CN103819694A - 一种具有细胞相容性的丝素蛋白水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有良好细胞相容性的丝素蛋白水凝胶及其制备方法。将浓度为30～300g/L的丝素蛋白水溶液和浓度为10～50g/L的N-月桂酰肌氨酸钠溶液混合均匀，再加入超纯水用于调节混合溶液中的丝素蛋白的终浓度为10～100g/L,N-月桂酰肌氨酸钠的终浓度为2～20g/L，置于30～50℃的温度下静置0.3～3h，得到丝素蛋白水凝胶。本发明提供的丝素蛋白水凝胶细胞相容性好，细胞能够稳定生长，可应用于组织修复，人工皮肤，人工软骨，细胞培养支架，生物反应器，酶固定化材料，药物辅料等生物医用方面。

Description

一种具有细胞相容性的丝素蛋白水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种水凝胶材料，特别涉及一种具有细胞相容性的丝素蛋白水凝胶及其制备方法，该丝素蛋白水凝胶材料可应用于生物医用、组织修复、药物辅料等技术领域。

背景技术

水凝胶是一种以水为分散介质的凝胶，是具有交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水集团而形成能遇水膨胀的交联聚合物；它是一种高分子网络体系，性质柔软，能吸收大量的水并保持一定的形状。水凝胶具有良好的生物相容性、水渗透性，目前被广泛用于药物释放载体、组织工程材料、人工皮肤、人造肌肉、生物传感器、分离装置、重金属离子回收等方面。对于需要植入体内的水凝胶要与组织和细胞直接接触，因此水凝胶必须具有良好的细胞生物相容性。具有良好细胞生物相容性的水凝胶可以更好的使细胞生长，加速组织修复进度，用于组织修复、细胞的包埋以及用作组织支架材料等方面。

丝素蛋白无毒、无刺激性，具有良好的生物相容性, 能够促进人体细胞的生长，具有一定的生物可降解性，通过对多种生物材料的对比研究表明，丝素蛋白具有与胶原同等的体内、体外生物相容性（参见文献[J]Biomaterials，2003，24 (3)：401–416），因此，丝素蛋白具有能够作为生物医用材料的应用潜能。丝素蛋白水凝胶可由丝素蛋白溶液制得。丝素蛋白溶液在静置下会逐渐向凝胶化转变，但是这个转变的时间比较长，通常要在1个月以上。可以通过改变丝素蛋白溶液的pH值来加快凝胶化的过程。当pH值接近于丝素蛋白的等电点(pH=3.9)时, 丝素蛋白容易发生胶凝作用, 但也需要8天的时间才能完成凝胶化（参见文献[J]浙江工程学院学报, 1999，16（3），172－176）。此外，丝素蛋白的浓度对于凝胶时间也有影响，丝素蛋白溶液在浓度大于10％时比较容易形成凝胶（参见文献[J]食品科学，2007, 28（12），58－62），但是在浓度小于10％时需要很长的时间才能形成凝胶。而高浓度丝素蛋白溶液形成的凝胶含水量较低，孔隙率也较低，在应用时受到一定的限制。因此低浓度下的丝素溶液凝胶化时间太长制约了丝素水凝胶的使用。在本发明作出之前，中国发明专利（CN1158338C）公开了一种化学交联结构的丝素凝胶、海绵状丝素凝胶材料制备方法，采用调整丝素蛋白质水溶液的pH，并混入环氧化合物作为交联剂，经冷冻，凝固成凝胶。众所周知，环氧化合物具有一定的毒性，虽然采用水洗法去除未反应的环氧交联剂，但是凝胶中仍然存在残留的环氧交联剂，从而带来一定的毒性并且降低丝素蛋白的生物相容性（参见文献[J]生物医学工程学杂志，2007，24 (6)∶1309～1313）。中国发明专利（CN102174203）采用聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物与丝素蛋白溶液混合得到的水凝胶同样具有一定的毒性难以解决。中国发明专利（CN101502670）公开了一种丝素蛋白水凝胶的制备方法，采用超声波震荡的方法，能够在短时间内形成水凝胶，但是其难以做到对时间的具体控制及在体内成型，特别是难以在其中加入细胞，细胞会被超声波破坏而死亡。

发明内容

本发明所要解决的问题是克服现有技术存在的不足，提供一种细胞生物相容性好，凝胶时间可控，易成型的丝素蛋白水凝胶及其制备方法。

本发明所采用的技术方案是提供一种具有细胞生物相容性的丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1、配置浓度为30～300g/L的丝素蛋白水溶液，保存于温度 2～8 ℃下；配置浓度为10～50 g/L的N-月桂酰肌氨酸钠溶液，保存于常温下；

2、将步骤1配置的丝素蛋白水溶液和N-月桂酰肌氨酸钠溶液混合均匀，再加入超纯水用于调节混合溶液中的丝素蛋白的终浓度为10～100g/L, N-月桂酰肌氨酸钠的终浓度为2～20g/L，置于 30～50℃的温度下静置 0.3～3h，得到丝素蛋白水凝胶。

本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的具有细胞相容性的丝素蛋白水凝胶。

与现有技术相比，本发明具有以下明显优点：

1、本发明采用丝素蛋白作为水凝胶主体，以生物表面活性剂溶液为凝胶剂，通过加入超纯水来调节最终浓度，所有组份均为液态，在室温混合过程中不会凝胶化，混合均匀，有利于吸入针管中，溶液稳定时间可通过温度与浓度调控，提供合适的凝胶时间；混合溶液注射入体内后，温度升高，溶液快速凝胶化；无化学交联剂残留，其生物相容性好；可以降解，降解产物无毒无刺激性。可应用于组织修复，人工皮肤，人工软骨，细胞培养支架，生物反应器，酶固定化材料，药物辅料等生物医用方面。

2、本发明所提供的丝素蛋白水凝胶，具有良好的细胞生物相容性，细胞在其表面生长稳定。可应用于组织修复，细胞的包埋等生物医用方面。 

附图说明

图1是本发明实施例一～四所制备的丝素蛋白水凝胶，在其上进行L929细胞培养后，经荧光检验细胞在丝素蛋白水凝胶上增殖情况的对比直方图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步描述。

实施例一

本实施例提供的丝素蛋白水凝胶制备步骤如下：

1、将40克白厂丝放入2升质量浓度为0.2g/L的碳酸氢钠、1g/L的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液中，于98～100℃处理0.5小时，充分洗涤，再次2升质量浓度为0.2g/L的碳酸氢钠、1g/L的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液中，于98～100℃处理0.5小时，充分洗涤，然后放入400mL浓度为3g/L的木瓜蛋白酶溶液中，于60℃处理1h，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素蛋白纤维。称取10g纯丝素纤维溶解于100毫升9.3摩尔/升的溴化锂溶液，在60±2℃缓慢搅拌溶解成丝素蛋白溴化锂混合溶液；

2、将所得的丝素蛋白溴化锂混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液；

3、调节丝素蛋白溶液浓度为20g/L，为组分A，存放于4 ℃；

4、配制10 g/L 的N-月桂酰肌氨酸钠溶液，为组分B，常温储存即可；

5、取一定量超纯水，为C组份；

6、将上述组分A与组分B以终浓度混合，通过C组份的加入调节得到A组份终浓度为10g/L, B组份终浓度为4g/L，即加入A、B、C体积比为5:4:1，混合均匀，注入模具中，升温至37℃，静置50分钟左右形成水凝胶。

7、细胞培养实验

（1）试验细胞为L929成纤维细胞，传代48h-72h生长旺盛的细胞。培养液为89% DMEM+10%胎牛血清+1%抗生素（双抗）。在96孔板中制备上述水凝胶，至少6孔。待水凝胶稳定2h后，用细胞培养液配制1×10⁴个/mL L929细胞悬液，每孔加入80uL细胞悬液，再加入120uL培养液，在含有5%（V/V）二氧化碳空气，37℃的培养箱中培养9天，每两天换新鲜的培养液200uL。

（2）配制50umol/L的阿尔玛蓝溶液，与培养液1:10配制成阿尔玛蓝染色培养液。

（3）在第一、三、五、七天检测细胞活性。96孔板每孔加入200uL阿尔玛蓝染色培养液,继续在相同条件下培养6h，在Synergy HT型多功能酶标仪（美国 Bio-Tek Instruments 公司）测其荧光值强度变化来表征细胞活性，其中激发波长530nm，发射波长590nm。细胞相容性检测结果参见附图1。

实施例二

1、将40克白厂丝放入2升质量浓度为0.2g/L的碳酸氢钠、1g/L的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液中，于98～100℃处理0.5小时，充分洗涤，重复一次，然后放入400mL浓度为3g/L的木瓜蛋白酶溶液中，于60℃处理1h，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到丝素蛋白纤维。取15g丝素纤维溶解于100毫升9.3摩尔/升的溴化锂溶液，在60±2℃溶解成丝素蛋白溴化锂混合溶液；

2、将所得的丝素蛋白溴化锂混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液；

3、调节丝素蛋白溶液浓度为30g/L，为组分A，存放于4 ℃；

4、配制20 g/L 的N-月桂酰肌氨酸钠溶液，为组分B，常温储存即可；

5、取一定量超纯水，为C组份；

6、将上述组分A与组分B以终浓度混合，通过C组份的加入调节得到A组份终浓度为15g/L,B组份终浓度为4g/L，即加入A、B、C体积比为5:2:3，混合均匀，注入模具中，升温至50℃，静置20分钟左右形成水凝胶。

7、细胞培养实验

（1）试验细胞为L929成纤维细胞。在96孔板中制备上述水凝胶，至少6孔。待水凝胶稳定2h后，每孔加入80uL 1×10⁴个/mL L929细胞悬液，再加入120uL培养液，在含有5%（V/V）二氧化碳空气，37℃的培养箱中培养9天，每两天换新鲜的培养液200uL。

（2）配制50umol/L的阿尔玛蓝溶液，与培养液1:10配制成阿尔玛蓝染色培养液。

（3）在第一、三、五、七天检测细胞活性。每孔加入200uL阿尔玛蓝染色培养液,继续在相同条件下培养6h，在Synergy HT型多功能酶标仪测其荧光值强度变化来表征细胞活性，其中激发波长530nm，发射波长590nm。细胞相容性检测结果参见附图1。

实施例三

1、将40克白厂丝放入2升质量浓度为0.2g/L的碳酸氢钠、1g/L的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液中，于98～100℃处理0.5小时，充分洗涤，重复一次，然后放入400mL浓度为3g/L的木瓜蛋白酶溶液中，于60℃处理1h，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到丝素蛋白纤维。取10g丝素纤维溶解于100毫升9.3摩尔/升的溴化锂溶液，在60±2℃溶解成丝素蛋白溴化锂混合溶液；

2、将所得的丝素蛋白溴化锂混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液；

3、调节丝素蛋白溶液浓度为30g/L，为组分A，存放于4 ℃；

4、配制30 g/L 的N-月桂酰肌氨酸钠溶液，为组分B，常温储存即可；

5、取一定量超纯水，为C组份；

6、将上述组分A与组分B以终浓度混合，通过C组份的加入调节得到A组份终浓度为20g/L, B组份终浓度为6g/L，即加入A、B、C体积比为20:9:1，混合均匀，注入模具中，升温至37℃，静置30分钟左右形成水凝胶。

7、细胞培养实验

（1）试验细胞为L929成纤维细胞。在96孔板中制备上述水凝胶，至少6孔。待水凝胶稳定2h后，每孔加入80uL 1×10⁴个/mL L929细胞悬液，再加入120uL培养液，在含有5%（V/V）二氧化碳空气，37℃的培养箱中培养9天，每天换新鲜的培养液200uL。

（2）配制50umol/L的阿尔玛蓝溶液，与培养液1:10配制成阿尔玛蓝染色培养液。

（3）在第一、三、五、七天检测细胞活性。每孔加入200uL阿尔玛蓝染色培养液,继续在相同条件下培养6h，在Synergy HT型多功能酶标仪测其荧光值强度变化来表征细胞活性，其中激发波长530nm，发射波长590nm。细胞相容性检测结果参见附图1。

实施例四

1、将40克白厂丝放入2升质量浓度为0.2g/L的碳酸氢钠、1g/L的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液中，于98～100℃处理0.5小时，充分洗涤，重复一次，然后放入400mL浓度为3g/L的木瓜蛋白酶溶液中，于60℃处理1h，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到丝素纤维。取10g丝素纤维溶解于100毫升9.3摩尔/升的溴化锂溶液，在60±2℃溶解成丝素蛋白溴化锂混合溶液；

2、将所得的丝素蛋白溴化锂混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液；

3、调节丝素蛋白溶液浓度为60g/L，为组分A，存放于4 ℃；

4、配制40 g/L 的N-月桂酰肌氨酸钠溶液，为组分B，常温储存即可；

5、取一定量超纯水，为C组份，备用；

6、将上述组分A与组分B以终浓度混合，通过C组份的加入调节得到A组份终浓度为30g/L,B组份终浓度为8g/L，即加入A、B、C体积比为5:2:3，混合均匀，注入模具中，升温至37℃，静置25分钟左右形成水凝胶。

7、细胞培养实验

（1）试验细胞为L929成纤维细胞。在96孔板中制备上述水凝胶，至少6孔。待水凝胶稳定2h后，每孔加入80uL 1×10⁴个/mL L929细胞悬液，再加入120uL培养液，在含有5%（V/V）二氧化碳空气，37℃的培养箱中培养9天，每天换新鲜的培养液200uL。

（2）配制50umol/L的阿尔玛蓝溶液，与培养液1:10配制成阿尔玛蓝染色培养液。

（3）在第一、三、五、七天检测细胞活性。每孔加入200uL阿尔玛蓝染色培养液,继续在相同条件下培养6h，在Synergy HT型多功能酶标仪测其荧光值强度变化来表征细胞活性，其中激发波长530nm，发射波长590nm。细胞相容性检测结果见参附图1。

参见附图1，它是本发明实施例一～四所制备的丝素蛋白水凝胶，在其上进行L929细胞培养后，经荧光检验细胞在丝素蛋白水凝胶上增殖情况的对比直方图。从图1中可以看出，细胞在水凝胶表面生长状况稳定，细胞呈对数增长，细胞增殖良好。

Claims (2)

1.一种具有细胞生物相容性的丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）配置浓度为30～300g/L的丝素蛋白水溶液，保存于温度 2～8 ℃下；配置浓度为10～50 g/L的N-月桂酰肌氨酸钠溶液，保存于常温下；

（2）将步骤（1）配置的丝素蛋白水溶液和N-月桂酰肌氨酸钠溶液混合均匀，再加入超纯水用于调节混合溶液中的丝素蛋白的终浓度为10～100g/L, N-月桂酰肌氨酸钠的终浓度为2～20g/L，置于 30～50℃的温度下静置 0.3～3h，得到丝素蛋白水凝胶。

2.一种按权利要求1制备方法得到的具有细胞相容性的丝素蛋白水凝胶。