JP6270158B2 - 凍結保存可能な細胞足場材料 - Google Patents
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Description
アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性電解質高分子であって、アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、両性電解質高分子が、
生理的溶液中で、分子間架橋されて、
生理的溶液が分散媒として固定されてなる、ハイドロゲル。
(2)
分子間架橋が、
両性電解質高分子の分子、又は両性電解質でない高分子の分子、に導入されたアジド基と、
両性電解質高分子の別な分子、又は両性電解質でない高分子の別な分子、に導入された炭素炭素三重結合部分とのトリアゾール環形成反応によって生成された分子間架橋(ただし、アジド基が導入された分子と炭素炭素三重結合部分が導入された分子のうち、少なくともいずれかの分子が、両性電解質高分子である)、
又は
両性電解質高分子のアミノ基と、マルチアームPEGのN−ヒドロキシコハク酸イミドの基とのアミド結合形成反応によって生成された分子間架橋、
である、(1)のハイドロゲル。
(3)
両性電解質高分子が、アミノ基及びカルボキシル基がデキストランに導入されてなるアミノカルボキシルデキストランであり、両性電解質でない高分子がデキストランである、
又は
両性電解質高分子が、カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンである、
(1)〜(2)のいずれかのハイドロゲル。
(4)
両性電解質高分子が、生理的溶液中に1〜60質量%含まれている、(1)〜(3)のいずれかのハイドロゲル。
(5)
(1)〜(4)のいずれかのハイドロゲルに、細胞又は組織が包埋されてなる、細胞包埋ハイドロゲル。
(6)
(1)〜(4)のいずれかのハイドロゲルに、細胞又は組織が包埋されてなる、凍結保存用細胞包埋ハイドロゲル。
(7)
(6)の凍結保存用細胞包埋ハイドロゲルを凍結保存する、細胞又は組織の凍結保存方法。
(11)
アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性電解質高分子であって、アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、両性電解質高分子を、生理的溶液中で、分子間架橋して、ゲル化する工程、を含む、ハイドロゲルを製造する方法。
(12)
分子間架橋して、ゲル化する工程が、
両性電解質高分子の分子、又は両性電解質でない高分子の分子、に導入されたアジド基と、
両性電解質高分子の別な分子、又は両性電解質でない高分子の別な分子、に導入された炭素炭素三重結合部分とのトリアゾール環形成反応によって分子間架橋して(ただし、アジド基が導入された分子と炭素炭素三重結合部分が導入された分子のうち、少なくともいずれかの分子が、両性電解質高分子である)、ゲル化する工程、
又は
両性電解質高分子のアミノ基と、添加されたマルチアームPEGのN−ヒドロキシコハク酸イミドの基とのアミド結合形成反応によって分子間架橋して、ゲル化する工程、
である、(11)の製造方法。
(13)
両性電解質高分子が、アミノ基及びカルボキシル基がデキストランに導入されてなるアミノカルボキシルデキストランであり、両性電解質でない高分子がデキストランである、
又は
両性電解質高分子が、カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンである、
(11)〜(12)のいずれかの製造方法。
(14)
両性電解質高分子が、生理的溶液中に1〜60質量%含まれている、(11)〜(14)のいずれかの製造方法。
(15)
(11)〜(14)のいずれかの製造方法において、分子間架橋して、ゲル化する工程の前に、
生理的溶液中に、細胞又は組織を、両性電解質高分子とともに、分散又は浸漬する工程、
を含む、細胞包埋ハイドロゲルを製造する方法。
(16)
(15)の製造方法において製造された細胞包埋ハイドロゲルを、凍結保存する工程、
を含む、細胞又は組織の凍結保存方法。
(17)
(11)〜(14)のいずれかの製造方法において、分子間架橋して、ゲル化する工程の前に、
生理的溶液中に、細胞又は組織を、両性電解質高分子とともに、分散又は浸漬する工程、
分散又は浸漬された細胞又は組織を、凍結保存する工程、
を含む、細胞又は組織の凍結保存後に、細胞包埋ハイドロゲルを製造する方法。
アミノ基及びカルボキシル基がデキストランに導入されてなる、アミノカルボキシルデキストランであって、
アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、アミノカルボキシルデキストラン。
(22)
(21)のアミノカルボキシルデキストランからなる、細胞凍結保存剤。
(23)
(21)のアミノカルボキシルデキストランが、
生理的溶液中に、1〜60質量%の濃度で溶解されて含まれる、細胞凍結保存用溶液。
(24)
生理的溶液が、生理食塩水、細胞培養液体培地、または組織培養液体培地である、(23)の細胞凍結保存用溶液。
(31)
アミノカルボキシルデキストランが、アミノ化デキストランにカルボキシル基が導入されてなるカルボキシル基導入アミノ化デキストランである、(21)のアミノカルボキシルデキストラン。
(32)
アミノカルボキシルデキストランが、アミノ化デキストランにカルボキシル基が導入されてなるカルボキシル基導入アミノ化デキストランである、(22)の細胞凍結保存剤。
(33)
アミノカルボキシルデキストランが、アミノ化デキストランにカルボキシル基が導入されてなるカルボキシル基導入アミノ化デキストランである、(23)〜(24)のいずれかの細胞凍結保存用溶液。
(41)
(21)又は(31)のアミノカルボキシルデキストランを、生理的溶液中に、1〜60質量%の濃度で溶解して、細胞凍結保存用溶液を製造する方法。
(42)
細胞凍結保存用溶液を製造するための、(21)又は(31)のアミノカルボキシルデキストランの使用。
(51)
(23)又は(33)の細胞凍結保存用溶液に、細胞又は組織を、分散又は浸漬する工程、
分散又は浸漬された細胞又は組織を、凍結する工程、
を含む、細胞又は組織を凍結保存する方法。
(52)
(51)の細胞又は組織を凍結保存する方法において、
分散又は浸漬された細胞又は組織を、凍結する工程の後に、さらに、
凍結された細胞又は組織を、凍結下で保存する工程、
凍結下で保存された細胞又は組織を、解凍する工程、
を含む、細胞又は組織を凍結保存する方法。
(61)
(21)又は(31)のアミノカルボキシルデキストランが分子間架橋されて、
生理的溶液が分散媒として固定されてなる、ハイドロゲル。
(62)
アミノカルボキシルデキストランの分子間架橋が、
アミノカルボキシルデキストランの分子に導入されたアジド基と、アミノカルボキシルデキストランの別な分子に導入された炭素炭素三重結合部分とのトリアゾール環形成反応によって生成された分子間架橋である、(61)のハイドロゲル。
(63)
アミノカルボキシルデキストランの分子に導入された炭素炭素三重結合部分が、
末端アルキンの基、又はシクロオクチン環含有化合物の基の炭素炭素三重結合部分である、(62)のハイドロゲル。
(64)
(61)〜(63)のいずれかのハイドロゲルに、細胞又は組織が、包埋されてなる、細胞包埋ハイドロゲル。
(71)
(21)又は(31)のアミノカルボキシルデキストランに、トリアゾール環形成反応が可能な、アジド基が導入された、アジド導入アミノカルボキシルデキストラン。
(72)
(21)又は(31)のアミノカルボキシルデキストランに、トリアゾール環形成反応が可能な、炭素炭素三重結合部分が導入された、炭素炭素三重結合導入アミノカルボキシルデキストラン。
(73)
アジド基の導入として、
アミノカルボキシデキストランの−OH基が、次の式(I):
で表される基に置換されている、(71)のアジド導入アミノカルボキシルデキストラン。
(74)
Y1が、次の:
−O−CO−O−(CH2)n−
(ただし、nは、1〜24の整数)
−O−CO−O−(CH2−CH2−O)m-1−CH2−CH2−
(ただし、mは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2)j−
(ただし、jは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2−CH2−O)k-1−CH2−CH2−
(ただし、kは、1〜24の整数)
からなる群から選択された二価基のスペーサー(ただし、−N3 は、各スペーサーの右端に結合する)である、(73)のアジド導入アミノカルボキシルデキストラン。
(75)
アミノカルボキシルデキストランに導入された炭素炭素三重結合部分が、
末端アルキンの基、又はシクロオクチン環含有化合物の基である、(72)の炭素炭素三重結合導入アミノカルボキシルデキストラン。
(76)
炭素炭素三重結合部分の導入として、
アミノカルボキシデキストランの−OH基が、次の式(II)又は式(III):
R1及びR2は、
それぞれ独立して、水素、又はC1〜C12のアルキル基であるか、
あるいは、一体となって、置換又は無置換の、C6〜C12の芳香族環状構造を形成しており、
R3及びR4は、
それぞれ独立して、水素、又はC1〜C12のアルキル基であるか、
あるいは、一体となって、置換又は無置換の、C6〜C12の芳香族環状構造を形成している)
で表される基に置換されている、(72)又は(75)の炭素炭素三重結合導入アミノカルボキシルデキストラン。
(77)
式IIIで表される基が、次の式IV:
で表される基である、(76)の炭素炭素三重結合導入アミノカルボキシルデキストラン。
(78)
Y2が、次の:
−O−CO−N(CH3)−(CH2)n−
(ただし、nは、1〜24の整数)
−O−CO−NH−(CH2−CH2−O)m-1−CH2−
(ただし、mは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2)j−
(ただし、jは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2−CH2−O)k-1−CH2−CH2−
(ただし、kは、1〜24の整数)
からなる群から選択された二価基のスペーサーである(ただし、−C≡CH は、各スペーサーの右端に結合する)、(73)の炭素炭素三重結合導入アミノカルボキシルデキストラン。
(79)
Y3が、次の:
−O−CO−N(CH3)−(CH2)n−CO−
(ただし、nは、1〜24の整数)
−O−CO−NH−(CH2−CH2−O)m-1−CH2−CO−
(ただし、mは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2)j−CO−
(ただし、jは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2−CH2−O)k-1−CH2−CO−
(ただし、kは、1〜24の整数)
からなる群から選択された二価基のスペーサーである(ただし、シクロオクチン環の−N基は、各スペーサーの右端に結合する)、(73)の炭素炭素三重結合導入アミノカルボキシルデキストラン。
(81)
次の(a)と(c)、(a)と(d)、(b)と(c)のいずれかの組み合わせを含んでなる、デキストランのキット:
(a) (71)、(73)〜(75)のいずれかのアジド導入アミノカルボキシルデキストラン、
(b) アジド導入デキストラン(ただし、アジド導入は(71)、(73)〜(74)のいずれかに規定された通りである)、
(c) (72)、(75)〜(79)のいずれかの炭素炭素三重結合導入アミノカルボキシルデキストラン、
(d) 炭素炭素三重結合導入デキストラン(ただし、炭素炭素三重結合導入は(72)、(75)〜(79)のいずれかに規定された通りである)。
(82)
(81)の(a)と(c)、(a)と(d)、(b)と(c)のいずれかの組み合わせを含む、アミノカルボキシルデキストラン含有組成物。
(83)
(71)〜(79)のいずれかのアミノカルボキシルデキストランからなる、細胞凍結保存剤。
(84)
(71)〜(79)のいずれかのアミノカルボキシルデキストランが、
生理的溶液中に、1〜60質量%の濃度で溶解されて含まれる、細胞凍結保存用溶液。
(91)
(71)〜(79)のいずれかのアミノカルボキシルデキストランからなる、細胞包埋ハイドロゲル製造用添加剤。
(92)
(71)〜(79)のいずれかのアミノカルボキシルデキストランが、生理的溶液中に、1〜60質量%の濃度で溶解されて含まれる、細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液。
(93)
生理的溶液が、生理食塩水、細胞培養液体培地、または組織培養液体培地である、(92)の細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液。
(94)
(92)〜(93)のいずれかの細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液に、細胞又は組織が、分散又は浸漬されてなる、細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物。
(95)
(94)の細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物が、ゲル化されてなる、細胞包埋ハイドロゲル。
(96)
(82)のアミノカルボキシルデキストラン含有組成物からなる、細胞包埋ハイドロゲル製造用添加剤。
(97)
(82)のアミノカルボキシルデキストラン含有組成物が、生理的溶液中に、アミノカルボキシデキストランの濃度として1〜60質量%の濃度で溶解されて含まれる、細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液。
(98)
生理的溶液が、生理食塩水、細胞培養液体培地、または組織培養液体培地である、(97)の細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液。
(99)
(97)〜(98)のいずれかの細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液に、細胞又は組織が、分散又は浸漬されてなる、細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物。
(100)
(99)の細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物が、ゲル化されてなる、細胞包埋ハイドロゲル。
(101)
(71)〜(79)のいずれかのアミノカルボキシルデキストランを、生理的溶液中に、1〜60質量%の濃度で溶解して、細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液を製造する方法。
(102)
細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液を製造するための、(71)〜(79)のいずれかのアミノカルボキシルデキストランの使用。
(103)
(92)〜(93)及び(97)〜(98)のいずれかの細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液に、細胞又は組織を、分散又は浸漬して、細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物を製造する方法。
(104)
細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物を製造するための、(92)〜(93)及び(97)〜(98)のいずれかの細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液の使用。
(105)
(94)又は(99)の細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物を、ゲル化して、細胞包埋ハイドロゲルを製造する方法。
(106)
細胞包埋ハイドロゲルを製造するための、(94)又は(99)の細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物の使用。
(111)
(92)〜(93)、(97)〜(98)のいずれかの細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液に、細胞又は組織を、分散又は浸漬する工程
分散又は浸漬された細胞又は組織を、凍結する工程、
を含む、細胞又は組織を凍結保存する方法。
(112)
(111)の細胞及び組織の凍結保存方法において、
分散又は浸漬された細胞又は組織を、凍結する工程の後に、さらに、
凍結された細胞又は組織を、凍結下で保存する工程、
凍結下で保存された細胞又は組織を、解凍する工程、
を含む、細胞又は組織を凍結保存する方法。
(113)
(92)〜(93)、(97)〜(98)のいずれかの細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液に、細胞又は組織を、分散又は浸漬して、細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物を調製する工程、
調製された細胞含有組成物を、凍結する工程、
凍結された細胞含有組成物を、凍結下で保存する工程、
凍結下で保存された細胞含有組成物を、解凍する工程、
解凍された細胞含有組成物を、アミノカルボキシルデキストランの分子間架橋の形成反応によって、ゲル化して、細胞包埋ハイドロゲルを調製する工程、
を含む、凍結保存された細胞含有組成物から、細胞包埋ハイドロゲルを、製造する方法。
(114)
アミノカルボキシルデキストランの分子間架橋の形成反応が、
アミノカルボキシルデキストランのアジド部分とアルキン部分とのトリアゾール環形成反応である、(113)の製造方法。
(121)
(92)〜(93)、(97)〜(98)のいずれかの細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液に、細胞又は組織を、分散又は浸漬して、細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物を調製する工程、
調製された細胞含有組成物を、アミノカルボキシルデキストランの分子間架橋の形成反応によって、ゲル化して、細胞包埋ハイドロゲルを調製する工程、
を含む、細胞含有組成物から、細胞包埋ハイドロゲルを、製造する方法。
(132)
アミノカルボキシルデキストランの分子間架橋の形成反応が、
アミノカルボキシルデキストランのアジド部分とアルキン部分とのトリアゾール環形成反応である、(131)の製造方法。
(133)
(92)〜(93)、(97)〜(98)のいずれかの細胞包埋ハイドロゲル製造用溶液に、細胞又は組織を、分散又は浸漬して、細胞包埋ハイドロゲル製造用細胞含有組成物を調製する工程、
調製された細胞含有組成物を、アミノカルボキシルデキストランの分子間架橋の形成反応によって、ゲル化して、細胞包埋ハイドロゲルを調製する工程、
調製された細胞包埋ハイドロゲルを、凍結する工程、
を含む、細胞又は組織を凍結保存する方法。
(134)
(132)の細胞及び組織の凍結保存方法において、
調製された細胞包埋ハイドロゲルを、凍結する工程の後に、さらに、
凍結された細胞包埋ハイドロゲルを、凍結下で保存する工程、
凍結下で保存された細胞包埋ハイドロゲルを、解凍する工程、
を含む、細胞又は組織を凍結保存する方法。
(135)
アミノカルボキシルデキストランの分子間架橋の形成反応が、
アミノカルボキシルデキストランのアジド部分とアルキン部分とのトリアゾール環形成反応である、(133)〜(134)のいずれかの製造方法。
アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンが、
生理的溶液中で、ε−ポリ−L−リジンのアミノ基と、マルチアームPEGのN−ヒドロキシコハク酸イミドの基とのアミド結合形成反応によって生成された分子間架橋によって架橋されて、
生理的溶液が分散媒として固定されてなる、ハイドロゲル。
(142)
マルチアームPEGが、次の式(V):
Xは、次の式(VI):
で表される4アームPEGである、(141)のハイドロゲル。
(143)
カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンが、生理的溶液中に1〜60質量%含まれている、(141)のハイドロゲル。
(144)
(141)〜(142)のいずれかのハイドロゲルに、細胞又は組織が包埋されてなる、細胞包埋ハイドロゲル。
(145)
(141)〜(142)のいずれかのハイドロゲルに、細胞又は組織が包埋されてなる、凍結保存用細胞包埋ハイドロゲル。
(146)
(144)の凍結保存用細胞包埋ハイドロゲルを凍結保存する、細胞又は組織の凍結保存方法。
(151)
アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンを、
生理的溶液中で、ε−ポリ−L−リジンのアミノ基と、マルチアームPEGのN−ヒドロキシコハク酸イミドの基とのアミド結合形成反応によって生成された分子間架橋によって架橋して、ゲル化する工程、
を含む、ハイドロゲルを製造する方法。
(152)
アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンを含む生理的溶液に、細胞又は組織を、分散又は浸漬して、細胞含有組成物を調製する工程、
細胞含有組成物を、ε−ポリ−L−リジンのアミノ基と、マルチアームPEGのN−ヒドロキシコハク酸イミドの基とのアミド結合形成反応によって生成された分子間架橋によって架橋して、ゲル化して、細胞包埋ハイドロゲルを調製する工程、
を含む、細胞包埋ハイドロゲルを製造する方法。
(153)
アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンを含む生理的溶液に、細胞又は組織を、分散又は浸漬して、細胞含有組成物を調製する工程、
調製された細胞含有組成物を、凍結する工程、
凍結された細胞含有組成物を、凍結下で保存する工程、
凍結下で保存された細胞含有組成物を、解凍する工程、
解凍された細胞含有組成物を、ε−ポリ−L−リジンのアミノ基と、マルチアームPEGのN−ヒドロキシコハク酸イミドの基とのアミド結合形成反応によって生成された分子間架橋によって架橋して、ゲル化して、細胞包埋ハイドロゲルを調製する工程、
を含む、細胞包埋ハイドロゲルを製造する方法。
本発明の両性電解質高分子は、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有するものとなっており、アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある。この比率は、好ましくは、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲、さらに好ましくは0.50/0.50〜0.90/0.10の範囲、あるいは例えば0.70/0.30〜0.75/0.25の範囲とすることができる。
好ましい実施の態様において、アミノ基及びカルボキシル基が導入される高分子としては、デキストランをあげることができる。デキストランは、グルコースを構成単位とする多糖類の高分子であり、α−1,6結合、及びα−1,4結合を含む。デキストランとしては、例えば市販されているデキストランを使用することができる。数平均分子量としては、例えば1000〜10,000,000の範囲、例えば5000〜1000,000の範囲、例えば10,000〜500,000の範囲、例えば10,000〜100,000の範囲を含むものを、使用することができる。
好ましい実施の態様において、アミノ基を有する高分子として、ポリアミンを使用することができる。ポリアミンとしては、例えば、ポリアミノ酸、アミノ化多糖類を使用することができ、例えば、ポリリジン、ポリアリルアミン、ポリアルギニン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸を使用することができる。好ましい実施の態様において、アミノ基を有する高分子として、ε−ポリ−L−リジンを使用することができる。このような高分子として、数平均分子量としては、例えば1000〜10,000,000の範囲、例えば5000〜1000,000の範囲、例えば10,000〜500,000の範囲、例えば10,000〜100,000の範囲を含むものを、使用することができる。
本発明のハイドロゲルは、上記両性電解質高分子が、生理的溶液中で分子間架橋されてなるものである。生理的溶液としては、例えば、生理食塩水、細胞培養液体培地、組織培養液体培地、無血清培地を挙げることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグルMEM培地(DMEM)を好ましいものとして挙げることができる。本発明の分子間架橋は、このような種々の生理物質や細胞そのものを含む溶液中においても、架橋反応が進行して、ハイドロゲルを形成することができるものとなっている。好適な実施の態様において、両性電解質高分子は、生理的溶液中に、例えば1〜60質量%の濃度、例えば5〜30質量%の濃度となるように添加することができる。本発明において、両性電解質高分子、及び両性電解質高分子が架橋されてなるハイドロゲルは、それ自体が優れた凍結保護の効果を発揮するものとなっており、これだけを凍結保護剤として好適に使用することができるものであるが、所望により、公知の凍結保護物質を、生理的溶液中に追加的に添加して、使用することもできる。このような公知の凍結保護物質としては、ジメチルスルホキシドやグリセロール、エチレングリコール、トレハロース、スクロースなどを挙げることができ、あるいは抗酸化剤を挙げることができる。このような抗酸化剤としては、例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビタミンE、ビタミンC、エピガロカテキンガレートなどのポリフェノール類またはグルタチオンなどを、挙げることができる。
好適な実施の態様において、分子間架橋は、両性電解質高分子の分子、又は両性電解質でない高分子の分子、に導入されたアジド基と、両性電解質高分子の別な分子、又は両性電解質でない高分子の別な分子、に導入された炭素炭素三重結合部分とのトリアゾール環形成反応によって生成された分子間架橋(ただし、アジド基が導入された分子と炭素炭素三重結合部分が導入された分子のうち、少なくともいずれかの分子が、両性電解質高分子である)とすることができる。すなわち、まず、細胞保護を担う両性電解質高分子に対して、アジド基又は炭素炭素三重結合部分を導入してものを用意する。このように修飾された両性電解質高分子の溶液に細胞を分散し、あるいは組織を浸漬しておく。次いで、この修飾された両性電解質高分子の分子とトリアゾール環形成反応が可能となるように炭素炭素三重結合部分又はアジド基が導入された分子を、あたかも架橋剤のように添加して、トリアゾール環形成反応を進行させて、分子間の架橋を形成し、ゲル化を行うことができる。あたかも架橋剤のように添加する分子は、両性電解質高分子の分子であってもよく、両性電解質でない高分子の分子であってもよい。最終的に形成されるゲル中の両性電解質高分子の量が、所望の量あるいは濃度となるように、総量を調整すればよいからである。好適な実施の態様において、両性電解質高分子として、アミノカルボキシルデキストランを使用することができ、両性電解質でない高分子として、デキストランを使用することができる。
好適な実施の態様において、トリアゾール環形成反応が可能となるように、両性電解質高分子の分子、または両性電解質でない高分子の分子に、アジド基が導入される。好適な実施の態様において、アジド基を末端に有する原子団を導入することができる。例えば、次の式(I):
−O−CO−O−(CH2)n−
(ただし、nは、1〜24の整数)
−O−CO−O−(CH2−CH2−O)m-1−CH2−CH2−
(ただし、mは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2)j−
(ただし、jは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2−CH2−O)k-1−CH2−CH2−
(ただし、kは、1〜24の整数)
からなる群から選択された二価基のスペーサー(ただし、−N3 は、各スペーサーの右端に結合する)とすることができる。上記n、m、j、kは、それぞれ独立して、所望の値とすることができるが、例えば、1〜24の整数、1〜12の整数、1〜6の整数とすることができる。
好適な実施の態様において、トリアゾール環形成反応が可能となるように、両性電解質高分子の分子、または両性電解質でない高分子の分子に、炭素炭素三重結合部分が導入される。好適な実施の態様において、炭素炭素三重結合部分を有する基として、末端アルキンの基、又はシクロオクチン環含有化合物の基を、使用することができる。次の式(II)又は式(III):
−O−CO−N(CH3)−(CH2)n−
(ただし、nは、1〜24の整数)
−O−CO−NH−(CH2−CH2−O)m-1−CH2−
(ただし、mは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2)j−
(ただし、jは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2−CH2−O)k-1−CH2−CH2−
(ただし、kは、1〜24の整数)
からなる群から選択された二価基のスペーサー(ただし、−C≡CH は、各スペーサーの右端に結合する)とすることができる。上記n、m、j、kは、それぞれ独立して、所望の値とすることができるが、例えば、1〜24の整数、1〜12の整数、1〜6の整数とすることができる。
−O−CO−N(CH3)−(CH2)n−CO−
(ただし、nは、1〜24の整数)
−O−CO−NH−(CH2−CH2−O)m-1−CH2−CO−
(ただし、mは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2)j−CO−
(ただし、jは、1〜24の整数)
−O−NH−(CH2−CH2−O)k-1−CH2−CO−
(ただし、kは、1〜24の整数)
からなる群から選択された二価基のスペーサー(ただし、シクロオクチン環の−N基は、各スペーサーの右端に結合する)とすることができる。上記n、m、j、kは、それぞれ独立して、所望の値とすることができるが、例えば、1〜24の整数、1〜12の整数、1〜6の整数とすることができる。
好適な実施の態様において、分子間架橋は、両性電解質高分子のアミノ基と、マルチアームPEG(ポリエチレングリコール)のN−ヒドロキシコハク酸イミドの基とのアミド結合形成反応によって生成された分子間架橋、とすることができる。すなわち、マルチアームPEG(ポリエチレングリコール)が架橋剤となって、両性電解質高分子の分子間に架橋を形成する。そのため、マルチアームのマルチの意味する分枝(アーム)の数は、架橋を意図する分子数によって選択することができ、例えば、2〜16、2〜8、2〜4とすることができる。好ましい実施の態様において、4アームPEGを使用することができる。例えば、マルチアームPEGは、次の式(V):
本発明のハイドロゲルを形成するための分子間架橋反応は、大気圧下での生理的な条件下で、速やかに進行し、さらに、細胞表面の種々の分子や、細胞培地中の成分の共存下でも、速やかに進行する。そのため、本発明のハイドロゲルの製造用の溶液に、細胞を分散し、あるいは組織を浸漬した後に、分子間架橋反応を行ってハイドロゲルを形成して、所望の三次元構造体として、細胞や組織がハイドロゲルに包埋された状態で凍結保存することもできる。これに加えて、ハイドロゲルの製造用の溶液に、細胞を分散し、あるいは組織を浸漬した後に、ハイドロゲルを形成させることなく、溶液の状態で凍結保存した後に、解凍し、それを所望の部位、例えば創傷を治癒したい部位に注入して、その生理的な状態で、分子間架橋反応を行ってハイドロゲルを形成して、所望の三次元構造体を生体内で形成させることもできる。好適な実施の態様において、細胞培養可能な温度条件下で、例えば35〜38℃、例えば37℃で、分子間架橋を行うことができる。
本発明者は、アミノ基及びカルボキシル基をデキストランに導入して得た両性電解質デキストラン(Dex−PA)が、上記手段によって分子間架橋した場合に、細胞及び組織を損なうことなく、好適にゲル化できること、得られたハイドロゲルが優れた凍結保護の効果を有していることを、見いだして、さらに、この両性電解質デキストラン(Dex−PA)が、ハイドロゲル化することなく、溶液として使用した場合においても、優れた凍結保護の効果を有していることを、見いだした。したがって、本発明は、アミノ基及びカルボキシル基がデキストランに導入されてなる、アミノカルボキシルデキストランであって、アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、アミノカルボキシルデキストランからなる、細胞凍結保存剤にもある。この両性電解質デキストラン(Dex−PA)は、上記トリアゾール環形成反応のためのアジド基を導入した場合にも、あるいは、炭素炭素三重結合部分を導入した場合にも、優れた凍結保護の効果を有しているものであった。したがって、アジド基導入アミノカルボキシルデキストラン、及び炭素炭素三重結合部分導入アミノカルボキシルデキストランもまた、それ自体が、優れた細胞凍結保存剤となっているものである。これらのデキストラン誘導体の濃度(ポリマー濃度、デキストラン濃度)は、細胞保護効果を発揮する範囲内において、適宜選択することができるが、例えば、5〜20%、7〜20%、7〜15%、8〜14%、10〜13%、10〜12%の範囲とすることができる。
本発明において、生理的溶液を使用して、温度及び大気圧についても、生理的な条件下で架橋反応を行って、ハイドロゲルを形成することができる。そのために、ハイドロゲル中に包埋可能な細胞及び組織には、特に制限がない。さらに、本発明においては、両性電解質高分子、及び両性電解質高分子によるハイドロゲルが、細胞内に浸透することなく、凍結保護の効果を発揮するものとなっている。そのために、凍結保護の効果が発揮可能な細胞及び組織には、特に制限がない。好適な実施の態様において、このような細胞としては、例えば、培養用樹立細胞、ヒトを含む動物の受精卵および卵細胞を挙げることができ、また、例えば、精細胞、ES細胞、iPS細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、臍帯血細胞などの幹細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、血球細胞などのヒトを含む動物細胞もしくは植物細胞を挙げることができる。好適な実施の態様において、このような組織・臓器としては、皮膚、神経、血管、軟骨、角膜、肝臓、腎臓、心臓、膵島などを挙げることができ、さらに、これらに由来する細胞を挙げることができる。
[実施例1]
[カルボキシル化ポリリジンによるハイドロゲル]
[カルボキシル化ポリリジンの合成]
ε-ポリ-L-リジン(チッソ、分子量4000)25%水溶液を5mLとり、無水コハク酸(和光純薬)を0.5-0.9g添加し、50℃で1時間反応させ、カルボキシル化ポリリジンを作成した。カルボキシル基の導入量は、アミノ基定量である、TNBS法を用い、アミノ基の減少量より計算し求めた。アミノ基のモル数に対して50%のモル数のカルボキシル基を導入したものをPLL(0.50)と表記する。
1×106個のマウス線維芽細胞L929細胞を、クライオバイアル(Simport Plastics)中にて1mLの10%PLL(0.50)培地溶液(無血清培地、Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、シグマ社)中に懸濁し、-80℃のフリーザー中に放置することで凍結保存を行った。解凍は37℃の湯浴中にて速やかに融解し、培地で洗浄したのち、トリパンブルー染色により生死判定を行った。その結果、95%以上の生存率を確認した。
次に解凍し終わった懸濁液を、24wellの培養用プレートに移し、10%の4官能ポリエチレングリコール(4−armed functional PEG)(N-ヒドロキシスクシンイミド末端)(日油、Sunbright PTE-100S、分子量1万)培地溶液を添加することで速やかにゲル化させた。ゲルの上部に培養液を添加し、37℃インキュベータ中で6時間後に、Live-deadアッセイキット(旧invitrogen、現Life Technologies社製)により細胞の生死判定を行ったところ、80%以上の生存率を確認した。図1は、この結果を示す蛍光写真である。図1は、カラー写真においては、緑と赤の二重の蛍光染色の写真となっており、緑の蛍光は生存している細胞を示し、赤の蛍光は生存していない細胞を示している。生存率はこれらを計数することによって算出した。また、そのゲルをインキュベータ中で放置することにより、48時間後にはすべてのゲルが溶解し、細胞が培養プレートに接着していることを確認した。
以上の実験から、両性電解質高分子PLL(0.50)水溶液は細胞を高い生存率で凍結保存することが可能な高分子溶液であり、両性電解質高分子PLL(0.50)のアミノ基によって細胞が分散された状態で細胞を高い生存率で維持しつつハイドロゲルを形成することが可能であることがわかった。つまり、細胞を凍結保存した後に解凍して、細胞の凍結保存剤を除去する必要なく、そのまますぐにゲル化する作業を行うことができ、高い生存率で細胞を包埋したまま、ハイドロゲルを形成することができることがわかった。さらに、このハイドロゲルは、培養条件下で24〜48時間で生分解するという生分解性を有するものであった。つまり、例えば、患部に細胞液を注入した後にゲル化させて、数日でそのゲル自体は生分解して、三次元的に包埋された細胞がそのまま生着するという、いわゆるインジェクタブルゲル(注入可能ゲル)を実現するものとなっていることがわかった。
[デキストランによるハイドロゲル]
[アミノ化デキストランの合成]
デキストラン(名糖産業、分子量7万)1.5gをジメチルスルホキシド(DMSO)90mLに溶解し、3.0gのカルボニルジイミダゾール(CDI)を添加し、50℃15分反応させた。その後、1.35mLのエチレンジアミン(EDA)を添加し、50℃18時間反応させることで64.1%の導入率(単位糖残基あたりのEDAの導入数)のアミノ化デキストラン(Amino-Dex)を得た。得られたアミノ化デキストランを10%溶液とし、無水コハク酸を加え、50℃で1時間反応させることで種々のカルボキシル基導入アミノ化デキストラン(デキストラン両性電解質、(Dex-PA))を作成した。この合成の手順を、次のスキーム4にまとめた。
[3-アジドプロパノールの合成]
2.34gのアジ化ナトリウム(東京化成)と0.05gのテトラブチルアンモニウム硫酸水素塩(東京化成)を6mlの水に溶解し、1.5mLの3-クロロプロパノール(東京化成)を添加し、80℃で24時間反応させ、その後室温で12時間放置した。ジエチルエーテルで抽出した溶液を乾燥し、3-アジドプロパノールを得た。
0.1gのデキストランを6mLのDMSOに溶解し、0.06gのCDI(カルバモイルジイミダゾール)を添加し、50℃2時間反応させた。その後、0.018gの3-アジドプロパノールを添加し、24時間反応させた。アジド導入率はNMRにて評価し、その結果は10%(単位糖残基あたり)であった(後述のスキーム3の化合物B)。このアジドデキストラン(Az-Dex)の合成の手順を、後述のスキーム3に示す。その後、上述のアミノ化デキストラン合成法と同じ手法でEDA導入アジド化デキストランおよびアジド導入両性電解質デキストラン(Az-Dex-PA)を合成した。
0.5gのデキストランを30mLのDMSOに溶解し、0.1gのCDI(カルバモイルジイミダゾール)を添加し、50℃で2時間反応させた。その後、52.1μLのN-メチルプロパルギルアミン(東京化成)を添加し、24時間反応させることでアルキン置換デキストラン(Alk-Dex)を合成した。アルキン導入率はNMRにて評価し、導入率はNMR〜12.4%(単位糖残基あたり)であった(後述のスキーム3の化合物C)。このアルキン含有デキストラン(Alk-Dex)の合成の手順を、後述のスキーム5に示す。
10%Az-Dex-PA培地溶液と10%Alk-Dexを当量混合し、銅イオンとしてCuSO4を0.2mg/mL、アスコルビン酸を0.8mg/mLの濃度以上で添加すると速やかにゲル化することが確認できた。このゲル化をもたらしたトリアゾール環形成の反応を説明する模式図を、スキーム6に示す。
以上の実験から、両性電解質高分子Dex−PA水溶液は細胞を高い生存率で凍結保存することが可能な高分子溶液であること、両性電解質高分子Dex−PAにアジド基と炭素炭素三重結合の基を導入してトリアゾール環形成反応によって架橋することによって細胞が分散された状態で細胞を高い生存率で維持しつつハイドロゲルを形成できること、細胞が包埋された両性電解質高分子Dex−PAのハイドロゲルは凍結保存して解凍しても細胞を高い生存率で維持して保護するものとなっていることが、わかった。つまり、両性電解質高分子Dex−PAの架橋によるハイドロゲルを形成させれば、細胞の懸濁液から、三次元培養が可能である三次元構造体を形成して、細胞が包埋された三次元構造体のままで凍結保存して解凍することができ、いわば、凍結保存と解凍の過程を通じて、細胞の増殖及び/又は分化のための三次元足場材料を提供するものとなっていることがわかった。
[コラーゲンゲル中での細胞の凍結保存]
セルマトリックスタイプI-A(新田ゼラチン)を用いてL929をコラーゲンゲル中に分散させた。それをそのまま-80℃で凍結させ、解凍後に生存率を調べたところ、すべての細胞が死滅し、生存率は0%であった。この結果から、従来から用いられている一般的なゲル中で細胞を凍結することは非常に困難であることがわかった。
[シクロオクチン含有デキストランの合成]
実施例2に準じて、実施例2のアルキン含有デキストランに代えて、N-メチルプロパルギルアミンの代わりにジベンジルシクロオクチン酸(DBCO-acid)をデキストランに導入して、シクロオクチンの基を有するデキストランを合成した(DBCO-Dex)。この合成の手順を次のスキーム7に示す。
[両性電解質高分子Dex−PAと細胞との相互作用]
両性電解質高分子Dex−PAと細胞との相互作用を検討するために、次の実験を行った。
[Dex−PAの細胞凍結保護活性の濃度依存性]
Dex−PAの細胞凍結保護活性を、さらに検討するために、以下の実験を行った。実施例2において、種々のカルボキシル基導入量のDex−PA溶液(濃度10%)1mlに1×106個のL929細胞を懸濁し、凍結、融解して、生存率を評価した場合と同様の手法で、カルボキシル基導入量65%のAzide−Dex−PAを用いて、その濃度を5%から15%まで変えた溶液の凍結保護活性についても調べた。その結果、図5に示すように12%で最も高い凍結保護活性を示すことがわかった。
[Azide−Dex−PAとDBCO−Dexによる細胞包埋ゲル]
後述するように、スキーム9の手順にしたがって、細胞(L929)懸濁液をゲル化させて、細胞包埋ゲルを作成して、その細胞保護活性を調べる実験を行った。この実験で得られたゲルの写真を、図6として示す。図6には、逆さまに置かれた容器の底が上部の楕円の線で囲んだ範囲にあり、そこに得られたゲルが観察されている。
Azide−Dex−PAとDBCO−Dexの混合溶液のゲル化の条件を検討した。
ゲル化に関しては、ポリマー濃度及びazide−Dex−PAのアジド導入率とDBCO−DexのDBCO導入率に依存してゲル化時間や硬さが変化する。ゲル化時間は、試験管に入れた混合溶液が固まり、逆さまにした時に流動性が失われた時間として定義した。以下の表1に、混合時におけるAzide−Dex−PAの濃度A(mg/mL)、DBCO−Dex濃度B(mg/mL)と、アジドとDBCOの混合溶液中の割合(Azide : Alkyneのモル比)、ゲル化時間(Gelation time)を示した。
次に、Azide−Dex−PAとDBCO−Dexの混合溶液中に、L929細胞を1×106個懸濁し、ゲル化するのを待って−80℃のフリーザーにゲルを放置することで凍結した。解凍後の生存率を、実施例2の図3と同様に、Live/Deadアッセイにより確認した。図7の(a)はAzideとDBCO(Alkyne)の比が1:4のゲル(ポリマー濃度10%)、図7の(b)はAzide:Alkyneの比が1:6のゲル(ポリマー濃度10%)、図7の(c)が1%コラーゲンゲル中で凍結し、解凍した細胞の様子である。図7の(a)の生存率は93%、図7の(b)の生存率は94%、図7の(c)0%であった。
Claims (14)
- アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンが、
生理的溶液中で、分子間架橋されて、
生理的溶液が分散媒として固定されてなる、ハイドロゲルであって、
分子間架橋が、
カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンのアミノ基と、マルチアームPEGのN−ヒドロキシコハク酸イミドの基とのアミド結合形成反応によって生成された分子間架橋、
であり、
カルボキシル化されたε−ポリ−L−リジンが、生理的溶液中に1〜60質量%含まれている、ハイドロゲル。 - 請求項1に記載のハイドロゲルに、細胞又は組織が包埋されてなる、細胞包埋ハイドロゲル。
- 請求項1に記載のハイドロゲルに、細胞又は組織が包埋されてなる、凍結保存用細胞包埋ハイドロゲル。
- 請求項3の凍結保存用細胞包埋ハイドロゲルを凍結保存する、細胞又は組織の凍結保存方法。
- アミノ基及びカルボキシル基がデキストランに導入されてなる、アミノカルボキシルデキストランであって、
アミノ基に対するカルボキシル基の比率(カルボキシル基/アミノ基)が、0.45/0.55〜0.95/0.05の範囲にある、アミノカルボキシルデキストラン。 - 請求項5に記載のアミノカルボキシルデキストランに、トリアゾール環形成反応が可能な、アジド基が導入された、アジド導入アミノカルボキシルデキストラン。
- 請求項5に記載のアミノカルボキシルデキストランに、トリアゾール環形成反応が可能な、炭素炭素三重結合部分が導入された、炭素炭素三重結合導入アミノカルボキシルデキストラン。
- 請求項5〜7のいずれかに記載のアミノカルボキシルデキストランからなる、細胞凍結保存剤。
- 請求項5〜7のいずれかに記載のアミノカルボキシルデキストランが、
生理的溶液中に、1〜60質量%の濃度で溶解されて含まれる、細胞凍結保存用溶液。 - 請求項5に記載のアミノカルボキシルデキストランに、トリアゾール環形成反応が可能な、アジド基が導入された、アジド導入アミノカルボキシルデキストランと、
請求項5に記載のアミノカルボキシルデキストランに、トリアゾール環形成反応が可能な、炭素炭素三重結合部分が導入された、炭素炭素三重結合導入アミノカルボキシルデキストランとが、
トリアゾール環形成反応によって架橋されてなる、架橋体。 - 請求項10に記載の架橋体を含んでなる、ハイドロゲル。
- 生理的溶液が分散媒として固定されてなる、請求項11に記載のハイドロゲル。
- 請求項11又は請求項12に記載のハイドロゲル中に細胞又は組織が包埋されてなる、細胞包埋ハイドロゲル。
- 請求項13の細胞包埋ハイドロゲルを凍結保存する、細胞又は組織の凍結保存方法。
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