JPH11509833A - 薬剤のマイクロカプセル化法 - Google Patents
薬剤のマイクロカプセル化法Info
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Abstract
(57)【要約】
製薬粒子または粒子クラスターの表面に染料を付着させ、物質を架橋させるように液体重合性物質の存在下で染料に放射エネルギーをあて、粒子の表面上に、架橋ポリマーのコンフォーマル層を生じせしめることを含む、マイクロカプセル化製薬製剤の製造方法を開示する。好ましくは、ポリマーは、治療成分がマイクロカプセルから出ることを許容しながら、粒子の周囲に免疫保護層を付与する。マイクロカプセル化製薬製剤とその医療用途、特に、インシュリン分泌細胞をカプセル化することによる糖尿病の治療への使用について開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
薬剤のマイクロカプセル化法 発明の分野
この発明は、特に製薬目的のマイクロカプセル化法に関する。この発明は、特
に、例えばインシュリンのような治療用物質を産生および分泌する免疫隔離(im
munoisolated)細胞を含んでなる医薬製剤の調製並びにこれら製剤の医療用途に
利用できる。発明の背景
細胞の免疫隔離(immunoisolation)とは、免疫系による拒絶反応を回避する
ために、移植前に半透膜バリア内に細胞または細胞クラスターを配することを含
む手順のことである。これは、自然に、または遺伝子工学的手法を介して、生物
活性を有する物質を分泌する全ての種類の細胞に応用することができる。実際、
主たる研究が、インシュリン分泌細胞についてなされている。カプセル化膜の分
子量(Mw)切断は、補体系の溶菌因子および免疫グロブリンの内部拡散を防止
するが、より小さい分子、例えばグルコースやインシュリンの通過は許容するよ
うに、カプセル化によりコントロールすることができる。よって、バリアは、β
細胞が血中グルコースの変化に生理的に応答することを許容するが、免疫系の構
成要素との如何なる接触も防止する。このような状況下では、移植された島が、
宿主の免疫系から隔離されるので、異種組織が使用されて、供給問題が解消され
、拒絶または病気の再発を防止するための免疫抑制は必要とされない。
島組織または膵臓フラグメントを封入する拡散チャンバーを使用して、免疫隔
離の原理を探究する初期の研究は、ほとんど成功していない(1、2でレビュー
されている)。高血圧症の一時的改善は達成されているが、利用可能な膜物質は
、迅速な刺激/インシュリンの分泌輸送を可能にするものではなかった(3)。
さらに近年、体外または血管内のインシュリン分泌デバイスとして、半透性チャ
ンバー内に封入した同種または異種の島と共に、中空のキャピラリ繊維を使用す
る
ことにより、齧歯動物(4、5)、イヌ(6、7)、およびサル(8)における
糖尿病を、短期間逆転させることに成功している。体外または血管内でのアプロ
ーチ法は、カプセル化技術の安全性を証明するために必須ではあるが、ヒト、特
に幼年の子供への適用には適していない。しかしながら、拡散チャンバー−ヒト
への応用への選択方法−は、コンシステンシーの問題が今だ障害となっている(
9)。
異なる工学技術に基づく、いくつかのポリマーカプセル製造技術が開発されて
いる。カプセル化法は、最も一般的には、それらの幾何学的な外観、すなわちマ
イクロ−またはマクロ−カプセルにより分類される。マクロ−カプセル化法にお
いて、細胞または細胞クラスターは、選択性透過中空繊維、または平坦なシート
状膜内に包含される。それらは、熱可塑性物質から製造されるため、これらのカ
プセルは、機械的に安定で回復するのが比較的容易である。数人の研究者は、領
歯動物の糖尿病モデルにおける島細胞の移植に熱可塑性物質をベースとした中空
繊維カプセルを成功裡に使用できたことを報告している。本発明者は、先に、適
切な表面ミクロ幾何特性および化学組成を付与することで、移植された熱可塑性
物質ベースのマクロカプセルの周囲に形成される組織反応が、齧歯動物の脳(1
0)および腹膜腔(11、12)の双方において最小であることを報告した。ま
た、種(13)に亘って移植された場合における、マクロカプセル化されたPC
12細胞、ドーパミン作用性の細胞系の長期間の脳生存を報告し、これらの移植
は、ラットおよび霊長類(14)の実験的パーキンソン病モデルにおいて、有意
に改善されていることを報告した。同様のカプセル化系を使用し、レイシー(La
cy)と共同研究者は、皮下マクロカプセル化島細胞を移植されたラットにおける
、ストレプトゾトシン誘発性高血糖症の矯正を報告している(15)。さらに最
近、シャープ(Scharp)と共同研究者は、同じアクリルベースのマクロカプセル
化系を使用して、糖尿病患者における、カプセル化されたヒトの島が、2週間生
存していたことを報告している。同様のアクリル系を使用し、本発明者は、最近
では、末期癌を病んでいるヒトのクモ膜下腔内空間における、ウシ属クロマチン
細胞の移植に成功したことを報告した。外植デバイスは、カプセル並びに生存能
力のあるクロマフィン細胞に対する宿主反応が存在しないことを示していた。回
収する
と、カプセルは、移植に先立ってインビトロで測定されたものと同等のカテコー
ルアミンを放出していた。機械的に安定で、生物学的適合性があるが、中空の繊
維をベースとした系は、移植された細胞が適切に生存できるように、低密度での
充填が必要である。この物質系をスケールアップしてヒトの糖尿病を矯正するに
は、非現実的にも50m長の装置を必要とする。この技術の他の制約は、カプセ
ル璧の厚みと、グルコースの拡散動力学へのその潜在的影響である。拡散バリア
は、過度のインシュリン分泌により、短期間の低血糖症を引き起こす可能性があ
る。
半透性の中空繊維を使用したマイクロカプセル化法は、ヒトの内分泌組織の異
種間移植に対して実行可能な技術であることを本発明者は立証した。また、この
技術は、島の移植およびカプセル化に実験的に使用されたが、効果的な包含(パ
ッケージング)には適切でない。カプセルの壁厚は、通常、最低100μmであ
り、中空の繊維内で細胞は典型的には500−600μmの直径のヒドロゲルマ
トリックスコア内に固定されている。これにより、宿主と移植細胞との間には、
数百μmの拡散距離が生じ、拡散動力学に悪影響を及ぼす。この拡散バリアは、
血中のグルコースレベルの検出において、著しい「ラグ」タイムを引き起こし、
インシュリン分泌において相シフトを引き起こし、よって、血中グルコースレベ
ルの不規則な調節を引き起こす。また、繊維技術の幾何的制約により、充填密度
が非常に乏しく、移植された島のカプセル化繊維は、数メートル必要となるかも
しれない。
これらの問題の解決法の一つは、マイクロカプセル化技術の使用であるかも知
れない。マイクロカプセル化法において、細胞クラスターは、500−600μ
mのヒドロゲルマクロスフィア内に固定される。典型的には、半透膜はマイクロ
スフェア表面で形成される。種々の化学系が使用されている。最も一般的な形態
では、カプセル膜は、2つの弱い多価電解質、典型的には酸性多糖類、例えばア
ルギン酸、およびカチオン性のポリアミノ酸、例えばポリリシンの間でのイオン
結合または水素結合により形成される。実際には、細胞の包括は、多価の対イオ
ンにさらされることで誘発される荷電多価電解質のゲル化により得られる。つい
で、対−多価電解質が、細胞固定化マトリックスに、界面的に吸着する。マイク
ロカプセルは拡散のための理想的な形状を有する。インビトロのテストでは、マ
イクロカプセル化された島からのインシュリンの放出は、マイクロカプセル化さ
れていない細胞からのものと同等であることが示された。しかしながら、それら
は、特に多価電解質を使用した場合に、機械的にもろい。また、それらは、結合
がイオン結合のみに依存する場合は、化字的にも不安定で、ヒト以外の霊長類の
脳に移植して数週間でマイクロカプセルは破裂に至る。このようなマイクロカプ
セルの腹膜内への移植は、齧歯動物の実験的糖尿病モデル、さらに最近では、ヒ
トにおいて、糖尿病を逆転させることが報告されている。しかしながら、系の生
物学的適合性に乏しく、若い糖尿病患者への使用については問題がある。安定性
および生物学的適合性の点を修正しようとして、セフトン(Sefton)とその共同
研究者は、有機ポリマー溶液の島クラスター周囲への沈殿に基づいたマイクロカ
プセルを開発している。溶媒の毒性と透過性特性の均衡の問題は、なおこのアプ
ローチ法の障害となっている。一般に、ヒトにおけるマイクロカプセル系の使用
は、大容量の島への均一な薄膜コーティングを可能にするためのプロセスの制約
および長期間に亘る安定性の問題により、制限されている。発明の概要
本発明の一つの側面は、マイクロカプセル化された製薬製剤の製造方法を提供
することにあり、該方法は、製薬粒子または粒子クラスター(ここでは、一般的
に「粒子」と称する)の表面に染料を付着させ、溶液重合(または重合性)物質
の存在下で染料に放射エネルギーをあててその物質を架橋させ、粒子の表面上に
架橋ポリマーのコンフォーマル(相似)層を生じせしめることを含んでなる。望
ましくは、染料は、前記表面(特に、島表面または細胞膜)に特異的に結合する
。一般的には、染料は蛍光染料である。
架橋のメカニズムは、レーザーで誘発させて三重項状態に染料の励起状態を生
じさせ、適切な電子供与体からフリーラジカルを生じさせることを含んでいる。
これらのフリーラジカルによりポリマーの架橋が開始させられ、ヒドロゲル調製
物になる。
「製薬」粒子は、実際、直接的に薬剤である必要はなく、例えば製薬的な活性
物質を産生し分泌する細胞または細胞クラスターであり得る。
ポリマーは、粒子からの治療成分がマイクロカプセルから出ることを許容しな
がら、免疫−保護層、すなわち体の免疫系が免疫応答を粒子に付与するのを防止
するものを好適には提供する。これは特に、粒子が、治療用物質、例えばタンパ
ク質を産生および分泌する細胞を含んでいる場合に特に適切であり、ポリマーは
治療用物質と細胞の栄養素に対して透過可能であるが、もちろん、細胞自体は透
過できない。ポリマーは、好ましくは、適切なエネルギー源、例えばレーザーを
、染料に照射することにより架橋させられ得るヒドロゲルであるか、または架橋
後のヒドロゲルになる。典型的には、架橋する前の物質が、ポリマー分子を、例
えば400g/mol−18500g/mol含有する。
染料は、液状のポリマー(またはポリマー形成)物質にこのように処理された
細胞を接触させ、染料を励起してポリマーを架橋させる前に、着色または他の手
段で、粒子表面に塗布される。膜内に特異的に含有させた染料の使用により、拡
散現象が制限され、よって、コーティングの厚みが改善され、光毒性が減少する
。別の方法としては、物質を粒子に接触させ、同時に染料に接触させてもよい。
例えば、物質の分子(例えば、鎖またはミセル)が染料で標識され、粒子と結合
可能になる。例えば、粒子が細胞である場合は、物質は、例えば両親媒性の相互
作用、タンパク質結合、または他の化学的手段、更にまたレセプター−リガンド
もしくは抗体−抗原相互作用により、細胞膜を結合することができる。
ポリマーは、適切なエネルギー源、例えば適切な周波数のレーザー光で染料を
励起させることにより架橋される。粒子物質および重合(重合形成)溶液と共に
、染料は、レーザー光を等しく分布させて均一な重合を可能にするレーザー一体
化チャンバー内に適切に配される。所望の厚みのコンフォマルコーティングが物
質の周りに形成されるまで、エネルギーが供給される。「コンフォーマル」コー
テイングとは、物質、例えば細胞または細胞クラスターの形状に一致する薄層コ
ーティングを意味する。
本発明の更なる側面は、上述した方法で得ることができるマイクロカプセル化
製薬製剤を提供することにある。
本発明の更なる側面は、粒子状の製薬用物質が、照射染料の作用により、共有
結合的に架橋したポリマーで、相似にコーティングされた製薬製剤を提供するこ
とにある。
本発明の更なる側面は、医療用途に、上述したマイクロカプセル化製薬製剤を
提供することにある。
本発明の更なる側面は、細胞が放射染料の作用で共有的に架橋されたポリマー
でコンフォーム的に被覆された糖尿病の治療薬の調製におけるインスリン分泌細
胞を含んでなるマイクロカプセル化製薬製剤の使用を提供することにある。
本発明の更なる側面は、上述した方法で得られるマイクロカプセル化粒子を含
有する、グルコースの治療的調節のための移植組織を提供することにある。詳細な記載
カプセル化技術における本進歩は、先に記載したマイクロ−またはマクロカプ
セル化技術の両方に利益をもたらす。共有結合的に架橋したヒドロゲルの機械的
安定性が、マイクロカプセル化ヒドロゲルの生物学的適合性および大きさと結合
させられている。約10〜20μm厚の、半永久的に架橋したヒドロゲル皮で、
多量の細胞クラスターをそれぞれ被覆する、カスタムデザインのレーザー重合法
が開発された。薄く均一な免疫隔離膜は、「コンフォーマル・コーティング」と
称される。この方法により、β細胞までのグルコース拡散距離を最短とし、細胞
移植のための充填係数を最大とすることができる。500,000の島等価物が
、ヒトの糖尿病を逆転させるために必要であると仮定すると、2mlのコンフォ
ーマルコーティングされた島が、グルコースの治療的調節に対して必要であると
仮定することができる。
コンフォーマルコートカプセル化の方法論を図1に示す。まず、島を、膜の蛍
光膜染色染料からなる溶液に懸濁させる。膜結合染料は、次の重合反応のための
電子供与体となる。染色後、島を洗浄し、再度懸濁させ、適切な周波数のレーザ
ーでの染料の励起後、島の周囲で素早く重合してヒドロゲルとなる。ついで、カ
スタムデザインのレーザー一体化チャンバー内に島を配し、所望の厚みを有する
コンフォーマルコーティングが、懸濁した島の周囲に形成されるまで、均一にレ
ーザー光を照射して、確実に均一的に重合させる(図2)。
予備実験において、次のコンフォーマル・コーティングのプロセスパラメータ
を研究した:a)細胞膜を特異的に染色するための染料の選択
2種類の染料が考えられる。
(i)自由に拡散する染料(例えば、エオシンY、エオシンB、フルオレセイン
、ローダミン)。
(ii)細胞膜に特異的に混入可能な染料[例えば、ディル(Dil)、D10、
イソチオシアン酸エオシン、フルオレセイン、およびエオシン誘導リン脂質]。
(i)自由に拡散する染料:
1mMのエオシンY溶液を使用して、均質な含浸物が得られた。含浸時間は1
〜10分で、続いて1または2回洗浄された。エオシンの吸収を可視化するため
に、共焦蛍光顕微鏡検査法を、含浸したラットのランゲルハンス島およびβ細胞
系のクラスターに使用した。1mM溶液での5分間の染色後、エオオシンYが細
胞質内部に吸収されたことが示された。
(ii)膜を染色する染料:
拡散の問題を低減させるために、我々は、細胞膜と結合可能ないくつかの染料
を選択した。最初の2つは、ジアルキルカルボシアニン族に属する、カチオン性
の膜マーカーである、DiIとDiOである。両親媒性のマーカーは、2重の脂
質膜と相互作用する。また、膜タンパク質に結合することが知られているエオシ
ン−5−イソチオシアナート(エオシンNCS)もテストされた。また、フルオ
レセイン誘導リン脂質(FLPE)が、マイクロカプセル化のための有望な染料
として出現した。ラットのランゲルハンス島およびβ細胞系のクラスターは、上
述した染料で含浸させられた。共焦蛍光顕微鏡検査法により、膜表面への染料の
特異的永久的吸着を示す蛍光層が分かった。FLPE含浸パラメータが最適化さ
れた。含浸時間を5分以上、染料濃度を250μM以上とすると、染料の混入を
著しくは増加させない。最良の結果は4℃の温度で得られた。
特異的染色を用いたこれらの有望な結果は、新しい応用への道を開いた。コー
ティング厚を制御する他の方法は、染料でラベルされ、細胞膜に結合可能な一つ
の末端基を有するポリマー鎖またはミセルの使用である。この結合は両親媒性相
互作用、タンパク質結合(イソチオシアナート基を有するようなもの)、または
他の化学的方法により、達成され得る。染料の吸収波長はレーザー源に適合され
なければならず、アルゴンレーザー用にはエオシンまたはフルオレセインである
。鎖の長さにより、コーティング厚が制御され、高分子量のポリマーが膜の浸透
を妨げ、よって起こりうる光毒性作用が除去される。例えば、親油性または荷電
末端基を持つ、エオシンでラベルされたデキストリンは、ポリマーによるコンフ
ォーマルコーティングの成長のための必要性を満たしている。
特異的染料結合を達成させるための他の方法としては、島に特異的な抗原にエ
オシンをカップリングすることによる、免疫化学の使用がある。特異性および膜
透過性の欠如がまた島のコンフォーマルコーティングを可能とする。(b)感光性ポリマーの開発
β細胞をコンフォーマルコートするために使用されるポリマー系は、生物学的
整合性のあるポリエチレングリコール(PEG)をベースとしたヒドロゲルであ
る。それは3つの要素:ポリ(エチレングリコール−400−ジアクリラート)
(PEG−DA)またはポリ(エチレングリコール−18−500−マルチアク
リラート)(PEG−MA)の水溶液、反応開始剤、トリエタノールアミン(T
EOA)、および光増感剤として作用する適切な染料(エオシンY、エオシンN
CS、FLPE等)からなる。
薄く均一なコーティングを形成させ、免疫保護膜としての適切な機能と、プロ
セシングおよび移植に対する機械的耐久性の双方を確実に付与するために、3つ
のプロセスパラメータを同時に制御する必要がある。
これらのパラメータは、染料濃度、重合の反応開始剤の量、およびレーザー強
度であり、これら全て反応時間の関数として最適化される。反応時間は、PEG
システム用の光学ホログラフィー技術を使用して、実験的に決定された17、18。
石英キュベットに収容されたPEG感光性ポリマーは、2分割されたアルゴンレ
ー
ザー光線(波長514nm)により生じる干渉パターンにさらされ、よって、感
光性ポリマー中に格子を描く。回析効率を測定することにより、この格子の成長
を探査するため、低パワーのHe−Neレーザーが使用される。重合時間は最大
回析強度が90%に達するのに必要な時間として定義される。
1W/cm2の最大レーザー強度で、素早い、また完全な重合反応を起こさせ
るのに必要な染料濃度が、最初に決定された。使用した90mMのTEOA濃度
は、反応速度を制限する要因ではなかった。図3には、10μm厚の膜とするた
めの、エオシンY濃度の関数として重合時間が示されてる。最適濃度は、膜を通
過する70%の光吸収に相当することが示されている。染料濃度がより高い11と
、染料の漂白が不完全で、不均質な重合になる。これらの測定から、1mM濃度
の染料が、細胞のマイクロカプセル化に使用された。
最適化された染料濃度と、1W/cm2の照射強度を使用し、重合の完了に必
要な反応開始剤TEOAの最小濃度を決定した。このようにすると、消費されな
いモノマーTEOAの最小量が重合後も残る。少なくとも90mMの濃度が、反
応速度を最大にするために必要であった。
光重合に必要な照射時間は、最適化された反応パラメータを使用して決定した
。図5には、重合時間とレーザー強度との関係が示されている。例えば、1W/
cm2のレーザー強度で13秒が、重合を完了させるのに必要であった。
低濃度(生理用培地に10%(w/v)濃度)のPEG−DAを使用した結果
、反応速度は非常に遅かった(図6)。さらに、得られたゲルは機械的に脆く、
5%(w/v)に濃縮されたアガロールゲルよりも、水分透過性が高いことが示
された(図7)。この測定に基づき、20%〜30%濃度のPEGが使用された
。
光化学の観点から、セクションa)に挙げた染料は、かなり特殊であった。ホ
ログラフィー技術による光重合速度の測定より、照射時間はDiOで17分間、
DiIで10分間であった(図8参照)。エオシンNCSは、エオシンYよりも
1.4倍遅かった。この挙動は、エオシンの高い三重項転換効率で、高反応量収
量を得ることができることにより、説明され得る。FLPEは、エオシンYに必
要な時間の2倍で光ポリマー架橋を誘発する。また、他の染料、例えばエシンB
、ローズベンガル(rose bengal)およびスチルベンが、有効な光増感剤である
こと
が証明された。c)生物学的細胞クラスターのカプセル化
(i)自由に拡散する染料でのカプセル化:
ランゲルハンス島のマイクロカプセル化は先に報告されている19、20。カプセ
ル化はエオシンY光増感剤を使用して評価された。初期細胞(ラットのランゲル
ハンス島)と、遺伝工学的に処理されたマウスのβ細胞系(βTCtet)とは成
功裡にカプセル化された(図9(a)および(b)参照)。90mMのTEOA
を含有する30%(w/v)のPEG−DA溶液を使用し、島を5分間、1mM
のエオシンY生理的溶液に含浸させた。照射強度は20秒間で、1W/cm2で
あった。50μmから20μmまでのコーティング厚が得られた。コーティング
厚は、照射時間とポリマー濃度の両方で制御することができることが分かった。
照射時間をより長くすればする程、染料の拡散により、より厚くなる結果となり
、ポリマー濃度を高くすればする程、粘度の増大により、より薄くなる結果とな
った。しかしながら、2つの主な欠点が生じた:第1に、細胞内部への染料の取
込みにより、フリーラジカルの光誘発のため毒性を有するようになった。第2に
、沈降や対流が、島の周囲に不均質な流れを生じさせ、結果として不規則なコー
ティング(尾状物が形成される)となり、ポリマー溶液が塊状に重合してしまう
おそれもある。これらの問題を克服するために、特定の膜染色用染料を、マイク
ロカプセル化用に実証した。
(ii)膜染色用染料でのカプセル化:
ラットのランゲルハンス島の染色が、1mMのエオシンNCS溶液で行われた
。動力学的に低い状態で混入されたため、含浸には長時間が必要であった(2時
間まで)。塩水で2回洗浄し、PEG−DAの30%(w/v)ポリマー溶液に
再懸濁させ後、島に、100mW〜1W/cm2の範囲内の強度で、10〜30
秒間照射した。10〜20ミクロンの厚みのコンフォーマル・コーティングが得
られた。一つの懸濁液で、島の約80%が、島の全周囲に可視できるコーティン
グでカプセル化された(図9(c)参照)。比較カプセル化実験は、エオシンY
よりも膜結合エオシンNCS染料で良好な結果を提供し、「尾状物効果(tail e
ff
ect)」がなく、より薄いコンフォーマル・コーティングが得られた。また、島
溶液の塊状重合を誘発する傾向も減少した。これらのカプセル化された島を培養
保存したところ、それらは、光重合工程を経ても生存していることが示された。
完全な島機能性を評価する更なる研究が必要とされている。
これらの実験で、生物学的粒子のマイクロカプセルに、膜結合染料を使用する
と、コーティング厚を減少させ、よって、より素早い放出の動力学特性を得るこ
とが可能になることが示された。
新規の染料を目下調査中である。フルオレセインDHPE(FLPE)のよう
なフルオレセイン誘導リン脂質が、細胞膜に特異的に結合し、高効率で重合を誘
発させることが分かった。また、エオシンDHPEを使用することもでき、その
高い三重項状態効率により、効率的な光重合が可能となる。d)工程の毒性
マイクロカプセル化工程中、生物学的粒子は、生物学的媒体から離れた状態に
置かれている。化学的、熱的、機械的、または光化学的性質のダメージにより、
細胞の生存力または機能性が制限される可能性がある。細胞の生存力は生体蛍光
染色法(フルオレセイン−ジアセタート(FDA)またはカルセインAM分析法
)により測定され、機能性はグルコース刺激下において、インシュリン分泌の動
的測定により評価される。
化学的毒性評価は、プレポリマー溶液(30%(w/v)のPEG−DAおよ
びTEOAを90mM)におけるランゲルハンス島のインキュベートによりなさ
れた。島は、4分間のインキュベートまでは、100%の生存率を示した。マイ
クロカプセル化工程を30秒間続けた場合、プレポリマー溶液から、化学的に誘
発されるダメージはないことが予想される。また、染料の含浸における毒性も実
証された。上述した染色条件において、エオシンYおよびFLPEに対しては、
何の化学的毒性も測定されなかった。しかしながら、エオシンNCSは、1mM
溶液における10分の含浸後、インシュリンの分泌を抑制することが示された。
細胞クラスターは、機械的ストレスに対して、極度に敏感である。5N/m2
の剪断応力に10秒間さらされた後の細胞クラスターの非分離化が報告されてい
る。
この種の剪断応力は、ノズルを通しての微細液滴の押出のような他のマイクロカ
プセル化工程において、即座に得られる21。 界面重合法においては、ほどんど
剪断応力は生じない。我々のカプセル化実験中には細胞の非分離化は見られなか
った。
重合熱またはレーザー光の吸収により引き起こされる細胞クラスターの加熱が
、細胞組織にダメージを与え得る。コンピュータによる計算によれば、用いた光
重合条件(例えば、1W/cm2以下の強度、1mMの染料濃度、10〜30秒
間の重合)において、最大、1.4℃の温度上昇が予期されることが示されてい
る。その結果、レーザ誘発加熱からはダメージは予期されない。
光毒性効果は、毒性フリーラジカルの発生による染料の脱励起化の結果生じ得
る。この効果の細胞生存性に対する評価は図10に示されている。1mMのエオ
シンY溶液を含浸させたラットのランゲルハンス島が、種々の強度および時間の
レーザー照射にされされ、1日後に生存率が測定された。照射時間が10秒で、
レーザー強度が50mW/cm2から1W/cm2の範囲内にある場合は、100
%の生存率が測定された。照射時間を長くすると、インシュリンの分泌の減少と
ともに、生存率の低下に至る。よって、30秒未満の照射時間がマイクロカプセ
ル化法には用いられなければならない。
FLPE染色され、レーザーにさらされたラットの島の生存率を測定した(図
11を参照)。4℃で5分間、200μMのFLPE溶液で染色した後、照射強
度が50mW/cm2では生存率は100%であり、1W/cm2では70%であ
った。これらの結果より、FLPE染料がマイクロカプセル化に対して有望な光
開始剤になる。
また、カプセル化されたラットのランゲルハンス島の生存率も評価された。1
mM濃度のエオシンYを使用し、1W/cm2で10秒の照射で30%のPEG
−DAでの膜をカプセル化後、70%±10%の生存率が測定された(8つのサ
ンプルの平均±標準偏差)。この後者の結果は、全マイクロカプセル化工程中に
、細胞膜が少しダメージを受けることを意味している。e)ベンゾフェノン化学に基づく光活性化ヒドロゲルの開発
ベンゾフェノン化学(BP)に基づく、ヘテロ二官能性リンカーを使用する、
第2の物質のカプセル化技術が開発される。この化学技術の利点は、現実的に如
何なるヒドロゲル物質でも効果的に架橋させることができることにある。BPの
化学的性質は、UV領域(350nm)近傍で光活性化され、C−H結合と容易
に反応することにある。予備実験において、我々は、島細胞が、数分間、100
mW/cm2の照射に耐えうることを見いだした。BPの化学的性質は、一端が
特定の化学官能基と熱化学的に反応し、BPの化学的性質を有する他端が、つい
で光活性化して、架橋反応を開始するようにカスタムデザインすることができる
。また、BPの化学的性質は、水性環境内で効果的に利用される。ベルン大学の
エイチ・シグリスト(H Sigrist)博士と共同して、我々の研究室では、光架橋
に利用できるBPユニットを他端に持つアルブミン上に熱化学的に変性可能な二
官能性結合体を開発した。アルブミン−BPは、β細胞クラスターの周囲をポリ
マー皮でコンフォーマルコーティングするための理想的な系であることが証明さ
れている。これは、まずβ細胞上にアルブミン−BPを吸着し、ついで、ヒドロ
ゲル溶液中でβ細胞を光活性化させることにより達成され得る。このようにして
、細胞膜上に吸着されたアルブミン−BPは、同時にβ細胞クラスターの周囲の
ヒドロゲル皮を架橋しながら直ちに固定される。先に述べた界面重合反応と比較
して、アルブミン−BPは、多量に生産することができ、β細胞系上で試みるこ
とができる。
また、BP化学でのリン脂質誘導体、例えばホスファチジルエタノールアミン
(PE)の変性も評価される。もしこれが実行されるならば、脂質は膜内に効果
的に取り入れられ、ついで、BPの化学的性質が活性化され、島凝集体の周囲の
任意のヒドロゲル系が光重合する。変性アルブミンと比較して、染料を使用する
利点は、吸着アルブミン系に対して、膜内に染料が固定され、近いことにある。
膜染料に付着したBP活性により形成されたポリマー「皮」は、より薄く、しっ
かりと結合したヒドロゲル膜を形成し得る。
いくつかのヒドロゲルをベースとした系が、BPの化学的性質での架橋に対し
て、実験的にテストされる。これらには、純粋なPEG、ポリビニルアルコール
、およびアガロースが含まれる。これらの親水系は最も低いタンパク質吸着作用
を
示し、よって任意の有意な細胞付着を防止するので、高い生物学的適合性を有す
ることが知られている。これらの架橋ヒドロゲルは、移植の研究に対して現在ま
で使用されている多価電解質に比べて、機械的および化学的安定性が改善されて
いるので、特に興味深いものであることが分かる。参考文献
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フロントページの続き
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Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
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スイス国 CH−1007 ローザンヌ アヴ
ェニュ ドゥ ティヴォリ 56
(72)発明者 ラニエリ,ジョン
アメリカ合衆国 テキサス 78703 オー
スティン ウールリッジ ドライヴ 2719
(72)発明者 イーヴィッシェー,パトリック
スイス国 CH−1095 ルトゥリ シュマ
ン ドゥ プランタス 56
(72)発明者 クレメンス,ジャン−フランソワ
スイス国 CH−3098 ケーニッツ ラン
ドルフシュトラーセ 59
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 製薬粒子または粒子クラスターの表面に染料を付着させ、物質を架橋させ るように液体重合性物質の存在下で、染料に放射エネルギーをあて、粒子の表面 上に架橋ポリマーのコンフォーマル層を生じせしめることを含んでなる、マイク ロカプセル化製薬製剤の製造方法。 2. ポリマーが、粒子からの治療成分がマイクロカプセルから出ることを許容 しながら、免疫保護層を付与する請求項1に記載の方法。 3. 製薬製剤が、製薬的な活性物質を産生し分泌する細胞または細胞クラスタ ーを含むも請求項1または2に記載の方法。 4. ポリマーが細胞の栄養素を透過可能である請求項3に記載の方法。 5. 染料が、エネルギー源からの照射を受けると、三重項状態に励起され、架 橋を開始させるフリーラジカルが形成される請求項1ないし4のいずれか1項に 記載の方法。 6. 染料が、粒子表面に結合可能である請求項1ないし5のいずれか1項に記 載の方法。 7. 染料が、DiI、DiO、またはエオシンNCS、エオシンY、 フルオ レセインDHPE、またはエオシンDHPEであることを特徴とする請求項1な いし6のいずれか1項に記載の方法。 8. 重合性物質が、適切な周波数の光をつくることのできるレーザーを染料に 照射することにより架橋可能なヒドロゲルである請求項1ないし7のいずれか1 項に記載の方法。 9. 染料が、液体重合性物質に粒子を接触させ、染料にエネルギーを付与して 物質を架橋させる前に粒子の表面に施与される請求項1ないし8のいずれか1項 に記載の方法。 10. 重合性物質が、粒子と同時に染料とも接触せしめられる請求項1ないし 8のいずれか1項に記載の方法。 11. 所望の厚みのコンフォーマルコーティングが物質の周囲に形成されるま で、エネルギーを供給する請求項1ないし10のいずれか1項に記載の方法。 12. 請求項1ないし11のいずれか1項に記載の方法で得られ得るマイクロ カプセル化製薬製剤。 13. 粒子状の製薬製剤が、照射された染料の作用により、共有結合的に架橋 されたポリマーで、コンフォーマルコーティングされているマイクロカプセル化 製薬製剤。 14. ポリマーコーティングが約10〜20mM厚である請求項13に記載の 製剤。 15. ポリマーが、粒子からの治療用成分がマイクロカプセルから出ることを 許容しながら、免疫保護層を付与する請求項13または14に記載の製剤。 16. 粒子状物質が、製薬的な活性物質を産生し分泌する細胞または細胞クラ スターを含む請求項13ないし15のいずれか1項に記載の製剤。 17. ポリマーが細胞の栄養素を透過可能である請求項13ないし16のいず れか1項に記載の製剤。 18. 粒子がインシュリン分泌細胞である請求項16または17に記載の製剤 。 19. 医薬用途に使用される請求項12ないし18のいずれか1項に記載のマ イクロカプセル化製薬製剤。 20. 糖尿病治療用の医薬の調製におけるインシュリン分泌細胞を含む、マイ クロカプセル化製薬製剤の使用において、 細胞が、照射染料の作用により、共有結合的に架橋されるポリマーで、コンフ ォーマルコーティングされている使用。 21. インシュリン分泌細胞がβ細胞である請求項20に記載の使用。 22. 請求項1ないし11のいずれか1項に記載の方法で得られ得る粒子を含 む、グルコースの治療的調節のための移植体。
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