CN109320970A - 一种用于软骨修复的温敏性水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于软骨修复的温敏性水凝胶及其制备方法与应用。用于软骨修复的温敏性水凝胶,包括琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液及DBM‑RGD颗粒。用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法，包括(1)制备琼脂糖水溶液；(2)制备明胶水溶液；(3)制备透明质酸钠水溶液；(4)制备DBM颗粒；(5)制备DBM‑RGD颗粒；(6)取10ml步骤(1)得到的琼脂糖水溶液、10ml步骤(2)得到的明胶水溶液、4ml步骤(3)得到的透明质酸钠水溶液及0.24～1.2g步骤(5)得到的DBM‑RGD颗粒混合并用玻璃棒搅拌均匀，混匀后放入37℃恒温水浴锅中形成凝胶，即得到用于软骨修复的温敏性水凝胶。

Description

一种用于软骨修复的温敏性水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用水凝胶领域，具体涉及一种用于软骨修复的温敏性水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
关节软骨是一种致密的结缔组织，在缓冲关节之间的应力，减少关节面之间的摩擦等方面起到极其重要的作用。但是关节软骨由于过度肥胖、运动创伤或者关节炎等又很容易受到损害，即使是小面积的缺损也存在严重退变性的潜在风险。而且关节软骨组织结构致密，缺乏神经、血管等，加上关节软骨组织中的软骨细胞本身自我增殖能力又比较低，因此，关节软骨一旦受到损伤很难自我修复。
软骨组织缺损的修复与再生一直是临床上一个难以完全攻克的挑战。传统治疗软骨损伤的方法有很多，例如自体软骨细胞移植技术、微骨折手术、自体骨膜移植技术以及骨软骨移植技术等，这些方法均存在着一些问题，例如自体软骨细胞移植技术要求取病人自体软骨细胞，需要二次手术，容易造成供体损伤，而且体外扩增细胞过程难以维持软骨细胞表型。微骨折手术对设备要求高，术后恢复周期长且新生成的多为纤维软骨而非透明质软骨，在生物学和力学性能上远不如正常的透明软骨。骨软骨移植技术则面临供体资源不足、可引起供区并发症而且不能用于修复超过2cm2的骨软骨缺损等问题。
幸运的是，将细胞与支架结合的软骨组织工程提供了一种有希望的途径。传统的生物医用支架材料如无机金属材料不锈钢、铝合金等，无机非金属材料如生物陶瓷、医用碳素等以及有机高分子材料如聚乳酸、聚乙醇酸等都存在着各种缺点，如生物相容性低、可降解性差等。新型水凝胶材料采用天然或者人工合成的高分子物质通过物理或者化学交联形成的一种可在水中溶胀并保持大量水分而又不溶解的聚合物。由于聚合物网络中充斥着大量的水分，使得整个材料具备了一种流体的性质，这与充盈有大量水性液体的机体组织极其相似，柔软润湿的表面以及与组织的亲和大大减少了材料对周围组织的刺激性，使得水凝胶聚合物具有良好的生物相容性。可注射的，对pH或者温度敏感的智能水凝胶材料因其很容易充满整个具有不规则形状的缺损部位，手术创伤非常微小且易于操作，近些年来被研究者广泛的关注。首先它可以在体外以流动性很好的液态形式复合药物，生长因子以及细胞等，然后以微创的方式，通过注射器或者内窥镜植入体内的器官或者缺损部位，因温度或者其他因素的影响，快速在原位形成凝胶，发挥其功效。
DBM(即脱钙骨基质)中含有相关的生物活性因子并有助于细胞粘附，增殖和分化。先前研究表明，DBM可以增强干细胞的成软骨分化。DBM也被用于其他生物材料如纤维蛋白水凝胶的功能化，以促进软骨形成。因而，DBM不仅能够促进干细胞的成软骨分化，还能促进软骨缺损的修复和再生。此外，支架上的细胞粘附是基于支架的组织工程策略取得成功的重要条件，其中细胞支架界面的工程化起主导作用。细胞粘附配体或亲和肽为生物支架材料的细胞募集提供了更有效的方法。精氨酸-甘氨酸-天冬氨(RGD)是众所周知的细胞粘附肽，广泛应用于细胞外基质纤连蛋白衍生的材料修饰中。据报道，低RGD密度对软骨细胞分化是有效的，RGD还可以增加炎症细胞的粘附和脱落修复。因此，我们拟采用RGD肽来修饰DBM颗粒，进一步增加细胞的募集和粘附能力，并促进干细胞的成软骨分化。
发明内容
发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明的第一个目的在于公开一种用于软骨修复的温敏性水凝胶。考虑到支架材料的组织相容性、生物降解性、力学强度以及软骨诱导能力等性质，我们选择琼脂糖、明胶和透明质酸三种天然高分子化合物来制备一种用于软骨修复的温敏性水凝胶，并采用DBM-RGD颗粒与之混合作进一步修饰。其中，琼脂糖具有良好的热可逆凝胶性能，而且可以通过调整琼脂糖的浓度比例来控制水凝胶的孔径大小；明胶是胶原的变性产物，具有与胶原相似的结构性质，但是免疫原性比胶原更低；透明质酸是一种具有与关节软骨细胞外基质中的粘多糖相似结构的天然多糖，能够促进细胞增殖，诱导干细胞向软骨细胞方向分化，DBM-RGD颗粒进一步增加细胞的募集和粘附能力，并促进干细胞的成软骨分化。本发明的第二个目的在于公开了一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法。本发明的第三个目的在于公开一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的用途。
技术方案：一种用于软骨修复的温敏性水凝胶,包括：琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液及DBM-RGD颗粒，其中：
琼脂糖水溶液的质量体积比浓度为0.002～0.02g/ml；
明胶水溶液的质量体积比浓度为0.05～0.1g/ml；
透明质酸钠水溶液的质量体积比浓度为在0.0002～0.01g/ml；
DBM-RGD颗粒的添加量以琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液形成的混合溶液的体积计，其加入量为0.01～0.05g/ml；
琼脂糖水溶液、明胶水溶液与透明质酸钠水溶液的体积比为5：5：2。
一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法，包括：
(1)制备琼脂糖水溶液
称取0.02～0.2g琼脂糖粉末加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，搅拌均匀后放入微波炉中加热，待看到有气泡冒出后停止加热，取出，即得到琼脂糖水溶液；
(2)制备明胶水溶液
称取0.5～1.0g明胶颗粒加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入55℃～65℃恒温水浴中，并用洁净的玻璃棒搅拌至明胶颗粒完全溶解后即得到明胶水溶液；
(3)制备透明质酸钠水溶液
称取0.8～40mg透明质酸钠粉末加入盛有4ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入37℃～65℃恒温水中，用洁净的玻璃棒搅拌至透明质酸钠粉末完全溶解后即得到透明质酸钠水溶液；
(4)制备DBM颗粒
(41)将猪股骨标本和/或猪胫骨标本修剪并浸入乙二胺四乙酸水溶液中，其中：
乙二胺四乙酸水溶液的摩尔浓度为0.5M；
乙二胺四乙酸水溶液的pH为8.3；
控制乙二胺四乙酸水溶液的温度在4℃；
(42)每三天更换一次乙二胺四乙酸水溶液，用原子吸收分光光度法分析换下来的乙二胺四乙酸水溶液，通过检测钙离子的含量以追踪去矿化过程，当换下来的乙二胺四乙酸水溶液中的钙离子浓度小于0.2mmol/L时，表示去矿化过程完成，进入步骤(43)
(43)将完全去矿化的猪股骨标本和/或猪胫骨标本放置在液氮中浸泡5～10分钟，然后在粉碎机中振动粉碎3分钟，通过筛分获得尺寸为100μm～800μm的DBM颗粒；
(5)制备DBM-RGD颗粒
(51)将50g步骤(4)制备的DBM颗粒浸入1L 1,6-己二胺水溶液中1小时并控制1,6-己二胺水溶液的温度为37℃，其中：
1,6-己二胺水溶液的质量体积浓度为0.1g/ml；
(52)将DBM颗粒取出，并用超纯水洗涤至少两次，并在室温下浸泡在400mL 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液中1小时，其中：
4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液质量体积浓度为2mg/mL；
(53)将DBM颗粒取出，并将DBM颗粒在400mL的RGD肽水溶液中4℃下孵育24小时，即得到DBM-RGD颗粒，DBM-RGD颗粒使用前冷冻干燥并储存在-20℃，其中：
RGD肽水溶液的质量体积浓度为0.1mg/mL；
(6)制备用于软骨修复的温敏性水凝胶
取10ml步骤(1)得到的琼脂糖水溶液、10ml步骤(2)得到的明胶水溶液、4ml步骤(3)得到的透明质酸钠水溶液及0.24～1.2g步骤(5)得到的DBM-RGD颗粒混合并用玻璃棒搅拌均匀，混匀后放入37℃恒温水浴锅中形成凝胶，即得到用于软骨修复的温敏性水凝胶。
进一步地，所述明胶颗粒为B型药用级明胶，所述透明质酸钠为药用级透明质酸钠。
进一步地，步骤(6)中得到用于软骨修复的温敏性水凝胶后，将其投入过量的0.1wt％碳二亚胺盐酸盐水溶液中，过夜，以进一步交联，增强用于软骨修复的温敏性水凝胶的结构稳定性，其中：
用于软骨修复的温敏性水凝胶整体淹没于碳二亚胺盐酸盐水溶液中。
进一步地，去矿化步骤完成后，还能使用X-射线照射猪股骨标本和/或猪胫骨标本，以确保完全去矿化。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于关节软骨损伤的修复，也能和各种细胞复合后再用于关节软骨修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于耳廓软骨缺损的修复，也能和各种细胞复合后再用于耳廓软骨缺损的修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，也能和各种细胞复合后再用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独作为生物3D打印修复材料，也能和各种细胞复合，个性化打印各种软骨缺损用修复材料，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
有益效果：本发明公开的一种用于软骨修复的温敏性水凝胶及其制备方法与应用具有以下有益效果：
(1)本发明公开的用于软骨修复的温敏性水凝胶具有温敏特性，溶胶能够通过注射器或者内窥镜植入体内的器官或者缺损部位，快速在原位形成凝胶，发挥其功效。
(2)本发明公开的用于软骨修复的温敏性水凝胶具有制备原料廉价易得，操作方法简单，免疫原性较低，诱导软骨修复和再生的作用。
(3)本发明公开的用于软骨修复的温敏性水凝胶具有合适的三维网格结构，可以和各种细胞(人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞等各种干细胞或者软骨细胞等其他与软骨形成相关的各种细胞)复合，有利于细胞及其分泌的各种细胞因子的粘附，从而发挥软骨诱导和修复作用。
(4)本发明公开的用于软骨修复的温敏性水凝胶采用RGD肽结合的DBM颗粒进一步修饰，增加了细胞的募集和粘附能力，并促进了间充质干细胞的成软骨分化，而且还可以增加炎症细胞的粘附和脱落修复。
(5)本发明公开的用于软骨修复的温敏性水凝胶可以填充任意形状的软骨缺损，实现原位软骨诱导再生，与传统移植方法相比，具有很好的优势与临床应用前景。
附图说明
图1为用于软骨修复的温敏性水凝胶的SEM图像，其中(黑色箭头所指的为DBM-RGD颗粒；
图2为细胞与用于软骨修复的温敏性水凝胶复合经Calcein-AM/PI双染后的统计分析图。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
具体实施例1
一种用于软骨修复的温敏性水凝胶,包括：琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液及DBM-RGD颗粒，其中：
琼脂糖水溶液的质量体积比浓度为0.004g/ml；
明胶水溶液的质量体积比浓度为0.08g/ml；
透明质酸钠水溶液的质量体积比浓度为在0.005g/ml；
DBM-RGD颗粒的添加量以琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液形成的混合溶液的体积计，其加入量为0.03g/ml；
琼脂糖水溶液、明胶水溶液与透明质酸钠水溶液的体积比为5：5：2。
一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法，包括：
(1)制备琼脂糖水溶液
称取0.04g琼脂糖粉末加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，搅拌均匀后放入微波炉中加热，待看到有气泡冒出后停止加热，取出，即得到琼脂糖水溶液；
(2)制备明胶水溶液
称取0.8g明胶颗粒加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入60℃恒温水浴中，并用洁净的玻璃棒搅拌至明胶颗粒完全溶解后即得到明胶水溶液；
(3)制备透明质酸钠水溶液
称取20mg透明质酸钠粉末加入盛有4ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入55℃恒温水中，用洁净的玻璃棒搅拌至透明质酸钠粉末完全溶解后即得到透明质酸钠水溶液；
(4)制备DBM颗粒
(41)将猪股骨标本修剪并浸入乙二胺四乙酸水溶液中，其中：
乙二胺四乙酸水溶液的摩尔浓度为0.5M；
乙二胺四乙酸水溶液的pH为8.3；
控制乙二胺四乙酸水溶液的温度在4℃；
(42)每三天更换一次乙二胺四乙酸水溶液，用原子吸收分光光度法分析换下来的乙二胺四乙酸水溶液，通过检测钙离子的含量以追踪去矿化过程，当换下来的乙二胺四乙酸水溶液中的钙离子浓度小于0.2mmol/L时，表示去矿化过程完成，进入步骤(43)
(43)将完全去矿化的猪股骨标本放置在液氮中浸泡8分钟，然后在粉碎机中振动粉碎3分钟，通过筛分获得尺寸为400μm的DBM颗粒；
(5)制备DBM-RGD颗粒
(51)将50g步骤(4)制备的DBM颗粒浸入1L 1,6-己二胺水溶液中1小时并控制1,6-己二胺水溶液的温度为37℃，其中：
1,6-己二胺水溶液的质量体积浓度为0.1g/ml；
(52)将DBM颗粒取出，并用超纯水洗涤至少两次，并在室温下浸泡在400mL 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液中1小时，其中：
4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液质量体积浓度为2mg/mL；
(53)将DBM颗粒取出，并将DBM颗粒在400mL的RGD肽水溶液中4℃下孵育24小时，即得到DBM-RGD颗粒，DBM-RGD颗粒使用前冷冻干燥并储存在-20℃，其中：
RGD肽水溶液的质量体积浓度为0.1mg/mL；
(6)制备用于软骨修复的温敏性水凝胶
取10ml步骤(1)得到的琼脂糖水溶液、10ml步骤(2)得到的明胶水溶液、4ml步骤(3)得到的透明质酸钠水溶液及0.72g步骤(5)得到的DBM-RGD颗粒混合并用玻璃棒搅拌均匀，混匀后放入37℃恒温水浴锅中形成凝胶，即得到用于软骨修复的温敏性水凝胶。
进一步地，所述明胶颗粒为B型药用级明胶，所述透明质酸钠为药用级透明质酸钠。
进一步地，步骤(6)中得到用于软骨修复的温敏性水凝胶后，将其投入过量的0.1wt％碳二亚胺盐酸盐水溶液中，过夜，以进一步交联，增强用于软骨修复的温敏性水凝胶的结构稳定性，其中：
用于软骨修复的温敏性水凝胶整体淹没于碳二亚胺盐酸盐水溶液中。
进一步地，去矿化步骤完成后，还能使用X-射线照射猪股骨标本，以确保完全去矿化。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于关节软骨损伤的修复，也能和各种细胞复合后再用于关节软骨修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于耳廓软骨缺损的修复，也能和各种细胞复合后再用于耳廓软骨缺损的修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，也能和各种细胞复合后再用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独作为生物3D打印修复材料，也能和各种细胞复合，个性化打印各种软骨缺损用修复材料，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
具体实施例1得到用于软骨修复的温敏性水凝胶的SEM图如图1所示。
取P3代人骨髓间充质干细胞(可取自病人自体组织后经体外扩增获得)经胰酶消化后，按1～2×107个/ml细胞密度与具体实施例1得到的用于软骨修复的温敏性水凝胶迅速混合均匀，同时按10ng/ml的比例加入TGF-β3(转化生长因子-3)迅速轻轻吹打均匀；然后将细胞与软骨修复用水凝胶复合培养一周，并使用Calcein-AM/PI活/死细胞荧光双染法分别检测第1,3,7天细胞的增殖生长情况，发现细胞的存活率均高于90％(如图2所示)，表明该用于软骨修复的温敏性水凝胶具有良好的细胞相容性。
具体实施例2
一种用于软骨修复的温敏性水凝胶,包括：琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液及DBM-RGD颗粒，其中：
琼脂糖水溶液的质量体积比浓度为0.002g/ml；
明胶水溶液的质量体积比浓度为0.05g/ml；
透明质酸钠水溶液的质量体积比浓度为在0.0002g/ml；
DBM-RGD颗粒的添加量以琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液形成的混合溶液的体积计，其加入量为0.01g/ml；
琼脂糖水溶液、明胶水溶液与透明质酸钠水溶液的体积比为5：5：2。
一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法，包括：
(1)制备琼脂糖水溶液
称取0.02g琼脂糖粉末加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，搅拌均匀后放入微波炉中加热，待看到有气泡冒出后停止加热，取出，即得到琼脂糖水溶液；
(2)制备明胶水溶液
称取0.5g明胶颗粒加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入55℃恒温水浴中，并用洁净的玻璃棒搅拌至明胶颗粒完全溶解后即得到明胶水溶液；
(3)制备透明质酸钠水溶液
称取0.8mg透明质酸钠粉末加入盛有4ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入37℃恒温水中，用洁净的玻璃棒搅拌至透明质酸钠粉末完全溶解后即得到透明质酸钠水溶液；
(4)制备DBM颗粒
(41)将猪胫骨标本修剪并浸入乙二胺四乙酸水溶液中，其中：
乙二胺四乙酸水溶液的摩尔浓度为0.5M；
乙二胺四乙酸水溶液的pH为8.3；
控制乙二胺四乙酸水溶液的温度在4℃；
(42)每三天更换一次乙二胺四乙酸水溶液，用原子吸收分光光度法分析换下来的乙二胺四乙酸水溶液，通过检测钙离子的含量以追踪去矿化过程，当换下来的乙二胺四乙酸水溶液中的钙离子浓度小于0.2mmol/L时，表示去矿化过程完成，进入步骤(43)
(43)将完全去矿化的猪胫骨标本放置在液氮中浸泡5分钟，然后在粉碎机中振动粉碎3分钟，通过筛分获得尺寸为100μm的DBM颗粒；
(5)制备DBM-RGD颗粒
(51)将50g步骤(4)制备的DBM颗粒浸入1L 1,6-己二胺水溶液中1小时并控制1,6-己二胺水溶液的温度为37℃，其中：
1,6-己二胺水溶液的质量体积浓度为0.1g/ml；
(52)将DBM颗粒取出，并用超纯水洗涤至少两次，并在室温下浸泡在400mL 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液中1小时，其中：
4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液质量体积浓度为2mg/mL；
(53)将DBM颗粒取出，并将DBM颗粒在400mL的RGD肽水溶液中4℃下孵育24小时，即得到DBM-RGD颗粒，DBM-RGD颗粒使用前冷冻干燥并储存在-20℃，其中：
RGD肽水溶液的质量体积浓度为0.1mg/mL；
(6)制备用于软骨修复的温敏性水凝胶
取10ml步骤(1)得到的琼脂糖水溶液、10ml步骤(2)得到的明胶水溶液、4ml步骤(3)得到的透明质酸钠水溶液及0.24g步骤(5)得到的DBM-RGD颗粒混合并用玻璃棒搅拌均匀，混匀后放入37℃恒温水浴锅中形成凝胶，即得到用于软骨修复的温敏性水凝胶。
进一步地，所述明胶颗粒为B型药用级明胶，所述透明质酸钠为药用级透明质酸钠。
进一步地，步骤(6)中得到用于软骨修复的温敏性水凝胶后，将其投入过量的0.1wt％碳二亚胺盐酸盐水溶液中，过夜，以进一步交联，增强用于软骨修复的温敏性水凝胶的结构稳定性，其中：
用于软骨修复的温敏性水凝胶整体淹没于碳二亚胺盐酸盐水溶液中。
进一步地，去矿化步骤完成后，还能使用X-射线照射猪胫骨标本，以确保完全去矿化。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于关节软骨损伤的修复，也能和各种细胞复合后再用于关节软骨修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于耳廓软骨缺损的修复，也能和各种细胞复合后再用于耳廓软骨缺损的修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，也能和各种细胞复合后再用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独作为生物3D打印修复材料，也能和各种细胞复合，个性化打印各种软骨缺损用修复材料，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
具体实施例3
一种用于软骨修复的温敏性水凝胶,包括：琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液及DBM-RGD颗粒，其中：
琼脂糖水溶液的质量体积比浓度为0.02g/ml；
明胶水溶液的质量体积比浓度为0.1g/ml；
透明质酸钠水溶液的质量体积比浓度为在0.01g/ml；
DBM-RGD颗粒的添加量以琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液形成的混合溶液的体积计，其加入量为0.05g/ml；
琼脂糖水溶液、明胶水溶液与透明质酸钠水溶液的体积比为5：5：2。
一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法，包括：
(1)制备琼脂糖水溶液
称取0.2g琼脂糖粉末加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，搅拌均匀后放入微波炉中加热，待看到有气泡冒出后停止加热，取出，即得到琼脂糖水溶液；
(2)制备明胶水溶液
称取1.0g明胶颗粒加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入65℃恒温水浴中，并用洁净的玻璃棒搅拌至明胶颗粒完全溶解后即得到明胶水溶液；
(3)制备透明质酸钠水溶液
称取40mg透明质酸钠粉末加入盛有4ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入65℃恒温水中，用洁净的玻璃棒搅拌至透明质酸钠粉末完全溶解后即得到透明质酸钠水溶液；
(4)制备DBM颗粒
(41)将等质量的猪股骨标本和猪胫骨标本修剪并浸入乙二胺四乙酸水溶液中，其中：
乙二胺四乙酸水溶液的摩尔浓度为0.5M；
乙二胺四乙酸水溶液的pH为8.3；
控制乙二胺四乙酸水溶液的温度在4℃；
(42)每三天更换一次乙二胺四乙酸水溶液，用原子吸收分光光度法分析换下来的乙二胺四乙酸水溶液，通过检测钙离子的含量以追踪去矿化过程，当换下来的乙二胺四乙酸水溶液中的钙离子浓度小于0.2mmol/L时，表示去矿化过程完成，进入步骤(43)
(43)将完全去矿化的猪股骨标本和猪胫骨标本放置在液氮中浸泡10分钟，然后在粉碎机中振动粉碎3分钟，通过筛分获得尺寸为800μm的DBM颗粒；
(5)制备DBM-RGD颗粒
(51)将50g步骤(4)制备的DBM颗粒浸入1L 1,6-己二胺水溶液中1小时并控制1,6-己二胺水溶液的温度为37℃，其中：
1,6-己二胺水溶液的质量体积浓度为0.1g/ml；
(52)将DBM颗粒取出，并用超纯水洗涤至少两次，并在室温下浸泡在400mL 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液中1小时，其中：
4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液质量体积浓度为2mg/mL；
(53)将DBM颗粒取出，并将DBM颗粒在400mL的RGD肽水溶液中4℃下孵育24小时，即得到DBM-RGD颗粒，DBM-RGD颗粒使用前冷冻干燥并储存在-20℃，其中：
RGD肽水溶液的质量体积浓度为0.1mg/mL；
(6)制备用于软骨修复的温敏性水凝胶
取10ml步骤(1)得到的琼脂糖水溶液、10ml步骤(2)得到的明胶水溶液、4ml步骤(3)得到的透明质酸钠水溶液及1.2g步骤(5)得到的DBM-RGD颗粒混合并用玻璃棒搅拌均匀，混匀后放入37℃恒温水浴锅中形成凝胶，即得到用于软骨修复的温敏性水凝胶。
进一步地，所述明胶颗粒为B型药用级明胶，所述透明质酸钠为药用级透明质酸钠。
进一步地，步骤(6)中得到用于软骨修复的温敏性水凝胶后，将其投入过量的0.1wt％碳二亚胺盐酸盐水溶液中，过夜，以进一步交联，增强用于软骨修复的温敏性水凝胶的结构稳定性，其中：
用于软骨修复的温敏性水凝胶整体淹没于碳二亚胺盐酸盐水溶液中。
进一步地，去矿化步骤完成后，还能使用X-射线照射猪股骨标本和猪胫骨标本，以确保完全去矿化。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于关节软骨损伤的修复，也能和各种细胞复合后再用于关节软骨修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于耳廓软骨缺损的修复，也能和各种细胞复合后再用于耳廓软骨缺损的修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，也能和各种细胞复合后再用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上述用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独作为生物3D打印修复材料，也能和各种细胞复合，个性化打印各种软骨缺损用修复材料，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (9)

1.一种用于软骨修复的温敏性水凝胶,其特征在于，包括：琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液及DBM-RGD颗粒，其中：
琼脂糖水溶液的质量体积比浓度为0.002～0.02g/ml；
明胶水溶液的质量体积比浓度为0.05～0.1g/ml；
透明质酸钠水溶液的质量体积比浓度为在0.0002～0.01g/ml；
DBM-RGD颗粒的添加量以琼脂糖水溶液、明胶水溶液、透明质酸钠水溶液形成的混合溶液的体积计，其加入量为0.01～0.05g/ml；
琼脂糖水溶液、明胶水溶液与透明质酸钠水溶液的体积比为5：5：2。
2.一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
(1)制备琼脂糖水溶液
称取0.02～0.2g琼脂糖粉末加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，搅拌均匀后放入微波炉中加热，待看到有气泡冒出后停止加热，取出，即得到琼脂糖水溶液；
(2)制备明胶水溶液
称取0.5～1.0g明胶颗粒加入盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入55℃～65℃恒温水浴中，并用洁净的玻璃棒搅拌至明胶颗粒完全溶解后即得到明胶水溶液；
(3)制备透明质酸钠水溶液
称取0.8～40mg透明质酸钠粉末加入盛有4ml蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入37℃～65℃恒温水中，用洁净的玻璃棒搅拌至透明质酸钠粉末完全溶解后即得到透明质酸钠水溶液；
(4)制备DBM颗粒
(41)将猪股骨标本和/或猪胫骨标本修剪并浸入乙二胺四乙酸水溶液中，其中：
乙二胺四乙酸水溶液的摩尔浓度为0.5M；
乙二胺四乙酸水溶液的pH为8.3；
控制乙二胺四乙酸水溶液的温度在4℃；
(42)每三天更换一次乙二胺四乙酸水溶液，用原子吸收分光光度法分析换下来的乙二胺四乙酸水溶液，通过检测钙离子的含量以追踪去矿化过程，当换下来的乙二胺四乙酸水溶液中的钙离子浓度小于0.2mmol/L时，表示去矿化过程完成，进入步骤(43)
(43)将完全去矿化的猪股骨标本和/或猪胫骨标本放置在液氮中浸泡5～10分钟，然后在粉碎机中振动粉碎3分钟，通过筛分获得尺寸为100μm～800μm的DBM颗粒；
(5)制备DBM-RGD颗粒
(51)将50g步骤(4)制备的DBM颗粒浸入1L 1,6-己二胺水溶液中1小时并控制1,6-己二胺水溶液的温度为37℃，其中：
1,6-己二胺水溶液的质量体积浓度为0.1g/ml；
(52)将DBM颗粒取出，并用超纯水洗涤至少两次，并在室温下浸泡在400mL 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液中1小时，其中：
4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐水溶液质量体积浓度为2mg/mL；
(53)将DBM颗粒取出，并将DBM颗粒在400mL的RGD肽水溶液中4℃下孵育24小时，即得到DBM-RGD颗粒，DBM-RGD颗粒使用前冷冻干燥并储存在-20℃，其中：
RGD肽水溶液的质量体积浓度为0.1mg/mL；
(6)制备用于软骨修复的温敏性水凝胶
取10ml步骤(1)得到的琼脂糖水溶液、10ml步骤(2)得到的明胶水溶液、4ml步骤(3)得到的透明质酸钠水溶液及0.24～1.2g步骤(5)得到的DBM-RGD颗粒混合并用玻璃棒搅拌均匀，混匀后放入37℃恒温水浴锅中形成凝胶，即得到用于软骨修复的温敏性水凝胶。
3.根据权利要求2所述的一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶颗粒为B型药用级明胶，所述透明质酸钠为药用级透明质酸钠。
4.根据权利要求2所述的一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(6)中得到用于软骨修复的温敏性水凝胶后，将其投入过量的0.1wt％碳二亚胺盐酸盐水溶液中，过夜，以进一步交联，增强用于软骨修复的温敏性水凝胶的结构稳定性，其中：
用于软骨修复的温敏性水凝胶整体淹没于碳二亚胺盐酸盐水溶液中。
5.根据权利要求2所述的一种用于软骨修复的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，去矿化步骤完成后，还能使用X-射线照射猪股骨标本和/或猪胫骨标本，以确保完全去矿化。
6.权利要求1～5中任意一项所述的用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于关节软骨损伤的修复，也能和各种细胞复合后再用于关节软骨修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
7.权利要求1～5中任意一项所述的用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于耳廓软骨缺损的修复，也能和各种细胞复合后再用于耳廓软骨缺损的修复，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
8.权利要求1～5中任意一项所述的用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，也能和各种细胞复合后再用于鼻软骨缺损的修复及鼻部整形，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
9.权利要求1～5中任意一项所述的用于软骨修复的温敏性水凝胶既能单独作为生物3D打印修复材料，也能和各种细胞复合，个性化打印各种软骨缺损用修复材料，其中：
各种细胞包括人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞。
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