KR20190097055A - 생물학적 표면의 컨포멀 코팅 - Google Patents

생물학적 표면의 컨포멀 코팅 Download PDF

Info

Publication number
KR20190097055A
KR20190097055A KR1020197017864A KR20197017864A KR20190097055A KR 20190097055 A KR20190097055 A KR 20190097055A KR 1020197017864 A KR1020197017864 A KR 1020197017864A KR 20197017864 A KR20197017864 A KR 20197017864A KR 20190097055 A KR20190097055 A KR 20190097055A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
layer
polymer
arm
cells
peg
Prior art date
Application number
KR1020197017864A
Other languages
English (en)
Inventor
벤카트 알. 가리가파티
테츠야 마추라
Original Assignee
밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 filed Critical 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드
Publication of KR20190097055A publication Critical patent/KR20190097055A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/16—Macromolecular materials obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/022—Artificial gland structures using bioreactors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/606—Coatings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2420/00—Materials or methods for coatings medical devices
    • A61L2420/02—Methods for coating medical devices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

본 발명은 특히, 초-박형 컨포멀 코팅된 생물학적 표면, 예컨대 살아 있는 세포, 세포 클러스터, 조직, 기관, 및 하이브리드 합성 기관, 및 이의 제조 방법을 제공하며, 이는 예를 들어, 생물학적 표면을 손상시키기 않거나 또는 상당하게 변형시키지 않는 조건 하에 클릭 반응성 수용성 중합체를 이용한다. 일부 구현예에서, 코팅된 생물학적 표면은 그것을 필요로 하는 대상체에의 전달에 적합하다.

Description

생물학적 표면의 컨포멀 코팅
선행 출원
본 출원은 하기 특허의 이익을 주장한다: 미국 가특허출원 번호 62/433,449, 2016년 12월 13일에 출원됨. 전술한 출원의 전체 교시는 본원에 참조로 편입되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 반투과성 박막 표면 - 컨포멀 코팅된 생물학적 표면을 갖는 생물학적 표면 (예를 들어, 세포, 세포 클러스터, 조직, 기관, 및 하이브리드 합성 기관) 및 관련된 이의 제조 방법에 관한 것이다.
인슐린-의존적 당뇨병을 치료하기 위한 세포 기반 요법, 예컨대 췌도 이식은 기저 숙주 면역계 활성으로 인하여 기저 숙주 면역계 활성으로 인하여 적어도 부분적으로 제한적이다. 숙주 면역계로부터 이식된 세포를 분리하기 위한 기존의 배리어 기반 방법은 제한된 성공을 이루었다. 살아 있는 세포에 적용된 미세캡슐화 방법은 일부 심각한 단점, 예컨대 마이크로캡슐 환경 내의 세포/클러스터의 변화된 임의의 분포 및 그것의 크기 차이로 인한 영양소 및 산소 확산의 제한을 가진다. 이러한 문제점은 일반적으로 세포의 기능 및 장수를 위협한다. 하이드로겔 컨포멀 코팅은 종래의 미세캡슐화에 일반적으로 관여된 문제점을 극복할 수 있다. -기존 방식으로 충족되지 않는- 컨포멀 코팅의 일부의 이론적 장점은 세포에의 우수한 영양소 및 산소 공급을 포함하고, 수명을 연장하고, 적은 용적에 높은 세포 용량을 장입하는 기회 및 약물 분비 세포 작용성을 개선한다. 컨포멀 코팅에 대한 다수의 장점에도 불구하고, 살아 있는 세포에 적용가능한 적합한 방법이 없으며, 컨포멀 코팅을 언급한 기존의 방법은 일반적으로 매우 두껍고, 미세캡슐화의 수많은 단점을 공유한다. 또한, 기존의 방법 예컨대 2단계 시스템, 에멀젼-기반 방법 및 라디칼/광개시 방법, 미세-유체 방법 및 액체/액체 계면 방법은 하기와 같다: 1) 살아 있는 세포에 대해 유해한 효과를 변형하고 생성하며, 2) 대개 50 내지 75 마이크론 초과의 두꺼운 코팅을 형성하고, 3) 재현가능성 및 확장가능성의 문제를 겪는다. 따라서, -실질적인 변형 또는 손상 없이- 컨포멀 코팅을 갖는 생물학적 표면 및 바람직하게는 생리적 조건 하에 일어날 수 있는 이의 관련된 제조 방법으로서, 생리적 조건 하에 일어날 수 있고, 재현가능성이고, 확장가능성이고, 우수한 결과를 전달하는 생물학적 표면 및 이의 관련된 제조 방법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 특히, -실질적인 변형 또는 손상 없이- 실제 컨포멀 코팅을 갖는 생물학적 표면 및 관련된 이의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 생리적 조건 하에 일어날 수 있고, 재현가능하고, 확장가능하며, 우수한 결과를 전달한다.
본 발명에 의해 제공된 조성물은 예를 들어 이황화 결합을 해리시키거나, 또는 변형시키는 작용성 카복실레이트, 아민, 또는 하이드록실기를 변형시키거나 또는 ((예를 들어, 광활성화를 요구하는 공정에서) 매트릭스 내에서 세포를 포매시키기 위해 사용되는 수많은 공정에서 DNA를 변형시킴으로써 없거나 또는 적은 손상 또는 변형을 일으키며, 예를 들어, 세포 표면 분자의 변형 없이, 예를 들어, 생물학적 표면에 하이드로겔에 공유적으로 접합되지 않거나 또는 그렇지 않으면 표면을 변형시키지 않고 생물학적 표면이 생물학적 기능이 유지되게 하는 컨포멀 코팅, 예컨대 하이드로겔을 가질 것이다. 당업자에게 알려진 다양한 중합체는 본원에 예시된 바와 같이 예를 들어, 다중-아암 PEG 분자 및 선형 메타크릴로일옥시에틸 공중합체, 예를 들어, 포스포콜린 또는 다른 쯔비터이온성 기를 갖는 메타크릴로일옥시에틸 공중합체, 예를 들어 포스포콜린 및 유도체화된 알릴 아민을 갖는 ((예를 들어, 부가된 작용기, 예컨대 클릭-반응성 기, 임의로 가교 결합을 촉진하는 개재 링커를 갖는) 메타크릴로일옥시에틸 공중합체로부터 형성된 하이드로겔을 포함하는 하이드로겔에 대해 적합할 것이다.
본 발명에 의해 제공된 조성물을 형성하기 위한 다수의 방법론이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명에 의해 제공된 방법의 장점은 용이성, 재현가능성, 확장가능성, 및 생리적 혼용성을 포함한다. 생물학적 표면, 예컨대 세포 또는 세포 클러스터는 가혹한 조건에 노출되지 않고, 이에 따라 다른 코팅 방법과 관련된 특정 잠재적인 돌연변이유발 단계를 회피하면서 우수한 생존력 및 기능성을 유지한다. 본 발명에 의해 제공된 특정 방법의 하나의 유리한 양태는 다중-아암 중합체, 예컨대 클릭 작용성 다중-아암 PEG 분자, 및 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 및 알릴아민에 기초한 클릭 작용성 선형 공중합체 (예컨대 상업적으로 입수가능한 LIPIDURE®-NH01)과 관련된 수성상 및 클릭-반응성 작용기의 사용이다.
또한, 관련된 양태에서, 본 발명에 제공된 조성물은 예를 들어, 장애를 치료하거나 또는 완화시키는 방법에서 대상체, 예컨대 인간에 투여될 수 있다. 예를 들어, 결여된 또는 그렇지 않으면 결합된 생물학적 기능 (예를 들어, 인슐린 생산)을 특징으로 하는 장애 (인슐린 결핍, 예컨대 1형 당뇨병)은 본 발명에 의해 제공된 유효량의 조성물, 예컨대 코포멀 코팅된 생물학적 표면을 포함하는 조성물 (예를 들어, 인슐린-생산 세포)에 의해 치료될 수 있다.
도 1은 수크로오스 매체; 4-아암PEGNH2/4-아암 PEGNHS에서의 코팅된 폴리스티렌 (PS) 입자의 공초점 현미경사진이다.
도 2는 코팅된 PS 입자, PEO (8 백만 mol wt), 4-아암PEG-NHS/4-아암 PEG-NH2의 공초점 현미경사진이다.
도 3은 코팅된 PS 입자, PEO (4 백만 mol wt), 4-아암PEG-NHS/4-아암 PEG-NH2의 공초점 현미경사진이다.
도 4는 코팅된 PS 입자, PEO (1 백만 mol wt), 4-아암PEG-NHS/4-아암 PEG-NH2의 공초점 현미경사진이다.
도 5는 코팅된 PS 입자, PEO (1 백만 mol wt), 4-아암PEG-N3/4-아암 PEG-DBCO의 공초점 현미경사진이다.
도 6은 코팅된 PS 입자, PEO (8 백만 mol wt), 4-아암PEG-N3/4-아암 PEG-DBCO의 공초점 현미경사진이다.
도 7은 코팅된 HCT116 스페로이드 500세포, PEO (1 백만 mol wt), 4-아암PEG-N3/4-아암 PEG-DBCO의 공초점 현미경사진이다.
도 8은 코팅된 HCT116 스페로이드 500세포, PEO (4 백만 mol wt), 4-아암PEG-N3/4-아암 PEG-DBCO의 공초점 현미경사진이다.
도 9는 코팅된 HCT116 스페로이드 500 세포, PEO (8 백만 mol wt), 4-아암 PEG-N3/4-아암 PEG-DBCO의 공초점 현미경사진이다.
도 10은 하기의 공초점 현미경 사진이다: 코팅된 HCT116 1000세포/스페로이드; PEO (8 백만 mol wt) 4-아암 PEG-DBCO: 4-아암 PEG아자이드.
도 11은 3일차의 네이키드 HCT116 1000세포/스페로이드; 세포 생존력 염색의 공초점 현미경사진이다.
도 12는 하기의 공초점 현미경 사진이다: 코팅된 HCT116 1000세포/스페로이드; PEO 8 백만 4-아암 PEG-DBCO: 4-아암 PEG아자이드; 세포 생존력 염색 (3일차).
도 13은 종래의 형광 현미경 하의 코팅된 랫트 인슐린종 세포 스페로이드의 현미경사진이다.
도 14는 종래의 형광 현미경 하의 코팅된 랫트 췌장 소도의 현미경사진이다.
도 15는 하기에 대한 글루코스에 대한 인슐린 분비 반응의 비교를 제공하는 랫트 인슐린종 세포 스페로이드를 사용하는 인슐린 분비 연구를 요약하는 막대 그래프이다: 컨포멀 코팅된, 네이키드, 및 마이크로캡슐화된 랫트 인슐린종 세포 스페로이드 제형.
도 16은 컨포멀 코팅된, 네이키드, 및 마이크로캡슐화된 랫트 인슐린종 스페로이드 제형을 비교하는, 인슐린 분비 동력학이 고도의 글루코스 완충액에서 측정되는 랫트 인슐린종 세포 스페로이드를 사용한 인슐린 분비 동력학을 요약하는 선 그래프이다.
도 17은 컨포멀 코팅된, 네이키드, 또는 마이크로캡슐화된 랫트 췌장 소도에서 글루코스에 대한 인슐린 분비 반응을 비교하는, 랫트 췌장 소도를 사용한 인슐린 분비 연구를 요약하는 막대 그래프이다.
도 18은 컨포멀 코팅된, 네이키드, 및 마이크로캡슐화된 랫트 췌장 소도 제형을 비교하는, 고도의 글루코스 완충액에서의 랫트 췌장 소도 인슐린 분비 동력학을 요약하는 선 그래프이다.
도 19-21은 제1 층 (최상층)에서의 현탁화제를 사용하는 클릭 반응성 MPC 중합체로 코팅된, 코팅된 ARPE-19 스페로이드의 안정성의 공초점 현미경 이미지다.
도 22-28은 두 층에서의 현탁화제를 사용하는 클릭 반응성 MPC 중합체로 코팅된 ARPE-19 스페로이드의 안정성의 공초점 현미경 이미지다.
도 29는 연속적 첨가 방법에 의해 코팅된 ARPE-19 스페로이드의 공초점 현미경 이미지다.
도 30-33은 MPC 클릭 반응성 중합체를 사용하는 연속적 첨가 방법에 의한 코팅된 랫트 췌장 소도의 안정성의 공초점 현미경 이미지다.
도 34-37은 네이키드 및 코팅된 랫트 췌장 소도; 클릭 반응성 MPC 중합체를 사용하는 연속적 첨가 방법에 의해 코팅된 소도의 라이브/대드 생존력의 공초점 현미경 이미지다.
도 38-39는 네이키드 소도 및 클릭 반응성 MPC 중합체를 사용하는 연속적 첨가 방법에 의해 코팅된 소도의 랫트 췌장 소도 인슐린 분비를 요약하는 막대 그래프이다.
도 40은 플루오레세인 표지된 4-아암 PEG-NH2의 합성에 대한 반응식 1의 예시이다.
도 41은 4 암-PEG-{NHCO-(PEG)4-DBCO}3-FITC의 합성에 대한 반응식 2의 예시이다.
도 42는 4-아암 PEG-NH-DBCO, mol wt 10K의 합성에 대한 반응식 3의 예시이다.
도 43은 4-아암 PEG-NH-(PEG)4-DBCO의 합성에 대한 반응식 4의 예시이다.
도 44는 PEG 링커를 갖는 클릭 반응성 DBCO 기를 함유하는 메타크릴로일옥시포스포콜린-알릴아민의 클릭 반응성 공중합체의 합성에 대한 반응식 5의 예시이다.
도 45는 PEG 링커를 갖는 클릭 반응성 아자이드기를 함유하는 메타크릴로일옥시포스포콜린-알릴아민의 공중합체의 합성에 대한 반응식 6의 예시이다.
도 46은 소수성 사슬 (C6) 링커를 갖는 클릭 반응성 DBCO 기를 함유하는 메타크릴로일옥시포스포콜린-알릴아민의 클릭 반응성 공중합체의 합성에 대한 반응식 7의 예시이다.
도 47은 플루오레세인 태그를 갖는 클릭 반응성 DBCO 기를 함유하는 메타크릴로일옥시포스포콜린-알릴아민의 클릭 반응성 공중합체의 합성에 대한 반응식 8의 예시이다.
도 48은 본 발명에 의해 제공된 2층 시스템 및 3층 시스템의 2개의 컨포멀 코팅 방법을 예시하는 반응식 9의 예시이다.
도 49는 컨포멀 코팅의 연속적 첨가 방법에 대한 반응식 10의 예시이다.
본 발명은 적어도 부분적으로 초박막 반투과성, 고도의 재생가능한 및 확장가능하며, 생물학적 표면 (예를 들어, 세포)의 임의의 상당한 손상 (구조적 변화) 또는 변형 (기능의 손실/손상 포함)을 가지지 않는 생물학적 표면의 컨포멀 코팅물뿐만 아니라 광범위한 생리적 조건 하의 이러한 컨포멀 코팅된 생물학적 표면의 제조 방법의 출원인의 발견에 기초한다. 개별적으로, 이들은 "본 발명에 의해 제공된 조성물" (또는 "본 발명에 의해 제공된 생물학적 표면") 및 "본 발명에 의해 제공된 방법"이 존재하고, 총괄적으로 "본 발명에 의해 제공된 조성물 및 방법", 및 기타 동종의 것으로 지칭될 것이다. 본 발명에 의해 제공된 조성물 및 방법은 예컨대 기존의 방법 및 조성물의 곤란성 및 제한, 예컨대 생물학적 표면에 대한 손상/좋지 않은 생체적합성, 재현가능성, 확장가능성, 및 두께, 투과도, 또는 균일성을 극복한다. 하기 문헌 참고: 예를 들어, Tomei 등 Proceedings of the National Academy of Sciences (2014) 111(29), 10514-10519; L.H. Granicka 등, (2011), Artificial Cells, Blood Substitutes and Biotechnology (2011) 39: 274-280; Blasi 등, International Journal of Pharmaceutics (2013) 440, 141- 147; Hubbell and Tomei, US2014/0147483 A1; Garcia 등, US2015/0071997 A1; Sang Van, 등, US 8,216,558 B2; Chaikof, 등 US 7,824,672 B2; Michael H.May, 1998, Ph.D. thesis, University of Toronto; Angelo S. Mao 등 Nature Materials, (2017), 16, 236-243; Green 등, Materials Today (2012), 15: 60-66; Ribeiro 등, Applied Materials & Interface, (2017), 9: 12967-12974.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 하이드로겔 컨포멀 코팅을 갖는 생물학적 표면을 포함하는 조성물을 제공한다. 컨포멀 코팅이 없는 적절한 대조군 생물학적 표면에 비해, 생물학적 표면은: i) 기능 (즉, 생물학적 기능, 예컨대, 예를 들어, 글루코스에 대한 반응시의 인슐린 분비)을 유지하고, 및 ii) 실질적으로 손상 또는 다른 형태의 표면 변형이 없거나 또는 단지 무시할만한 양이 손상 또는 다른 형태의 표면 변형을 가진다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 약 하기 값 미만: 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0.1 % 미만의 생물학적 표면 상의 이황화 결합, 아민 (-NH2), 카복실 (-COOH), 또는 하이드록실 (-OH) 모이어티 (또는 1, 2, 3, 또는 4 모두의 조합)가 변형된다.
"컨포멀 코팅"은 얇은 (50 μm 미만, 일부 구현예에서, 약 하기 값 미만: 50, 40, 30, 20, 또는 10 μm; 예를 들어, 20 μm 미만, 예를 들어, 약 5 내지 20 μm, 약 10 μm 이하) 외인성 코팅이고, 이는 코팅되는 표면 상에서 실질적으로 균일하고, 분자량 체질, 즉, 항체 또는 세포 이외의 영양소, 특정 단백질 및 산소, 등의 통과를 가능하게 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 컨포멀 코팅은 컨포멀 코팅에 대한 생물학적 표면의 유의미한 공유 결합 또는 그렇지 않으면 생물학적 표면의 공유적인 변형을 포괄하지 않는다. 대신에, 컨포멀 코팅은 상당한 양의 하기의 것 없이 생물학적 표면을 둘러싼 가교결합 네트워크, 예컨대 하이드로겔을 포괄한다: (즉, 약 하기 값 미만 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0.1 %, 또는 바람직하게는 임의의, 즉, 검출 제한 미만)의 생물학적 표면에 대한 가교 결합. 임의의 특정 구현예에서, 컨포멀 코팅은 하기를 포괄하지 않는다: 광활성화, 라디칼 개시제, 계면활성제, 산 또는 염기 촉매작용, 산화제 또는 환원제, 또는 유기 용매의 사용, 바람직하게는 예를 들어, 하기 수치와 같은 광범위한 온도와 하기 조건에서 일어날 수 있다: 약 4°C 및 37°C 및 적합한, 예를 들어, 생리적, pH 조건. 특정 구현예에서, 컨포멀 코팅을 구성하는 하이드로겔은 순수 중성 전하를 가진다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공된 컨포멀 코팅물 (및 이의 제조 방법)은 실질적으로 생물학적 표면, 예를 들어, 세포의 기능성에 실질적으로 (또는 전혀) 영향을 미치지 않는다. 즉, 생물학적 표면의 생물학적 기능 (예컨대 글루코스에의 반응시 인슐린 분비)은 존재하더라도 무시할 정도로 영향을 받는다. 마찬가지로, 생물학적 표면, 특히 컨포멀 코팅에 근접한 그것의 외부 표면의 물리적 구조는 변형되지 않고, 예를 들어, 이황화 결합은 실질적으로 (또는 완전히) 온전하게 유지되고, 한편 다른 반응성 기 예컨대 아민, 카복실, 및 하이드록실은 실질적으로 (또는 완전히) 비변형된다. 임의의 특정 구현예에서, 약: 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0.1 % 미만의 생물학적 표면 상의 이황화 결합, 아민 (-NH2), 카복실 (-COOH), 또는 하이드록실 (-OH) 모이어티 (또는 1, 2, 3, 또는 4 모두의 조합)은 컨포멀 코팅의 적용 이후에 변형되지 않는다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 컨포멀 코팅물 (및 이의 제조 방법)은 대략 하기 수치까지의 분자 (예를 들어, 영양소, 산소, 및 특정 분비된 분자, 예컨대 분비된 단백질, 예컨대 인슐린)에 대해 투과성이다: 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, kDa, 이상, 예를 들어, 75, 80, 또는 85 kDa (그러나 더 큰 분자, 예컨대 항체 또는 세포는 아님), 이에 따라 대략 하기 크기의 분자에 대해 불투과성이다: 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 kDa 이상.
"생물학적 표면"은 생존 세포 (박테리아, 고세균, 진균, 식물, 또는 동물 세포, 예컨대 곤충 또는 포유동물 세포, 예컨대 영장류, 예컨대 인간뿐만 아니라 비인간 영장류로부터의 세포, 뿐만 아니라 비영장류 포유동물 세포, 예컨대 마우스, 랫트, 돼지, 양, 소과, 갯과, 고양이, 낙타과, 토끼과 등 포함)를 포함하고, 여기서 생존 세포는 개개의 세포, 세포 클러스터, 오가노이드, 세포 스페로이드, 배양체, 천연 조직 외식편 (전체의 기관 또는 장기 단편, 예컨대 신장, 췌장, 간, 또는 심장 포함)을 포함하는 조직, 또는 조직 단편 또는 시험관내 성장된 조직뿐만 아니라 생체인공/하이브리드 기관 또는 기관 장치의 형태일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 만능 줄기 세포, 예컨대 유도 만능 줄기 세포이다. 또한, 생물학적 표면은 인공 세포, 예컨대 비-살아 있는 세포에 연결된 단백질 (예컨대 효소), 예컨대 리포좀, 하이드로겔, 고체 (예컨대 플라스틱, 예컨대 폴리스티렌, 또는 PLA, PGA, 또는 이들의 조합), 등을 포괄한다. 생물학적 표면, 예컨대 세포는 전형적으로 (꼭 그렇지는 않지만) 실질적으로 구형 형상이다. 세포 (뿐만 아니라 세포 클러스터 또는 스페로이드)는 직경 약 5 μm 내지 약 1 mm, 예를 들어, 약 10 μm 내지 1 mm, 예를 들어, 약 100 μm 내지 약 400 μm, 예를 들어, 일부 구현예에서 최대 약 300 μm, 예를 들어, 대략 하기의 크기의 직경을 가질 수 있다: 100-300 μm.다른 구현예에서, 생물학적 표면 (세포, 세포 클러스터, 또는 세포 스페로이드)는 대략 하기의 크기이다: 10 μm 내지 2mm, 20 μm 내지 1mm, 50 내지 800 μm, 또는 100 내지 500 μm.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 조성물의 하이드로겔은 다중 암 중합체, 예컨대 4-아암 5-10 kDa PEG, 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 공중합체 100-200 kDa, 60-90% 포스포콜린 (또는 다른 쯔비터이온성 기; LIPIDURE®-NH01에 기초한 중합체 포함)뿐만 아니라 상기의 것의 조합의 공유 가교결합 네트워크이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하이드로겔에서 생물학적 표면을 컨포멀 코팅하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 2개의 수성층을 포함하는 시스템을 제공하는 단계를 포괄하며, 여기서 상기 제1 층은 대략 하기 성분의 용액을 포함하고: 0.25% 내지 2% (W/V)의 현탁화제, 약 1% 내지 약 25% (W/V)의 제1 작용화된 다중 암 중합체, 및 생물학적 표면, 그리고 제2 층은 당류 쿠션 (saccharide cushion) 및 약 1% 내지 약 25% (W/V)의 제2 작용화된 다중 암 중합체를 포함하고, 상기 제2 작용화된 다중 암 중합체의 작용기는 생리적 조건 하에 제1 작용화된 다중 암 중합체의 작용기와 반응성이고, 상기 단계 이후 생물학적 표면을 제2 층에 통과되게 하여 그것에 의해 제1 및 제2 작용기가 반응하여 가교결합된 하이드로겔 컨포멀 코팅된 생물학적 표면을 형성하는 단계를 포괄한다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 의해 제공된 방법은 2개 초과의 층, 예를 들어, 3개 이상의 층을 사용하고, 1개 초과의 당류 쿠션을 포함할 수 있다. 전형적으로, 수성층은 라디칼 및 유기 용매 (예를 들어, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05% (V/V) 미만의 라디칼 또는 유기 용매, 또는, 일부 구현예에서, 검출 제한 미만)을 실질적으로 함유하지 않는다.
"현탁화제"는 수용액의 점도를 증가시키고, 선형의 빗형 다가 중합체, 분지형, 호모 및 블록 중합체를 포함하는 화학물질이다. 예시적인 현탁화제는 고분자량 PEG (폴리에틸렌 옥사이드, PEO로도 지칭됨)를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 뿐만 아니라 PVA (폴리비닐 알코올), PVP (폴리비닐피롤리돈), 및 HPMC (하이드록시프로필 메틸셀룰로스)를 포함한다. 현탁화제는 선형 또는 분지형일 수 있다. 현탁화제는 대략 하기의 양으로 존재한다: 0.05% 내지 2.0%, 예를 들어, 약: 0.1% 내지 2.0%, 또는 약: 0.25% 내지 2.0%, 또는 약 1%, 예를 들어, 0.5% 내지 1.5%. 특정 구현예에서, 현탁화제는 약 1 MDa (메가달톤) 내지 약 10MDa, 예를 들어, 약 1 MDa 내지 약 8 MDa의 분자량을 가진다. 특정 구현예에서, 현탁화제는 대략 하기 수치의 분자량을 갖는 PEO이다: 예를 들어, 상기 농도에서의 1 MDa 내지 10 MDa, 예를 들어, 1 MDa 내지 8 MDa.당업자에게 이해되는 바와 같이, 다른 현탁화제는 예를 들어, 약 1 MDa 내지 약 8 MDa의 약 1%의 고분자량 PEO에 대해 본원에 기재된 결과와 유사한 특성이 달성되도록 사용될 수 있다. 현탁화제는 다양한 수용액, 예컨대, 예를 들어, 염수, 예를 들어, 0.9% 염수에 용해될 수 있다. 일부 구현예에서, 현탁화제는 제1 층에서만 존재하고, 한편 다른 구현예에서 현탁화제는 제1 및 제2 층 모두에 존재한다. 일부 구현예에서, 현탁화제가 두 층에 존재하는 경우, 제1 층에서의 현탁화제는 제2 층에서의 현탁화제와 동일하고, 한편 다른 구현예에서, 현탁화제가 상이할 수 있다.
"당류 쿠션"은 용액의 밀도를 증가시키고, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 수용액의 층상화(layering)를 촉진하는 단, 이, 삼, 올리고, 또는 다당류 (예를 들어, 수크로스, 글루코스, 트레할로스, 만니톨, 덱스트로스, 푸룩토스, 락토스, 말토스, 또는 이들의 조합)의 1%-15% (W/V) 용액이다. 특정 구현예에서, 당류는 약 5% 내지 약 15%, 예를 들어, 약 7.5% 내지 약 12.5%, 예를 들어, 약 10%의 용액이다. 임의의 특정 구현예에서, 당류는 수크로스이다. 다른 당류 쿠션은 예를 들어, 본원에 예시된 특정 농도에서의 스크로스와 유사한 밀도를 달성하는 것에 기초하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 방법은 2개의 층 이상, 예컨대 또한 3개의 층 이상을 사용한다.
"작용화된 다중 암 중합체"는 암의 원위 말단에서 작용기를 갖는 3개 이상의 (예를 들어, 3 내지 12, 더 상세하게는, 4 또는 8개의) 암을 갖는 다중 암 중합체다. 상기 암은 일부 구현예에서, 중심 핵 (예컨대 다중-아암 PEG)으로부터 발산되거나, 다른 구현예에서, (빗-형상화 중합체, 예컨대 공중합체에서와 같이) 중심 축 중합체의 길이에 따른 상이한 지점에서 발생될 수 있고, 이 경우에 다중-아암 중합체는 예를 들어 대략 하기의 수의 암과 같은 4개 초과의 암을 가질 수 있고: 20, 25, 30, 35, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900개의 암 이상을 가질 수 있고, 공중합체는 예를 들어 대략 하기 분자량의 그것의 전체 크기/ 질량에 대해 그것의 축에 따라 상이한 중합체의 균일한 분포를 실질적으로 함유한다: 10 kDa-1 MDa, 20 kDa-800 kDa, 50-500 kDa, 예를 들어, 약: 100-400 kDa, 100-300 kDa, 200-350 kDa, 200-300 kDa, 또는 약 300 kDa, 예를 들어, 약 275-325 kDa.작용화된 다중 암 중합체는 암의 원위 말단에서, 예를 들어, 2개 이상의 암, 예를 들어, 2개로부터 최대 n개의 암의 원위 말단에서 작용기를 가지고, 여기서 n은 다중-아암 중합체 상의 암의 수이고, 예를 들어, n=4인 경우, 그것의 원위 말단에서 작용기를 갖는 2, 3, 또는 4개 모두의 암이 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 모든 암의 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%는 그것의 원위 말단에서의 작용기를 가지고, 예를 들어, 모든 암의 약 5-15%는 그것의 원위 말단에서 작용기를 가지고, 예를 들어, 여기서 다중-아암 중합체는 큰 빗-형상화 중합체다. 작용화된 다중 암 중합체는 약 1% 내지 약 25% (W/V), 예를 들어, 약 2.5% 내지 약 20%, 더 상세하게는 약 8% 내지 약 12%, 또는 약 10%로 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 작용화된 다중 암 중합체는 약 5% 내지 약 10%로 존재한다. 다른 특정 구현예에서, 다중 암 중합체는 약 2.5% 내지 7.5%, 예를 들어, 약 4% 내지 약 6% 또는 약 5%로 용액에 존재한다.
특정 구현예에서, 작용화된 다중 암 중합체는 예를 들어 대략 하기 수치의 총 분자량을 갖는 PEG이거나: 5-40, 5-30, 10-20, 8-12, 또는 10 kDa, 예를 들어, 대략 하기 분자량의 4 또는 8 arm PEG이다: 예를 들어, 대략 하기 수치에서의 5-40, 5-30, 10-20, 8-12, 또는 10 kDa: 5% 또는 10% W/V.
다른 구현예에서, 작용화된 다중 암 중합체는 메타크릴로일옥시에틸 또는 다른 골격 (예컨대 폴리비닐 또는 폴리아미드)을 갖는 선형 공중합체, 예컨대 포스포콜린 또는 다른 쯔비터이온성 기를 포함하는 공중합체이고, 예를 들어, 여기서 공-중합체의 약: 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95%는 중합체에서의 쯔비터이온성 기-함유 암의 백분율, 예컨대 백분율 포스포콜린, 예를 들어, 60-90% 포스포콜린으로 간단하게 언급되는 예를 들어, 암의 60-90%, 70-90%, 75-85%, 또는 약 80%의 쯔비터이온성 기를 포함한다. 이들 구현예에서, 공-중합체 암의 나머지 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5%는 작용기, 예컨대 알릴아민 (예컨대 명칭 LIPIDURE®-NH01 하에 시판되는 공중합체), 또는 유도체, 예컨대 작용화된 암을 함유하고, 여기서 공중합체의 아릴아민 단위의 NH2 기는 클릭 작용기, 예컨대 DBCO 또는 아자이드와 함께 부가된다 (임의로 대략 하기 길이일 수 있는 개재 링커, 예컨대 PEG와 함께: 길이가 2-80, 3-60, 3-50, 5-40, 10-40, 15-40, 20-40, 25-40, 30-40, 35-40, 또는 38개인 원자 (예컨대 C, N, O, P, S, 또는 이들의 조합)). 일부 구현예에서, (예를 들어, 부가된 클릭- 작용기를 갖는, 임의로 개재 링커를 갖는) 작용화된 유도체로 전환되는 작용기 (예를 들어, 예컨대 알릴아민)의 백분율은 대략 하기와 같다: 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75%, 이상, 예를 들어, 약: 25-75%, 40-60%, 45-55%, 또는 50%.따라서, 예를 들어, 공중합체의 60-90%가 쯔비터이온성 암인 구현예에서, 공중합체의 암의 40-10%는 클릭 작용기를 갖게 하는 전환을 위해 이용가능하고, 일부 구현예에서 이의 약 50%는 클릭 작용기가 부가되고, 즉, 암의 총수의 20-5%는 부가된 클릭 작용기를 가진다. 따라서, 특정 구현예에서, 약: 50, 60, 80, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200개의 암, 이상, 예를 들어, 약: 70-150 또는 80-90, 또는 약 85개의 암 (빗-형상화 작용화된 다중 암 중합체 내의 것)이 부가된 클릭 작용기를 가진다.
다른 구현예에서, 작용화된 다중 암 중합체는 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 (MPC; 예를 들어, 일부 구현예에서, DBCO, 예컨대 라이신-DBCO, 다른 구현예에서 알릴아민 공중합체로 작용화됨)이고, 예를 들어, 보다 특정한 구현예에서, 제1 층에서의 작용화된 다중 암 중합체는 MPC (예를 들어, MPC-라이신-DBCO)이고, 제2 층에서의 작용화된 다중 암 중합체는 PEG, 예를 들어, 4 또는 8 암 PEG (예를 들어, PEG-아자이드)이다. 다른 구현예에서, 작용화된 선형 공중합체는 제1 중합체로서 클릭 작용성 DBCO를 갖는 공중합체의 알릴아민 단위의 NH2 기로 작용화된 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린- 알릴아민 (예를 들어, LIPIDURE®-NH01); 및 작용화된 선형 공중합체 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린- 알릴아민 (예를 들어, LIPIDURE®-NH01)이며, 이는 제2 중합체이며 클릭 작용성 아자이드기를 갖는 공중합체의 알릴아민 단위의 아민기로 작용화된 것이다. 일부 구현예에서, 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린-알릴아민의 공중합체는 대략 하기와 같다: 80: 20 몰비; 50: 50 몰비; 20: 80 몰비.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "다중 암 중합체"는 작용화된 다중 암 중합체뿐만 아니라 작용기기 결여된 것을 제외하고 실질적으로 동일한 중합체, 예를 들어, 중합체 암의 원위 말단에서 반응성 작용기를 더 이상 갖지 않는 가교결합된 (즉, 반응된) 작용화된 다중 암 중합체로 구성된 하이드로겔을 포괄하며, 상기 반응성 작용기의 양은 하기와 같다 (즉, 하기 수치 미만: 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0.1 %의 미반응된 작용기가 잔류한다). 특정 구현예에서, 제1 작용화된 다중 암 중합체는 제2 작용화된 다중 암 중합체와 동일하며, 단 2개의 작용화된 다중 암 중합체가 상보적 (반응성), 예컨대 각각 DBCO 및 아자이드 작용화된 메타크릴로일옥시에틸 공중합체, 각각 또는 DBCO 및 아자이드 작용화된 다중-아암 PEG를 가진다. 다른 구현예에서, 상기 제1 작용화된 다중 암 중합체는 제2 작용화된 다중 암 중합체, 예를 들어, 아자이드 또는 DBCO 작용화된 다중-아암 PEG를 갖는 DBCO 또는 아자이드 작용화된 메타크릴로일옥시에틸 공중합체와 상이하다.
본 발명에 의해 제공된 방법에서 유용한 작용화된 다중 암 중합체 상의 작용기는 제1 작용화된 다중 암 중합체와 제2 작용화된 다중 암 중합체 사이의 효율적인 가교 결합을 촉진하여 안정한 하이드로겔을 형성하는 반응성 기이다. 다양한 적합한 화학물질은 이러한 목적에 적합한 것으로 당업자에게 인식될 것이다. 예시적인 화학물질은 NHS/ 활성화된 에스테르 및, 특정 구현예에서, 클릭 작용기를 포함한다.
"클릭 작용성" (때때로 클릭 반응성으로 언급됨) 기는 클릭 화학(click chemistry), 즉, 특이적으로 생물학적 조건 하에 빠르게 (높은 열역학적 구동력) 진행되며, 물에 의해 방해되지 않고, 상당한 독성 또는 불쾌한 부산물이 발생되지 않는 단일 포트 반응에 대해 적합한 화학적 모이어티이다. 적합한 클릭 작용기는 화학 반응 예컨대 고리화 첨가반응 예컨대 1,2-쌍극성 고리화 첨가반응 및 헤테로-딜스 알더 고리화 첨가반응; 변형된 복소환형 친전자체 예컨대 아지리딘, 에폭사이드, 환형 설페이트, 에피설포늄, 등의 친핵성 고리 개환; 우레아, 티오 우레아, 하이드로존, 옥심 에테르, 아미드 및 방향족 헤테로사이클을 형성하기 위한 비-알돌 카보닐 화학; 및 탄소-탄소 다중 결합에의 첨가, 예컨대 에폭시화, 아지리딘화, 디하이드록실화, 설페닐 할라이드 첨가, 니트로실 첨가, 및 마이클 첨가를 진행한다. 특정 구현예에서, 클릭 화학 반응 쌍 (즉, 제1 및 제2 작용화된 다중-아암 중합체 상의 클릭 작용기)은 아자이드-DBCO (디벤조사이클로옥틴) (트리아졸 연결 생성), 티올-노르보렌 (마이클 첨가), 및 테트라진-노르보렌 (피라조 연결)을 포함한다. 임의의 특정 구현예에서, 본 발명에 유용한 클릭 작용기는 아자이드 및 DBCO를 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 방법의 특정 구현예에서, 제1 작용화된 다중 암 중합체는 4-아암 5-10 kDa PEG이다. 보다 특정한 구현예에서, 제1 작용화된 다중 암 중합체의 작용기는 클릭 작용기, 예컨대 DBCO 또는 아자이드이다. 본 발명에 의해 제공된 방법의 다른 특정 구현예에서, 제1 작용화된 다중 암 중합체는 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 공중합체 100-200 kDa, 60-90% 포스포콜린이다. 보다 특정한 구현예에서, 제1 작용화된 다중 암 중합체의 작용기는 클릭 작용기, 예컨대 DBCO 또는 아자이드이다.
본 발명에 의해 제공된 방법의 일부 구현예에서, 제2 작용화된 다중 암 중합체는 4-아암 5-10 kDa PEG이다. 보다 특정한 구현예에서, 제2 작용화된 다중 암 중합체의 작용기는 클릭 작용기, 예컨대 아자이드 또는 DBCO이다. 본 발명에 의해 제공된 방법의 다른 특정 구현예에서, 제2 작용화된 다중 암 중합체는 100-200 kDa 및 60-90% 포스포콜린인 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 공중합체이다. 보다 특정한 구현예에서, 제2 작용화된 다중 암 중합체의 작용기는 클릭 작용기, 예컨대 아자이드 또는 DBCO이다.
본 발명에 의해 제공된 방법의 일부 구현예에서, 현탁화제는 약 1%로 존재하는 약 1-8 MDa의 분자량을 갖는 PEO이다.
본 발명에 의해 제공된 방법의 특정 구현예에서, 생물학적 표면은 원심분리에 의해 제2 층을 통과하게 된다.
본 발명에 의해 제공된 방법의 특정 구현예에서, 생물학적 표면은 바닥층으로 원심분리 하에 한 방울씩 연속적으로 첨가된다.
특정 구현예에서, 원심분리 바이알은 원심력 하에 한 방울씩 혼합물 이동을 가능하게 하는데 충분하게 작은 오리피스를 갖는 테이퍼링된 측면 암을 삽입함으로써 생물학적 표면의 연속적인 첨가에 적합하도록 설계된다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 개재층 (예컨대 기체층)에 의해 분리된 2개의 수성층을 포함하는 시스템을 제공함으로써 하이드로겔에서 생물학적 표면을 컨포멀 코팅하는 방법을 제공하며, 제1 층은 대략 하기 함량의 성분의 용액을 포함하고: 0.25% 내지 2% (W/V)의 현탁화제, 약 1% 내지 약 25% (W/V)의 제1 작용화된 다중 암 중합체, 및 생물학적 표면, 그리고 제2 층은 대략 하기 함량의 성분의 용액을 포함한다: 0.25% 내지 2% (W/V)의 현탁화제, 당류 쿠션, 및 약 1% 내지 약 25% (W/V)의 제2 작용화된 다중 암 중합체; 상기 제2 작용화된 다중 암 중합체의 작용기는 생리적 조건 하에 제1 작용화된 다중 암 중합체의 작용기와 반응성이고, 생물학적 표면을 제2 층을 통과시키고, 이에 의해 제1 및 제2 작용기가 반응하여 컨포멀 코팅하는 가교결합된 하이드로겔 컨포멀 코팅된 생물학적 표면을 형성하고, 여기서 제1 작용화된 다중 암 중합체는 선형 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 공중합체이다.
이들 방법의 특정 구현예에서, 제1 층은 제2 층에 연속적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제2 층은 원심력 하에 혼합물 이동이 가능하도록 치수화된 오리피스를 갖는 테이퍼링된 측면 암을 통해 제1 층의 첨가에 적합한 컨테이너 내에 있다. 이러한 구현예의 하나의 예시는 도 49에 예시된 바와 같이 한 방울씩 첨가되고, 이 방식으로 생물학적 표면은 현탁화제를 함유하는 당류 용액에 제2의 작용화된 중합체의 층으로 유입된다. 이 공정은 계면에서 세포의 트랩핑을 회피하고, 고수율의 코팅된 생물학적 표면을 제공한다. 특정 구현예에서, 제2 층으로의 제1 층의 실질적인 연속적 첨가는 출발 생물학적 표면의 양에 대해 컨포멀 코팅된 생물학적 표면의 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상의 수율을 야기하고, 예를 들어, 세포, 소도(islet)의 연속적 첨가 방법은 완전하게 코팅된 세포로서 종결되는 출발 (미코팅된) 세포의 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상을 야기한다. 특정 구현예에서, 상부 오리피스 직경은 200 마이크로미터 내지 5000 마이크로미터이고; 하부 오리피스 직경은 5 마이크로미터 내지 1000 마이크로미터, 바람직하게는 10 마이크로미터 500 마이크로미터이다.
본 발명에 의해 제공된 조성물 및 방법에 대한 특정 구현예에서, 컨포멀 코팅의 두께는 약 20 μm 미만이고, 예를 들어, 대략 하기와 같다: 10-20 μm, 5-10 μm, 7.5-12.5 μm, 또는 10 μm.
본 발명에 의해 제공된 조성물 및 방법에 대한 특정 구현예에서, 생물학적 표면은 살아 있는 세포 (예를 들어, 동물, 식물, 박테리아, 효모 세포) 또는 세포 클러스터이다. 특정 구현예에서, 살아 있는 세포는 동물 세포이다. 보다 특정한 구현예에서, 동물 세포는 포유동물 세포이다. 다른 보다 특정한 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 생물학적 표면이 세포인 다른 특정 구현예에서, 세포는 인슐린-생산 세포이다. 생물학적 표면이 세포인 일부 특정 구현예에서, 세포는 만능 줄기 세포, 예컨대 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 예컨대 포유동물 iPSC, 예컨대 인간 iPSC이다.
세포가 인슐린-생산 세포인 본 발명에 의해 제공된 조성물 및 방법에 대한 특정 구현예에서, 컨포멀 코팅되지 않은 적합한 대조군 세포에 대해 약 2 mM 내지 약 20 mM로의 글루코스로의 자극시에 세포가 적합한 대조군 세포와 실질적으로 유사한 동력학으로 및/또는 농도로 인슐린을 분비하고, 이는 예를 들어, 대략 하기 시간 이내: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30 분 (대조군 세포로부터의 최고 인슐린 분비의 경우) 및/또는 대략 하기 수치 이내로 이루어진다: (예를 들어, 10, 20, 60, 90, 또는 120 분에서) 대조군 세포로부터의 인슐린의 농도의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50%.
관련된 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 임의의 방법에 의해 제조된 하이드로겔 컨포멀 코팅을 갖는 생물학적 표면을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 치료적 유효량의 조성물을 투여함으로써 포유동물 대상체를 치료하는데 사용하기 위한, 생물학적 표면 및 1개 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 조성물에 의해 제공되는 특정 생물학적 기능이 결여되거나 또는 결핍된) 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 이는 대상체의 상기 필요를 완화시키는 본 발명에 의해 제공된 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 인간, 예컨대 예를 들어, 인슐린-의존적 당뇨병을 갖는 성인 또는 소아 대상체이다. 상기와 같은 방법에서 사용되는 본 발명에 의해 제공된 조성물은 상기 대상체에 직접적으로 적용될 수 있고 (예를 들어, 주사로 또는 이식으로, 이 경우에 본 발명에 의해 제공된 조성물은 포유동물 대상체, 예컨대 인간에의 투여에 적합한 주사기로 제공됨) 또는 대상체에 이식된 생체적합성 컨테이너에 제공될 수 있고, 예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 조성물은 대상체 내의 그것의 운동을 제한하지만, 반투과성이고, 예를 들어, 영양소, 산소, 및 치료제의 확산이 허용되는 생체적합성 컨테이너 내에 배치된다.
예시
개요
초-박형 컨포멀 코팅은 특정 살아 있는 세포에 대해 적합한 바람직한 온도에서 수성 등장성 시스템 중의 중성 pH에서 다른 중합체에 대해 하나의 중합체가 특이적으로 반응할 수 있는 다중-아암 클릭-반응성 친수성 중합체를 이용하여 달성되었다. 우선, 상기 방법은 4-아암 PEG-NHS 및 4-아암 PEG-NH2로 이루어진 활성화된 N-하이드록시 석신이미드 (NHS) 에스테르 접근법을 사용하여 세포 스페로이드에 대한 모델로서 폴리스티렌 입자 (100 내지 125 마이크론 범위)를 사용하여 개발되었다. 이를 달성하기 위하여, 초기에 FITC 라벨을 갖는 4-아암 PEG-NH2는 입자 표면 상에 층상화되었고, 이는 상기 방법에서 중요한 단계인 것으로 발견되었다. 이는 입자를 4-아암-PEG-(NH2)3-FITC (1% 용액)로 스파이킹된 5% 4-아암 PEG-NH2와 혼합하여 달성되었다. 상기 혼합물은 6시간 동안 30 ℃에서 진공 건조되었다. 수득한 분말은 4-아암 PEG-NHS (5%)를 함유하는 60% 수크로스 용액에 현탁시켰다. 상기 혼합물을 와동시키고, 과잉의 수크로스, 비-반응된 PEG 및 과잉의 형광 PEG 중합체 및 염을 제거하기 위해 PBS 완충액으로 세정하였다. 상기 입자를 수집하고, 형광 필드에서의 공초점 현미경 하에 시각화되었다. 현미경 이미지는 초박형 코팅이 5 내지 10 마이크론 범위의 두께를 갖는 입자 표면 상에 균일하게 형성되었음을 확인하였다, 도 1. 따라서, 수성계에서 2개-반응성 중합체를 사용하는 컨포멀 코팅의 개념이 입증되었고, 그러나, 작업 조건 및 시약 예컨대 테트라 PEG-NH2, 테트라-PEG-NHS 에스테 및 진공 건조 및 고장성 수크로스 60% 용액의 사용은 살아 있는 세포에 대해 바람직하지 않다.
다수의 분산매는 60% 수크로스 용액을 대체하기 위해 조사되었고, 높은 mol wt PEO 1 백만 내지 8 백만의 1% 용액은 분산매로서 고장성 수크로스 용액을 대체하기에 유용하였음이 밝혀졌다. 또한, 높은 mol wt PEO 용액에서 제1 중합체를 입자와 혼합하는 밀도 구배 방법으로 진공 건조 단계를 대체하는 것이 평가되었다. 이는 하나의 층으로서 고려된다. 높은 mol wt PEO의 긴 중합체 사슬은 입자 표면 상에서 4-아암 PEG-NH2의 짧은 사슬이 일시적으로 유지되게 한다. 이들 입자가 반응식 5 (도 23)에 나타난 바와 같이 등장성 수크로스 용액 내의 4-아암 PEG-NHS을 가지는 바닥층으로 이동함에 따라, PEG-NHS 분자는 PEO 사슬을 통과하여 4-아암 PEG-NH2과 신속하게 반응하여 이에 따라 입자 표면 상에 균일하게 공유 결합된 하이드로겔 네트워크를 형성한다, 도 2, 3, 및 4. 이는 고장성 수크로스 (60%) 용액이 1% PEO 용액으로 대체될 수 있고, 진공 건조는 밀도 구배 방법을 사용하여 제거될 수 있음을 확인한다. 이러한 방법이 실시되고, 재현가능하였지만, 활성화된 에스테르가 세포 표면 단백질과 반응할 수 있기 때문에 이는 살아 있는 세포에 이상적이지 않았고, 그리하여 더 양호한 중합 화학에 의해 활성화된 에스테르를 대체하는 것이 바람직하였다. 클릭-화학이 살아 있는 세포에 대해 적합한 화학적 방법일 것으로 간주되었다.
4-아암 PEG-DBCO (디벤조사이클로옥틴) 및 4-아암 PEG-아자이드와 같은 클릭 반응성 다중-아암 PEG는 4-아암 PEG-NH2 및 4-아암 PEG-NHS 에스테르를 대체하는 것으로 여겨졌다. 클릭-반응은 살아 있는 세포에 대해 바람직한 중성 조건에서 일어난다. 다수의 높은 mol wt PEO 1 백만 내지 8 백만의 다양한 농도 용액은 상기에 기재된 바와 같은 밀도 구배 방법을 사용하여 선별되었다. 이는 높은 mol wt PEO 용액 중의 입자 표면 상에서 제1 중합체를 층상화하는 것을 수반하였다. 높은 mol wt PEO의 긴 중합체 사슬은 단쇄 4-아암 PEG-DBCO이 입자 표면 상에 일시적으로 체류하게 하였다. 이러한 입자는 5% 수크로스 용액 중의 4-아암 PEG-아자이드를 가진 바닥층으로 이동함에 따라, PEG-아자이드 분자는 PEO 사슬을 통과하였고, 4-아암 PEG-DBCO와 신속하게 반응하였고, 이에 따라 입자 표면 상에 공유결합된 하이드로겔 네트워크를 형성하였다, 도 5 및 6. 이러한 조건은 살아 있는 세포의 컨포멀 코팅에 대해 이상적인 것으로 밝혀졌다. 이를 살아 있는 세포에 적용하기 이전에, 클릭-화학 방법은 폴리스티렌 (PS) 입자에 적용되었고, 이는 임의의 문제점 없이 실시되는 것으로 밝혀졌다, 도 5 및 6. 이후, 이러한 방법은 HCT116 세포 스페로이드 (도 7 내지 9), 인슐린종 세포 스페로이드 (도13) 및 새롭게 단리된 랫트 췌장 소도 (도 14)에 성공적으로 적용되었다.
HCT 세포 스페로이드 (hct116 세포주), 인슐린종 스페로이드 (인간 기원) 또는 랫트 췌장 소도는 PEO (1백만 내지 8 백만) 1% 용액 중의 4-아암 PEG-(DBCO)3-FITC의 1% 용액으로 스파이킹된 4-아암 PEG-DBCO 5%의 용액과 혼합되었다. 혼합물은 10% 수크로스 용액 중의 4-아암 PEG-아자이드의 층 상에 층상화되었다. 높은 mol wt PEO의 긴 중합체 사슬은 이들이 수크로스 층으로 이동함에 따라 세포 표면을 향하여 단쇄 4-아암 PEG-DBCO를 가압할 수 있고, 여기서 4-아암 PEG 아자이드는 관통하여 4-아암 PEG-DBCO와 신속하게 반응하여 2개의 중합체 사이에 공유 결합을 형성하고, 이에 따라 세포 스페로이드 또는 소도 주변에 균일하게 얇은 코팅을 형성한다. 이동 속도는 원심분리력 및 PEO 용액의 점도에 의해 제어된다. 코팅 두께는 입자 이동 속도, 2개의 클릭-반응성 PEG 중합체의 농도, 현탁화제 중합체 mol wt 및 점도에 의해 영향을 받을 수 있다. 코팅된 스페로이드는 바닥으로 침강되었고, 이는 상청액을 제거함으로써 수집되었다. 코팅된 스페로이드는 완충액/혈장으로 세정하여, 4 ℃에서 원심분리에 의해 첨가제 예컨대 PEO, 수크로스, 염 및 비-반응성 PEG를 제거하였다. 코팅된 세포 스페로이드 및 췌장 소도는 형광 필드 하에 공초점 현미경뿐만 아니라 종래의 형광 현미경을 사용하여 시각화되었다. 초-박형 코팅은 5 내지 10 마이크론 두께의 범위로 스페로이드 주변에 균일하게 형성되었다. 세포는 이러한 조건 하에 생존하였고, 코팅 이후 그것의 전체 기능성을 나타내었다.
살아 있는/사멸한 세포는 3일차에 칼시안(calcian)/에티듐 동종이량체-1 (Ethd-1)를 사용하여 코팅된 HCT116 스페로이드 및 상응하는 네이키드 스페로이드에서 조사되었다. 코팅된 스페로이드는 상당하게 높은 수의 사멸한 세포 (적색, 도 11)를 갖는 네이키드 스페로이드와 비교하여 생존 세포 (녹색을 나타냄, 도 12)의 높은 백분율을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이러한 데이터는 제공된 컨포멀 코팅이 세포에 대한 안정성을 제공하고, 이에 따라 이는 네이키드 세포 시험관내와 비교하여 더 긴 시간 동안 생존하였음을 나타낸다.
컨포멀 코팅된 인슐린종 스페로이드 및 랫트 췌장 소도의 방출 동력학 및 인슐린 분비는 이에 따라 바륨/알기네이트 마이크로캡슐화된 및 미코팅된 스페로이드 /소도와 비교되었다.
컨포멀 코팅된 스페로이드 및 랫트 췌장 소도는 낮은, 중간의 및 높은 글루코스 농도에서 상응하는 미코팅된 형태와 동등하게, 그러나 마이크로캡슐화된 제형보다 더 양호하게 매우 잘 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비하였다 (도 15 및 17).
컨포멀 코팅된 제형의 인슐린 방출 동력학은 네이키드 및 바륨/알기네이트 마이크로-캡슐화된 제형보다 더 양호한 것으로 밝혀졌다 (도 16 및 18).
물질 및 방법:
4-아암-PEG-NHS 에스테르 mol wt 5k, 4-아암-PEG-NHS 에스테르 mol wt 5k 및 10k, 4-아암 PEG-아자이드 5k 및 10k는 JenKem technology USA로부터 구입하였다. 4-아암 PEG-NH2 5k 및 10k는 Creative PEG Works로부터 구입하였다. DBCO 시약 및 용매는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 106 내지 125 마이크론 크기의 폴리스티렌 입자를 Polysciences Inc, PA, USA로부터 구입하였다. 스페로이드로 성장된 HCT 116 세포 (Thermo Fisher Scientific로부터 이용가능함)는 72 시간 동안 5% CO2 환경 중에 37 ℃에서 10% 우태 혈청이 스파이킹된 McCoy 5a (Fisher Scientific)에서 성장되었다.
실시예 1: 4 - 아암 -PEG-(NH 2 ) 3 - FITC , [4- 아암 -(PEG-NH 2 ) 3 -PEG-NH-C(=S)=N-플루오레세인], mol wt 5k, 반응식1.
4-아암 PEG NH2 (mol wt 5k) 0.5g (0.1 mmol)을 플루오레세인 이소티오시아네이트 (39 mg, 0.1 mmol)이 암 조건에서 첨가된 DMF(디메틸 포름아미드 10 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 6시간 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 암 조건 하에 1000 mol wt 컷오프 멤브레인을 사용하여 밤새 탈이온수에서 투석하였고, 상기 탈이온수는 4x1L로 교환되었다. 용액을 동결 건조시켰다. 밝은 황색 분말 (512 mg)을 수집하였고, -20 ℃에서 호박색 병에 저장하였다.
실시예 2: 4 - 아암 -PEG-(NH 2 ) 3 - FITC , [4- 아암 -(PEG-NH 2 ) 3 -PEG-NH-C(=S)=NH-플루오레세인], mol wt 10k, 반응식 1.
4-아암 PEG NH2 (mol wt 10k) 0.5 g (0.05 mmol)을 플루오레세인 이소티오시아네이트 (20 mg, 0.05 mmol)이 암조건 하에 첨가된 DMF (10 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 6시간 동안 실온에서 교반되었다. 용액을 암 조건 하에 1000 mol wt 컷오프 멤브레인을 사용하여 밤새 탈이온수에서 투석하였고, 상기 탈이온수는 4x1L로 교환되었다. 용액을 동결 건조시켰다. 밝은 황색 분말 (492 mg)을 수집하였고, -20 ℃에서 호박색 병에 저장하였다.
실시예 3: - 아암 -PEG-( NHCO - PEG 4 - DBCO ) 3 -NH 2 , [4- 아암 - 폴리에틸렌 글리콜-{NH-CO-(CH 2 CH 2 -O) 3 -CH 2 CH 2 NHCOCH 2 CH 2 CO-디벤조사이클로옥틴}3-NH 2 ], mol wt 10k, 반응식 2:
4-아암 PEG NH2 (mol wt 10k) 1.0g (0.1 mmol)을 이 DBCO-PEG4-NHS 에스테르 (195 mg, 0.3 mmol)이 첨가된 메틸렌 염화물 (20ml)에 용해시켰고, 상기 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응을 TLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 이후에, 용매를 진공 하에서 5 ml로 제거되었다. 용액을 냉각된 디에틸 에테르에 한 방울씩 부었다. 생성물을 침전시키고, 여과하여 수집하였다. 생성물을 에테르 4x50 ml로 완전하게 세정하였고, 4시간 동안 진공 하에 건조시켰다. 물질은 옅은 황색 분말 1.1 g로서 수득하였다. 이를 -20 ℃에서 호박색 병에 저장하였다. .
실시예 4: 4 - 아암 -PEG-[NH- PEG 4 - DBCO )] 3 - FITC , [4- 아암 - 폴리에틸렌 글리콜-NH-[CO-(CH 2 CH 2 -O) 3 -CH 2 CH 2 NHCOCH 2 CH 2 CO-디벤조사이클로옥틴]-플루오레세인이 티오시아네이트임], mol wt 10k, 반응식 2.
4-아암-PEG-{NHCO-PEG4-DBCO}3-NH2 (mol wt 10k) 500mg (0.05 mmol)을 플루오레세인 이소티오시아네이트 (20 mg, 0.05 mmol)이 암조건 하에 첨가되는 DMF (5 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 6시간 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 암 조건 하에 1000 mol wt 컷오프 멤브레인을 사용하여 밤새 탈이온수에서 투석하였고, 상기 탈이온수는 4x1L로 교환되었다. 용액을 동결 건조시켰다. 밝은 황색 분말 (485 mg)을 수집하였고, -20 ℃에서 호박색 병에 저장하였다.
실시예 5: 4 - 아암 -PEG-NH- DBCO : 4- 아암 - 폴리에틸렌 글리콜-{NH-CO-(CH 2 ) 4 -코- 디벤조사이클로옥틴 , mol wt 10k, 반응식 3:
4-아암 PEG NH2 (mol wt 10k) 1.4 g (0.14 mmol)을 이 DBCO-설포-NHS 에스테르 (0.30 g, 0.56 mmol)을 첨가한 인산염 완충액에 용해시켰고, 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응을 TLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 이후에, 반응 혼합물을 교반하면서 냉각된 이소-프로판올 (500 ml)로 한 방울씩 부었다. 생성물을 침전시키고, 여과하여 수집하였다. 생성물을 다시 CH2Cl2 (20 ml)에 용해시켰고, 냉각된 디에틸 에테르 (300 ml)에 부었다. 생성물을 분말로서 침전시켰고, 이것을 여과하여 수집하였고, 에테르 4x50 ml로 완전하게 세정하였고, 4시간 동안 진공 하에 건조시켰다. 물질은 옅은 황색 분말 1.65 g로서 수득하였다. 이를 -20 ℃에서 호박색 병에 저장하였다.
실시예 6: 4 - 아암 -PEG-NH- PEG 4 - DBCO : 4- 아암 - 폴리에틸렌 글리콜-NH-CO-(CH 2 CH 2 -O) 3 -CH 2 CH 2 NCOCH 2 CH 2 CO-디벤조사이클로옥틴], mol wt 10k, 반응식4 :
4-아암 PEG NH2 (mol wt 10k) 1.4 g (0.14 mmol)을 이 DBCO-PEG4-NHS 에스테르 (0.37 g, 0.56 mmol)가 첨가된 메틸렌 염화물 (30 ml)에 용해시켰고, 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완료된 이후에, 반응을 TLC로 모니터링하였고; 용매를 진공 하에 5 ml로 제거하였다. 용액을 냉각된 디에틸 에테르에 한 방울씩 부었다. 생성물을 침전시키고, 여과하여 수집하였고, 이를 에테르 4x50ml로 완전하게 세정하였고, 4시간 동안 진공 하에 건조시켰다. 물질은 옅은 황색 분말 1.71 g로서 수득하였다. 이를 -20 ℃에서 호박색 병에 저장하였다.
실시예 7: PEG 링커를 갖는 클릭 반응성 DBCO 기를 함유하는 메타크릴로일옥시포스포콜린 -알릴아민의 클릭 반응성 공중합체의 합성 (반응식 5):
메타크릴로일옥시포스포콜린-알릴아민 공중합체 (LIPIDURE®NH-01, 5% 중합체 용액, 20 ml)의 용액을 DMF (5 ml) 중의 DBCO-PEG4-NHS 에스테르 (400 mg)가 첨가된 둥근바닥 플라스크에 넣었고, 혼합물을 실온에서 자석 교반 막대로 교반하였다. 즉시, 트리에틸아민 (100 μL)을 혼합물에 첨가하여 약 8.5로 pH를 유지하고, 교반을 16시간 동안 실온에서 지속하였다. 반응의 종료시, 반응 혼합물을 투석하였다 (10K mol wt 컷오프 멤브레인). 용액을 동결 건조시켰다. 중합체를 백색 분말로서 수득하였다. 1H NMR (D2O): 0.96-1.16 (m, CH3); 1.5-2.2 m (골격 CH2); 2.8 -3.2 m; 3.8-4.4 m; 4.7 m, 6.8 내지 7.3 확산 피크 (방향족 H).
실시예 8: 클릭 반응성 아자이드기를 함유하는 메타크릴로일옥시포스포콜린 - 알릴아민의 공중합체의 합성 (반응식 6):
메타크릴로일옥시포스포콜린-알릴아민 공중합체 (LIPIDURE®NH-01, 5% 중합체 용액, 20 ml)의 용액을 DMF (5 ml) 중의 아지도-PEG12-NHS 에스테르 (400mg)가 첨가된 둥근바닥 플라스크에 넣었고, 한편 혼합물을 실온에서 자석 교반 막대로 교반하였다. 즉시, 트리에틸아민 (100 마이크로리터)을 혼합물에 첨가하여 약 8.5로 pH를 유지하고, 교반을 16시간 동안 실온에서 지속하였다. 반응의 종료시, 반응 혼합물을 투석하였다 (10K mol wt 컷오프 멤브레인). 용액을 동결 건조시켰다. 중합체를 백색 분말로서 수득하였다. 1H NMR (D2O): 3.15 (s, 사차 CH3 기); 3.58 s, 3.9-4.28 (m, -CH2).
실시예 9: 소수성 알킬 사슬 링커를 갖는 클릭 반응성 DBCO 기를 함유하는 메타크릴로일옥시포스포콜린 -알릴아민의 클릭 반응성 공중합체의 합성 (반응식 7):
메타크릴로일옥시포스포콜린-알릴아민 공중합체 (LIPIDURE®NH-01 , 5% 중합체 용액, 20 ml)의 용액을 DBCO- (C6-링커)-설포N-하이드록시석신이미드 에스테르 (400 mg) 분말이 첨가된 둥근바닥 플라스크에 넣고, 혼합물을 실온에서 자석 교반 막대로 교반하였다. 즉시, NaHCO3 (100 mg 분말)을 혼합물에 첨가하여 약 7.4로 pH를 유지하였고, 교반을 16시간 동안 실온에서 지속하였다. 반응의 종료시, 반응 혼합물을 투석하였다 (10K mol wt 컷오프 멤브레인). 용액을 동결 건조시켰다. 중합체를 옅은 황색의 면 유사 물질로서 수득하였다. 1H NMR (D2O): 0.98-1.18 (m, CH3); 1.6-2.2 m; 2.8 -3.4 m; 3.9-4.3 m; 4.8 m, 6.9 내지 7.3m (방향족 H).
실시예 10: 플루오레세인 태그를 갖는 클릭 반응성 DBCO 기를 함유하는 메타크릴로일옥시포스포콜린 -알릴아민의 클릭 반응성 공중합체의 합성 (반응식 8):
둥근바닥 플라스크에 클릭 반응성 DBCO 중합체를 함유하는 메타크릴로일옥시포스포콜린-알릴아민(100 mg) 및 자석 교반 막대를 충전하였다. 플라스크에, 10 mL의 탈이온수를 첨가하고, 중합체가 완전하게 용해될 때까지 교반하였다. 중합체 용액의 pH는 7.1이었고, 이는 트리에틸아민으로 8.0으로 조정되었다. 플루오레세인 이소티오시아네이트 35 mg을 바이알에서 칭량 주입하였고, 암조건 하에 DMF (5 ml)에 용해시켰다. 플루오레세인 이소티오시아네이트 용액을 중합체 용액에 첨가하였고, 혼합물을 암조건 하에 밤새 교반하였다. 반응의 종료시, 반응 혼합물을 10K mol wt 컷오프 멤브레인을 사용하여 탈이온수에 대해 암조건 하에 투석하였다. 투석의 완료 이후, 투석 백의 내용물을 동결 건조시켰다. 생성물은 밝은 황색의 스펀지 유사 물질 (120 mg)로 수득되었다. 생물학적 표면의 코팅을 위한 다른 클릭 반응성 중합체와 혼합함으로써 직접적으로 생성물을 사용하였다.
실시예 11: HCT116 스페로이드: HCT116 세포 스페로이드 제조에 대한 절차
10% 우태 혈청이 스파이킹된 100 마이크로리터의 McCoy 5a 완충액을 함유하는 웰당 500, 1000 및 1500 세포의 용량으로 각 웰에 HCT 116 세포주를 씨딩하였다. 5% CO2 하에 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션시켰다. 72시간 이후, 스페로이드를 수집하였고, PBS로 세정하였고, 컨포멀 코팅을 위해 즉시 사용하였다.
실시예 12: 랫트 인슐린종 세포 스페로이드 : 인슐린종 세포 스페로이드 제조에 대한 절차
10% 우태 혈청을 함유하는 100 마이크로리터의 DMEM 배지를 함유하는 웰당 1000의 용량으로 각 웰에 랫트 인슐린종 세포 (ins-1 세포)을 씨딩하였다. 5% CO2 하에 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션시켰다. 72시간 이후, 스페로이드를 수집하였고, 컨포멀 코팅을 위해 즉시 사용하였다.
실시예 13: 랫트 췌장 소도: 코팅이 수행될 때까지의 췌장 소도 단리 및 보존에 대한 절차
랫트 소도를 콜라겐분해효소 증해 방법을 사용하여 랫트 소도를 위스타 랫트로부터 단리하였다. Carter 등, BIOLOGICAL PROCEDURES ONLINE, vol 11, 넘버 1, 2009. 근위의 일반 담관을 카테터로 캐뉼레이팅시키고, 10 mL의 냉각된 콜라겐분해효소 용액을 서서히 주사하였다. 전체 췌장절제술을 주의하여 수행하여 췌장 캡슐의 완전성을 유지하였다. 단리된 췌장 조직을 37 ℃에서 20분 동안 추가의 5 mL의 콜라겐분해효소 용액에서 인큐베이션시켰고, 그 다음 조직을 격렬한 진탕 하에 분해시켰다. 0.02 % DNase I 및 1 % 우태 혈청 알부민을 함유하는 30 mL의 냉각된 HBSS 완충액으로 2회 세정한 이후, 이를 와이어 메쉬 스크린에 통과시키고, 이후 4 ℃에서 3분 동안 1300 rpm에서 원심분리하였다. 이후 물질은 10 mL의 히스토파크-1077 용액에 현탁시켰다. 상기 조직 현탁액을 0.02% DNase I 및 1% 우태 혈청 알부민을 함유하는 10 mL의 HBSS 완충액과 함께 오버레잉시켰고, 이후 4 ℃에서 3분 동안 1800 rpm에서 원심분리하였다. 정제된 소도를 최상부와 제2 층 사이의 계면으로부터 피펫을 사용하여 수집하였고, RPMI-1640 배지로 반복적으로 세정하였다. 세정된 소도를 얼음으로의 저장 하에 보존하였고, 컨포멀 코팅을 위해 즉시 사용하였다.
실시예 14: 컨포멀 코팅 방법: 코팅 이전에 진공 건조가 후속되는 분산매로서의 수크로스 중에서의 활성화된 에스테르 방법을 사용한 폴리스티렌 (PS) 입자의 컨포멀 코팅.
폴리스티렌 (PS) 입자 (106 내지 125 마이크론 크기) 50mg, 4-아암 PEG-NH2 (5k) 50mg 및 4-아암 PEG(NH2)3-FITC (5k) 200 마이크로리터 1% 용액을 400 마이크로리터의 물과 혼합하였다. 페이스트를 6시간 동안 진공 원심분리기 상에서 30 ℃에서 진공 건조시켰다. 펠릿을 250 마이크로리터의 수크로스 용액 (60%)에 현탁시켰다. 활성화된 4-아암 PEG-NHS 에스테르 (5k), (20 mg을 80 마이크로리터 물에 용해시켰음)의 새롭게 제조된 용액을 3분 동안 2000 rpm으로 와동시키면서 수크로스 용액 중의 PS 입자에 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 3000rpm으로 4 ℃에서 원심분리하였고, 상청액을 제거하였다. 펠릿은 PBS (2ml)에 현탁시키고 와동시켜 용액 중에 코팅된 입자를 균일하게 분산시키고, 다시 5분 동안 3000 rpm으로 4 ℃에서 원심분리시켰다. 세정 절차를 5회 반복하여 과잉의 비-반응된 중합체 및 수크로스를 제거하였다. 코팅된 입자를 현미경 평가를 위해 웰로 이송시켰다. 공초점 현미경 이미지는 입자가 형광 필드 하에 시각화되는 바와 같이 균일하게 코팅된 것을 나타내었다, 도 1.
실시예 15: 4 - 아암 PEG- NHS 활성화된 에스테르 (10k)로의 폴리스티렌 입자의 하기 용액 중의컨포멀 코팅: PEO (8 백만 mol.Wt.)1% 용액 (최상층의 분산매로의 것).
2ml 원심관에 100 마이크로리터의 15% 수크로스 용액을 장입하였다 (층 3). 4-아암 PEG-NHS, 10k, 20 mg을 함유하는 이러한 200 마이크로리터의 2.5% 수크로스 용액의 최상부에 층상화하였다 (제2 층). 이의 최상부에 폴리스티렌 입자 1 mg, 4-아암 PEG-NH2 (10k, 5 mg), 4-아암 PEG-(NH2)3-FITC 10k (5 마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (8 백만 mol wt) 50 마이크로리터의 1% 용액을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (층 1). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 60 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 PS 입자를 바닥에서 침강시켰고, 상청액을 조심스럽게 제거하고, 새로운 탈이온수 (2 ml)를 교체하고 와동시켜 액체 중의 층을 균일하게 분산시키고, 3분 동안 1000 rpm으로 다시 이를 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 담수로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 코팅된 입자를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 필드 하의 공초점 현미경 이미지는 폴리스티렌 입자가 균일하게 코팅된 것을 나타낸다, 도 2.
실시예 16: 최상층의 분산매로서 PEO (4 백만 mol wt) 1% 용액에서의 4- 아암 PEG-NHS 에스테르 (10k)로의 폴리스티렌 입자의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 100 마이크로리터의 15% 수크로스 용액을 장입하였다 (층 3). 4-아암 PEG-NHS, (10k, 및 20 mg)를 함유하는 이 200 마이크로리터의 2.5% 수크로스 용액의 최상부 상에 층상화하였다 (제2 층). 이의 최상부 상에 폴리스티렌 입자 1mg, 4-아암 PEG-NH2 (5 mg,10k), 4-아암 PEG-(NH2)3-FITC (10k, 5 마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (4 백만 mol wt) 50 마이크로리터의 1% 용액을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (층 1). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 60 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 폴리스티렌 입자를 바닥에서 침강시켰고; 상청액을 조심스럽게 제거하고, 새로운 탈이온수 (2 ml)를 교체하였다. 이를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 3분 동안 다시 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 담수로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 종료시, 코팅된 입자를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 필드 하의 공초점 현미경 이미지는 입자가 균일하게 코팅된 것을 나타낸다, 도 3.
실시예 17: 최상층의 분산매로서 PEO (1 백만 mol wt) 1% 용액에서의 4- 아암 PEG-NHS 활성화된 에스테르 (10k)로의 폴리스티렌 입자의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 100 마이크로리터의 15% 수크로스 용액을 장입하였다 (층 3). 이의 최상부 상에 4-아암 PEG-NHS, (10k) 20 mg을 함유하는 200 마이크로리터의 2.5% 수크로스 용액을 층상화하였다 (제2 층). 이의 최상부 상에 폴리스티렌 입자 1mg, 4-아암 PEG-NH2 (10k, 5mg), 4-아암 PEG-(NH2)3-FITC , (10k, 5마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (1 백만 mol wt) 50 마이크로리터의 1% 용액을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (층 1). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 60 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 폴리스티렌 입자를 바닥에서 침강시켰고; 상청액을 조심스럽게 제거하고, 새로운 탈이온수 (2 ml)를 교체하였다. 이를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 3분 동안 다시 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 담수로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 코팅된 입자를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 필드 하의 공초점 현미경 이미지는 폴리스티렌 입자가 PEO 8 백만 또는 4 백만 현탁화제와 비교하여 PEO 1 백만 mol wt 중에 덜 균일하게 코팅된 것을 나타내었다, 도 4, 3 및 2.
실시예 18: 최상층의 분산매로서 PEO (1 백만 mol wt) 1% 용액에서의 클릭 반응성 중합체 로의 폴리스티렌 입자의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 100 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 장입하였다 (층 3). 이의 최상부 상에 4-아암 PEG-아자이드 (10k mol wt) 10mg을 함유하는 200 마이크로리터의 5% 수크로스 용액을 층상화하였다 (제2 층). 다시 제2의 층의 상부에 PS 입자 1mg, 4-아암 PEG-NH-DBCO, (10k,1.25 mg), 4-아암-PEG-[NH-(PEG)4-dbco)]3-FITC (10k, 1.25마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (1 백만 mol wt) 50 마이크로리터의 1% 용액을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (층 1). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 10 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 입자를 바닥에 침강시켰다. 상청액을 주의하여 제거하고, 새로운 탈이온수(2 ml)로 교체하였다. 이를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 담수로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 세정된 코팅된 입자를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 필드 하의 공초점 현미경 이미지는 비드가 균일하게 코팅된 것을 나타내었다. 도 5를 참조한다.
실시예 19: 최상층의 분산매로서 PEO (8 백만 mol wt) 1% 용액에서의 클릭 반응성 중합체 로의 폴리스티렌 입자의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 100 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 장입하였다 (층 3). 이 위에 4-아암 PEG-아자이드 (10k mol wt) 10mg을 함유하는 200 마이크로리터의 5% 수크로스 용액을 층상화하였다 (제2 층). 제2 층의 최상부 상에, PS 입자 1mg, 4-아암 PEG-NH-DBCO (10k, 1.25 mg), 4-아암-PEG-[NH-(PEG)4-DBCO]3-FITC (10k, 1.25 마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (8 백만 mol wt) 50 마이크로리터의 1% 용액을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (층 1). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 10 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 입자를 바닥에 침강시켰다. 상청액을 주의하여 제거하고, 새로운 탈이온수 (2mL)을 교체하고, 와동시켜, 액체 중에 층을 분산시키고 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 담수로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 세정된 코팅된 입자를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 필드 하의 공초점 현미경 이미지는 PEO 8 백만 mol wt 분산매 중의 PS 입자가 PEO 1백만 mol wt 분산매와 비교하여 균일하게 코팅하였음을 나타내었다. 도 5 및 6을 참조한다.
실시예 20: 최상층의 분산매로서 1 백만 mol wt 1% 용액 중의 PEO에서의 클릭 반응성 중합체로의 HCT116 세포 스페로이드 ( 스페로이드당 500세포 초기 용량)의 컨포멀 코팅 방법
2ml 원심관에 4-아암 peg-아자이드 (10k mol wt) 10mg를 함유하는 200 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 장입하였다 (제2 층). 이의 최상부 상에 HCT-116 세포 스페로이드 (30 스페로이드), 4-아암 PEG-NH-DBCO (10k, 1.25 mg), 4-아암-PEG-[NH-(PEG)4-DBCO]3-FITC (10k, 1.25 마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (1 백만 mol wt, 50 마이크로리터, 염수 중 1% 용액)을 제1의 층으로서 층상화하였다. 튜브를 단단히 밀봉하였고, 3 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 세포 스페로이드를 바닥에 침강시켰다. 상청액을 주의하여 제거하였고, 새로운 McCoy 5a 완충액 2 ml (10% 우태 혈청으로 스파이킹됨)을 교체하고 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 3분 동안 1000 rpm으로 다시 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 3ml의 새로운 완충액으로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 완충액과 함께 코팅된 세포 스페로이드를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 필드 하의 공초점 현미경 이미지는 HCT116 세포 스페로이드가 PEO 4 및 8 백만 mol wt 분산매와 비교하여 덜 균일하게 코팅된 것을 나타내었다, 도 7.
실시예 21: 최상층의 분산매로서 PEO (4 백만 mol wt) 1% 용액 중에서의 클릭 반응성 중합체로의 HCT세포 116 스페로이드 ( 스페로이드 당 500 세포 초기 용량)의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 4-아암 PEG-아자이드 (10k mol wt, 10 mg)를 함유하는 200 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 장입하였다 (제2 층, 바닥층). 이의 최상부 상에 HCT-116 스페로이드 (30 스페로이드), 4-아암 PEG-NH-DBCO (1.25 mg), 4-아암-PEG-[NH-PEG4-DBCO]3-FITC (10k, 탈이온수 중의 1.25 마이크로리터의 1% 용액) 및 PEO (4 백만 mol wt, 염수 중의 50 마이크로리터의 1% 용액)을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (제1 층, 최상층). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 3 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 스페로이드를 바닥에 침강시켰다. 상청액을 주의하여 제거하였고, 새로운 McCoy 5a 완충액 2 ml (10% 우태 혈청으로 스파이킹됨)을 교체하였다. 이를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 3ml의 새로운 완충액으로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 완충액과 함께 코팅된 세포 스페로이드를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 필드 하의 공초점 현미경 이미지는 HCT116 세포 스페로이드가 PEO 1 백만 mol wt 분산매와 비교하여 균일하게 코팅되고 더 양호한 것을 나타내었다, 도 8.
실시예 22: 최상층의 분산매로서 PEO (8 백만 mol wt) 1% 용액 중에서의 클릭 반응성 중합체로의 HCT세포 116 스페로이드 ( 스페로이드 당 500 세포 초기 용량)의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 4-아암 PEG-아자이드 (10k mol wt, 10 mg)를 함유하는 200 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 장입하였다 (제2 층, 바닥층). 이의 최상부 상에 HCT-116 세포 스페로이드 (30 스페로이드), 4-아암 PEG-NH-DBCO (1.25 mg), 4-아암-PEG-[NH-(PEG)4-DBCO]3-FITC (10k, 1.25 마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (8 백만 mol wt, 50마이크로리터, 염수 1% 용액)을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (제1 층, 최상층). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 3 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 스페로이드를 바닥에 침강시켰다. 상청액을 주의하여 제거하였고, 새로운 McCoy 5a 완충액 2 ml (10% 우태 혈청으로 스파이킹됨)을 교체하였다. 이를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 3ml의 새로운 완충액으로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 완충액과 함께 코팅된 세포 스페로이드를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 필드 하의 공초점 현미경 이미지는 HCT116 세포 스페로이드가 PEO 1 백만 분산매와 비교하여 균일하게 코팅되고 더 양호한 것을 나타내었다, 도 9.
실시예 23: 최상층의 분산매로서 PEO (8 백만 mol wt) 1% 용액 중에서의 클릭 반응성 중합체로의 HCT116 세포 스페로이드 ( 스페로이드 당 1000 세포 초기 용량)의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 4-아암 PEG-아자이드 (10k mol wt, 20 mg)를 함유하는 200 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 장입하였다 (제2 층, 바닥층). 이의 최상부 상에 HCT-116 세포 스페로이드 (30 스페로이드), 4-아암 PEG-NH-DBCO (2.5 mg), 4-아암-PEG-[NH-(PEG)4-DBCO]3-FITC (10k, 2.5 마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (8 백만 mol wt, 50 마이크로리터, 염수 중의 1% 용액)을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (제1 층, 최상층). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 3 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 스페로이드를 바닥에 침강시켰고, 상청액을 주의하여 제거하고, 이후 새로운 McCoy 5a 완충액 2 ml (10% 우태 혈청으로 스파이킹됨)의 첨가를 후속하였다. 튜브를 와동시켜 액체 중에 균일하게 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 3ml의 새로운 McCoy 5a 완충액으로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 코팅된 스페로이드를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 필드 하의 공초점 현미경 이미지는 도 10에 도시된 바와 같이 균일하게 코팅된 것을 나타내었다.
실시예 24: 살아 있는/사멸한 세포 검증
생존 세포는 세포내 에스테라제 활성에 의해 구분되고, 이는 사실상 비-형광 칼세인 AM을 형광 칼세인 모이어티로의 효소 전환에 의해 결정된다. 칼세인 AM 염료는 생존 세포 내에서 유지되고, 세포내 에스테라제와 반응하여 ex/em ~495 nm/~515 nm에서 강렬한 녹색 형광을 생성하는 다음이온성 염료이다. 그에 반해서, 에티듐 동종이량체-1 (EthD-1)은 사멸한 세포의 손상된 막을 갖는 세포를 유입하고, 핵산과의 결합시 40-배 향상된 형광이 진행되어 ex/em ~495/~635 nm에서 밝은 적색 형광을 생성하였다. Ethd-1은 생존 세포의 온전한 원형질막에 의해 배제되었다. 이러한 2개의 염료의 조합은 주어진 샘플의 살아 있는/사멸한 세포의 사진을 생성할 것이다.
실시예 25: 살아 있는/사멸한 세포 검종
20 마이크로리터의 2 mM Ethd-1 모액을 10 ml 멸균 조직 배양 등급 Dulbecco PBS에서 취하였다. DMSO 중의 5 마이크로-리터의 4 mM 칼세인 AM 용액을 Ethd-1 용액에 첨가하였고, 혼합물을 와동시켰다. 생성된 살아 있는/사멸한 테스트 시약은 용액 중의 4 마이크로몰 EthD-1당 2 마이크로몰 칼세인을 가진다. 다중-웰 플레이트의 각각의 웰은 100 마이크로리터의 세포-함유 테스트 용액이 장입되고, 이에 100 마이크로리터의 살아 있는/사멸한 테스트 시약을 첨가하고, 30분 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 세포는 2개의 상이한 파장 ex/em ~495 nm/~515 nm 및 ~495/~635 nm에서 공초점 현미경 상에서 평가되었다.
실시예 26: 코팅된 및 네이키드 HCT116 세포 스페로이드의 현미경적 시험 및 살아 있는 세포/사멸한 생존력 검정
코팅된 HCT 세포 116 스페로이드 (1000 세포 초기 용량/스페로이드)을 새롭게 제조하여 2개의 부분으로 나누었다. 컨포멀 코팅은 실시예 19에 기재된 바와 같은 4-아암 PEG-DBCO 및 4-아암PEG 아자이드의 하나의 부분에 적용되었다. 코팅된 및 네이키드 세포 스페로이드 둘 모두를 칼세인 AM/EthD-1 검정을 사용하여 세포 생존력에 대해 즉시 평가하였다. 코팅된 스페로이드 뿐만 아니라 네이키드 스페로이드는 초기에 생존가능 세포를 가졌고, 사멸한 세포는 존재하지 않았다. 5% CO2 하에 McCoy 5a 완충액 중에서 37 ℃에서의 에이징시, 세포사멸은 3일차에 코팅된 세포 스페로이드에 비해 네이키드 스페로이드 (도 11)에서 상당하게 높았다, 도 12.
실시예 27: 최상층의 분산매로서 PEO (1 백만 mol wt) 1% 용액 중에서의 클릭 반응성 중합체로의 인슐린종 세포 스페로이드의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 4-아암 PEG-아자이드 (10k mol wt, 20 mg)를 함유하는 200 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 제2 층으로서 장입하였다 (바닥층). 이의 최상부 상에 인슐린종 스페로이드 (1000 스페로이드), 4-아암 PEG-NG-DBCO (2.5 mg), 4-아암-PEG-[NH-(PEG)4-DBCO]3-FITC (10k, 2.5마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (1 백만 mol wt, 50 마이크로리터, 염수 중의 1% 용액)을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (제1 층). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 3 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 스페로이드를 바닥에 침강시켰고, 상청액을 주의하여 제거하고, 이후 염수 2ml의 첨가를 후속하였다. 튜브를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 2ml의 새로운 완충액으로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 세정된 코팅된 스페로이드를 형광 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 현미경 이미지는 인슐린종 세포 스페로이드가 균일하게 코팅된 것을 나타내었다, 도 13.
실시예 28: 최상층의 분산매로서 PEO (1 백만 mol wt) 1% 용액 중에서의 클릭 반응성 중합체로의 랫트 췌장 소도의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 4-아암 PEG-아자이드 (10k mol wt, 10 mg)를 함유하는 200 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 장입하였다 (제2 층, 바닥층). 이의 최상부 상에 췌장 소도 (100개의 소도), 4-아암 PEG-NH-DBCO (2.5 mg), 4-아암-PEG-[NH-(PEG)4-DBCO]3-FITC (10k, 2.5 마이크로리터, 탈이온수 중의 1% 용액) 및 PEO (1 백만 mol wt, 50 마이크로리터, 염수 중의 1% 용액)을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (제1 층, 최상층). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 3 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하였다.
코팅된 소도를 바닥에 침강시켰고, 상청액을 주의하여 제거하고, 이후 새로운 염수 2ml의 첨가를 후속하였다. 튜브를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 새로운 염수 2 ml로 교체하였고, 이를 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 4회 반복하였다. 마지막으로, 세정된 코팅된 소도를 형광 현미경 연구를 위해 웰에 배치하였다. 형광 현미경 이미지는 췌장 소도가 코팅된 것을 나타내었다, 도 14.
실시예 29: 최상층의 분산매로서 PEO 용액 중에서의 클릭 반응성 MPC 중합체로의 ARPE-19 세포 스페로이드의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 아자이드-변형된 MPC 중합체 (10 mg)를 함유하는 200 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 제2 층으로서 장입하였다 (바닥층). 이의 최상부 상에 ARPE-19 스페로이드 (50 스페로이드), DBCO-변형된 MPC 중합체 (2.5mg), FITC-표지된 DBCO-변형된 MPC 중합체 (0.025 mg) 및 PEO (1 백만 mol wt, 50 마이크로리터, 염수 중의 1% 용액)을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (제1 층). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 3 분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 코팅된 스페로이드를 바닥에 침강시켰고, 상청액을 주의하여 제거하고, 이후 염수 2ml의 첨가를 후속하였다. 튜브를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 새로운 PBS 2 ml로 교체하였고, 이를 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 3회 반복하였다. 마지막으로, 세정된 코팅된 스페로이드를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하고, 37 ℃에서 DMEM 배지 중에 배양하였다. 공초점 현미경 이미지는 ARPE-19 세포 스페로이드가 균일하게 코팅되고, 시간에 걸쳐 코팅된 중합체를 제거하여 점차적으로 융합되는 것을 나타내었다, 도 19-21.
실시예 30: 2개의 층에서의 분산매로서 PEO 용액 중에서의 클릭 반응성 MPC 중합체로의 ARPE-19 세포 스페로이드의 컨포멀 코팅
2ml 원심관에 아자이드-변형된 MPC 중합체 (10 mg) 및 PEO (1 백만 mol wt, 2 mg)를 함유하는 200 마이크로리터의 10% 수크로스 용액을 제2 층으로서 장입하였다 (바닥층). 이의 최상부 상에 ARPE-19 스페로이드 (50 스페로이드), DBCO-변형된 MPC 중합체 (2.5 mg), FITC-표지된 DBCO-변형된 MPC 중합체 (0.025 mg) 및 PEO (1 백만 mol wt, 50 마이크로리터, 염수 중의 1% 용액)을 함유하는 용액의 혼합물을 층상화하였다 (제1 층). 튜브를 단단히 밀봉하였고, 3 분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 코팅된 스페로이드를 바닥에 침강시켰고, 상청액을 주의하여 제거하고, 이후 염수 2ml의 첨가를 후속하였다. 튜브를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 2ml의 새로운 PBS로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 3회 반복하였다. 마지막으로, 세정된 코팅된 스페로이드를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하고, 37 ℃에서 DMEM 배지 중에 배양하였다. 공초점 현미경 이미지는 ARPE-19 세포 스페로이드가 균일하게 코팅되고, 2개월 미만으로 안정하고 융합되지 않음을 나타내었다, 도 22-28.
실시예 31: 2개의 층에서의 분산매를 사용하는 최상층의 연속 첨가 방법에 의한 클릭 반응성 중합체로의 ARPE-19 세포 스페로이드의 컨포멀 코팅
DBCO-변형된 MPC 중합체 (0.5 mg), FITC-표지된 DBCO-변형된 MPC 중합체 (0.05 mg) 및 PEO (1백만 mol wt, 0.1 mg)을 함유하는 10 마이크로리터의 200 ARPE-19 스페로이드-현탁된 염수 용액을 피펫 팁으로 도입하고, 바닥에서 아자이드-변형된 MPC 중합체 (10 mg) 및 PEO (1 백만 mol wt, 2 mg)를 함유하는 200 마이크로리터의 10 % 수크로스 용액이 충전된 마이크로튜브에서 배합시켰다. 마이크로튜브를 3분 동안 1000 rpm으로 테이블-최상부 원심분리기를 사용하여 원심분리시켰다. 코팅된 스페로이드는 바닥에 침강시켰고, 상청액을 주의하여 제거하여, 이후 염수 2ml의 첨가를 후속하였다. 튜브를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 2ml의 새로운 PBS로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 3회 반복하였다. 마지막으로, 세정된 코팅된 스페로이드를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하고, 37 ℃에서 DMEM 배지 중에 배양하였다. 공초점 현미경 이미지는 ARPE-19 세포 스페로이드가 균일하게 코팅되고, 고수율 비로 수득되었다, 도 29.
실시예 32: 2개의 층에서의 분산매를 사용하고 최상층의 연속 첨가 방법에 의한 클릭 반응성 MPC 중합체로의 랫트 췌장 소도의 컨포멀 코팅
50개의 소도 (5 마이크로리터 용적)을 DBCO-변형된 MPC 중합체 (0.25 mg), FITC-표지된 DBCO-변형된 MPC 중합체 (0.025 mg) 및 PEO (1백만 mol wt, 0.05 mg)를 함유하는 염수 용액에 현탁시키고, 피펫 팁으로 도입시키고, 바닥에서 아자이드-변형된 MPC 중합체 (5 mg) 및 PEO (1 백만 mol wt, 1 mg)를 함유하는 100 마이크로리터의 10 % 수크로스 용액이 충전된 마이크로튜브에서 배합시켰다. 마이크로튜브를 3분 동안 1000 rpm으로 테이블-최상부 원심분리기를 사용하여 원심분리시켰다. 코팅된 소도를 바닥에 침강시켰고, 상청액을 주의하여 제거하여, 이후 염수 2ml의 첨가를 후속하였다. 튜브를 와동시켜 액체 중에 층을 분산시키고, 다시 3분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 2ml의 새로운 PBS로 교체하고, 와동시켜 층을 분산시켰다. 세정 절차를 3회 반복하였다. 마지막으로, 세정된 코팅된 소도를 공초점 현미경 연구를 위해 웰에 배치하고, 37 ℃에서 RPMI 배지 중에 배양하였다. 공초점 현미경 이미지는 소도가 균일하게 코팅되었고, 코팅된 중합체는 안정적으로 최대 26일 동안 존재하였음을 나타내었다, 도 30-33.
실시예 33: 네이키드 인슐린종 세포 스페로이드와 비교되는 실시예 27의 코팅된 인슐린종 세포 스페로이드의 인슐린 분비 연구
코팅된 인슐린종 스페로이드 및 네이키드 인슐린종 스페로이드 (각각 100개의 스페로이드)을 평형 및 사전-인큐베이션을 위해 37 ℃에서의 1시간 동안 1 mL의 1밀리몰 글루코스 Krebs 완충액 (Sigma)을 함유하는 웰에 배치되었다. 이에 이어서 37 ℃에서 낮은 글루코스 (3 밀리몰, 1 mL), 높은 글루코스 (10 밀리몰, 1 mL) 및 낮은 글루코스 (3 밀리몰, 1 mL) Krebs 완충액에서 2시간 동안 순차적인 인큐베이션이 후속되었다. 낮은 글루코스 완충액에서의 인큐베이션의 종료시, 100 마이크로리터의 상청액을 검정을 위해 수집되었다. 높은 글루코스 완충액의 경우, 각각의 시점 (10, 30, 60, 90, 120 분)에서 30 마이크로리터의 상청액을 검정을 위해 수집되었고, 다시 낮은 글루코스 완충액의 경우, 100 마이크로리터의 상청액을 검정을 위해 수집되었다. 수집된 샘플을 ELISA에 의해 평가하였다. 글루코스에 대한 인슐린 분비 반응성을 코팅된 및 네이키드 스페로이드 둘 모두에 대해 확인되었고, 코팅된 스페로이드의 인슐린 분비는 높은 글루코스 완충액에서의 네이키드 스페로이드와 비슷하였다. 도 15를 참조한다. 높은 글루코스 완충액에서의 코팅된 스페로이드의 인슐린 분비의 지연은 관측되지 않았고, 이는 네이키드 스페로이드에 상대적이나, 마이크로캡슐화된 (바륨/알기네이트) 제형에 대해 우수한 것으로 발견되었다. 데이터는 도 16에 플롯팅되었다.
실시예 34: 네이키드 소도와 비교되는 실시예 28의 코팅된 랫트 췌장 소도를 사용한 인슐린 분비 연구
코팅된 랫트 소도 및 네이키드 소도 (각각 20개의 소도)를 평형 및 사전-인큐베이션을 위해 37 ℃에서의 1시간 동안 1 mL의 1밀리몰 글루코스 Krebs 완충액 (Sigma)을 함유하는 웰에 배치되었다. 이에 이어서 37 ℃에서 낮은 글루코스 (2 mM, 1 mL), 높은 글루코스 (20 mM, 1 mL) 및 낮은 글루코스 (2 mM, 1 mL) Krebs 완충액에서 2시간 동안 순차적인 인큐베이션이 후속되었다. 낮은 글루코스 완충액에서의 인큐베이션의 종료시, 100 마이크로리터의 상청액을 검정을 위해 수집되었다. 높은 글루코스 완충액의 경우, 각각의 시점 (10, 30, 60, 90, 120 분)에서 30 마이크로리터의 상청액을 검정을 위해 수집되었고, 다시 낮은 글루코스 완충액의 경우, 100 마이크로리터의 상청액을 검정을 위해 수집되었다. 수집된 샘플을 ELISA에 의해 평가하였다. 글루코스에 대한 인슐린 분비 반응성은 코팅된 및 네이키드 스페로이드 둘 모두에 대해 확인되었고, 코팅된 소도의 인슐린 분비는 높은 글루코스 완충액에서의 네이키드 소도와 비슷하였다, 도 17. 높은 글루코스 완충액에서의 코팅된 스페로이드에 대한 인슐린 분비의 지연은 관측되지 않았고, 이는 네이키드 스페로이드에 대해 상대적이고, 이는 마이크로캡슐화된 (바륨/알기네이트) 제형에 대해 우수한 것으로 발견되었다. 데이터는 도 18에 플롯팅된다.
실시예 35: 실시예 32의 연속적 첨가 방법에 의한 코팅된 소도 및 네이키드 랫트 소도의 현미경적 시험 및 살아 있는/사멸한 생존력 검정
소도는 둘베코 인산염 완충액 염수 (DPBS)로 간단히 세정하고, 4 μM 칼세인 AM 및 8 μM 에티듐 동종이량체-1 (EthD-1)으로 구성된 DPBS에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 소도의 생존력은 공초점 현미경 상에서 평가되었다. 코팅된 스페로이드 뿐만 아니라 네이키드 스페로이드는 초기에 거의 모두 생존가능한 세포를 가진다. 배양 배지에서의 에이징 시에, 네이키드 소도는 29일차에 서로의 응집으로 인하여 중심 세포 괴사를 야기하였고, 한편 코팅된 소도는 코팅된 중합체의 효과에 의한 응집을 회피하기 위해 여전히 살아 있었다, 도 34-37
실시예 36: 네이키드 소도와 비교되는 실시예 32의 연속적 첨가 방법에 의해 코팅된 랫트 췌장 소도의 인슐린 분비 연구
코팅된 랫트 소도 및 네이키드 소도 (각각 20개의 소도)를 평형 및 사전-인큐베이션을 위해 37 ℃에서 1시간 동안 1 mL의 1 mM 글루코스 Krebs 완충액을 함유하는 웰에 배치하였다. 이에 이어서 37 ℃에서 낮은 글루코스 (2 mM, 1 mL), 높은 글루코스 (20 mM, 1 mL) 및 낮은 글루코스 (2 mM, 1 mL) Krebs 완충액에서 2시간 동안 순차적인 인큐베이션이 후속되었다. 각각의 글루코스 완충액에서의 인큐베이션의 종료시, 100 μl의 상청액을 검정을 위해 수집되었다. 수집된 샘플을 ELISA에 의해 평가하였다. 네이키드 및 코팅된 소도 둘 모두의 인슐린 분비 기능은 17일까지 시험관내 배양액 하에 일관된 것으로 밝혀졌고, 그러나, 네이키드 소도는 23일차에 그것의 기능이 상당하게 감소되었고, 한편 코팅된 소도는 여전히 그의 기능을 유지하였다, 도 38,39.
예컨대 "약," "적어도," "미만", 및 "초과"와 같은 이러한 응용분야에서의 일부 파라미터를 기술하는 모든 수치 한계에 대해, 설명은 또한 반드시 인용된 값에 의해 한정된 임의의 범위를 포괄하는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 예를 들어, 설명 "적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5"는 또한 특히, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-3, 2-4, 2-5, 3-4, 3-5, 및 4-5, 등의 범위를 기술한다.
모든 특허, 적용, 또는 본원에 인용된 다른 참조문헌, 예컨대 비-특허 문헌 및 기준 서열 정보의 경우, 이들은 모든 목적을 위해 그리고 이에 인용된 제시를 위해 그 전문이 참조로 편입되어 있음을 이해하여야 한다. 참조로 편입된 문헌과 본 출원 사이에 임의의 상충이 존재하는 경우, 본원이 우선할 것이다.
본원에 사용된 제목은 단지 편의를 위한 것이며 본 출원의 해석에 영향을 미치지 않는다.
본 발명에 의해 제공된 각각의 양태의 바람직한 특징은 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 모든 다른 양태에 적용가능하고, 비제한적으로, 종속 청구항에 의해 예시되고, 또한 작용 실시예를 포함하는 특정 구현예 및 본 발명의 양태의 개별 특징 (예를 들어, 수치 범위 및 예시적인 구현예를 포함하는 구성요소)의 조합 및 순열을 포괄한다. 예를 들어, 작업 실시예에서 예시된 특정 실험적 파라미터는 본 발명을 벗어남 없이 단편적으로 청구된 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 개시된 물질의 경우, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별 및 집단적인 조합 및 순열의 특이적 참조는 명확하게 개시되지 않을 수 있지만, 각각은 구체적으로 본원에 고려되고 기재된다. 따라서, 구성요소 A, B, 및 C의 부류가 개시되어 있을 뿐만 아니라 구성요소 D, E, 및 F 및 구성요소 A-D의 조합의 예가 개시되는 경우, 심지어, 각각이 개별적으로 인용되지 않는 한, 각각은 개별적으로 총괄적으로 고려되지 않는다. 따라서, 이 실시예에서, 각각의 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, 및 C-F가 구체적으로 고려되지 않고, A, B, 및 C; D, E, 및 F의 개시내용; 및 예시적인 조합 A-D로부터 개시된 것으로 고려되여야 한다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위세트 또는 조합이 또한 구체적으로 고려되고, 개시되어 있다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F, 및 C-E의 하위그룹이 구체적으로 고려되며, 이는 A, B, 및 C; D, E, 및 F; 및 예시적인 조합 A-D의 개시내용으로부터 고려되어야 한다. 이러한 개념은 주제의 조성물의 구성요소 및 조성물의 제조 또는 사용 방법의 단계를 포함하는 본원의 모든 양태에 적용된다.
명세서의 교시에 따라 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명의 상술한 양태는 선행기술에 비해 신규하고, 명백하지 않은 범위로 임의의 조합 또는 순열에 청구될 수 있고 - 이에 따라 구성요소가 당업자에게 자명한 공지된 하나 이상의 참조문헌에 기재된 범위로, 이는 특징의 부정적 단서 또는 부인 또는 특징의 조합에 의해 청구된 발명으로부터 배제될 수 있다.

Claims (23)

  1. 하이드로겔 컨포멀 코팅을 갖는 생물학적 표면을 포함하는 조성물로서, 컨포멀 코팅 없이 적합한 대조군 생물학적 표면에 비해, 생물학적 표면은 i) 기능을 유지하고 그리고 ii) 손상 또는 다른 형태의 표면 변형을 실질적으로 가지지 않거나, 또는 무시할만한 양의 손상 또는 다른 형태의 표면 변형을 가지는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 다중 암 중합체, 예컨대 4-아암 5-10kDa PEG 또는 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 공중합체 (100-200 kDa 및 60-90% 포스포콜린, 또는 이들의 조합임)의 공유결합 네트워크를 포함하는, 조성물.
  3. 하기 단계를 포함하는 하이드로겔에서의 생물학적 표면의 컨포멀 코팅 방법:
    2개의 수성층을 포함하는 시스템을 제공하는 단계로서, 제1 층은 약 0.25% 내지 약 2% (W/V)의 현탁화제, 약 1% 내지 약 25% (W/V)의 제1 작용화된 다중 암 중합체, 및 생물학적 표면의 용액을 포함하고;
    제2 층은 당류 쿠션 및 약 1% 내지 약 25% (W/V)의 제2 작용화된 다중 암 중합체를 포함하고, 상기 제2 작용화된 다중 암 중합체의 작용기는 생리적 조건 하에 제1 작용화된 다중 암 중합체의 작용기와 반응성인 단계,
    생물학적 표면이 제2 층을 통과하고, 그것에 의해 제1 및 제2 작용기가 반응하여 가교결합된 하이드로겔 컨포멀 코팅된 생물학적 표면을 형성하는 단계.　
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 작용화된 다중 암 중합체가 4-아암 5-10kDa PEG인, 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 제1 작용화된 다중 암 중합체가 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 공중합체 (100-200 kDa 및 60-90% 포스포콜린임)인, 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 작용화된 다중 암 중합체의 작용기는 클릭 작용기, 예컨대 라이신-DBCO를 포함하는 DBCO, 또는 아자이드인, 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 작용화된 다중 암 중합체가 4-아암 5-10 kDa PEG인, 방법.
  8. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 작용화된 다중 암 중합체가 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 공중합체 (100-200 kDa 및 60-90% 포스포콜린임)인, 방법.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 작용화된 다중 암 중합체의 작용기가 클릭 작용기, 예컨대 아자이드 또는 DBCO인, 방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 층은 제2 현탁화제를 포함하고, 임의로 여기서 제2 현탁화제는 제1 층에서의 현탁화제와 동일한 것인, 방법.
  11. 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 제1 층과 제2 층 사이에 개재층을 포함하고, 임의로 상기 개재층은 기체층인, 방법.
  12. 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁화제가 약 1%로 존재하는 약 1-8 MDa의 분자량을 갖는 PEO인, 방법.
  13. 하기 단계를 포함하는 하이드로겔에서의 생물학적 표면의 컨포멀 코팅 방법:
    개재 기체층에 의해 분리되는 2개의 수성층을 포함하는 시스템을 제공하는 단계로서, 제1 층은 약 0.25% 내지 약 2% (W/V)의 현탁화제, 약 1% 내지 약 25% (W/V)의 제1 작용화된 다중 암 중합체, 및 생물학적 표면의 용액을 포함하고;
    제2 층은 약 0.25% 내지 약 2% (W/V)의 현탁화제, 당류 쿠션, 및 약 1% 내지 약 25% (W/V)의 제2 작용화된 다중 암 중합체의 용액을 포함하고, 상기 제2 작용화된 다중 암 중합체의 작용기가 생리적 조건 하에 제1 작용화된 다중 암 중합체의 작용기와 반응성인 단계,
    생물학적 표면을 제2 층에 통과시키고 이에 의해 제1 및 제2 작용기를 반응시켜 가교결합된 하이드로겔 컨포멀 코팅된 생물학적 표면을 형성하고, 여기서 제1 작용화된 다중 암 중합체가 메타크릴로일옥시에틸 포스포콜린 공중합체인 단계.
  14. 제13항에 있어서, 제1 층이 제2 층에 연속적으로 첨가되며, 임의로 상기 제2 층이 원심력 하에 혼합물 이동이 가능하도록 치수화된 오리피스를 갖는 테이퍼링된 측면 암을 통한 제1층의 첨가에 적합한 컨테이너 내에 있는, 방법.
  15. 제3항 내제 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 표면이 원심분리에 의해 제2 층을 통과하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨포멀 코팅의 두께가 약 20 μm 미만인, 조성물 또는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 표면이 살아 있는 세포, 예컨대 동물 세포, 예컨대 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포를 포함하는, 조성물 또는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 살아 있는 세포가 인슐린-생산 세포인, 조성물 또는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 세포가 만능 줄기 세포, 예컨대 유도 만능 줄기 세포인, 조성물 또는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 컨포멀 코팅에 가해지지 않은 적합한 대조군 세포에 비해 약 2 mM 내지 약 20 mM에서 글루코스로의 자극시에, 세포는 적합한 대조군 세포에 실질적으로 유사한 동력학 및/또는 농도로 인슐린을 분비하는, 조성물 또는 방법.
  21. 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 컨포멀 코팅을 갖는 생물학적 표면.
  22. 제1항, 제2항 또는 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제를 더 포함하고, 임의로 생물학적 표면이 주사기 또는 생체적합성 컨테이너에 함유되어 있는, 조성물.
  23. 제1항, 제2항 또는 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항의 치료적 유효량의 조성물을 포유동물 대상체에게 투여하는 단계로서, 임의로 상기 투여는 직접적인 주사 또는 생체적합성 컨테이너의 이식에 의한 것일 수 있는 단계를 포함하는 포유동물 대상체의 치료 방법.
KR1020197017864A 2016-12-13 2017-12-13 생물학적 표면의 컨포멀 코팅 KR20190097055A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662433449P 2016-12-13 2016-12-13
US62/433,449 2016-12-13
PCT/US2017/066072 WO2018112026A1 (en) 2016-12-13 2017-12-13 Conformal coating of biological surfaces

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190097055A true KR20190097055A (ko) 2019-08-20

Family

ID=60991532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197017864A KR20190097055A (ko) 2016-12-13 2017-12-13 생물학적 표면의 컨포멀 코팅

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20190365955A1 (ko)
EP (1) EP3554569A1 (ko)
JP (2) JP7125398B2 (ko)
KR (1) KR20190097055A (ko)
CN (2) CN115463261A (ko)
AU (1) AU2017378248A1 (ko)
CA (1) CA3044892A1 (ko)
EA (1) EA201991452A1 (ko)
IL (1) IL267005B (ko)
MX (1) MX2019006536A (ko)
WO (1) WO2018112026A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3433282B1 (en) 2016-03-24 2022-07-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Alginate hydrogel compositions
WO2018218085A2 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Prellis Biologics, Inc. Three-dimensional printed organs, devices, and matrices
CN111565707A (zh) 2017-06-14 2020-08-21 森玛治疗公司 用于递送治疗物的装置和方法
EP3919093A4 (en) * 2019-02-27 2022-03-30 TERUMO Kabushiki Kaisha METHOD FOR MANUFACTURING MEDICAL DEVICE AND MEDICAL DEVICE

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9506844D0 (en) * 1995-04-03 1995-05-24 Armitage Ian M Pharmaceutical microencapsulation
MXPA05003829A (es) * 2002-10-11 2005-10-05 Novocell Inc Implantacion de materiales biologicos encapsulados para el tratamiento de enfermedades.
US7824672B2 (en) 2004-03-26 2010-11-02 Emory University Method for coating living cells
US7674452B2 (en) 2005-03-16 2010-03-09 Nitto Denko Corporation Polymer coating of cells
JP2009508991A (ja) * 2005-09-15 2009-03-05 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション ポリマー組成物ならびにその作製方法および使用方法
CN102164580A (zh) * 2008-09-16 2011-08-24 恩伟绅技术公司 可分解的生物相容水凝胶及使用其的系统和方法
CN102239248B (zh) * 2008-12-02 2013-10-30 皇家飞利浦电子股份有限公司 同轴封装的细胞悬浮液和微组织
WO2010099818A1 (en) * 2009-03-03 2010-09-10 Ao Technology Ag Thermoreversible polysaccharide hydrogel
ES2637640T3 (es) * 2011-04-29 2017-10-16 Converge Biotech Inc. Recubrimiento conformal de células para inmunoaislamiento
CA2878051A1 (en) * 2012-07-31 2014-02-06 The University Of Akron Strain-promoted crosslinking of peg-based hydrogels via copper-free cycloaddition
JP6270158B2 (ja) * 2012-08-31 2018-01-31 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 凍結保存可能な細胞足場材料
ES2455441B1 (es) * 2012-09-14 2015-02-05 Universidad De Valladolid Hidrogel útil como soporte inyectable para aplicación en terapia celular y como sistema de liberación controlada de fármacos
CN104292454B (zh) * 2013-07-17 2017-12-01 北京键凯科技股份有限公司 聚乙二醇‑环辛炔衍生物
US9381217B2 (en) * 2013-09-09 2016-07-05 Georgia Tech Research Corporation Microgels for encapsulation of cells and other biologic agents
US20170182220A1 (en) * 2014-02-26 2017-06-29 University Of Massachusetts Degradable hydrogel with predictable tuning of properties, and compositions and methods thereof
CN104530441B (zh) * 2015-01-19 2017-08-25 中山大学 一种用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物及其制备方法与应用
US10774186B2 (en) * 2015-04-03 2020-09-15 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Photodegradable hydrogel, culture device, method for forming tissue, and method for separating cells
LT3347061T (lt) * 2015-09-09 2021-09-10 ETH Zürich Įšvirkščiami makroporiniai hidrogeliai

Also Published As

Publication number Publication date
IL267005B (en) 2021-12-01
EA201991452A1 (ru) 2020-01-16
CA3044892A1 (en) 2018-06-21
JP2020501646A (ja) 2020-01-23
US20240091414A1 (en) 2024-03-21
WO2018112026A1 (en) 2018-06-21
MX2019006536A (es) 2019-08-22
US20190365955A1 (en) 2019-12-05
EP3554569A1 (en) 2019-10-23
IL267005A (en) 2019-07-31
JP7125398B2 (ja) 2022-08-24
AU2017378248A1 (en) 2019-07-04
JP2022022330A (ja) 2022-02-03
CN110049789B (zh) 2022-07-19
CN115463261A (zh) 2022-12-13
CN110049789A (zh) 2019-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240091414A1 (en) Conformal coating of biological surfaces
Abbina et al. Surface engineering for cell-based therapies: Techniques for manipulating mammalian cell surfaces
Wang et al. Microencapsulation using natural polysaccharides for drug delivery and cell implantation
Hasturk et al. Cell armor for protection against environmental stress: Advances, challenges and applications in micro-and nanoencapsulation of mammalian cells
US10513587B2 (en) Self-integrating hydrogels and methods for making the same
Scott et al. Modular scaffolds assembled around living cells using poly (ethylene glycol) microspheres with macroporation via a non-cytotoxic porogen
US7943353B2 (en) Multi-layer cell encapsulation for tissue engineering
Bhatia et al. Polyelectrolytes for cell encapsulation
Stewart et al. Cross-linked hydrogels formed through Diels–Alder coupling of furan-and maleimide-modified poly (methyl vinyl ether-alt-maleic acid)
WO1995026714A1 (en) Living cells microencapsulated in a polymeric membrane
Xue et al. Controllable fabrication of alginate/poly-L-ornithine polyelectrolyte complex hydrogel networks as therapeutic drug and cell carriers
TW202015801A (zh) 可注射型自組裝微球凝膠、其用途及可注射型自組裝微球凝膠的製備方法
Hwang et al. Synthesis and characterization of functional nanofilm-coated live immune cells
He et al. Controllable fabrication of composite core–shell capsules at a macroscale as organoid biocarriers
Davis et al. Coatings on mammalian cells: interfacing cells with their environment
EP3017301B1 (en) Microtissues
Mazumder et al. Self-cross-linking polyelectrolyte complexes for therapeutic cell encapsulation
Hastings et al. Crosslinked hydrogel capsules for cell encapsulation formed using amino/betaine dual-functional semibatch copolymers
KR100380569B1 (ko) 고분자 결합을 이용한 췌장소도 막의 표면개질 방법
CA2445363C (en) Semi-permeable microcapsule with covalently linked layers and method for producing same
EP3946254B1 (en) Capsule comprising insulin-secreting cells for treating diabetes
CN106421925B (zh) 基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法
US9198872B2 (en) Dendritic and hyperbranched polymers for cellular encapsulation and functionalization
Teramura et al. Polymeric Materials for Surface Modification of Living Cells
Tiruvannamalai Annamalai A Bottom-Up Assembly Of Vascularized Bioartificial Constructs Using Ecm Based Microscale Modules

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant