JPH11509833A

JPH11509833A - 薬剤のマイクロカプセル化法

Info

Publication number: JPH11509833A
Application number: JP8530088A
Authority: JP
Inventors: ジョーダン，オリヴィエ; ラニエリ，ジョン; イーヴィッシェー，パトリック; クレメンス，ジャン−フランソワ
Original assignee: エコールポリテクニークフェデラルドゥローザンヌ; ユニヴェルスィテドゥローザンヌ; サントルオスピタリエユニヴェルスィテールヴォドワ
Priority date: 1995-04-03
Filing date: 1996-04-03
Publication date: 1999-08-31
Also published as: EP0818993A1; WO1996031199A1; MX9707492A; AU704240B2; AU5280396A; US6080412A; CA2216359A1; GB9506844D0

Abstract

(57)【要約】製薬粒子または粒子クラスターの表面に染料を付着させ、物質を架橋させるように液体重合性物質の存在下で染料に放射エネルギーをあて、粒子の表面上に、架橋ポリマーのコンフォーマル層を生じせしめることを含む、マイクロカプセル化製薬製剤の製造方法を開示する。好ましくは、ポリマーは、治療成分がマイクロカプセルから出ることを許容しながら、粒子の周囲に免疫保護層を付与する。マイクロカプセル化製薬製剤とその医療用途、特に、インシュリン分泌細胞をカプセル化することによる糖尿病の治療への使用について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】薬剤のマイクロカプセル化法発明の分野この発明は、特に製薬目的のマイクロカプセル化法に関する。この発明は、特に、例えばインシュリンのような治療用物質を産生および分泌する免疫隔離（im munoisolated）細胞を含んでなる医薬製剤の調製並びにこれら製剤の医療用途に利用できる。発明の背景細胞の免疫隔離（immunoisolation）とは、免疫系による拒絶反応を回避するために、移植前に半透膜バリア内に細胞または細胞クラスターを配することを含む手順のことである。これは、自然に、または遺伝子工学的手法を介して、生物活性を有する物質を分泌する全ての種類の細胞に応用することができる。実際、主たる研究が、インシュリン分泌細胞についてなされている。カプセル化膜の分子量（Ｍｗ）切断は、補体系の溶菌因子および免疫グロブリンの内部拡散を防止するが、より小さい分子、例えばグルコースやインシュリンの通過は許容するように、カプセル化によりコントロールすることができる。よって、バリアは、β 細胞が血中グルコースの変化に生理的に応答することを許容するが、免疫系の構成要素との如何なる接触も防止する。このような状況下では、移植された島が、宿主の免疫系から隔離されるので、異種組織が使用されて、供給問題が解消され、拒絶または病気の再発を防止するための免疫抑制は必要とされない。島組織または膵臓フラグメントを封入する拡散チャンバーを使用して、免疫隔離の原理を探究する初期の研究は、ほとんど成功していない（１、２でレビューされている）。高血圧症の一時的改善は達成されているが、利用可能な膜物質は、迅速な刺激／インシュリンの分泌輸送を可能にするものではなかった（３）。さらに近年、体外または血管内のインシュリン分泌デバイスとして、半透性チャンバー内に封入した同種または異種の島と共に、中空のキャピラリ繊維を使用することにより、齧歯動物（４、５）、イヌ（６、７）、およびサル（８）における糖尿病を、短期間逆転させることに成功している。体外または血管内でのアプローチ法は、カプセル化技術の安全性を証明するために必須ではあるが、ヒト、特に幼年の子供への適用には適していない。しかしながら、拡散チャンバー−ヒトへの応用への選択方法−は、コンシステンシーの問題が今だ障害となっている（９）。異なる工学技術に基づく、いくつかのポリマーカプセル製造技術が開発されている。カプセル化法は、最も一般的には、それらの幾何学的な外観、すなわちマイクロ−またはマクロ−カプセルにより分類される。マクロ−カプセル化法において、細胞または細胞クラスターは、選択性透過中空繊維、または平坦なシート状膜内に包含される。それらは、熱可塑性物質から製造されるため、これらのカプセルは、機械的に安定で回復するのが比較的容易である。数人の研究者は、領歯動物の糖尿病モデルにおける島細胞の移植に熱可塑性物質をベースとした中空繊維カプセルを成功裡に使用できたことを報告している。本発明者は、先に、適切な表面ミクロ幾何特性および化学組成を付与することで、移植された熱可塑性物質ベースのマクロカプセルの周囲に形成される組織反応が、齧歯動物の脳（１０）および腹膜腔（１１、１２）の双方において最小であることを報告した。また、種（１３）に亘って移植された場合における、マクロカプセル化されたＰＣ１２細胞、ドーパミン作用性の細胞系の長期間の脳生存を報告し、これらの移植は、ラットおよび霊長類（１４）の実験的パーキンソン病モデルにおいて、有意に改善されていることを報告した。同様のカプセル化系を使用し、レイシー（La cy）と共同研究者は、皮下マクロカプセル化島細胞を移植されたラットにおける、ストレプトゾトシン誘発性高血糖症の矯正を報告している（１５）。さらに最近、シャープ（Scharp）と共同研究者は、同じアクリルベースのマクロカプセル化系を使用して、糖尿病患者における、カプセル化されたヒトの島が、２週間生存していたことを報告している。同様のアクリル系を使用し、本発明者は、最近では、末期癌を病んでいるヒトのクモ膜下腔内空間における、ウシ属クロマチン細胞の移植に成功したことを報告した。外植デバイスは、カプセル並びに生存能力のあるクロマフィン細胞に対する宿主反応が存在しないことを示していた。回収すると、カプセルは、移植に先立ってインビトロで測定されたものと同等のカテコールアミンを放出していた。機械的に安定で、生物学的適合性があるが、中空の繊維をベースとした系は、移植された細胞が適切に生存できるように、低密度での充填が必要である。この物質系をスケールアップしてヒトの糖尿病を矯正するには、非現実的にも５０ｍ長の装置を必要とする。この技術の他の制約は、カプセル璧の厚みと、グルコースの拡散動力学へのその潜在的影響である。拡散バリアは、過度のインシュリン分泌により、短期間の低血糖症を引き起こす可能性がある。半透性の中空繊維を使用したマイクロカプセル化法は、ヒトの内分泌組織の異種間移植に対して実行可能な技術であることを本発明者は立証した。また、この技術は、島の移植およびカプセル化に実験的に使用されたが、効果的な包含（パッケージング）には適切でない。カプセルの壁厚は、通常、最低１００μｍであり、中空の繊維内で細胞は典型的には５００−６００μｍの直径のヒドロゲルマトリックスコア内に固定されている。これにより、宿主と移植細胞との間には、数百μｍの拡散距離が生じ、拡散動力学に悪影響を及ぼす。この拡散バリアは、血中のグルコースレベルの検出において、著しい「ラグ」タイムを引き起こし、インシュリン分泌において相シフトを引き起こし、よって、血中グルコースレベルの不規則な調節を引き起こす。また、繊維技術の幾何的制約により、充填密度が非常に乏しく、移植された島のカプセル化繊維は、数メートル必要となるかもしれない。これらの問題の解決法の一つは、マイクロカプセル化技術の使用であるかも知れない。マイクロカプセル化法において、細胞クラスターは、５００−６００μ ｍのヒドロゲルマクロスフィア内に固定される。典型的には、半透膜はマイクロスフェア表面で形成される。種々の化学系が使用されている。最も一般的な形態では、カプセル膜は、２つの弱い多価電解質、典型的には酸性多糖類、例えばアルギン酸、およびカチオン性のポリアミノ酸、例えばポリリシンの間でのイオン結合または水素結合により形成される。実際には、細胞の包括は、多価の対イオンにさらされることで誘発される荷電多価電解質のゲル化により得られる。ついで、対−多価電解質が、細胞固定化マトリックスに、界面的に吸着する。マイクロカプセルは拡散のための理想的な形状を有する。インビトロのテストでは、マイクロカプセル化された島からのインシュリンの放出は、マイクロカプセル化されていない細胞からのものと同等であることが示された。しかしながら、それらは、特に多価電解質を使用した場合に、機械的にもろい。また、それらは、結合がイオン結合のみに依存する場合は、化字的にも不安定で、ヒト以外の霊長類の脳に移植して数週間でマイクロカプセルは破裂に至る。このようなマイクロカプセルの腹膜内への移植は、齧歯動物の実験的糖尿病モデル、さらに最近では、ヒトにおいて、糖尿病を逆転させることが報告されている。しかしながら、系の生物学的適合性に乏しく、若い糖尿病患者への使用については問題がある。安定性および生物学的適合性の点を修正しようとして、セフトン（Sefton）とその共同研究者は、有機ポリマー溶液の島クラスター周囲への沈殿に基づいたマイクロカプセルを開発している。溶媒の毒性と透過性特性の均衡の問題は、なおこのアプローチ法の障害となっている。一般に、ヒトにおけるマイクロカプセル系の使用は、大容量の島への均一な薄膜コーティングを可能にするためのプロセスの制約および長期間に亘る安定性の問題により、制限されている。発明の概要本発明の一つの側面は、マイクロカプセル化された製薬製剤の製造方法を提供することにあり、該方法は、製薬粒子または粒子クラスター（ここでは、一般的に「粒子」と称する）の表面に染料を付着させ、溶液重合（または重合性）物質の存在下で染料に放射エネルギーをあててその物質を架橋させ、粒子の表面上に架橋ポリマーのコンフォーマル（相似）層を生じせしめることを含んでなる。望ましくは、染料は、前記表面（特に、島表面または細胞膜）に特異的に結合する。一般的には、染料は蛍光染料である。架橋のメカニズムは、レーザーで誘発させて三重項状態に染料の励起状態を生じさせ、適切な電子供与体からフリーラジカルを生じさせることを含んでいる。これらのフリーラジカルによりポリマーの架橋が開始させられ、ヒドロゲル調製物になる。「製薬」粒子は、実際、直接的に薬剤である必要はなく、例えば製薬的な活性物質を産生し分泌する細胞または細胞クラスターであり得る。ポリマーは、粒子からの治療成分がマイクロカプセルから出ることを許容しながら、免疫−保護層、すなわち体の免疫系が免疫応答を粒子に付与するのを防止するものを好適には提供する。これは特に、粒子が、治療用物質、例えばタンパク質を産生および分泌する細胞を含んでいる場合に特に適切であり、ポリマーは治療用物質と細胞の栄養素に対して透過可能であるが、もちろん、細胞自体は透過できない。ポリマーは、好ましくは、適切なエネルギー源、例えばレーザーを、染料に照射することにより架橋させられ得るヒドロゲルであるか、または架橋後のヒドロゲルになる。典型的には、架橋する前の物質が、ポリマー分子を、例えば４００ｇ／ｍｏｌ−１８５００ｇ／ｍｏｌ含有する。染料は、液状のポリマー（またはポリマー形成）物質にこのように処理された細胞を接触させ、染料を励起してポリマーを架橋させる前に、着色または他の手段で、粒子表面に塗布される。膜内に特異的に含有させた染料の使用により、拡散現象が制限され、よって、コーティングの厚みが改善され、光毒性が減少する。別の方法としては、物質を粒子に接触させ、同時に染料に接触させてもよい。例えば、物質の分子（例えば、鎖またはミセル）が染料で標識され、粒子と結合可能になる。例えば、粒子が細胞である場合は、物質は、例えば両親媒性の相互作用、タンパク質結合、または他の化学的手段、更にまたレセプター−リガンドもしくは抗体−抗原相互作用により、細胞膜を結合することができる。ポリマーは、適切なエネルギー源、例えば適切な周波数のレーザー光で染料を励起させることにより架橋される。粒子物質および重合（重合形成）溶液と共に、染料は、レーザー光を等しく分布させて均一な重合を可能にするレーザー一体化チャンバー内に適切に配される。所望の厚みのコンフォマルコーティングが物質の周りに形成されるまで、エネルギーが供給される。「コンフォーマル」コーテイングとは、物質、例えば細胞または細胞クラスターの形状に一致する薄層コーティングを意味する。本発明の更なる側面は、上述した方法で得ることができるマイクロカプセル化製薬製剤を提供することにある。本発明の更なる側面は、粒子状の製薬用物質が、照射染料の作用により、共有結合的に架橋したポリマーで、相似にコーティングされた製薬製剤を提供することにある。本発明の更なる側面は、医療用途に、上述したマイクロカプセル化製薬製剤を提供することにある。本発明の更なる側面は、細胞が放射染料の作用で共有的に架橋されたポリマーでコンフォーム的に被覆された糖尿病の治療薬の調製におけるインスリン分泌細胞を含んでなるマイクロカプセル化製薬製剤の使用を提供することにある。本発明の更なる側面は、上述した方法で得られるマイクロカプセル化粒子を含有する、グルコースの治療的調節のための移植組織を提供することにある。詳細な記載カプセル化技術における本進歩は、先に記載したマイクロ−またはマクロカプセル化技術の両方に利益をもたらす。共有結合的に架橋したヒドロゲルの機械的安定性が、マイクロカプセル化ヒドロゲルの生物学的適合性および大きさと結合させられている。約１０〜２０μｍ厚の、半永久的に架橋したヒドロゲル皮で、多量の細胞クラスターをそれぞれ被覆する、カスタムデザインのレーザー重合法が開発された。薄く均一な免疫隔離膜は、「コンフォーマル・コーティング」と称される。この方法により、β細胞までのグルコース拡散距離を最短とし、細胞移植のための充填係数を最大とすることができる。５００，０００の島等価物が、ヒトの糖尿病を逆転させるために必要であると仮定すると、２ｍｌのコンフォーマルコーティングされた島が、グルコースの治療的調節に対して必要であると仮定することができる。コンフォーマルコートカプセル化の方法論を図１に示す。まず、島を、膜の蛍光膜染色染料からなる溶液に懸濁させる。膜結合染料は、次の重合反応のための電子供与体となる。染色後、島を洗浄し、再度懸濁させ、適切な周波数のレーザーでの染料の励起後、島の周囲で素早く重合してヒドロゲルとなる。ついで、カスタムデザインのレーザー一体化チャンバー内に島を配し、所望の厚みを有するコンフォーマルコーティングが、懸濁した島の周囲に形成されるまで、均一にレーザー光を照射して、確実に均一的に重合させる（図２）。予備実験において、次のコンフォーマル・コーティングのプロセスパラメータを研究した：ａ）細胞膜を特異的に染色するための染料の選択２種類の染料が考えられる。（ｉ）自由に拡散する染料（例えば、エオシンＹ、エオシンＢ、フルオレセイン、ローダミン）。（ｉｉ）細胞膜に特異的に混入可能な染料［例えば、ディル（Dil）、Ｄ１０、イソチオシアン酸エオシン、フルオレセイン、およびエオシン誘導リン脂質］。（ｉ）自由に拡散する染料：１ｍＭのエオシンＹ溶液を使用して、均質な含浸物が得られた。含浸時間は１〜１０分で、続いて１または２回洗浄された。エオシンの吸収を可視化するために、共焦蛍光顕微鏡検査法を、含浸したラットのランゲルハンス島およびβ細胞系のクラスターに使用した。１ｍＭ溶液での５分間の染色後、エオオシンＹが細胞質内部に吸収されたことが示された。（ｉｉ）膜を染色する染料：拡散の問題を低減させるために、我々は、細胞膜と結合可能ないくつかの染料を選択した。最初の２つは、ジアルキルカルボシアニン族に属する、カチオン性の膜マーカーである、ＤｉＩとＤｉＯである。両親媒性のマーカーは、２重の脂質膜と相互作用する。また、膜タンパク質に結合することが知られているエオシン−５−イソチオシアナート（エオシンＮＣＳ）もテストされた。また、フルオレセイン誘導リン脂質（ＦＬＰＥ）が、マイクロカプセル化のための有望な染料として出現した。ラットのランゲルハンス島およびβ細胞系のクラスターは、上述した染料で含浸させられた。共焦蛍光顕微鏡検査法により、膜表面への染料の特異的永久的吸着を示す蛍光層が分かった。ＦＬＰＥ含浸パラメータが最適化された。含浸時間を５分以上、染料濃度を２５０μＭ以上とすると、染料の混入を著しくは増加させない。最良の結果は４℃の温度で得られた。特異的染色を用いたこれらの有望な結果は、新しい応用への道を開いた。コーティング厚を制御する他の方法は、染料でラベルされ、細胞膜に結合可能な一つの末端基を有するポリマー鎖またはミセルの使用である。この結合は両親媒性相互作用、タンパク質結合（イソチオシアナート基を有するようなもの）、または他の化学的方法により、達成され得る。染料の吸収波長はレーザー源に適合されなければならず、アルゴンレーザー用にはエオシンまたはフルオレセインである。鎖の長さにより、コーティング厚が制御され、高分子量のポリマーが膜の浸透を妨げ、よって起こりうる光毒性作用が除去される。例えば、親油性または荷電末端基を持つ、エオシンでラベルされたデキストリンは、ポリマーによるコンフォーマルコーティングの成長のための必要性を満たしている。特異的染料結合を達成させるための他の方法としては、島に特異的な抗原にエオシンをカップリングすることによる、免疫化学の使用がある。特異性および膜透過性の欠如がまた島のコンフォーマルコーティングを可能とする。（ｂ）感光性ポリマーの開発 β細胞をコンフォーマルコートするために使用されるポリマー系は、生物学的整合性のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベースとしたヒドロゲルである。それは３つの要素：ポリ（エチレングリコール−４００−ジアクリラート）（ＰＥＧ−ＤＡ）またはポリ（エチレングリコール−１８−５００−マルチアクリラート）（ＰＥＧ−ＭＡ）の水溶液、反応開始剤、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、および光増感剤として作用する適切な染料（エオシンＹ、エオシンＮＣＳ、ＦＬＰＥ等）からなる。薄く均一なコーティングを形成させ、免疫保護膜としての適切な機能と、プロセシングおよび移植に対する機械的耐久性の双方を確実に付与するために、３つのプロセスパラメータを同時に制御する必要がある。これらのパラメータは、染料濃度、重合の反応開始剤の量、およびレーザー強度であり、これら全て反応時間の関数として最適化される。反応時間は、ＰＥＧシステム用の光学ホログラフィー技術を使用して、実験的に決定された^17、18。石英キュベットに収容されたＰＥＧ感光性ポリマーは、２分割されたアルゴンレーザー光線（波長５１４ｎｍ）により生じる干渉パターンにさらされ、よって、感光性ポリマー中に格子を描く。回析効率を測定することにより、この格子の成長を探査するため、低パワーのＨｅ−Ｎｅレーザーが使用される。重合時間は最大回析強度が９０％に達するのに必要な時間として定義される。１Ｗ／ｃｍ²の最大レーザー強度で、素早い、また完全な重合反応を起こさせるのに必要な染料濃度が、最初に決定された。使用した９０ｍＭのＴＥＯＡ濃度は、反応速度を制限する要因ではなかった。図３には、１０μｍ厚の膜とするための、エオシンＹ濃度の関数として重合時間が示されてる。最適濃度は、膜を通過する７０％の光吸収に相当することが示されている。染料濃度がより高い¹¹と、染料の漂白が不完全で、不均質な重合になる。これらの測定から、１ｍＭ濃度の染料が、細胞のマイクロカプセル化に使用された。最適化された染料濃度と、１Ｗ／ｃｍ²の照射強度を使用し、重合の完了に必要な反応開始剤ＴＥＯＡの最小濃度を決定した。このようにすると、消費されないモノマーＴＥＯＡの最小量が重合後も残る。少なくとも９０ｍＭの濃度が、反応速度を最大にするために必要であった。光重合に必要な照射時間は、最適化された反応パラメータを使用して決定した。図５には、重合時間とレーザー強度との関係が示されている。例えば、１Ｗ／ｃｍ²のレーザー強度で１３秒が、重合を完了させるのに必要であった。低濃度（生理用培地に１０％（ｗ／ｖ）濃度）のＰＥＧ−ＤＡを使用した結果、反応速度は非常に遅かった（図６）。さらに、得られたゲルは機械的に脆く、５％（ｗ／ｖ）に濃縮されたアガロールゲルよりも、水分透過性が高いことが示された（図７）。この測定に基づき、２０％〜３０％濃度のＰＥＧが使用された。光化学の観点から、セクションａ）に挙げた染料は、かなり特殊であった。ホログラフィー技術による光重合速度の測定より、照射時間はＤｉＯで１７分間、ＤｉＩで１０分間であった（図８参照）。エオシンＮＣＳは、エオシンＹよりも１．４倍遅かった。この挙動は、エオシンの高い三重項転換効率で、高反応量収量を得ることができることにより、説明され得る。ＦＬＰＥは、エオシンＹに必要な時間の２倍で光ポリマー架橋を誘発する。また、他の染料、例えばエシンＢ、ローズベンガル（rose bengal）およびスチルベンが、有効な光増感剤であることが証明された。ｃ）生物学的細胞クラスターのカプセル化（ｉ）自由に拡散する染料でのカプセル化：ランゲルハンス島のマイクロカプセル化は先に報告されている^19、20。カプセル化はエオシンＹ光増感剤を使用して評価された。初期細胞（ラットのランゲルハンス島）と、遺伝工学的に処理されたマウスのβ細胞系（βＴＣtet）とは成功裡にカプセル化された（図９（ａ）および（ｂ）参照）。９０ｍＭのＴＥＯＡを含有する３０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−ＤＡ溶液を使用し、島を５分間、１ｍＭのエオシンＹ生理的溶液に含浸させた。照射強度は２０秒間で、１Ｗ／ｃｍ²であった。５０μｍから２０μｍまでのコーティング厚が得られた。コーティング厚は、照射時間とポリマー濃度の両方で制御することができることが分かった。照射時間をより長くすればする程、染料の拡散により、より厚くなる結果となり、ポリマー濃度を高くすればする程、粘度の増大により、より薄くなる結果となった。しかしながら、２つの主な欠点が生じた：第１に、細胞内部への染料の取込みにより、フリーラジカルの光誘発のため毒性を有するようになった。第２に、沈降や対流が、島の周囲に不均質な流れを生じさせ、結果として不規則なコーティング（尾状物が形成される）となり、ポリマー溶液が塊状に重合してしまうおそれもある。これらの問題を克服するために、特定の膜染色用染料を、マイクロカプセル化用に実証した。（ｉｉ）膜染色用染料でのカプセル化：ラットのランゲルハンス島の染色が、１ｍＭのエオシンＮＣＳ溶液で行われた。動力学的に低い状態で混入されたため、含浸には長時間が必要であった（２時間まで）。塩水で２回洗浄し、ＰＥＧ−ＤＡの３０％（ｗ／ｖ）ポリマー溶液に再懸濁させ後、島に、１００ｍＷ〜１Ｗ／ｃｍ²の範囲内の強度で、１０〜３０秒間照射した。１０〜２０ミクロンの厚みのコンフォーマル・コーティングが得られた。一つの懸濁液で、島の約８０％が、島の全周囲に可視できるコーティングでカプセル化された（図９（ｃ）参照）。比較カプセル化実験は、エオシンＹよりも膜結合エオシンＮＣＳ染料で良好な結果を提供し、「尾状物効果（tail e ff ect）」がなく、より薄いコンフォーマル・コーティングが得られた。また、島溶液の塊状重合を誘発する傾向も減少した。これらのカプセル化された島を培養保存したところ、それらは、光重合工程を経ても生存していることが示された。完全な島機能性を評価する更なる研究が必要とされている。これらの実験で、生物学的粒子のマイクロカプセルに、膜結合染料を使用すると、コーティング厚を減少させ、よって、より素早い放出の動力学特性を得ることが可能になることが示された。新規の染料を目下調査中である。フルオレセインＤＨＰＥ（ＦＬＰＥ）のようなフルオレセイン誘導リン脂質が、細胞膜に特異的に結合し、高効率で重合を誘発させることが分かった。また、エオシンＤＨＰＥを使用することもでき、その高い三重項状態効率により、効率的な光重合が可能となる。ｄ）工程の毒性マイクロカプセル化工程中、生物学的粒子は、生物学的媒体から離れた状態に置かれている。化学的、熱的、機械的、または光化学的性質のダメージにより、細胞の生存力または機能性が制限される可能性がある。細胞の生存力は生体蛍光染色法（フルオレセイン−ジアセタート（ＦＤＡ）またはカルセインＡＭ分析法）により測定され、機能性はグルコース刺激下において、インシュリン分泌の動的測定により評価される。化学的毒性評価は、プレポリマー溶液（３０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−ＤＡおよびＴＥＯＡを９０ｍＭ）におけるランゲルハンス島のインキュベートによりなされた。島は、４分間のインキュベートまでは、１００％の生存率を示した。マイクロカプセル化工程を３０秒間続けた場合、プレポリマー溶液から、化学的に誘発されるダメージはないことが予想される。また、染料の含浸における毒性も実証された。上述した染色条件において、エオシンＹおよびＦＬＰＥに対しては、何の化学的毒性も測定されなかった。しかしながら、エオシンＮＣＳは、１ｍＭ溶液における１０分の含浸後、インシュリンの分泌を抑制することが示された。細胞クラスターは、機械的ストレスに対して、極度に敏感である。５Ｎ／ｍ² の剪断応力に１０秒間さらされた後の細胞クラスターの非分離化が報告されている。この種の剪断応力は、ノズルを通しての微細液滴の押出のような他のマイクロカプセル化工程において、即座に得られる²¹。界面重合法においては、ほどんど剪断応力は生じない。我々のカプセル化実験中には細胞の非分離化は見られなかった。重合熱またはレーザー光の吸収により引き起こされる細胞クラスターの加熱が、細胞組織にダメージを与え得る。コンピュータによる計算によれば、用いた光重合条件（例えば、１Ｗ／ｃｍ²以下の強度、１ｍＭの染料濃度、１０〜３０秒間の重合）において、最大、１．４℃の温度上昇が予期されることが示されている。その結果、レーザ誘発加熱からはダメージは予期されない。光毒性効果は、毒性フリーラジカルの発生による染料の脱励起化の結果生じ得る。この効果の細胞生存性に対する評価は図１０に示されている。１ｍＭのエオシンＹ溶液を含浸させたラットのランゲルハンス島が、種々の強度および時間のレーザー照射にされされ、１日後に生存率が測定された。照射時間が１０秒で、レーザー強度が５０ｍＷ／ｃｍ²から１Ｗ／ｃｍ²の範囲内にある場合は、１００％の生存率が測定された。照射時間を長くすると、インシュリンの分泌の減少とともに、生存率の低下に至る。よって、３０秒未満の照射時間がマイクロカプセル化法には用いられなければならない。ＦＬＰＥ染色され、レーザーにさらされたラットの島の生存率を測定した（図１１を参照）。４℃で５分間、２００μＭのＦＬＰＥ溶液で染色した後、照射強度が５０ｍＷ／ｃｍ²では生存率は１００％であり、１Ｗ／ｃｍ²では７０％であった。これらの結果より、ＦＬＰＥ染料がマイクロカプセル化に対して有望な光開始剤になる。また、カプセル化されたラットのランゲルハンス島の生存率も評価された。１ｍＭ濃度のエオシンＹを使用し、１Ｗ／ｃｍ²で１０秒の照射で３０％のＰＥＧ −ＤＡでの膜をカプセル化後、７０％±１０％の生存率が測定された（８つのサンプルの平均±標準偏差）。この後者の結果は、全マイクロカプセル化工程中に、細胞膜が少しダメージを受けることを意味している。ｅ）ベンゾフェノン化学に基づく光活性化ヒドロゲルの開発ベンゾフェノン化学（ＢＰ）に基づく、ヘテロ二官能性リンカーを使用する、第２の物質のカプセル化技術が開発される。この化学技術の利点は、現実的に如何なるヒドロゲル物質でも効果的に架橋させることができることにある。ＢＰの化学的性質は、ＵＶ領域（３５０ｎｍ）近傍で光活性化され、Ｃ−Ｈ結合と容易に反応することにある。予備実験において、我々は、島細胞が、数分間、１００ｍＷ／ｃｍ²の照射に耐えうることを見いだした。ＢＰの化学的性質は、一端が特定の化学官能基と熱化学的に反応し、ＢＰの化学的性質を有する他端が、ついで光活性化して、架橋反応を開始するようにカスタムデザインすることができる。また、ＢＰの化学的性質は、水性環境内で効果的に利用される。ベルン大学のエイチ・シグリスト（H Sigrist）博士と共同して、我々の研究室では、光架橋に利用できるＢＰユニットを他端に持つアルブミン上に熱化学的に変性可能な二官能性結合体を開発した。アルブミン−ＢＰは、β細胞クラスターの周囲をポリマー皮でコンフォーマルコーティングするための理想的な系であることが証明されている。これは、まずβ細胞上にアルブミン−ＢＰを吸着し、ついで、ヒドロゲル溶液中でβ細胞を光活性化させることにより達成され得る。このようにして、細胞膜上に吸着されたアルブミン−ＢＰは、同時にβ細胞クラスターの周囲のヒドロゲル皮を架橋しながら直ちに固定される。先に述べた界面重合反応と比較して、アルブミン−ＢＰは、多量に生産することができ、β細胞系上で試みることができる。また、ＢＰ化学でのリン脂質誘導体、例えばホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の変性も評価される。もしこれが実行されるならば、脂質は膜内に効果的に取り入れられ、ついで、ＢＰの化学的性質が活性化され、島凝集体の周囲の任意のヒドロゲル系が光重合する。変性アルブミンと比較して、染料を使用する利点は、吸着アルブミン系に対して、膜内に染料が固定され、近いことにある。膜染料に付着したＢＰ活性により形成されたポリマー「皮」は、より薄く、しっかりと結合したヒドロゲル膜を形成し得る。いくつかのヒドロゲルをベースとした系が、ＢＰの化学的性質での架橋に対して、実験的にテストされる。これらには、純粋なＰＥＧ、ポリビニルアルコール、およびアガロースが含まれる。これらの親水系は最も低いタンパク質吸着作用を示し、よって任意の有意な細胞付着を防止するので、高い生物学的適合性を有することが知られている。これらの架橋ヒドロゲルは、移植の研究に対して現在まで使用されている多価電解質に比べて、機械的および化学的安定性が改善されているので、特に興味深いものであることが分かる。参考文献１．ヘグレ・オー・ディー（Hegre，O.D.）「糖尿病患者の膵臓（The Diabeti c Pancreas）」の島細胞移植、ボルク・アンド・アーキュイラ（Volk and Arqui lla）社版、プレナム（Plenum）、ニューヨーク、1985. ２．ティゼ・ダブリュー・ジェイ（Tze，W.J.）およびタイ・ジェイ（Tai，J.）：他家移植における膵臓島細胞の操作（Manipulation of pancreatic islet cel l in allotransplantation）．Trans Proc．14:714、1982. ３．テオドロン・エヌ・エー（Theodoron，N.A.）、ブルボバ・エイチ（Vrbova, H.）、タイハースト・エム（Tyhurst，M.）、およびホーウェル・エス・エル（ Howell，S.L.）：ラットにおける先天性の膵臓島移植用のポリカーボナート拡散チャンバーの使用での問題（Problems with the use of polycarbonate diffusi on chambers for syngenic pancreatic islet transplantation in rats）．Dia betologia 18:313、1980. ４．チック・ダブリュー・エル（Chick，W.L.）、パーナ・ジェイ・ジェイ（Per na，J.J.）、ラウリス・ブイ（Lauris，V.）、ロウ・ディ（Low，D.）ら：生存 β細胞を使用する人工膵臓（Artificial pancreas using living beta cells）：糖尿病のラットにおけるグルコースホメオスタシスの影響（effects of gluco se homeostasis in diabetic rats）、Science 197:780、1977. ５．ティゼ・ダブリュー・ジェイ、ウォン・エフ・シー（Wong，F.C.）、およびチェン・エル・エム（Chem，L.M.）：膵臓島の同種移植および異種移植用の移植可能な人工エキャビラリーユニット（Implantable artificial capillary unit for pancreatic islet allograft and xenograft）、Diabetologia 16:247、197 9. ６．ティゼ・ダブリュー・ジェイ、タイ・ジェイ、ウォン・エフ・シー、デイビス・エイチ・アール（Davis，H.R.）：糖尿病のイヌにおけるラットの島を含有する移植可能な人工キャビラリーユニットの研究（Studies with implantable a rtificial capillary unit containing rat islets on diabetic dog）．Diabet ologia 19:541、1980. ７．サリバン・エス・ジェイ（Sullivan，S.J.）、マキ・ティー（Maki，T.）、ボーランド・ケー・エム（Borland，K.M.)、マホーニー・エム・ディー（Mahone y，M.D.）、ソロモン・ビー（Solomon，B.）ら：バイオハイブリッドの人工膵臓；膵臓切除された糖尿病のイヌにおける長期移植の研究（Biohybrid artificial pancreas；long-term implantation studies in diabetic，pancreatectomized dogs）．Science 252:718、1991. ８．サン・エー・エム（Sun，A.M.）、パリシウス・ダブリュー（Parisius，W. ）、ヒーリィ・ジー・エム（Healy，G.M.）、バセック・アイ（Vacek，I.）ら：培養したランゲルハンス島を含有するキャピラリーユニットの糖尿病のラットおよびサルへの使用（The use in diabetic rats and monkeys of artificial cap illary units containing cultured islets of Langerhans）．Diabetes 26:113 6、1977. ９．コルトン・シー（Colton，C.）、アヴウゴースティニアトス・イー・エス（ Avgoustiniatos，E.S.）：ハイブリッド人工膵臓の開発における生体工学（Bioe ngineering in development of the hybrid artificial pancreas）．J.Biomech ．Eng．113:152、1991. １０．ウィン・エス・アール（Winn，S.R.）、エアビッシャー・ピー（Aebische r，P.）、ギャレッティー・ピー・エム（Galletti，P.M.）：選択透過性ポリマーカプセルに対する脳組織の反応（Brain tissue reaction to permselective p olymer capsules）．Biomed．Hater．Res．23:31、1989. １１．クリステンソン・エル（Christenson，L.）、エアビッシャー・ピー、マックミラン・ピー（Mcmillan，P.）、ギャレッティー・ピー・エム：腹膜内移植の組織反応（Tissue reaction to intraperitoneal implants）：コルチコイドとドキソルビシンの影響と種の差異（species difference and effects of cort icoid and doxorubicin）．J．Biomed Master．Res．23:705、1989. １２．クリステンソン・エル、ウォールベルグ・エル（Wahlberg，L.）、エアビッシャー・ピー：腹膜内移植のポリマーカプセルの組織反応に対するマスト細胞の寄与およびコルチコイドの局所的放出の影響（Contribution of mast cells t o tissue reaction to intraperitoneally implanted polymer capsules and ef fect of local release of corticoid）．J．Biomed Master．Res．25:1119、19 91. １３．エアビッシャー・ピー、テスコ・ピー・エー（Tesco，P.A.）、グリーン・エル・エー（Green，L.A.）、ジャガー・シー・ビー（Jaeger，C.B.）：ポリマーカプセル化されたドーパミン分泌細胞系の長期間の交雑種における脳移植（ Long-term cross-species brain transplantation of a polymer-encapsulated dopamine-secreting cell line）．Exp．Neurol．111:269、1991. １４．トレスコ・ピー・エー（Tresco，P.A.）、ウィン・エス・アール、タン・エス（Tan，S.）、ジャガー・シー・ビー、グリーン・エル・エー、エアビッシャー・ピー：ポリマーカプセル化されたＰＣ１２細胞の移植による障害誘発性循環挙動の減少（Transplantation of polymer encapsulated PC12 cells reduces lesion-induced rotational behaviour）、Cell．Transpl.，刊行準備中. １５．ラシー・ピー・イー（Lacy，P.E.）、ヘグレ・オー・ディー、ゲラシミディー−バゼオウ・エー（Gerasimidi-Vazeou，A.）、ジェンティル・エフ・ティー（Gentile，F.T.）、ディオン・ケー・イー（Dionne，K.E.）：カプセル化された島の皮下への異種移植による糖尿病のマウスにおける正常血糖の維持（Main tenance of normoglycernia in diabetic mice by subcutaneous xenografts of encapsulated islets）．Science 24:1782. １６．シャープ・ディ・ダブリュー（Scharp，D.W.）、ラシー・ピー・イー、サンチアゴ・ジェイ・ブイ（Santiago，J.V.）、マックカルロー・シー・エス（Mc Cullough，C.S.）ら：最初の９つの１型インシュリン依存患者の島の同種移植の結果（Results of our first nine intraportal islet allografts in type l， insulin-dependent diabetic patients）．Transpl．51:76、1991. １７．ジョーダン・オー（Jordan，O.）およびマーキス・ウェイブル・エフ（Ma rquis Weible F.）、「生物学的適合性を有する光ポリマーのためのヒドロゲル形成のホログラフィー制御（Holographic control of hydrogel formation for biocompatible photopolymer）」、2629:46（1995）. １８．ジョーダン・オーおよびマーキス・ウェイブル・エフ、「拡散ヒドロゲルに適用されるホログラフィー技術による光重合の特徴化（Characterisation of photopolymerisation by holographic technique applied to a diffuse hydoro gel）」、応用光学に寄稿、（1995）１９．ソウヘニー・エー・エス（Sawhney，A.S.）、パットハック・シー・ピー（Pathak C.P.）、およびフベル・ジェイ・エー（Hubbell J.A.)、「界面光重合を介する免疫保護ポリ（エチレングリコール）コーティングによるランゲルハンス島表面の変性（Modification of islet of Langerhans surfaces with immuno protective poly(ethylene glycol)coating via interfacial photopolymerisat ion」、Biotech．Bioeng．44:383-386（1994）. ２０．フベル・ジェイ・エー、米国特許、国際特許第93/16687号、PCT/US93/017 76、1993 ２１．フア・ジェイ・エム（Hua J.M.）、エリックソン・エル・イー（Erickson L.E.）、イーリン・ティ・ワイ（Ylin T.Y.）およびグラスゴー・エル・エー（ Glasgow L.A.）「細胞生存率に対する界面現象および剪断効果の再考（A Review of the Effects of Shear and Interfacial Phenomena on Cell Viability）」、Crit．Rev．Biotech．13:305-328（1993）.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジョーダン，オリヴィエスイス国ＣＨ−1007 ローザンヌアヴェニュドゥティヴォリ 56 (72)発明者ラニエリ，ジョンアメリカ合衆国テキサス 78703 オースティンウールリッジドライヴ 2719 (72)発明者イーヴィッシェー，パトリックスイス国ＣＨ−1095 ルトゥリシュマンドゥプランタス 56 (72)発明者クレメンス，ジャン−フランソワスイス国ＣＨ−3098 ケーニッツランドルフシュトラーセ 59

Claims

【特許請求の範囲】１．製薬粒子または粒子クラスターの表面に染料を付着させ、物質を架橋させるように液体重合性物質の存在下で、染料に放射エネルギーをあて、粒子の表面上に架橋ポリマーのコンフォーマル層を生じせしめることを含んでなる、マイクロカプセル化製薬製剤の製造方法。２．ポリマーが、粒子からの治療成分がマイクロカプセルから出ることを許容しながら、免疫保護層を付与する請求項１に記載の方法。３．製薬製剤が、製薬的な活性物質を産生し分泌する細胞または細胞クラスターを含むも請求項１または２に記載の方法。４．ポリマーが細胞の栄養素を透過可能である請求項３に記載の方法。５．染料が、エネルギー源からの照射を受けると、三重項状態に励起され、架橋を開始させるフリーラジカルが形成される請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。６．染料が、粒子表面に結合可能である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。７．染料が、ＤｉＩ、ＤｉＯ、またはエオシンＮＣＳ、エオシンＹ、フルオレセインＤＨＰＥ、またはエオシンＤＨＰＥであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。８．重合性物質が、適切な周波数の光をつくることのできるレーザーを染料に照射することにより架橋可能なヒドロゲルである請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。９．染料が、液体重合性物質に粒子を接触させ、染料にエネルギーを付与して物質を架橋させる前に粒子の表面に施与される請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。１０．重合性物質が、粒子と同時に染料とも接触せしめられる請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。１１．所望の厚みのコンフォーマルコーティングが物質の周囲に形成されるまで、エネルギーを供給する請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。１２．請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法で得られ得るマイクロカプセル化製薬製剤。１３．粒子状の製薬製剤が、照射された染料の作用により、共有結合的に架橋されたポリマーで、コンフォーマルコーティングされているマイクロカプセル化製薬製剤。１４．ポリマーコーティングが約１０〜２０ｍＭ厚である請求項１３に記載の製剤。１５．ポリマーが、粒子からの治療用成分がマイクロカプセルから出ることを許容しながら、免疫保護層を付与する請求項１３または１４に記載の製剤。１６．粒子状物質が、製薬的な活性物質を産生し分泌する細胞または細胞クラスターを含む請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の製剤。１７．ポリマーが細胞の栄養素を透過可能である請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の製剤。１８．粒子がインシュリン分泌細胞である請求項１６または１７に記載の製剤。１９．医薬用途に使用される請求項１２ないし１８のいずれか１項に記載のマイクロカプセル化製薬製剤。２０．糖尿病治療用の医薬の調製におけるインシュリン分泌細胞を含む、マイクロカプセル化製薬製剤の使用において、細胞が、照射染料の作用により、共有結合的に架橋されるポリマーで、コンフォーマルコーティングされている使用。２１．インシュリン分泌細胞がβ細胞である請求項２０に記載の使用。２２．請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法で得られ得る粒子を含む、グルコースの治療的調節のための移植体。