CN111281887A - 一种适于搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞的温敏性水凝胶复合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适于搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞(Wharton's Jelly‑derived mesenchymal stem cells,WJ‑MSCs)的温敏性水凝胶复合物及其应用。所述温敏性水凝胶复合物包括以下组分：温敏性水凝胶、温敏性水凝胶添加剂和溶剂，其中，所述温敏性水凝胶添加剂为抗坏血酸磷酸酯钠。本发明的这种温敏性水凝胶复合物可以显著促进人脐带华顿氏胶间充质干细胞的存活率，增强细胞迁移能力；可用于修复大面积、全皮层切除的小鼠皮肤，移植后第8天可见明显的损伤愈合效果；可作为温敏性水凝胶药物制剂，应用于促进被搭载细胞存活、细胞迁移、组织修复、组织再生等领域。

Description

一种适于搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞的温敏性水凝胶 复合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种适于搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞的温敏性水凝胶复合物及其应用。
背景技术
脐带华顿氏胶间充质干细胞具有良好的自我更新能力、多种分化潜能以及免疫调节功能，因此被广泛应用于多种组织的再生与修复工程，例如神经系统疾病、、皮肤损伤愈合再生等等。
细胞包埋是组织再生工程中移植细胞时的关键技术之一，通过采用一定的包埋剂(溶剂)将被移植细胞包被其中，使之与目的组织在免疫上相对隔离，并在植入时维持被移植细胞与目的组织接近的浓度，可以有效提高移植细胞的存活率和维持其正常代谢功能，因此在临床上是细胞移植时的常用方法。
温敏性水凝胶能对环境温度产生快速响应并产生可逆转化，在较低温环境(4～8℃)中是可流动的液体，而在生理温度环境(37℃)迅速转变为多孔的三维凝胶。由于其生物相容性好并可降解，因此常作为组织再生工程的细胞基质和药物佐剂在临床和研究中使用，介导被移植细胞的黏附与驻留，或者作为缓释药物的佐剂来延长药物的药效持续时间。
比如聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)，是一种具有温敏性的嵌段聚合物，现已上市的有ICI的泊洛沙姆(poloxamers)和BASF的普朗尼克(pluronics)，它的水溶液可随温度的升高，由胶束聚集而形成凝胶。由于其水凝胶给药体系具有缓释、对水难溶性药物的增溶、稳定等作用，因而现已用于丝裂霉素C、白细胞介素多种药物的缓释给药系统。PEO-PPO-PEO嵌段共聚物分子式如(A)式所示，(A)式：HO(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)aH，其中a代表环氧乙烷的比例；b为代表环氧丙烷的比例。尽管PEO-PPO-PEO嵌段共聚物在诸多领域得到了应用，然而，由于其水凝胶强度低、体内溶蚀快，因而对药物的缓释时间较短。更为重要的是PEO-PPO-PEO嵌段共聚物为非生物降解性材料，由其制备的水凝胶在使用过程中存在安全性问题，例如长期应用PEO-PPO-PEO可引起高胆固醇和高甘油三脂症，在一定程度上限制了它们的广泛应用。
而且研究显示，聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)具有较为明显的细胞毒性，影响搭载细胞的存活。如温敏性水凝胶PF-127(P407)，是由约70％的聚乙烯氧化物(PEO)和30％的聚丙烯氧化物(PPO)组成的嵌段共聚物(PEO-PPO-PEO)，分子量为12600，易溶于水，其成胶浓度为15％～20％，是临床上常用的医用温敏性水凝胶。PF-127分子式如(B)式所示。(B)式：HO(C2H4O)100-(C3H6O)65-(C2H4O)100H。对于其毒性的考察研究中发现，使用较低浓度(0.1-5％w/v)时，被搭载细胞的生长并未受到显著影响；但在10％w/v浓度时，被搭载细胞的存活率和生长曲线受到明显抑制；成胶浓度(15-20％w/v)时，被搭载细胞在第五天完全死亡。
中国专利CN107802887A公开了一种温敏性水凝胶复合物及其促进被搭载细胞存活和/或组织修复的方法与应用。该专利中提出，通过添加维生素C作为添加剂可以有效促进水凝胶搭载大鼠的骨髓间质细胞贴壁生长，减少相应细胞凋亡比例。但是因为上述专利为使用的是动物大鼠细胞，与本专利使用的人脐带华顿氏胶间充质干细胞有明显的差异，而且维生素C暴露在空气中极容易被氧化，理化性质不够稳定，应用于容易接触空气的皮肤损伤修复受到限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有温敏性水凝胶搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞存活率低，以及温敏性水凝胶复合物在皮肤损伤修复领域应用受限的缺陷和不足，提供一种搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞的温敏性水凝胶复合物，并添加有抗坏血酸磷酸酯钠，可以有效促进人脐带华顿氏胶间充质干细胞的存活率，促进细胞迁移能力，对皮肤愈合具有更好的促进效果。
本发明的目的是提供一种适于搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞的温敏性水凝胶复合物。
本发明的另一目的是提供所述温敏性水凝胶复合物的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种适于搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞的温敏性水凝胶复合物，包括以下组分：温敏性水凝胶、温敏性水凝胶添加剂和溶剂，其中，所述温敏性水凝胶添加剂为抗坏血酸磷酸酯钠。
优选地，所述温敏性水凝胶添加剂浓度范围为400～800μM。
更优选地，所述抗坏血酸磷酸酯钠的浓度为400μM。
优选地，所述温敏性水凝胶的质量体积分数为1％～20％。
更优选地，所述温敏性水凝胶的质量体积分数为20％。
温敏性水凝胶能在温度升高时转变为多孔的三维凝胶，是组织再生和细胞搭载的良好载体。但由于其本身具有一定细胞毒性，随其使用浓度增高，会造成搭载细胞存活率的降低。本发明发现，在临床使用温敏性水凝胶PF-127常规浓度20％(w/v)搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞进行组织修复时，制胶时发现添加抗坏血酸磷酸酯钠可以有效促进人脐带华顿氏胶间充质干细胞24h的存活率，促进细胞迁移能力。
所述的抗坏血酸磷酸酯钠(又名L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐)分子式C6H6Na3O9P，分子量322.1，常温为白色晶体粉末，易溶于水。
优选地，所述温敏性水凝胶为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。
所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)嵌段共聚物，名称为PF-127，分子量为12600，其中PEO的重量百分比为70％，PPO的重量百分比为30％。
进一步地，所述温敏性水凝胶还可以包括聚N-异丙烯酰胺嵌段共聚物水凝胶、聚乙烯醚嵌段共聚物水凝胶、聚环氧乙烷-聚环氧丙烯嵌段共聚物水凝胶、聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物水凝胶、基于壳聚糖-β-甘油磷酸钠的水凝胶、基于纤维素的水凝胶的一种或两种以上。
本发明采用的PEO-PPO-PEO嵌段共聚物的凝胶机理是基于胶束的聚集，而胶束又具有典型的内部疏水和外部亲水的核-壳结构，因而该类水凝胶除了可以荷载亲水性的大分子诸如蛋白多肽类药物于胶束间外，还可以荷载疏水性的小分子药物于胶束内，可用于抗肿瘤药物、抗炎镇痛药、局麻药或其它临床上需要发挥长效的局部治疗或全身作用的药物。
所述的温敏性水凝胶还可以替换为药用上和/或生理上可以接受的水凝胶。
进一步地，所述的药用上和/或生理上可以接受的水凝胶为温敏性和/或pH和/或光敏感的水凝胶。
优选地，所述的溶剂为水、缓冲液、体液、细胞培养液、组织液中的一种或两种以上。
优选地，所述温敏性水凝胶复合物还包括其它药物可接受的载体。
具体地，所述其它药物可接受的载体为氢化可地松、维他命C。
针对具体需要，可加入药用上或生理上可以接受的物质来调节制剂的胶凝温度至临床所需温度，这些物质选自不同分子量大小的聚乙二醇(PEG)等大分子物质，或是维他命C等小分子物质。
优选地，所述的搭载细胞为人脐带华顿氏胶间充质干细胞。
优选地，所述的搭载细胞搭载浓度为4×106～2×107/mL。
更优选地，所述的搭载细胞搭载浓度为2×107/mL。
具体地，所述细胞以4×106～2×107/mL密度混合在温敏性水凝胶复合物中，再将所得温敏性水凝胶复合物置于37℃下培养，获得可临床应用温敏性水凝胶细胞混合物。
本发明还提供所述温敏性水凝胶复合物在制备能够促进被搭载细胞存活、促进细胞迁移、促进组织修复和/或促进组织再生的药物制剂中的应用，以及所述温敏性水凝胶复合物在制备增加小鼠或人真皮层厚度、增加新生毛囊数量、增加胶原纤维沉积量、减少瘢痕宽度、促进抗炎型巨噬细胞数量增加、增加细胞总增殖比例和新生血管数量的药物以及制备缓释药物的佐剂中的应用。
本发明还提供一种人脐带华顿氏胶间充质干细胞药物制剂，由上述温敏性水凝胶复合物和人脐带华顿氏胶间充质干细胞混合所得。
优选地，人脐带华顿氏胶间充质干细胞的搭载浓度为4×106～2×107/mL。
针对具体需要，本领域技术人员可加入其他药用上或生理上可以接受的药物，比如针对癌症、肿瘤或炎症的药物、提高机体免疫的药物或其他调节因子，以期获得协同的治疗或修复效果。
由于本发明采用的PEO-PPO-PEO嵌段共聚物，既可以荷载亲水性的大分子诸如蛋白多肽类药物于胶束间外，也可以荷载疏水性的小分子药物于胶束内，可用于抗肿瘤药物、抗炎镇痛药、局麻药或其它临床上需要发挥长效的局部治疗或全身作用的药物。因此，本发明的药物制剂还可以搭载其他药物，所述药物可以选自肿瘤坏死因子-α、神经生长因子、表皮生长因子、骨形态发生蛋白、胰岛素、生长激素释放因子、内啡肽、肝素酶、白细胞介素-2等蛋白多肽类药物，也可以选自紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、丝裂霉素等小分子药物。
另外，温敏性水凝胶药物制剂中，在必要时还可加入其它药物可接受的载体；其中所载药物可以直接溶解或分散在凝胶溶液中，也可以将荷载药物的微球、脂质体、乳滴等粒子分散在温敏性水凝胶中。
本发明的温敏性水凝胶药物制剂，药物以扩散和/溶蚀方式缓慢释放，其给药途径为注射、经皮、眼部、阴道、尿道、鼻腔、耳道等，可产生局部或全身治疗作用。
温敏性水凝胶复合物和/或温敏性水凝胶药物制剂可以通过皮下注射、肌肉注射、腹腔内注射、血管瘤局部注射或血管瘤瘤内注射；注射剂量为8×105cm2～4×106cm2，所述平方厘米是指皮肤损伤面积。
本发明还保护上述温敏性水凝胶复合物在制备增加小鼠或人真皮层厚度、增加新生毛囊数量、增加胶原纤维沉积量、减少瘢痕宽度、促进抗炎型巨噬细胞数量增加、增加细胞总增殖比例和新生血管数量的药物以及作为缓释药物的佐剂的应用。
在体内试验中发现，添加抗坏血酸磷酸酯钠促进PF-127包埋的人脐带华顿氏胶间充质干细胞对大面积、全皮层切除的小鼠皮肤愈合具有更好的促进效果。因此，在温敏性搭载细胞进行组织修复时，添加抗坏血酸磷酸酯钠具有有益的辅助作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种温敏性水凝胶复合物，包括组分为：温敏性水凝胶、温敏性水凝胶添加剂和溶剂，其中，所述温敏性水凝胶添加剂为抗坏血酸磷酸酯钠。本发明的温敏性水凝胶复合物可以显著促进人脐带华顿氏胶间充质干细胞的存活率，增强细胞迁移能力；可用于修复大面积，全皮层切除的小鼠皮肤，移植后第8天可见明显的损伤愈合效果，包括真皮层厚度增加、新生毛囊数量增多、胶原纤维沉积量增加、瘢痕宽度减少、抗炎型M2巨噬细胞数量、细胞总增殖比例和新生血管数量增加。可作为温敏性水凝胶药物制剂，应用于促进被搭载细胞存活、细胞迁移、组织修复、组织再生等领域。
附图说明
图1为从人脐带华顿氏胶分离获得的间充质细胞。
图2为采用流式细胞术以及成骨、成脂分化实验鉴定分离获得的脐带华顿氏胶间充质干细胞；CD73,CD90和CD105是间充质干细胞表面抗原标志物，CD31为血管内皮细胞表面抗原标志物，HLA-DR为组织相容性复合体(MHC)II类蛋白，IgG1为同型对照。
图3为利用Live/Dead TM Cell Imaging Kit试剂盒以及CCK8染色试剂盒检测24h细胞存活率。人脐带华顿氏胶间充质干细胞包被于添加不同浓度抗坏血酸磷酸酯钠的温敏性水凝胶PF-127中，其中A为Live/DeadTM Cell Imaging Kit染色结果，B为A的统计图，C为CCK8结果统计。
图4A、B为采用细胞划痕实验检测12h、24h细胞在体外迁移能力情况。人脐带华顿氏胶间充质干细胞包被于添加不同浓度抗坏血酸磷酸酯钠的温敏性PF-127水凝胶中；图4C、D为检测72h人脐带华顿氏胶间充质干细胞在体内的迁移能力情况。
图5为PF-127水凝胶包裹400μM抗坏血酸磷酸酯钠的人脐带华顿氏胶间充质干细胞移植到机械损伤的小鼠皮肤损伤处，分别于第5、8天检测伤口愈合效率、图6A为H&E染色检测移植后第8天小鼠真皮再生情况。B为真皮层厚度统计结果，C为新生毛囊数量统计结果，D为瘢痕宽度统计结果，E为Masson三色染色胶原纤维生成情况、
图7为免疫组化染色检测移植后第8天小鼠真皮层抗炎型M2巨噬细胞数量，细胞总增殖比例以及新生血管生成水平。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
本发明提供了一种适于搭载脐带华顿氏胶间充质干细胞的温敏性水凝胶复合物及其应用，以下实施例具体举例说明。
实施例1
一种温敏性水凝胶复合物，包括以下组分：
温敏性水凝胶PEO-PPO-PEO嵌段共聚物PF-127、抗坏血酸磷酸酯钠和PBS缓冲液，其中抗坏血酸磷酸酯钠浓度为400μM，PF-127的质量体积分数为20％。
上述的温敏性水凝胶复合物的制备方法，包括如下步骤：
用20％(w/v)PF-127搭载P4人脐带华顿氏胶间充质干细胞，再添加400μM抗坏血酸磷酸酯钠，混合均匀。
实施例2
一种温敏性水凝胶复合物，包括以下组分：
温敏性水凝胶PEO-PPO-PEO嵌段共聚物PF-127、抗坏血酸磷酸酯钠和PBS缓冲液，其中抗坏血酸磷酸酯钠浓度为800μM，PF-127的质量体积分数为20％。
上述的温敏性水凝胶复合物的制备方法与实施例1相同。
对比例1
一种温敏性水凝胶复合物，包括以下组分：
温敏性水凝胶PEO-PPO-PEO嵌段共聚物PF-127、抗坏血酸磷酸酯钠和PBS缓冲液，其中不包含抗坏血酸磷酸酯钠，PF-127的质量体积分数为20％。
上述的温敏性水凝胶复合物的制备方法与实施例1相同。
应用例
1、温敏性水凝胶复合物应用于搭载移植人脐带华顿氏胶间充质干细胞，被搭载细胞存活以及迁移能力测试
(1)P4人脐带华顿氏胶间充质干细胞的存活率测试
首先采用植块法从人脐带华顿氏胶分离出原代间充质干细胞，14天后在光镜下可观察到组织边缘爬出的典型成纤维样细胞形态，如图1所示。
接着人脐带华顿氏胶间充质干细胞传代培养至P4，利用流式细胞术以及成骨，成脂分化实验鉴定细胞，如图2所示。然后采用Live/Dead TM Cell Imaging Kit试剂盒以及CCK8染色试剂盒检测实施例1和2以及对比例1搭载P4人脐带华顿氏胶间充质干细胞24h后温敏性水凝胶复合物中的细胞存活率。
结果发现，实施例1和2温敏性水凝胶复合物中的抗坏血酸磷酸酯钠都可显著提高人脐带华顿氏胶间充质干细胞存活，但两者提高效率没有显著差异，如图3所示。
2、人脐带华顿氏胶间充质干细胞的迁移能力
在体外，采用细胞划痕实验检测12、24h细胞迁移能力情况。人脐带华顿氏胶间充质干细胞包被于添加不同浓度抗坏血酸磷酸酯钠的温敏性PF-127水凝胶中，发现实施例1和2温敏性水凝胶复合物中的抗坏血酸磷酸酯钠都可显著提高人脐带华顿氏胶间充质干细胞迁移能力，但两者促进效率没有显著差异，如图4A、B所示。
在体内，通过将编码EGFP的慢病毒载体转导到人脐带华顿氏胶间充质干细胞(称为MSCs EGFP)，建立一个稳定表达的EGFP的细胞系。接着，MSCEGFP,MSCEGFP+PF-127,MSCEGFP+400μM SAP和MSCEGFP+PF-127+400μM SAP(每个伤口给以1x 106细胞)通过局部给药方法递送到伤口部位。注射后72h从各组收集皮肤组织，并进行原位免疫荧光染色。我们发现与其他三组相比，MSCEGFP+PF-127+400μM SAP这个组的细胞在72h迁移到真皮中的数量更多，如图4C、D所示。
3、温敏性水凝胶复合物移植到小鼠皮肤损伤部位，对小鼠皮肤伤口愈合的能力测试
(1)小鼠皮肤伤口愈合情况
采用20％(w/v)PF-127搭载P4人脐带华顿氏胶间充质干细胞并添加400μM抗坏血酸磷酸酯钠(SAP)，以2×107/mL浓度局部注射于小鼠皮肤伤口部位，分别以注射同浓度的不用水凝胶搭载的细胞、细胞+水凝胶、细胞+抗坏血酸磷酸酯钠、不搭载细胞只注射水凝胶PF-127、PBS和PBS+PF-127作为实验对照，以上抗坏血酸磷酸酯钠的浓度均为400μM。移植后分别于第5，8天检测伤口愈合效率。结果发现，温敏性水凝胶复合物有利于伤口更快愈合，如图5所示。
(2)真皮再生情况
移植后第8天将小鼠处死取皮肤样品包埋切片并进行H&E染色，结果发现，实施例1的温敏性水凝胶复合物可以有效促进真皮厚度增加、新生毛囊数量增加、减少瘢痕宽度以及促进胶原纤维沉积量，如图6所示。
(3)真皮层抗炎型M2巨噬细胞数量增加情况，细胞总增殖比例和新生血管生成水平
将上述皮肤样品包埋切片后进行免疫组化染色分析，发现移植了实施例1的温敏性水凝胶复合物后，可以有效促进真皮层抗炎型M2巨噬细胞数量增加，提高细胞总增殖比例以及新生血管生成水平，如图7所示。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种适于搭载人脐带华顿氏胶间充质干细胞的温敏性水凝胶复合物，其特征在于，包括以下组分：温敏性水凝胶、温敏性水凝胶添加剂和溶剂，其中，所述温敏性水凝胶添加剂为抗坏血酸磷酸酯钠。
2.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶复合物，其特征在于，所述抗坏血酸磷酸酯钠的浓度范围为400～800μM。
3.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶复合物，其特征在于，所述温敏性水凝胶复合物可搭载细胞的搭载浓度为4×106～2×107/mL。
4.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶复合物，其特征在于，所述温敏性水凝胶为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。
5.根据权利要求4所述的温敏性水凝胶复合物，其特征在于，所述温敏性水凝胶还包括聚N-异丙烯酰胺嵌段共聚物水凝胶、聚乙烯醚嵌段共聚物水凝胶、聚环氧乙烷-聚环氧丙烯嵌段共聚物水凝胶、聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物水凝胶、基于壳聚糖-β-甘油磷酸钠的水凝胶、基于纤维素的水凝胶的一种或两种以上。
6.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶复合物，其特征在于，温敏性水凝胶的质量体积分数为1％～20％。
7.权利要求1-6任一所述温敏性水凝胶复合物在制备能够促进被搭载细胞存活、促进细胞迁移、促进组织修复和/或促进组织再生的药物制剂中的应用。
8.权利要求1～6任一项所述的温敏性水凝胶复合物在制备增加小鼠或人真皮层厚度、增加新生毛囊数量、增加胶原纤维沉积量、减少瘢痕宽度、促进抗炎型巨噬细胞数量增加、增加细胞总增殖比例和新生血管数量的药物以及制备缓释药物的佐剂中的应用。
9.一种人脐带华顿氏胶间充质干细胞药物制剂，其特征在于，由权利要求1-6任一所述温敏性水凝胶复合物和脐带华顿氏胶间充质干细胞混合所得。
10.根据权利要求9所述药物制剂，其特征在于，人脐带华顿氏胶间充质干细胞的搭载浓度为4×106～2×107/mL。
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