a(Fisher Scientific)中、5%CO2環境下、37℃で72時間増殖させた。
4アームPEG NH2(分子量5k)0.5g(0.1mmol)をDMF(ジメチルホルムアミド10ml)中に溶解させ、これにフルオレセインイソチオシアネート(39mg、0.1mmol)を暗下で添加した。混合物を室温で6時間撹拌した。溶液を、1000分子量カットオフ膜を使用してDI水中で、暗所で一晩、DI水を交換しながら(4×1L)透析した。溶液を凍結乾燥させた。明るい黄色の粉末(512mg)を収集し、琥珀色のボトル中に−20℃で貯蔵した。
4アームPEG NH2(分子量10k)0.5g(0.05mmol)をDMF(10ml)中に溶解させ、これにフルオレセインイソチオシアネート(20mg、0.05mmol)を暗下で添加した。混合物を室温で6時間撹拌した。溶液を、1000分子量カットオフ膜を使用してDI水中で、暗所で一晩、DI水を交換しながら(4×1L)透析した。溶液を凍結乾燥させた。明るい黄色の粉末(492mg)を収集し、琥珀色のボトル中に−20℃で貯蔵した。
4アームPEG NH2(分子量10k)1.0g(0.1mmol)を塩化メチレン(20ml)中に溶解させ、これにDBCO−PEG4−NHSエステル(195mg、0.3mmol)を添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。反応をTLCによって監視した。反応が完了した後、溶媒を真空下で除去して5mlとなった。溶液を低温のジエチルエーテル中に一滴ずつ注いだ。生成物が沈殿し、それを濾過により収集した。生成物をエーテル(4×50ml)で十分に洗浄し、真空下で4時間乾燥させた。材料を淡黄色の粉末1.1gとして得た。それを琥珀色のボトル中に−20℃で貯蔵した。
4アーム−PEG−{NHCO−PEG4−DBCO}3−NH2(分子量10k)500mg(0.05mmol)をDMF(5ml)中に溶解させ、これにフルオレセインイソチオシアネート(20mg、0.05mmol)を暗下で添加した。混合物を室温で6時間撹拌した。溶液を、1000分子量カットオフ膜を使用してDI水中で、暗所で一晩、DI水を交換しながら(4×1L)透析した。溶液を凍結乾燥させた。明るい黄色の粉末(485mg)を収集し、琥珀色のボトル中に−20℃で貯蔵した。
4アームPEG NH2(分子量10k)1.4g(0.14mmol)をリン酸緩衝液中に溶解させ、これにDBCO−スルホ−NHSエステル(0.30g、0.56mmol)を添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。反応をTLCによって監視した。反応が完了した後、反応混合物を低温イソプロパノール(500ml)中に撹拌しながら一滴ずつ注いだ。生成物が沈殿し、それを濾過により収集した。生成物をCH2Cl2(20ml)中に再び溶解させ、低温ジエチルエーテル(300ml)中に注いだ。生成物が粉末として沈殿し、それを濾過により収集し、エーテル(4×50ml)で十分に洗浄し、真空下で4時間乾燥させた。材料を淡黄色の粉末1.65gとして得た。それを琥珀色のボトル中に−20℃で貯蔵した。
4アームPEG NH2(分子量10k)1.4g(0.14mmol)を塩化メチレン(30ml)中に溶解させ、これにDBCO−PEG4−NHSエステル(0.37g、0.56mmol)を添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。反応をTLCによって監視し、反応が完了した後、溶媒を真空下で除去して5mlとなった。溶液を低温のジエチルエーテル中に一滴ずつ注いだ。生成物が沈殿し、それを濾過により収集し、それをエーテル(4×50ml)で十分に洗浄し、真空下で4時間乾燥させた。材料を淡黄色の粉末1.71gとして得た。それを琥珀色のボトル中に−20℃で貯蔵した。
メタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンコポリマー(LIPIDURE(登録商標)NH−01、5%ポリマー溶液、20ml)の溶液を丸底フラスコに取り込み、これにDMF(5ml)中DBCO−PEG4−NHSエステル(400mg)を添加し、混合物を磁気撹拌子により室温で撹拌した。即座に、pHを8.5前後に維持するためにトリエチルアミン(100μL)を混合物に添加し、撹拌を室温で16時間継続した。反応の終わりに、反応混合物を透析した(10K分子量カットオフ膜)。溶液を凍結乾燥させた。ポリマーを白色の粉末として得た。1HNMR (D2O):0.96−1.16 (m, CH3);1.5−2.2 m (骨格CH2);2.8 −3.2 m;3.8−4.4 m;4.7m, 6.8−7.3広域ピーク (芳香族H).
メタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンコポリマー(LIPIDURE(登録商標)NH−01、5%ポリマー溶液、20ml)の溶液を丸底フラスコに取り込み、これにDMF(5ml)中アジド−PEG12−NHSエステル(400mg)を添加し、この間、混合物を磁気撹拌子により室温で撹拌した。即座に、pHを8.5前後に維持するためにトリエチルアミン(100マイクロリットル)を混合物に添加し、撹拌を室温で16時間継続した。反応の終わりに、反応混合物を透析した(10K分子量カットオフ膜)。溶液を凍結乾燥させた。ポリマーを白色の粉末として得た。1HNMR (D2O):3.15 (s, 第四級CH3基);3.58 s, 3.9−4.28 (m, −CH2).
メタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンコポリマー(LIPIDURE(登録商標)NH−01、5%ポリマー溶液、20ml)の溶液を丸底フラスコに取り込み、これにDBCO−(C6−リンカー)−スルホN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(400mg)粉末を添加し、混合物を磁気撹拌子により室温で撹拌した。即座に、pHを7.4前後に維持するためにNaHCO3(100mg粉末)を混合物に添加し、撹拌を室温で16時間継続した。反応の終わりに、反応混合物を透析した(10K分子量カットオフ膜)。溶液を凍結乾燥させた。ポリマーを淡黄色の綿状材料として得た。1HNMR (D2O):0.98−1.18 (m, CH3);1.6−2.2 m;2.8 −3.4 m;3.9−4.3 m;4.8 m, 6.9−7.3m(芳香族H).
丸底フラスコに、クリック反応性DBCOポリマーを含有するメタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミン(100mg)及び磁気撹拌子を装入した。フラスコに、10mlの脱イオン水を添加し、ポリマーが完全に溶解するまで撹拌した。ポリマー溶液のpHは7.1であり、これをトリエチルアミンで8.0に調整した。フルオレセインイソチオシアネート35mgをバイアル中で秤量し、暗所でDMF(5ml)中に溶解させた。フルオレセインイソチオシアネート(isothyocyante)溶液をポリマー溶液に添加し、混合物を暗所で一晩撹拌させた。反応の終わりに、反応混合物を、10K分子量カットオフ膜を使用して脱イオン水に対して暗所で透析した。透析の完了後、透析バッグの内容物を凍結乾燥させた。生成物を明るい黄色が買った海綿状の材料(120mg)として得た。生成物を他のクリック反応性ポリマーと混合することによって生体表面のコーティング用に直接使用した。
HCT116細胞株を、10%ウシ胎仔血清でスパイクした100マイクロリットルのMcCoy 5a緩衝液を含有する各ウェルに、ウェル当たり500、1000、及び1500細胞の用量で播種した。プレートを5%CO2下、37℃でインキュベートした。72時間後、スフェロイドを収集し、PBSで洗浄し、コンフォーマルコーティング用に即座に使用した。
ラットインスリノーマ細胞(ins−1細胞)を、10%ウシ胎仔血清を含有する100マイクロリットルのDMEM培地を含有する各ウェルに、ウェル当たり1000の用量で播種した。プレートを5%CO2下、37℃でインキュベートした。72時間後、スフェロイドを収集し、コンフォーマルコーティング用に即座に使用した。
コラゲナーゼ消化法を使用してラット膵島細胞をWistarラットから単離した。Carter et al.,BIOLOGICAL PROCEDURES ONLINE,vol 11,number 1,2009。近位総胆管にカテーテルをカニュレーションし、10mlの低温コラゲナーゼ溶液をゆっくりと注射した。膵被膜の完全性を維持するように膵全摘術を慎重に行った。単離した膵臓組織を追加の5mlのコラゲナーゼ溶液中、37℃で20分間インキュベートし、次いで組織を激しい振とう下で消化させた。0.02%DNase I及び1%ウシ血清アルブミンを含有する30mlの低温HBSS緩衝液で2回洗浄した後、それを金網ふるいに通し、続いて1300rpmで、4℃で3分間遠心分離した。次いで塊を10mlのHistopaque−1077溶液中に縣濁させた。組織懸濁液の上に0.02%DNase I及び1%ウシ血清アルブミンを含有する10mlのHBSS緩衝液を積層し、続いて1800rpmで、4℃で3分間勾配遠心分離を行った。精製された膵島細胞を上層と第2の層との間の界面からピペットで収集し、次いでRPMI−1640培地で繰り返し洗浄した。洗浄した膵島細胞を氷冷貯蔵下で保存し、コンフォーマルコーティング用に即座に使用した。
ポリスチレン(PS)粒子(106〜125ミクロンサイズ)50mg、4アームPEG−NH2(5k)50mg、及び4アームPEG(NH2)3−FITC(5k)200マイクロリットル(micrioliters)の1%溶液を、400マイクロリットル(microlters)の水と混合した。ペーストを30℃で真空遠心機において6時間真空乾燥させた。ペレットを250マイクロリットルのスクロース溶液(60%)中に縣濁させた。活性化4アームPEG−NHSエステル(5k)の新たに調製した溶液(20mgを80マイクロリットルの水中に溶解させた)を、2000rpmで3分間ボルテックスしながらスクロース溶液中のPS粒子に添加した。混合物を3000rpmで、4℃で5分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットをPBS(2ml)中に縣濁させ、ボルテックスして、コーティングされた粒子を溶液中に均一に分散させ、再び3000rpmで、4℃で5分間遠心分離した。この洗浄手順を5回繰り返して、過剰の未反応ポリマー及びスクロースを除去した。コーティングされた粒子を顕微鏡評価のためにウェルに移した。共焦点顕微鏡画像により、蛍光場の下で可視化したときに粒子が均一にコーティングされたことが明らかとなった(図1)。
2ml遠心管に、100マイクロリットルの15%スクロース溶液を充填した(層3)。この上部に、4アームPEG−NHS(10k、20mg)を含有する200マイクロリットルの2.5%スクロース溶液を積層した(第2の層)。その上部に、ポリスチレン粒子1mg、4アームPEG−NH2(10k、5mg)、4アームPEG−(NH2)3−FITC(10k)(5マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量800万)50マイクロリットル(microlters)の1%溶液を含有する溶液の混合物を積層した(層1)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で60分間遠心分離した。
2ml遠心管に、100マイクロリットルの15%スクロース溶液を充填した(層3)。この上部に、4アームPEG−NHS(10k、及び20mg)を含有する200マイクロリットルの2.5%スクロース溶液を積層した(第2の層)。その上部に、ポリスチレン粒子1mg、4アームPEG−NH2(5mg、10k)、4アームPEG−(NH2)3−FITC(10k、5マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量400万)50マイクロリットルの1%溶液を含有する溶液の混合物を積層した(層1)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で60分間遠心分離した。
2ml遠心管に、100マイクロリットルの15%スクロース溶液を充填した(層3)。その上部に、4アームPEG−NHS(10k)20mgを含有する200マイクロリットルの2.5%スクロース溶液を積層した(第2の層)。その上部に、ポリスチレン粒子1mg、4アームPEG−NH2(10k、5mg)、4アームPEG−(NH2)3−FITC(10k、5マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量100万)50マイクロリットル(microlters)の1%溶液を含有する溶液の混合物を積層した(層1)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で60分間遠心分離した。
2ml遠心管に、100マイクロリットルの10%スクロース溶液を充填した(層3)。その上部に、4アームPEG−アジド(分子量10k)10mgを含有する200マイクロリットルの5%スクロース溶液を積層した(第2の層)。再び、第2の層の上部に、PS粒子1mg、4アームPEG−NH−DBCO、(10k、1.25mg)、4アーム−PEG−[NH−(PEG)4−dbco)]3−FITC(10k、1.25マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量100万)50マイクロリットル(microlters)の1%溶液を含有する溶液の混合物を積層した(層1)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で10分間遠心分離した。
2ml遠心管に、100マイクロリットルの10%スクロース溶液を充填した(層3)。この上に、4アームpeg−アジド(分子量10k)10mgを含有する200マイクロリットルの5%スクロース溶液を積層した(第2の層)。第2の層の上部に、PS粒子1mg、4アームPEG−NH−DBCO(10k、1.25mg)、4アーム−PEG−[NH−(PEG)4−DBCO]3−FITC(10k、1.25マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量800万)50マイクロリットル(microlters)の1%溶液を含有する溶液の混合物を積層した(層1)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で10分間遠心分離した。
2ml遠心管に、4アームpeg−アジド(分子量10k)10mgを含有する200マイクロリットルの10%スクロース溶液を充填した(第2の層)。その上部に、HCT−116細胞スフェロイド(30スフェロイド)、4アームPEG−NH−DBCO(10k、1.25mg)、4アーム−PEG−[NH−(PEG)4−DBCO]3−FITC(10k、1.25マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量100万、50マイクロリットル(microlters)、生理食塩水中1%溶液)を含有する溶液の混合物を第1の層として積層した。管を密閉し、1000rpmで、4℃で3分間遠心分離した。
2ml遠心管に、4アームPEG−アジド(分子量10k、10mg)を含有する200マイクロリットルの10%スクロース溶液を充填した(第2の層、下層)。その上部に、HCT−116スフェロイド(30スフェロイド)、4アームPEG−NH−DBCO(1.25mg)、4アーム−PEG−[NH−PEG4−DBCO]3−FITC(10k、1.25マイクロリットルのDI水中1%溶液)、及びPEO(分子量400万、50マイクロリットル(microlters)の生理食塩水中1%溶液)を含有する溶液の混合物を積層した(第1の層、上層)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で3分間遠心分離した。
2ml遠心管に、4アームPEG−アジド(分子量10k、10mg)を含有する200マイクロリットルの10%スクロース溶液を充填した(第2の層、下層)。その上部に、HCT−116細胞スフェロイド(30スフェロイド)、4アームPEG−NH−DBCO(1.25mg)、4アーム−PEG−[NH−(PEG)4−DBCO]3−FITC(10k、1.25マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量800万、50マイクロリットル(microlters)、生理食塩水中1%溶液)を含有する溶液の混合物を積層した(第1の層、上層)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で3分間遠心分離した。
2ml遠心管に、4アームPEG−アジド(分子量10k、20mg)を含有する200マイクロリットルの10%スクロース溶液を充填した(第2の層、下層)。その上部に、HCT−116細胞スフェロイド(30スフェロイド)、4アームPEG−NH−DBCO(2.5mg)、4アーム−PEG−[NH−(PEG)4−DBCO]3−FITC(10k、2.5マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量800万、50マイクロリットル、生理食塩水中1%溶液)を含有する溶液の混合物を積層した(第1の層、上層)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で3分間遠心分離した。
生細胞は、細胞内エステラーゼ活性によって識別され、これは、実質的に非蛍光性のカルセインAMの蛍光カルセイン部分への酵素変換によって決定される。カルセインAM色素は、生細胞内に保持され、細胞内エステラーゼと反応してex/em約495nm/約515nmで強い緑色蛍光を生成する、ポリアニオン色素である。対照的に、エチジウムホモダイマー−1(EthD−1)は、死細胞の損傷した膜を有する細胞に進入し、核酸に結合すると40倍の蛍光増強を経て、ex/em約495/約635nmで明るい赤色蛍光を発する。Ethd−1は、生細胞の無傷の形質膜によっては除外される。これらの2つの色素を組み合わせることにより、所与の試料の生/死細胞の概観が得られるであろう。
20マイクロリットルの2mM Ethd−1原液を10mlの滅菌組織培養グレードダルベッコPBSに取り込んだ。5マイクロリットルのDMSO中4mMカルセインAM溶液をEthd−1溶液に添加し、混合物をボルテックスした。結果として得られた生/死試験用試薬は、溶液中、EthD−1 4マイクロモル当たり2マイクロモルのカルセイン(Calcien)を有する。マルチウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞含有試験液を充填し、これに100マイクロリットルの生/死試験用試薬を添加し、37℃で30分間インキュベートした。細胞を共焦点顕微鏡においてex/em約495nm/約515nm及び約495/約635nmの2つの異なる波長で評価した。
コーティングされたHCT細胞116スフェロイド(1000細胞の初回用量/スフェロイド)を新たに調製し、2つの部分に分割した。コンフォーマルコーティングを、実施例19に記載される4アームPEG−DBCO及び4アームPEGアジドにより1つの部分に適用した。コーティングされた細胞スフェロイド及び裸の細胞スフェロイドの両方を、カルセインAM/EthD−1アッセイを使用して細胞生存率について即座に評価した。コーティングされたスフェロイドも裸のスフェロイドも、最初は生存細胞を有し、死細胞はなかった。McCoy 5a緩衝液中、5%CO2下で、37℃でエージングすると、3日目時点で、細胞死は、コーティングされた細胞スフェロイド(図12)と比較して裸のスフェロイド(図11)において顕著に高かった。
2ml遠心管に、4アームPEG−アジド(分子量10k、10mg)を含有する200マイクロリットルの10%スクロース溶液を第2の層として充填した(下層)。その上部に、インスリノーマスフェロイド(1000スフェロイド)、4アームPEG−NG−DBCO(2.5mg)、4アーム−PEG−[NH−(PEG)4−DBCO]3−FITC(10k、2.5マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量100万、50マイクロリットル、生理食塩水中1%溶液)を含有する溶液の混合物を積層した(第1の層)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で3分間遠心分離した。
2ml遠心管に、4アームPEG−アジド(分子量10k、10mg)を含有する200マイクロリットルの10%スクロース溶液を充填した(第2の層、下層)。その上部に、膵島細胞(100の膵島細胞)、4アームPEG−NH−DBCO(2.5mg)、4アーム−PEG−[NH−(PEG)4−DBCO]3−FITC(10k、2.5マイクロリットル、DI水中1%溶液)、及びPEO(分子量100万、50マイクロリットル(microlters)、生理食塩水中1%溶液)を含有する溶液の混合物を積層した(第1の層、上層)。管を密閉し、1000rpmで、4℃で3分間遠心分離した。
2ml遠心管に、アジド修飾MPCポリマー(10mg)を含有する200マイクロリットルの10%スクロース溶液を第2の層として充填した(下層)。その上部に、ARPE−19スフェロイド(50スフェロイド)、DBCO修飾MPCポリマー(2.5mg)、FITC標識DBCO修飾MPCポリマー(0.025mg)、及びPEO(分子量100万、50マイクロリットル、生理食塩水中1%溶液)を含有する溶液の混合物を積層した(第1の層)。管を密閉し、1000rpmで3分間遠心分離した。コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて生理食塩水2mlを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び1000rpmで3分間遠心分離した。上清を除去し、新たなPBS 2mlで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。洗浄手順を3回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされたスフェロイドをウェルに入れ、共焦点顕微鏡研究のためにDMEM培地中、37℃で培養した。共焦点顕微鏡画像により、ARPE−19細胞スフェロイドが均一にコーティングされ、コーティングポリマーの経時的な除去とともに徐々に融合したことが明らかとなった(図19〜21)。
2ml遠心管に、アジド修飾MPCポリマー(10mg)及びPEO(分子量100万、2mg)を含有する200マイクロリットルの10%スクロース溶液を第2の層として充填した(下層)。その上部に、ARPE−19スフェロイド(50スフェロイド)、DBCO修飾MPCポリマー(2.5mg)、FITC標識DBCO修飾MPCポリマー(0.025mg)、及びPEO(分子量100万、50マイクロリットル、生理食塩水中1%溶液)を含有する溶液の混合物を積層した(第1の層)。管を密閉し、1000rpmで3分間遠心分離した。コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて生理食塩水2mlを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び1000rpmで3分間遠心分離した。上清を除去し、新たなPBS 2mlで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。洗浄手順を3回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされたスフェロイドをウェルに入れ、共焦点顕微鏡研究のためにDMEM培地中、37℃で培養した。共焦点顕微鏡画像により、ARPE−19細胞スフェロイドが均一にコーティングされ、2カ月を超えても安定しており融合しなかったことが明らかとなった(図22〜28)。
DBCO修飾MPCポリマー(0.5mg)、FITC標識DBCO修飾MPCポリマー(0.05mg)、及びPEO(分子量100万、0.1mg)を含有する、200のARPE−19スフェロイドが縣濁した10マイクロリットルの生理食塩水をピペット先端に導入し、底部にアジド修飾MPCポリマー(10mg)及びPEO(分子量100万、2mg)を含有する、200マイクロリットルの10%スクロース溶液を充填したマイクロチューブに組み立てた。卓上遠心機を使用してマイクロチューブを1000rpmで3分間遠心分離した。コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて生理食塩水2mlを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び1000rpmで3分間遠心分離した。上清を除去し、新たなPBS 2mlで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。洗浄手順を3回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされたスフェロイドをウェルに入れ、共焦点顕微鏡研究のためにDMEM培地中、37℃で培養した。共焦点顕微鏡画像により、ARPE−19細胞スフェロイドが均一にコーティングされ、高収率で得られたことが明らかとなった(図29)。
DBCO修飾MPCポリマー(0.25mg)、FITC標識DBCO修飾MPCポリマー(0.025mg)、及びPEO(分子量100万、0.05mg)を含有する生理食塩水に、50の膵島細胞(5マイクロリットル体積)を縣濁させ、それをピペット先端に導入し、底部にアジド修飾MPCポリマー(5mg)及びPEO(分子量100万、1mg)を含有する、100マイクロリットルの10%スクロース溶液を充填したマイクロチューブに組み立てた。卓上遠心機を使用してマイクロチューブを1000rpmで3分間遠心分離した。コーティングされた膵島細胞が底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて生理食塩水2mLを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び1000rpmで3分間遠心分離した。上清を除去し、新たなPBS 2mLで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。洗浄手順を3回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされた膵島細胞をウェルに入れ、共焦点顕微鏡研究のためにRPMI培地中、37℃で培養した。共焦点顕微鏡画像により、膵島細胞が均一にコーティングされ、コーティングポリマーが最大26日間安定して存在したことが明らかとなった(図30〜33)。
コーティングされたインスリノーマスフェロイド及び裸のインスリノーマスフェロイド(各々100のスフェロイド)を、平衡化及びプレインキュベーションのために1mLの1ミリモル濃度グルコースのクレブス緩衝液(Sigma)を含有するウェルに37℃で1時間入れた。これに続いて、低グルコース(3ミリモル濃度、1mL)、高グルコース(10ミリモル濃度、1mL)、及び低グルコース(3ミリモル濃度、1mL)のクレブス緩衝液中で、37℃で2時間、順次にインキュベートした。低グルコース緩衝液中でのインキュベーションの終わりに、100マイクロリットルの上清をアッセイのために収集した。高グルコース緩衝液の場合、各時点(10、30、60、90、120分)で、30マイクロリットルの上清をアッセイのために収集し、再び低グルコース緩衝液の場合は100マイクロリットルの上清をアッセイのために収集した。収集した試料をELISAによってアッセイした。グルコースに対するインスリン分泌反応性が、コーティングされたスフェロイド及び裸のスフェロイドの両方について確認され、コーティングされたスフェロイドのインスリン分泌は、高グルコース緩衝液中で裸のスフェロイドに匹敵した。図15を参照されたい。コーティングされたスフェロイドについて、高グルコース緩衝液中でインスリン分泌の遅延は観察されず、それは裸のスフェロイドと比べてであるが、マイクロカプセル化された(アルギン酸バリウム)製剤よりも優れていることが見出された。データを図16においてプロットした。
コーティングされたラット膵島細胞及び裸の膵島細胞(各々20の膵島細胞)を、平衡化及びプレインキュベーションのために1mlの1ミリモル濃度グルコースのクレブス緩衝液を含有するウェルに37℃で1時間入れた。これに続いて、低グルコース(2mM、1mL)、高グルコース(20mM、1mL)、及び低グルコース(2mM、1mL)のクレブス緩衝液中で、37℃で2時間、順次にインキュベートした。低グルコース緩衝液中でのインキュベーションの終わりに、100マイクロリットルの上清をアッセイのために収集した。高グルコース緩衝液の場合、各時点(10、30、60、90、120分)で、30マイクロリットルの上清をアッセイのために収集し、再び低グルコース緩衝液の場合は100マイクロリットルの上清をアッセイのために収集した。収集した試料をELISAによってアッセイした。グルコースに対するインスリン分泌反応性が、コーティングされたスフェロイド及び裸のスフェロイドの両方について確認され、コーティングされた膵島細胞のインスリン分泌は、高グルコース緩衝液中で裸の膵島細胞に匹敵した(図17)。コーティングされたスフェロイドについて、高グルコース緩衝液中でインスリン分泌の遅延は観察されず、それは裸のスフェロイドと比べてであるが、マイクロカプセル化された(アルギン酸バリウム)製剤よりも優れていることが見出された。データを図18においてプロットした。
膵島細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で簡便にすすぎ、4μMカルセインAM及び8μMエチジウムホモダイマー−1(EthD−1)から構成されるDPBS中で30分間インキュベートした。膵島細胞の生存率を共焦点顕微鏡で評価した。コーティングされたスフェロイドも裸のスフェロイドも、最初はほぼすべて生存細胞を有する。培地中でエージングすると、裸の膵島細胞では、29日目時点で互いの凝集に起因して中心細胞の壊死が引き起こされた一方で、コーティングされた膵島細胞は、依然として生存して、コーティングポリマーの作用による凝集を回避した(図34〜37)。
コーティングされたラット膵島細胞及び裸の膵島細胞(各々20の膵島細胞)を、平衡化及びプレインキュベーションのために1mLの1mMグルコースのクレブス緩衝液を含有するウェルに37℃で1時間入れた。これに続いて、低グルコース(2mM、1mL)、高グルコース(20mM、1mL)、及び低グルコース(2mM、1mL)のクレブス緩衝液中で、37℃で2時間、順次にインキュベートした。各グルコース緩衝液中でのインキュベーションの終わりに、100μlの上清をアッセイのために収集した。収集した試料をELISAによってアッセイした。裸の膵島細胞及びコーティングされた膵島細胞の両方のインスリン分泌機能は、インビトロ培養下で17日目まで一致していることが見出されたが、裸の膵島細胞では23日目時点でそれらの機能が顕著に減少した一方で、コーティングされた膵島細胞は、依然としてそれらの機能を維持した(図38、39)。
Claims (23)
- ハイドロゲルコンフォーマルコーティングを有する生体表面を含む組成物であって、前記コンフォーマルコーティングを有しない好適な対照生体表面と比べて、前記生体表面が、i)機能を保持する、及びii)損傷または他の形態の表面修飾を実質的に有しないか、またはごく少量しか有しない、前記組成物。
- 前記ハイドロゲルが、5〜10kDaの4アームPEG、もしくは100〜200kDaでありホスホコリン60〜90%のメタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマー、またはそれらの組み合わせなどのマルチアームポリマーの共有結合性架橋ネットワークを含む、請求項1に記載の組成物。
- ハイドロゲル中での生体表面のコンフォーマルコーティング方法であって、
2つの水性層を含む系を用意することであって、第1の層が、約0.25%〜約2%(W/V)の懸濁化剤、約1%〜約25%(W/V)の第1の官能化マルチアームポリマー、及び前記生体表面の溶液を含み、
第2の層が、糖類のクッション及び約1%〜約25%(W/V)の第2の官能化マルチアームポリマーを含み、前記第2の官能化マルチアームポリマーの官能基が、生理学的条件下で前記第1の官能化マルチアームポリマーの官能基と反応性である、前記用意することと、
前記生体表面を前記第2の層の中に通過させ、それによって前記第1及び第2の官能基が反応し、前記生体表面にコンフォーマルコーティングを施す架橋したハイドロゲルを形成できるようにすることと、を含む、前記方法。 - 前記第1の官能化マルチアームポリマーが、5〜10kDaの4アームPEGである、請求項3に記載の方法。
- 前記第1の官能化マルチアームポリマーが、100〜200kDaでありホスホコリン60〜90%のメタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマーである、請求項3に記載の方法。
- 前記第1の官能化マルチアームポリマーの前記官能基が、リジン−DBCOを含むDBCO、またはアジドなどのクリック官能基である、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の官能化マルチアームポリマーが、5〜10kDaの4アームPEGである、請求項3〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の官能化マルチアームポリマーが、100〜200kDaでありホスホコリン60〜90%のメタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマーである、請求項3〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の官能化マルチアームポリマーの前記官能基が、アジドまたはDBCOなどのクリック官能基である、請求項3〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の層が第2の懸濁化剤を含み、任意選択的に、前記第2の懸濁化剤が、前記第1の層における前記懸濁化剤と同じである、請求項3〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記系が、前記第1の層と前記第2の層との間に介在層を含み、任意選択的に、前記介在層が気層である、請求項3〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記懸濁化剤が、約1%で存在する約1〜8MDaの分子量を有するPEOである、請求項3〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ハイドロゲル中での生体表面のコンフォーマルコーティング方法であって、
介在する気層によって分離された2つの水性層を含む系を用意することであって、第1の層が、約0.25%〜約2%(W/V)の懸濁化剤、約1%〜約25%(W/V)の第1の官能化マルチアームポリマー、及び前記生体表面の溶液を含み、
第2の層が、約0.25%〜約2%(W/V)の懸濁化剤、糖類のクッション、及び約1%〜約25%(W/V)の第2の官能化マルチアームポリマーの溶液を含み、前記第2の官能化マルチアームポリマーの官能基が、生理学的条件下で前記第1の官能化マルチアームポリマーの官能基と反応性である、前記用意することと、
前記生体表面を前記第2の層の中に通過させ、それによって前記第1及び第2の官能基が反応し、前記生体表面にコンフォーマルコーティングを施す架橋したハイドロゲルを形成できるようにすることと、を含み、前記第1の官能化マルチアームポリマーが、メタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマーである、前記方法。 - 前記第1の層が、前記第2の層に連続的に添加され、任意選択的に、前記第2の層が、前記混合物が遠心力下で移動できるように寸法決めされた開口部を有する先細サイドアームを通した前記第1の層の前記添加に好適な容器内にある、請求項13に記載の方法。
- 前記生体表面が、遠心分離によって前記第2の層の中に通過させられる、請求項3〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コンフォーマルコーティングの厚さが、約20μm未満である、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物または方法。
- 前記生体表面が、ヒト細胞などの哺乳類細胞などの動物細胞などの、生細胞を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物または方法。
- 前記生細胞がインスリン産生細胞である、請求項17に記載の組成物または方法。
- 前記細胞が、誘導多能性幹細胞などの多能性幹細胞である、請求項17または18に記載の組成物または方法。
- 約2mM〜約20mMのグルコースで刺激すると、前記コンフォーマルコーティングに供されていない好適な対照細胞と比べて、前記細胞が、前記好適な対照細胞と実質的に同様である動態で及び/または濃度でインスリンを分泌する、請求項19に記載の組成物または方法。
- 請求項3〜20のいずれか1項に記載の方法によって調製された、コンフォーマルコーティングを有する生体表面。
- 薬学的に許容される希釈剤または賦形剤をさらに含み、任意選択的に、前記生体表面が、シリンジ中または生体適合性容器中に含有される、請求項1、2、または16〜21のいずれか1項に記載の組成物。
- 哺乳類対象の治療方法であって、前記対象に、治療上有効量の請求項1、2、または16〜22のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含み、任意選択的に、前記投与が、直接注射によってまたは生体適合性容器の埋め込みによってのいずれかで行われ得る、前記方法。
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