CN110029084B - 一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3d凝胶、制备方法及其应用方法 - Google Patents

一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3d凝胶、制备方法及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶，包括第一凝胶和第二凝胶，第二凝胶包裹于第一凝胶内，并在第一凝胶内形成微块状3D分散状态，使得第一凝胶和第二凝胶混合构成非均匀凝胶结构，第二凝胶含有细胞，同时还公开了其制备方法和应用方法；能够为细胞三维生长与基质结构形态的关系规律研究提供体外模型，也为进一步开发用于加速细胞生长的新型凝胶基质结构提供了新手段。

Description

一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶、制备方法及其应用方法
技术领域
本发明属于3D凝胶技术领域，具体涉及一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶、制备方法及其应用方法。
背景技术
细胞的体外三维培养或者四维培养是组织工程和再生医学领域的重要技术手段。通过使用不同的生物材料及技术方法，构建出接近于体内生长环境并利用细胞群体内在的固有自组织属性，使细胞呈现出立体生长状态，并通过外界调控手段，引导细胞的增殖、迁移、营养物质输运、分化等活动，有利于控制和优化细胞组织化的过程，也有望在体外构建与各类组织、器官相对应的细胞三维生长类似物或等同物。由于3D或4D培养的其中一项关键内容就是构建性质优良且调控灵活的细胞三维外基质，而目前采用较多的材料是各类天然或者合成的水凝胶，但通常使用的水凝胶都是匀质的且水凝胶的刚度是均一的。当水凝胶刚度小时，虽然有利于细胞的快速伸展和迁移，但是由于细胞对凝胶的降解作用使得凝胶的机械支撑作用无法长时间维持；当水凝胶刚度大时，虽然能够延缓降解的时间且使得凝胶的机械支撑作用得以长时间维持，但是却使得细胞的伸展和迁移都被不同程度的抑制。如果能够灵活调控水凝胶的内在结构，使其既能较好的促进细胞的伸展和迁移，又能在较长范围内维持机械支撑作用，则会进一步提升控制细胞在三维凝胶内生长和自组织的途径。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶，并公开了其制备方法和应用方法。
本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的：
一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶，包括第一凝胶和第二凝胶，所述第二凝胶包裹于第一凝胶内，并在第一凝胶内形成微块状3D分散状态，使得第一凝胶和第二凝胶混合构成非均匀凝胶结构，所述第二凝胶含有细胞，所述第一凝胶与第二凝胶各自的交联强度不同。
一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、制备经过修饰的葡聚糖大分子的初步混合液态产物；
步骤S2、在所述步骤S1中的初步混合液态产物中添加含有巯基的接枝分子，使其发生接枝反应后，加入细胞悬液，得到第一凝胶的前体溶液；
步骤S3、在所述步骤S1中的初步混合液态产物中添加含有巯基的接枝分子，使其发生接枝反应后，加入细胞悬液，得到第二凝胶的前体溶液，再向第二凝胶的前体溶液中加入第二凝胶的交联剂，得到已部分交联的第二凝胶；
步骤S4、在所述步骤S2得到的第一凝胶的前体溶液中加入步骤S3得到的已部分交联的第二凝胶，同时吹打所述已部分交联的第二凝胶，使已部分交联的第二凝胶在第一凝胶的前体溶液中呈现微块状3D分散状态，得到凝胶混合物；
步骤S5、在所述步骤S4中得到的凝胶混合物中加入第一凝胶的交联剂，得到局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶。
作为进一步改进的技术方案，所述步骤S1具体包括如下步骤：
步骤S11、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液；
步骤S12、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物并加入蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；
步骤S13、将所述步骤S11中的得到的液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液与所述步骤S12得到的葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于离心管中混匀，得到初步混合液态产物。
作为进一步改进的技术方案，所述步骤S2具体包括如下步骤：
步骤S21、取出于-20℃或-80℃温度条件下含有巯基的RGD肽链固态物质，加入蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到含巯基RGD肽链水溶液；
步骤S22、在所述步骤S1中的初步混合液态产物中添加所述步骤S21得到的含巯基RGD肽链水溶液，吹打混匀后，室温静置5-6分钟，然后加入细胞悬液，得到第一凝胶的前体溶液，所述细胞悬液为培养基细胞悬液，且可含细胞也可不含细胞。
作为进一步改进的技术方案，所述步骤S3具体包括如下步骤：
步骤S31、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂并加蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂溶液，再将所述聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂溶液滴加到细胞培养板上；
步骤S32、在所述步骤S1中的初步混合液态产物中添加所述步骤S21得到的含巯基RGD肽链水溶液，吹打混匀后，室温静置T0分钟，然后加入细胞悬液，得到凝胶前体溶液，所述细胞悬液为培养基细胞悬液，且含有细胞；
步骤S33、取所述步骤S32得到的凝胶前体溶液与步骤S31中细胞培养板上的含有巯基的聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂混合，快速吹打2-3次后静置T1分钟，得到已部分交联的第二凝胶。
作为优选的技术方案，所述步骤S4中，采用正位移移液器在所述步骤S2得到的第一凝胶的前体溶液中加入所述步骤S3得到的已部分交联的第二凝胶，同时通过外置活塞式吸头吹打所述已部分交联的第二凝胶，使已部分交联的第二凝胶在第一凝胶的前体溶液中呈现微块状3D分散状态，得到凝胶混合物。
作为进一步改进的技术方案，所述步骤S5具体包括如下步骤：
步骤S51、在所述步骤S4得到的凝胶混合物中加入第一凝胶的交联剂，快速吹打2-3次后静置T2分钟，得到交联后的非匀质葡聚糖3D凝胶；
步骤S52、将所述步骤S51得到的交联后的非匀质葡聚糖3D凝胶，加培养基至完全被覆盖后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；
步骤S53、2小时后更换所述步骤S52中的培养基，得到局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶；所述第一凝胶的交联剂为肽链交联剂。
作为优选的技术方案，所述T0≥3min，所述T1≥0min，且T1≠T2。
一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的应用方法，包括以下步骤：
步骤S(a)、取两个或者多个所述局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶，分别标记为第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块，将所述第1凝胶块、第二凝胶块、……、第n凝胶块堆叠粘连成三维结构形态，得到凝胶组，再将凝胶组浸没于培养基中，所述第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块之间存在间隙；
步骤S(b)、将所述步骤S(a)中得到的凝胶组应用于组织培养。
作为优选的技术方案，所述第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块各自内部的凝胶结构特征相同。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶，其制备方法操作简单易行，通过外置活塞式吸头将第二凝胶吹打使之在第一凝胶中成为微块状3D分散状态，利用了轻微粘稠状物质的混合分散特点，避免了复杂微块形成工艺。
(2)另外，采用本发明提供的制备方制备得到的局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶可同时探究在不同组分比例和不同刚度值情况下的三维凝胶内组织培养特点，并能够兼顾长时间维持机械支撑和促进细胞伸展迁移两个要求，使细胞外基质的特性更加接近自然情况，进而能够更充分利用细胞的固有先天再生特性，充分模拟机体内三维形态，自组织形成组织或类器官，能够为细胞三维生长与基质结构形态的关系规律研究提供体外模型，也为进一步开发用于加速细胞生长及调控细胞自组织过程的新型凝胶基质结构提供了新手段。
(3)本发明制备形成的非匀质3D凝胶的结构完整，力学性能良好，且可以将多个非匀质凝胶块堆叠成三维形态，使其粘连且凝胶块之间存在间隙，并将堆叠粘连后的整体凝胶组合体浸没于培养基中，这对于营养物质在大尺度培养物中的渗透起到积极作用，有利于组织的长期培养。
附图说明
图1是为本发明的一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的结构示意图；
图2是本发明的凝胶组的结构示意图。
附图标记说明：01、第一凝胶；02、第二凝胶；03、间隙。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例
实施例1
如图1所示，一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶，包括第一凝胶01和第一凝胶02，第一凝胶02包裹于第一凝胶01内，并在第一凝胶01内形成微块状3D分散状态，使得第一凝胶01和第一凝胶02共同构成非均匀凝胶结构,第一凝胶01含有细胞也可以不含细胞，第二凝胶02含有细胞，第一凝胶01与第一凝胶02各自的交联强度不同。
本实施例1所述的一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、制备经过修饰的葡聚糖大分子的初步混合液态产物
步骤S11、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液；
步骤S12、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物并加入蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；
步骤S13、将步骤S11中的得到的液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液与步骤S12得到的葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于离心管中混匀，得到初步混合液态产物。
步骤S2、制备第一凝胶01的前体溶液
步骤S21、取出于-20℃或-80℃温度条件下含有巯基的RGD肽链固态物质，加入蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到含巯基RGD肽链水溶液；
步骤S22、在步骤S1中的初步混合液态产物中添加步骤S21得到的含巯基RGD肽链水溶液，吹打混匀后，室温静置5-6分钟，然后加入细胞悬液，得到第一凝胶01的前体溶液，细胞悬液为培养基细胞悬液，且可含细胞也可不含细胞。
步骤S3、制备已部分交联的第一凝胶02
步骤S31、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂并加蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂溶液，再将聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂溶液滴加到细胞培养板上；
步骤S32、在步骤S1中的初步混合液态产物中添加步骤S21得到的含巯基RGD肽链水溶液，吹打混匀后，室温静置T0分钟，然后加入细胞悬液，得到凝胶前体溶液，细胞悬液为培养基细胞悬液，且含有细胞；
步骤S33、取步骤S32得到的凝胶前体溶液与步骤S31中细胞培养板上的含有巯基的聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂混合，且交联剂的浓度可以根据需要设定，快速吹打2-3次后静置T1分钟，得到已部分交联的第一凝胶02，T0≥3min，T1≥0min，且T1≠T2。
步骤S4、采用正位移液器在步骤S2得到的第一凝胶01的前体溶液中加入步骤S3得到的已部分交联的第一凝胶02，同时通过外置活塞式吸头吹打已部分交联的第一凝胶02，使已部分交联的第一凝胶02在第一凝胶01的前体溶液中呈现微块状3D分散状态，得到凝胶混合物；
步骤S5、制备局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶
步骤S51、在步骤S4得到的凝胶混合物中加入第一凝胶01的交联剂，且交联剂的浓度可以根据需要设定，快速吹打2-3次后静置T2分钟，得到交联后的非匀质葡聚糖3D凝胶，第一凝胶01的交联剂为肽链交联剂；
步骤S52、将步骤S51得到的交联后的非匀质葡聚糖3D凝胶，加培养基至完全被覆盖后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；
步骤S53、2小时后更换步骤S52中的培养基，得到局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶。
实施例2
采用实施例1制得的局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶应用于培养细胞组织：
按上述实施例配制同时含有成纤维细胞(NIH/3T3)和成肌细胞的凝胶。成纤维细胞(NIH/3T3)和成肌细胞在实施例1制得的局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶中进行共培养，并测试在大于3-4周的培养期间内的细胞生长曲线。
实施例3
实施例1所述的一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的应用方法，包括以下步骤：
步骤S(a)、取两个或者多个局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶，分别标记为第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块，将第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块堆叠粘连成三维结构形态，得到凝胶组，再将凝胶组浸没于培养基中，第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块之间存在间隙03，如图2所示,第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块均包含第一凝胶01和第二凝胶02；
步骤S(b)、将步骤S(a)中得到的凝胶组应用于组织培养。
需要说明的是，第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块内的细胞可以是一种或者多种细胞，凝胶块内可以包含有血管内皮细胞和血管生成因子。
如图2所示，将第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块堆叠成三维形态，具有随机性，且每个凝胶块的方位可以不是水平和竖直的。当存在倾斜的凝胶块时，凝胶块之间形成了缝隙，且缝隙的形状是不规则的。每个凝胶块周边的上下左右方位处的其他凝胶块都与其有接触，但同时每个凝胶块周围都存在缝隙。
实施例4
采用实施例3所述的一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的应用方法，并且将第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块设置为内部的凝胶结构特征相同的凝胶块，因其能形成更大的组织结构，并且凝胶组的凝胶块之间的间隙03利于营养物质的渗透，从而应用于大面积或者较大体积生物组织模型的建立或者为组织修复提供更大体积的生物修复材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、制备经过修饰的葡聚糖大分子的初步混合液态产物；
步骤S11、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液；
步骤S12、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物并加入蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；
步骤S13、将所述步骤S11中的得到的液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液与所述步骤S12得到的葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于离心管中混匀，得到初步混合液态产物；
步骤S2、在所述步骤S1中的初步混合液态产物中添加含有巯基的接枝分子，使其发生接枝反应后，加入细胞悬液，得到第一凝胶的前体溶液；
步骤S21、取出于-20℃或-80℃温度条件下含有巯基的RGD肽链固态物质，加入蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到含巯基RGD肽链水溶液；
步骤S22、在所述步骤S1中的初步混合液态产物中添加所述步骤S21得到的含巯基RGD肽链水溶液，吹打混匀后，室温静置5-6分钟，然后加入细胞悬液，得到第一凝胶的前体溶液，所述细胞悬液为培养基细胞悬液，且可含细胞也可不含细胞；
步骤S3、在所述步骤S1中的初步混合液态产物中添加含有巯基的接枝分子，使其发生接枝反应后，加入细胞悬液，得到第二凝胶的前体溶液，再向第二凝胶的前体溶液中加入第二凝胶的交联剂，得到已部分交联的第二凝胶；
步骤S31、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂并加蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂溶液，再将所述聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂溶液滴加到细胞培养板上；
步骤S32、在所述步骤S1中的初步混合液态产物中添加所述步骤S21得到的含巯基RGD肽链水溶液，吹打混匀后，室温静置T0分钟，然后加入细胞悬液，得到凝胶前体溶液，所述细胞悬液为培养基细胞悬液，且含有细胞；
步骤S33、取所述步骤S32得到的凝胶前体溶液与步骤S31中细胞培养板上的含有巯基的聚乙二醇化修饰的寡肽交联剂混合，快速吹打2-3次后静置T1分钟，得到已部分交联的第二凝胶，所述T0≥3min，所述T1≥0min，且T1≠T2；
步骤S4、采用正位移移液器在所述步骤S2得到的第一凝胶的前体溶液中加入步骤S3得到的已部分交联的第二凝胶，同时通过外置活塞式吸头吹打所述已部分交联的第二凝胶，使已部分交联的第二凝胶在第一凝胶的前体溶液中呈现微块状3D分散状态，得到凝胶混合物；
步骤S5、在所述步骤S4中得到的凝胶混合物中加入第一凝胶的交联剂，得到局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶；
步骤S51、在所述步骤S4得到的凝胶混合物中加入第一凝胶的交联剂，快速吹打2-3次后静置T2分钟，得到交联后的非匀质葡聚糖3D凝胶；
步骤S52、将所述步骤S51得到的交联后的非匀质葡聚糖3D凝胶，加培养基至完全被覆盖后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；
步骤S53、2小时后更换所述步骤S52中的培养基，得到局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶；所述第一凝胶的交联剂为肽链交联剂。
2.根据权利要求1所述的一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的制备方法制备的非匀质葡聚糖3D凝胶，其特征在于：包括第一凝胶和第二凝胶，所述第二凝胶包裹于第一凝胶内，并在第一凝胶内形成微块状3D分散状态，使得第一凝胶和第二凝胶混合构成非均匀凝胶结构，所述第二凝胶含有细胞，所述第一凝胶与第二凝胶各自的交联强度不同；凝胶块堆叠粘连成三维结构形态，得到凝胶组，再将凝胶组浸没于培养基中，凝胶块之间存在间隙。
3.基于权利要求2所述的一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的制备方法制备的非匀质葡聚糖3D凝胶的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S(a)、取两个或者多个所述局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶，分别标记为第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块，将所述第1凝胶块、第二凝胶块、……、第n凝胶块堆叠粘连成三维结构形态，得到凝胶组，再将凝胶组浸没于培养基中，所述第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块之间存在间隙；
步骤S(b)、将所述步骤S(a)中得到的凝胶组应用于组织培养。
4.基于权利要求3所述的一种局部交联强度可调控的非匀质葡聚糖3D凝胶的制备方法制备的非匀质葡聚糖3D凝胶的应用方法，其特征在于：所述第1凝胶块、第2凝胶块、……、第n凝胶块各自内部的凝胶结构特征相同。
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