CN102898660A - 一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,应用聚甲基乙烯基醚马来酸酐水解产物甲基乙烯基醚马来酸共聚物和交联剂聚乙二醇、聚乙交酯丙交酯-聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯三嵌段共聚物、聚-ε-己内酯丙交酯-聚乙二醇-聚-ε-己内酯丙交酯三嵌段共聚物或葡聚糖进行交联反应,通过调整甲基乙烯基醚/马来酸共聚物中羧基和交联剂中羟基的比例,获得不同交联密度的凝胶,交联后凝胶中多余的羧基再用聚乙二醇单甲醚进行酯化,最后将获得的凝胶配成5%的水溶液,再用弱碱,如饱和碳酸氢钠水溶液进行中和,至pH=7.0,制得可适合用作肿瘤细胞三维培养基质的水凝胶。
Description
技术领域
本发明涉及医用材料制备领域,具体涉及可应用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法和抗肿瘤药物的高通量筛选。
背景技术
传统的二维肿瘤细胞培养(2D 培养),由于其简单、易行和费用低等优点,在肿瘤细胞培养中广泛使用。然而由于2D 培养与体内的真实环境差别较大,如肿瘤细胞呈平面生长,无法构建一个立体环境,细胞与细胞或细胞与基质之间的相互作用得不到真实体现。体外三维细胞培养(3D 培养)微环境更接近体内的细胞生长环境,因此从21 世纪初3D 培养已经在生物医学领域获得了广泛的应用。应用3D 培养技术,则可以形成肿瘤模型并观察药物作用,研究肿瘤对化疗或放疗等的耐受性,观察肿瘤生物学行为如转移和浸润等,观察细胞间相互作用和研究肿瘤血管生成和血管拟态。正因为如此,三维细胞培养正成为极具吸引力的抗肿瘤药物的评价方法。目前的三维培养技术包括自发性细胞聚集、基质覆盖培养、旋转烧瓶培养、微载体培养、预置支架培养和旋转细胞培养系统等。其中预置支架(或基质)培养操作相对简单,易于实现肿瘤细胞的三维生长,但关键技术在于选择合适的培养基质材料。目前所用于抗肿瘤药物的三维细胞培养基质主要来源于动物性凝胶, 如胶原蛋白I、明胶或提取细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)。由于动物性凝胶内含有很多不确定组份及其批次间的组份差异,影响了药物评价结果的准确性和客观性;另外一方面,动物性凝胶价格昂贵,限制了其广泛的应用。
聚甲基乙烯基醚 (poly methyl vinyl ether, PMVE) 是无毒安全的热敏性材料,其低临界共溶温度(LCST)在37℃左右, 比常用的热敏性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺(PINPAAM)的LCST (约32℃) 更接近人体温度(约37℃)。而甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物(PMVE-alt-MAH)是另一类对人体和动物无毒无害的高分子材料, 具有良好的化学稳定性和生物相容性优点,兼有亲水和疏水的独特性能, 在现代工业中有着非常广泛的应用。甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物的水解产物,甲基乙烯基醚/马来酸共聚物(PMVE-alt-MA),经α-甲氧基-ω-氨基-聚乙二醇(MeO-PEG-NH2)修饰后,对细胞显示良好的活性。聚乳酸乙醇酸(PLGA),聚ε-己内酯乳酸(PCLA), 聚乙二醇(PEG)都是已经被证明具有良好生物相容性的合成聚合物, 已经作为微纤维支架进行细胞的三维培养。右旋糖酐(Dextran)在化学结构上类似于细胞外基质(ECM)组份之一的糖胺聚糖,是具有高分子量和亲水性多糖,含有丰富的悬挂的羟基可供化学修饰。而RGD(Arg–Gly–Asp)多肽能够很好地促进肿瘤细胞的黏附和生长。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,提供好了一种简单易制的合适的肿瘤细胞三维培养的基质材料的制备方法。
本发明提供的技术方案如下:
一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,,,具体包括以下步骤:
步骤一:将不同质量的交联剂:聚乙二醇、聚乙交酯丙交酯-聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯三嵌段共聚物、聚-ε—己内酯丙交酯—聚乙二醇-聚-ε-己内酯丙交酯三嵌段共聚物、聚乙交酯-聚乙二醇-聚乙交酯三嵌段共聚物、聚丙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯三嵌段共聚物、聚-ε-己内酯-聚乙二醇-聚-ε-己内酯三嵌段共聚物或右旋糖酐中的一种或几种的组合,溶于二次蒸馏水中,获得不同浓度的交联剂水溶液;
步骤二:将上述不同浓度的的交联剂的水溶液加入到同一份聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中,充分搅拌混合均匀后,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在60-120℃的条件下交联12小时-72小时, 获得交联的水凝胶固体;
步骤三:在交联的水凝胶固体中加入二次蒸馏水,获得交联的水凝胶溶液,再按聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中聚甲基乙烯基醚马来酸的羧基的物质的量(n-COOH/mol)和交联剂水溶液中交联剂中羟基的物质的量(n-OH/mol)的比率(n-COOH : n-OH)为50:1 - 3000:1的量,加入聚乙二醇单甲基醚水溶液,混合均匀,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在60-120℃的条件下酯化12小时-72小时, 将步骤二中未交联的羧基进行酯化成水凝胶固体;
步骤四:或者将步骤一中已经配好的交联剂水溶液再加入一定量的酯化剂聚乙二醇单甲醚,获得不同浓度的包含酯化剂和交联剂水溶液;将上述不同浓度的的交联剂的水溶液加入到同一份聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中,充分搅拌混合均匀后,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在60-120℃的条件下交联12小时-72小时, 获得交联的水凝胶固体;
步骤五:按质量比为1:19的比例将经上述步骤三或四获得的交联后的水凝胶固体溶于二次蒸馏水进行溶胀,在搅拌条件下获得均相澄清的水凝胶溶液,再逐滴滴加碱溶液,直到水凝胶溶液的pH值等于7为止,便获得最终的水凝胶溶液。
优选的,步骤一中,所用的二次蒸馏水的体积为10ml。
优选的,步骤二中,所述聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液是通过将0.7800g聚甲基乙烯基醚马来酸酐放置于20mL二次蒸馏水中,在90-100℃下加热水解2小时后,获得的澄清的聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液。
优选的,步骤二中,在烘箱中进行交联反应时,交联时间为24小时。
优选的,步骤三中,所用的二次蒸馏水的体积为30mL。
优选的,步骤三中,聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液和交联剂水溶液是在
0-100℃的条件下混合均匀的。
优选的,步骤三中,在烘箱中进行酯化反应时,温度为80℃, 交联时间为24小时。
优选的,步骤五中,所述碱溶液为饱和的碳酸氢钠水溶液或浓度为5%到20%的氢氧化钠水溶液。
优选的,步骤五中,最后获得的水凝胶溶液的浓度在0.1wt%-10wt%之间。
有益效果:本发明以聚甲基乙烯基醚马来酸共聚物和聚乙二醇,聚乳酸乙醇酸-聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸、聚ε-己内酯乳酸-聚乙二醇-聚ε-己内酯乳酸,或右旋糖酐等与甲基乙烯基醚/马来酸共聚物进行交联获得水凝胶,作为适用于三维卵巢癌细胞等肿瘤细胞培养基质。
具体实施方式
本发明的一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备技术,具体包括以下步骤:
步骤一:首先将0.7800g聚甲基乙烯基醚马来酸酐放置于20 mL二次蒸馏水中,加热90℃水解两个小时获得聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液;
步骤二:将不同质量的交联剂:聚乙二醇、聚乙交酯丙交酯-聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯三嵌段共聚物、聚-ε—己内酯丙交酯—聚乙二醇-聚-ε-己内酯丙交酯三嵌段共聚物、聚乙交酯-聚乙二醇-聚乙交酯三嵌段共聚物、聚丙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯三嵌段共聚物、聚-ε-己内酯-聚乙二醇-聚-ε-己内酯三嵌段共聚物或右旋糖酐中的一种或几种的组合,溶于二次蒸馏水中,获得不同浓度的交联剂水溶液;
步骤三:将上述不同浓度的的交联剂的水溶液加入到同一份聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中,充分搅拌混合均匀后,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在60-120℃的条件下交联12小时-72小时, 获得交联的水凝胶固体;
步骤四:在交联的水凝胶固体中加入二次蒸馏水,获得交联的水凝胶溶液,再按聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中的羧基的物质的量(n-COOH/mol)和交联剂水溶液中交联剂中羟基的物质的量(n-OH/mol)的比率(n-COOH : n-OH)为50:1 - 3000:1的量,加入聚乙二醇单甲基醚水溶液,混合均匀,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在60-120℃的条件下酯化12小时-72小时, 将步骤三中未交联的羧基进行酯化成水凝胶固体;
步骤五:或者将不同质量的交联剂:聚乙二醇PEG、聚乙交酯丙交酯—聚乙二醇—聚乙交酯丙交酯三嵌段共聚物(PLGA-PEG-PLGA)、聚-ε—己内酯丙交酯-聚乙二醇—聚-ε-己内酯丙交酯三嵌段共聚物(PCLA-PEG-PCLA)、聚乙交酯-聚乙二醇-聚乙交酯三嵌段共聚物(PGA-PEG-PGA)、聚丙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯三嵌段共聚物(PLLA-PEG-PLLA)、聚-ε—己内酯-聚乙二醇—聚-ε-己内酯三嵌段共聚物(PCL-PEG-PCL)或右旋糖酐的一种或几种的混合物,和酯化剂聚乙二醇单甲醚同时溶于10 mL二次蒸馏水,获得不同浓度水溶液;交联剂和聚乙二醇单甲醚中羟基的数量等于聚甲基乙烯基醚马来酸中羧基的数量;
步骤六:将上述交联剂和酯化剂的水溶液加入到聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在80℃的条件下交联24小时, 获得交联的水凝胶固体。
步骤七:将上述步骤四或六获得的水凝胶固体0.2000g溶于3.800g二次蒸馏水,搅拌条件下,向上述水凝胶溶液逐滴滴加饱和碳酸氢钠的水溶液, 直到水凝胶溶液的pH值等于7为止。
实施例1
首先将0.0975g聚甲基乙烯基醚马来酸酐放置于10 mL二次蒸馏水中,加热90℃水解两个小时获得聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液;再将0.0156g交联剂聚乙二醇PEG(分子量为1万)溶于10 mL二次蒸馏水;将上述交联剂加入到聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中(羧基的量n-COOH:羟基的量n-OH = 400:1),在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在80℃的条件下交联24小时, 获得交联的水凝胶固体。再将上述水凝胶固体溶于10 mL二次蒸馏水,再加入1.2500g 酯化剂聚乙二醇单甲醚(MeO-PEG-OH (1K)搅拌条件下混合均匀,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在80℃的条件下酯化24小时。然后将酯化后的凝胶二次蒸馏水配成4wt%溶液,搅拌条件下,向上述水凝胶溶液逐滴滴加饱和碳酸氢钠的水溶液,直到水凝胶溶液的pH值等于7为止, 最终获得的水凝胶溶液的浓度大约为3.5 wt %。
实施例2
首先将0.0975g聚甲基乙烯基醚马来酸酐放置于10 mL二次蒸馏水中,加热90℃水解两个小时获得聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液;再将0.01563g交联剂聚乙二醇PEG(分子量为1万)和1.2500g酯化剂聚乙二醇单甲醚溶于10 mL二次蒸馏水;将上述交联剂(羧基的量n-COOH:羟基的量n-OH = 400:1)和酯化剂的水溶液加入到聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在80℃的条件下交联24小时, 获得交联的水凝胶固体。然后将上述凝胶溶于二次蒸馏水配成4wt%溶液,搅拌条件下,向上述水凝胶溶液逐滴滴加饱和碳酸氢钠的水溶液,直到水凝胶溶液的pH值等于7为止, 最终获得的水凝胶溶液的浓度大约为3.5 wt %。
实施例3
首先将0.7800g聚甲基乙烯基醚马来酸酐放置于20 mL二次蒸馏水中,加热90 ooC水解两个小时获得聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液;再将0.0625g交联剂聚乙二醇PEG和聚乳酸乙醇酸三嵌段共聚物PLGA1300-PEG1500-PLGA1300(分子量为4100)溶于10 mL二次蒸馏水获得水溶液;将上述交联剂的水溶液加入到聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中(羧基的量n-COOH:羟基的量n-OH = 800:1),在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在80℃的条件下交联24小时, 获得交联的水凝胶固体。称取0.2000g水凝胶固体溶于4.8000g二次蒸馏水,搅拌条件下,向上述水凝胶溶液逐滴滴加饱和碳酸氢钠的水溶液,直到水凝胶溶液的pH值等于7为止, 最终获得的水凝胶溶液的浓度大学为3.5wt%。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点,其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
步骤一:将不同质量的交联剂:聚乙二醇、聚乙交酯丙交酯-聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯三嵌段共聚物、聚-ε—己内酯丙交酯—聚乙二醇-聚-ε-己内酯丙交酯三嵌段共聚物、聚乙交酯-聚乙二醇-聚乙交酯三嵌段共聚物、聚丙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯三嵌段共聚物、聚-ε-己内酯-聚乙二醇-聚-ε-己内酯三嵌段共聚物或右旋糖酐中的一种或几种的组合,溶于二次蒸馏水中,获得不同浓度的交联剂水溶液;
步骤二:将上述不同浓度的的交联剂的水溶液加入到同一份聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中,充分搅拌混合均匀后,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在60-120℃的条件下交联12小时到72小时, 获得交联的水凝胶固体;
步骤三:在交联的水凝胶固体中加入二次蒸馏水,获得交联的水凝胶溶液,再按聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中聚甲基乙烯基醚马来酸的羧基的物质的量(n-COOH/mol)和交联剂水溶液中交联剂中羟基的物质的量(n-OH/mol)的比率(n-COOH : n-OH)为50:1 - 3000:1的量,加入聚乙二醇单甲基醚水溶液,混合均匀,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在60-120℃的条件下酯化12小时到72小时, 将步骤二中未交联的羧基进行酯化成水凝胶固体;
步骤四:或者将步骤一中已经配好的交联剂水溶液再加入一定量的酯化剂聚乙二醇单甲醚,获得不同浓度的包含酯化剂和交联剂水溶液;将上述不同浓度的酯化剂和交联剂的水溶液加入到同一份聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中,充分搅拌混合均匀后,在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水,然后置于烘箱中在60-120℃的条件下交联12小时到72小时, 获得交联的水凝胶固体;
步骤五:按质量比为1:19的比例将经上述步骤三或步骤四获得的交联后的水凝胶固体溶于二次蒸馏水进行溶胀,在搅拌条件下获得均相澄清的水凝胶溶液,再逐滴滴加碱溶液,直到水凝胶溶液的pH值等于7为止,便获得最终的水凝胶溶液。
2. 根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤一中,所用的二次蒸馏水的体积为10ml。
3.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤二中,所述聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液是通过将0.7800g聚甲基乙烯基醚马来酸酐放置于20mL二次蒸馏水中,在90-100℃下加热水解2小时后,获得的澄清的聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤二中,在烘箱中进行交联反应时,交联时间为24小时。
5.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤三中,所用的二次蒸馏水的体积为30mL。
6.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤三中,聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液和交联剂水溶液是在
0-100℃的条件下混合均匀的。
7.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤三中,在烘箱中进行酯化反应时,温度为80℃, 交联时间为24小时。
8.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤五中,所述碱溶液为饱和的碳酸氢钠水溶液或浓度为5%到20%的氢氧化钠水溶液。
9.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤五中,最后获得的水凝胶溶液的浓度为3.5±0.2%。
10.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤五中,最后获得的水凝胶溶液的浓度在0.1wt%-10wt%之间。
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