CN108841776B - 一种成分可调控的3d凝胶的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种成分可调控的3D凝胶的制备方法，主要包括制备凝胶前体混合溶液和制备含有细胞的成分可调控的3D凝胶两个步骤，同时，还公开了运用其制备的一种成分可调控的3D凝胶应用于细胞组织培养的具体应用；由本发明的制备方法操作简便，制备出的一种成分可调控的3D凝胶为细胞的三维生长提供了支撑，为细胞与生物材料的三维空间复合体搭建了框架。

Description

一种成分可调控的3D凝胶的制备方法及应用
技术领域
本发明属于的3D凝胶技术领域，具体涉及一种成分可调控的3D凝胶的制备方法及应用。
背景技术
近年来，人体受损组织器官再生技术受到越来越多的关注，而细胞的体外三维培养也成为了细胞培养领域的热点。通过使用不同的技术方法以及材料，构建出接近于体内的生长环境并利用细胞群体内在的固有属性，使细胞呈现出多维立体的生长状态，既有利于诱导细胞的定向分化以及分化后表型的维持与增殖，又有望在体外构建与各类组织、器官相对应的细胞三维生长类似物或等同物。组织工程的核心是构建细胞与生物材料的三维空间复合体。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种成分可调控的3D凝胶的制备方法及应用，由其所制备出的一种成分可调控的3D凝胶为细胞的三维生长提供了支撑，为细胞与生物材料的三维空间复合体搭建了框架。
本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的：
一种成分可调控的3D凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、制备凝胶前体混合溶液；
步骤S2、制备含有细胞的成分可调控的3D凝胶。
作为优选的技术方案，所述步骤S1中具体包括如下步骤：
步骤S11、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液，再取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物，每170μL固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物加蒸馏水175μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；
步骤S12、将所述步骤S11中的得到的液态蒸馏水、液态碳酸盐缓冲液、细胞悬液和葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于一锥形离心管中进行配制，得到凝胶前体混合溶液。
作为优选的技术方案，所述步骤S2中包括具体如下步骤：
步骤S21，取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂，每200μL固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂加蒸馏水188μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液，再将聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液滴加到96孔的细胞培养板上；
步骤S22，取所述步骤S12得到的凝胶前体混合溶液与步骤S21中细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂混合，快速吹打2-3次后静置3-5分钟，得到成分可调控的凝胶；
步骤S23，将所述步骤S22得到的成分可调控的凝胶溶液，加培养基至完全覆盖凝胶后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；
步骤S24，两小时后更换培养基，得到成分可调控的3D凝胶。
作为优选的技术方案，所述步骤S12中得到的凝胶前体混合溶液的组分含量为：液态蒸馏水0-17.0μL、液态碳酸盐缓冲液2.5μL、细胞悬液5.0μL、葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液2.5-9.0μL，所述细胞悬液为培养基细胞悬液。
作为优选的技术方案，步骤S21中所述的滴加到96孔的细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液的量为3.0-13.5μL。
作为优选的技术方案，所述步骤S22中所述的吹打的过程采用正位移移液枪和正位移吸头在5秒内完成。
一种成分可调控的3D凝胶的应用，所述成分可调控的3D凝胶应用于细胞组织培养。
作为优选的技术方案，所述成分可调控的3D凝胶具体应用于胚胎成纤维细胞间充质干细胞组织培养和成肌纤维细胞组织培养。
作为优选的技术方案，所述胚胎成纤维细胞间充质干细胞组织培养或成肌纤维细胞组织培养采用的成分可调控的3D凝胶由复合成分可调控的3D凝胶组成，所述复合成分可调控的3D凝胶是由葡萄糖马来酰亚胺聚合物含量不同的两种成分可调控的3D凝胶，紧贴形成结合界面而成的。
作为优选的技术方案，所述结合界面形式为平坦型或曲面型，方向为竖直、水平或倾斜。
本发明的有益效果为：
与现有技术相比，通过本发明提供的一种成分可调控的3D凝胶的制备方法操作简单易行，添加了凝胶前体溶液与聚乙二醇多肽混合物交联剂混合的吹打过程，该吹打过程是凝胶形成的关键，经多次实验测试验证，采用前述的吹打过程而形成的3D凝胶的结构更完整并且各成分混合更充分，适合于细胞体外三维培养。
另外，由本发明提供的一种成分可调控的3D凝胶的制备方法所制备出的3D凝胶，可探究在不同组分比例的情况下细胞的增殖、分化能力，细胞呈现的三维状态，在不同成分浓度的凝胶中细胞的生长状态，以及两种具有不同刚度的凝胶界面激励下的细胞的生长状态；并且前述的3D凝胶组成成分较少，在其制备中的生物交联材料后期部分可被细胞降解，使细胞充分利用先天性再生特性，与凝胶框架紧密结合，并适当引入刚度界面，充分模拟肌体内三维形态，自发的自组装成组织结构或器官；因此本发明制备出的3D凝胶对于细胞的三维培养对受损机体修复及再生、有机与无机结合界面的制造、开发组织或器官形态生物替代物具有重要意义。
附图说明
图1是为不同刚度凝胶在孔板中的构建；
图2是不同刚度凝胶结合界面；
图3是不同形式的刚度界面。
附图标记说明：1、葡萄糖马来酰亚胺聚合物含量为2.5μL的成分可调控的3D凝胶；2、葡萄糖马来酰亚胺聚合物含量为3.0μL的成分可调控的3D凝胶；3、结合界面。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1
一种成分可调控的3D凝胶的制备方法：
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液(本实施例中碳酸盐缓冲液采用CBpH5.5缓冲液)，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液，再取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物，每170μL固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物加蒸馏水175μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；而后将使用正位移移液枪和正位移吸头取得到的先前得到的液态蒸馏水17.0μL、液态碳酸盐缓冲液2.5μL、5.0μL细胞悬液和2.5μL葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于一锥形离心管中进行配制，得到凝胶前体混合溶液。
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂，每200μL固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂加蒸馏水188μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液，取3.0μL的聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液滴加到96孔的细胞培养板上；取先前得到的凝胶前体混合溶液与细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂混合，快速吹打2-3次后静置3-5分钟(吹打的过程采用正位移移液枪和正位移吸头在5秒内完成)，静置时可用吸头轻吸凝胶试探，若无法吸动，表明终成分可调控的凝胶已经形成。
将成分可调控的凝胶溶液，加100μL培养基至完全覆盖凝胶后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；两小时后更换培养基，得到成分可调控的3D凝胶。
实施例2
一种成分可调控的3D凝胶的制备方法：
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液(本实施例中碳酸盐缓冲液采用CBpH5.5缓冲液)，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液，再取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物，每170μL固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物加蒸馏水175μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；而后将使用正位移移液枪和正位移吸头取得到的先前得到的液态蒸馏水15.5μL、液态碳酸盐缓冲液2.5μL、5.0μL细胞悬液和3.0μL葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于一锥形离心管中进行配制，得到凝胶前体混合溶液。
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂，每200μL固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂加蒸馏水188μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液，取4.0μL的聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液滴加到96孔的细胞培养板上；取先前得到的凝胶前体混合溶液与细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂混合，快速吹打2-3次后静置3-5分钟(吹打的过程采用正位移移液枪和正位移吸头在5秒内完成)，静置时可用吸头轻吸凝胶试探，若无法吸动，表明终成分可调控的凝胶已经形成。
将成分可调控的凝胶溶液，加100μL培养基至完全覆盖凝胶后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；两小时后更换培养基，得到成分可调控的3D凝胶。
实施例3
一种成分可调控的3D凝胶的制备方法：
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液(本实施例中碳酸盐缓冲液采用CBpH5.5缓冲液)，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液，再取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物，每170μL固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物加蒸馏水175μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；而后将使用正位移移液枪和正位移吸头取得到的先前得到的液态蒸馏水12.0μL、液态碳酸盐缓冲液2.5μL、5.0μL细胞悬液和4.0μL葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于一锥形离心管中进行配制，得到凝胶前体混合溶液。
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂，每200μL固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂加蒸馏水188μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液，取6.5μL的聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液滴加到96孔的细胞培养板上；取先前得到的凝胶前体混合溶液与细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂混合，快速吹打2-3次后静置3-5分钟(吹打的过程采用正位移移液枪和正位移吸头在5秒内完成)，静置时可用吸头轻吸凝胶试探，若无法吸动，表明终成分可调控的凝胶已经形成。
将成分可调控的凝胶溶液，加100μL培养基至完全覆盖凝胶后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；两小时后更换培养基，得到成分可调控的3D凝胶。
实施例4
一种成分可调控的3D凝胶的制备方法：
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液(本实施例中碳酸盐缓冲液采用CBpH5.5缓冲液)，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液，再取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物，每170μL固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物加蒸馏水175μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；而后将使用正位移移液枪和正位移吸头取得到的先前得到的液态蒸馏水10.5μL、液态碳酸盐缓冲液2.5μL、5.0μL细胞悬液和5.0μL葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于一锥形离心管中进行配制，得到凝胶前体混合溶液。
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂，每200μL固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂加蒸馏水188μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液，取7.0μL的聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液滴加到96孔的细胞培养板上；取先前得到的凝胶前体混合溶液与细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂混合，快速吹打2-3次后静置3-5分钟(吹打的过程采用正位移移液枪和正位移吸头在5秒内完成)，静置时可用吸头轻吸凝胶试探，若无法吸动，表明终成分可调控的凝胶已经形成。
将成分可调控的凝胶溶液，加100μL培养基至完全覆盖凝胶后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；两小时后更换培养基，得到成分可调控的3D凝胶。
实施例5
一种成分可调控的3D凝胶的制备方法：
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液(本实施例中碳酸盐缓冲液采用CBpH5.5缓冲液)，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液，再取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物，每170μL固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物加蒸馏水175μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；而后将使用正位移移液枪和正位移吸头取得到的先前得到的液态蒸馏水5.5μL、液态碳酸盐缓冲液2.5μL、5.0μL细胞悬液和7.0μL葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于一锥形离心管中进行配制，得到凝胶前体混合溶液。
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂，每200μL固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂加蒸馏水188μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液，取10.0μL的聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液滴加到96孔的细胞培养板上；取先前得到的凝胶前体混合溶液与细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂混合，快速吹打2-3次后静置3-5分钟(吹打的过程采用正位移移液枪和正位移吸头在5秒内完成)，静置时可用吸头轻吸凝胶试探，若无法吸动，表明终成分可调控的凝胶已经形成。
将成分可调控的凝胶溶液，加100μL培养基至完全覆盖凝胶后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；两小时后更换培养基，得到成分可调控的3D凝胶。
实施例6
一种成分可调控的3D凝胶的制备方法：
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液(本实施例中碳酸盐缓冲液采用CBpH5.5缓冲液)，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液，再取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物，每170μL固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物加蒸馏水175μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；而后将使用正位移移液枪和正位移吸头取得到的先前得到的液态蒸馏水2.5μL、液态碳酸盐缓冲液2.5μL、5.0μL细胞悬液和9.0μL葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于一锥形离心管中进行配制，得到凝胶前体混合溶液。
取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂，每200μL固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂加蒸馏水188μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液，取13.5μL的聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液滴加到96孔的细胞培养板上；取先前得到的凝胶前体混合溶液与细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂混合，快速吹打2-3次后静置3-5分钟(吹打的过程采用正位移移液枪和正位移吸头在5秒内完成)，静置时可用吸头轻吸凝胶试探，若无法吸动，表明终成分可调控的凝胶已经形成。
将成分可调控的凝胶溶液，加100μL培养基至完全覆盖凝胶后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；两小时后更换培养基，得到成分可调控的3D凝胶。
实施例7
一种成分可调控的3D凝胶应用于培养细胞组织：
按上述实施例配制含有小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)的凝胶。小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)在凝胶层中显出较强的增殖分化能力。
实施例8
一种成分可调控的3D凝胶应用于培养细胞组织：
按上述实施例配制含有小鼠成肌纤维细胞(C2C12)的凝胶。小鼠成肌纤维细胞(C2C12)在凝胶层中显出较强的增殖分化能力。
ALP活性，DAPI染色，分化特异性转录因子myogenin大量出现于分化的肌细胞核内。成肌特异性蛋白Desmin阳性表达于分化肌管的胞质内，表明所构建的三维极性分化肌组织具有成熟骨骼肌组织的分子特性。
实施例9
一种成分可调控的3D凝胶应用于培养细胞组织：
按上述实施例配制含有小鼠间充质干细胞(MSC)的凝胶。小鼠间充质干细胞(MSC)在凝胶层中显出较强的增殖分化能力。
随着诱导培养时间的延长，细胞逐渐堆积并矿盐沉积，形成矿化结节。培养14d和21d后，矿化结节形成率分别约为70.5％和88％，ALP染色阳性率分别约为45％和85％。
实施例10
一种成分可调控的3D凝胶应用于培养细胞组织：
如图1-2所示，通过改变葡萄糖马来酰亚胺聚合物或者交联剂的浓度来制备两种具有不同刚度的凝胶，并使得两种具有不同刚度的凝胶紧贴形成界面，界面可以是平的，弯曲的，竖直的或是水平的。在凝胶刚度界面激励下的，细胞的迁移和增殖状态会得到界面几何形状或走向的引导。按上述实施例分别配置含有小鼠成肌纤维细胞(C2C12)葡萄糖马来酰亚胺聚合物含量为2.5μL的成分可调控的3D凝胶1和葡萄糖马来酰亚胺聚合物为3.0μL的成分可调控的3D凝胶2，后者的刚度大于前者。构建不同刚度凝胶结合界面3。如图3所示的不同的阵列式形状的结合界面3，形成了深度均匀的沟槽或是深度不均匀的沟槽，这些沟槽可以引导肌纤维细胞在沟槽中成纤维化对其生长。结合界面3的线段形状可以是直线也可以是曲线，故结合界面3形式为平坦型或曲面型，方向为竖直、水平或倾斜。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种成分可调控的3D凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、制备凝胶前体混合溶液，具体为：
步骤S11、取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的蒸馏水和碳酸盐缓冲液，并在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态碳酸盐缓冲液，再取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物，每170μL固态的葡萄糖马来酰亚胺聚合物加蒸馏水175μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液；
步骤S12、将所述步骤S11中的得到的液态蒸馏水、液态碳酸盐缓冲液、细胞悬液和葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液于一锥形离心管中进行配制，得到凝胶前体混合溶液，所述凝胶前体混合溶液的组分含量为：液态蒸馏水0-17.0μL、液态碳酸盐缓冲液2.5μL、细胞悬液5.0μL、葡萄糖马来酰亚胺聚合物溶液2.5-9.0μL，所述细胞悬液为培养基细胞悬液；
步骤S2、制备含有细胞的成分可调控的3D凝胶，具体为：
步骤S21，取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂，每200μL固态的聚乙二醇多肽混合物交联剂加蒸馏水188μL进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液，再将聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液滴加到96孔的细胞培养板上，所述滴加到96孔的细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂溶液的量为3.0-13.5μL；
步骤S22，取所述步骤S12得到的凝胶前体混合溶液与步骤S21中细胞培养板上的聚乙二醇多肽混合物交联剂混合，快速吹打2-3次后静置3-5分钟，得到成分可调控的凝胶，所述的吹打的过程采用正位移移液枪和正位移吸头在5秒内完成；
步骤S23，将所述步骤S22得到的成分可调控的凝胶溶液，加培养基至完全覆盖凝胶后，再盖上细胞培养板盖子，放入培养箱中孵育；
步骤S24，两小时后更换培养基，得到成分可调控的3D凝胶。
2.如权利要求1所述的制备方法制备的一种成分可调控的3D凝胶的应用，其特征在于，所述成分可调控的3D凝胶应用于细胞组织培养。
3.根据权利要求2所述的一种成分可调控的3D凝胶的应用，其特征在于，所述成分可调控的3D凝胶具体应用于胚胎成纤维细胞组织培养间充质干细胞组织培养和成肌纤维细胞组织培养。
4.根据权利要求3所述的一种成分可调控的3D凝胶的应用，其特征在于，所述胚胎成纤维细胞间充质干细胞组织培养或成肌纤维细胞组织培养采用的成分可调控的3D凝胶由复合成分可调控的3D凝胶组成，所述复合成分可调控的3D凝胶是由葡萄糖马来酰亚胺聚合物含量不同的两种成分可调控的3D凝胶，紧贴形成结合界面而成的。
5.根据权利要求4所述的一种成分可调控的3D凝胶的应用，其特征在于，所述结合界面形式为平坦型或曲面型，方向为竖直、水平或倾斜。
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