CN113133445B - 一种间充质干细胞的保存方法、运输方法及其处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞储存领域，尤其涉及一种间充质干细胞的保存方法、运输方法及其处理方法。间充质干细胞的保存方法包括以下步骤：将溶胶状态下的温度敏感性水凝胶溶液与间充质干细胞混合，得到含有间充质干细胞的液态混合液；液态混合液放置于不低于20℃的温度下保存，此时，温度敏感性水凝胶为凝胶状态，间充质干细胞进入静息状态。本发明利用温度敏感性水凝胶在不同温度下的存在状态，将间充质干细胞与溶胶状态下的温度敏感性水凝胶混合，通过转换温度，使得温度敏感性水凝胶处于凝胶状态，而其中的间充质干细胞处于静息状态，这样实现了间充质干细胞在常温下即可保存，降低了间充质干细胞的保存条件，利于间充质干细胞更广泛的应用。

Description

一种间充质干细胞的保存方法、运输方法及其处理方法
技术领域
本发明涉及细胞储存领域，尤其涉及一种间充质干细胞的保存方法、运输方法及其处理方法。
背景技术
干细胞移植治疗是一门先进的医学技术。干细胞移植治疗是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的。很多疾病目前是传统医药难以攻克的，利用干细胞再生医学治疗疾病包括神经性疾病、糖尿病、慢性心脏疾病、肾脏病等拥有巨大潜力。
干细胞治疗流程涉及细胞采集、细胞培养、细胞移植治疗等过程。通常，这些过程的实施地点或者时间并不一致，用于治疗的细胞会在不同的地点之间运输。在常温或37℃环境中，细胞增殖迅速、代谢旺盛、耗氧高、能耗大，产生的大量氧自由基和脂质过氧化物，必须及时通过更换培养基清除，否则引起环境pH和渗透压变化，造成细胞死亡。若仅仅增加培养基，细胞在运输过程中会过度增殖、迅速将培养基消耗殆尽等原因而最终死亡，因此通常采用干冰或者液氮低温冻存的方法。低温冻存的细胞送达目的地后接着会被复苏，复苏过程需要对温度的严格控制，避免对细胞造成不可逆的损伤，但并非所有的细胞使用机构都配备常规的低温贮藏设备以及经过相关技术训练的人员。冷冻运输要求苛刻、成本高昂、细胞复苏技术要求较高，并且细胞冻存液中的DMSO具有一定的细胞毒性，可能会给其应用带来一定风险。因此，寻找一种有效的在非低温条件下的细胞保存和运输的方法尤为重要。
发明内容
本发明利用特定浓度的温敏性水凝胶包裹细胞，在常温、大气条件下，为细胞创造保护环境，使细胞进入静息状态。运输过程中，细胞维持低代谢静息状态，不再增殖和分化，有效保护细胞存活，受到的稳定保护长达数天。这一方法对细胞运输条件要求比目前的干冰或液氮冻存运输更低，甚至可以实现干细胞在不同机构之间快递运输。最重要的是，在细胞的临床应用中，细胞到达目的地后，可通过简单的物理手段，通过给离心管降温的方式进行细胞离心收集，并且干细胞的特性不发生改变，细胞在使用前不需任何进一步处理。
基于此，本发明的第一目的在于提供一种间充质干细胞的保存方法，包括以下步骤：
将溶胶状态下的温度敏感性水凝胶溶液与间充质干细胞混合，得到含有间充质干细胞的液态混合液；
所述液态混合液放置于不低于20℃的温度下保存，此时，所述温度敏感性水凝胶为凝胶状态，所述间充质干细胞进入静息状态。
本发明利用温度敏感性水凝胶在不同温度下的存在状态，将间充质干细胞与溶胶状态下的温度敏感性水凝胶混合，通过转换温度，使得温度敏感性水凝胶处于凝胶状态，而其中的间充质干细胞处于静息状态，这样实现了间充质干细胞在常温下即可保存，降低了间充质干细胞的保存条件，利于间充质干细胞更广泛的应用。
在一些可能的实施方式中，所述温度敏感性水凝胶溶液的溶剂为细胞培养溶液。
本发明中，用于溶解温度敏感性水凝胶的溶剂选用用于培养或储存细胞的培养液，以便于细胞更好的适应外界环境，在必要时可给予间充质干细胞补充适当的营养成分，另外在分离时也避免了溶液的转换而给细胞带来的损伤。因此，基于上述内容，可选择合适的溶剂溶解温度敏感性水凝胶。
如在一些可能的实施方式中，所述温度敏感性水凝胶溶液的溶剂为液态的DMEM/F-12完全培养基。
在一些可能的实施方式中，所述温度敏感性水凝胶为聚N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇的嵌段共聚物。
温度敏感性水凝胶可选用聚N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇的嵌段共聚物，其在低温下为液态，高温时凝聚，这种状态的变化随温度可逆。它同时具有聚合材料的多种特征，如网络结构和高含水量，广泛的运用于医药生命科学等多种领域。该材料具有易于操作；无毒性，生物相容性好；100％合成，无病原体；透明度高，利于细胞观察；性能完善等优势。
进一步地，所述温度敏感性水凝胶溶液中，所述温度敏感性水凝胶的质量浓度为2.5％±0.5％。
温度敏感性水凝胶溶液中，温度敏感性水凝胶的浓度太高，在温度敏感性水凝胶呈凝胶状态时，容易对细胞产生挤压作用，对细胞产生破坏；而温度敏感性水凝胶的浓度太低，在温度敏感性水凝胶呈凝胶状态时，细胞易沉降，然后就会贴壁生长，达不到静息状态。因此，适量浓度的温度敏感性水凝胶溶液可促使间充质干细胞处于静息状态，进而达到常温保存的目的。
进一步地，所述温度敏感性水凝胶溶液与间充质干细胞混合步骤中，所述间充质干细胞在所述温度敏感性水凝胶溶液的细胞密度为102-103个/μl。
适量浓度的细胞一方面利于其在温度敏感性水凝胶溶液中分布均匀；另一方面利于其在凝胶状态中的温度敏感性水凝胶溶液防止相互之间的挤压。因此，适量浓度的细胞才利于更好的在常温下保存。
进一步地，所述液态混合液放置于25-37℃的温度下保存。
如在不同的实施方式中，液态混合液可以放置于25℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃、37℃等的温度下保存，也可以为上述不同温度点值组合的范围值内进行保存，如在天气温度较高时，也可直接在室温下保存。
进一步地，所述保存的时间为1-15天，优选为1-7天。如在不同的实施方式中，保存的时间可以为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、14天、15天等等。
本发明的第二目的提供了一种间充质干细胞的运输方法，将上述保存的间充质干细胞在不低于20℃的温度下运输。
本发明利用温度敏感性水凝胶在温度较高时形成固态水凝胶，此时，固定在凝胶状态下的温度敏感性水凝胶的干细胞被水凝胶结构所包裹，细胞进入低代谢的静息状态，停止分裂和分化，实现了常温运输的条件。本发明利用温度敏感性水凝胶在不同温度的状态变化，为在不同温度、不同环境下细胞保存、运输提供了一种简便、有效的方法。
其中，温度敏感性水凝胶和干细胞的混合物放置在培养容器中，培养容器如培养板、培养皿等，培养容器可放置在其他容器中运输，需要保证运输过程中，培养容器中的温度高于20℃，并且最好处于一种无菌的状态。
运输过程在温度高于20℃的条件下进行，如在不同的实施方式中，运输过程可以设置保温箱，如可以设置温度为25℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃、37℃等等；在天气炎热时，也可以直接室温下运输，如在25℃-32℃的室温、23℃-35℃的室温、28℃-35℃的室温，等等，只要室温高于20℃即可。
本发明的第三目的提供了一种保存的间充质干细胞的处理方法，将上述保存的间充质干细胞放入离心管中，然后通过在低于20℃的温度下离心分离，获得间充质干细胞。
本发明利用温度敏感性水凝胶可以跟随温度变化进行可逆性溶胶-凝胶转换，当温度降低时，为溶胶状态，当温度较高时形成固态水凝胶。将干细胞与一定浓度的聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇(PNIPAAm-PEG)水凝胶混合，在凝胶状态时，细胞被水凝胶结构所包裹，细胞进入低代谢的静息状态，停止分裂和分化。当降温使得凝胶成为液体溶胶状态后，可以通过离心的方式移除水凝胶，并收集干细胞，这时细胞就会复苏并恢复原有的状态，干细胞的特性不会发生改变，为运输的干细胞的后处理提供了便利条件。
保存的间充质干细胞在分离出间充质干细胞时，在低温情况下，温度敏感性水凝胶为液态，便于分离，低温为低于20℃的温度，如10℃、8℃、6℃、4℃等等，为了防止细胞损伤，以4-10℃的温度下离心分离为佳。离心的转速为300g-600g。
需要说明的是，本发明中的常温指20℃以上的温度。
本发明与现有技术相比至少具有以下有益效果：
(1)本发明利用特定浓度的温敏性水凝胶包裹细胞，在常温、大气条件下，为细胞创造保护环境，使细胞进入静息状态，不再增殖和分化，解决了常温保存和运输间充质干细胞的问题。
(2)本发明提供的间充质干细胞的保存方法，细胞到达目的地后，可轻通过简单的物理手段，即低温离心的方式进行细胞收集，并且干细胞的特性不发生改变，细胞在使用前不需任何进一步处理，极大简便了保存和运输后的细胞处理流程和对人员的要求。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1中在稀释比例为1:1的PNIPAAM-PEG水凝胶中的细胞图片；
图2为本发明实施例1中在稀释比例为1:2的PNIPAAM-PEG水凝胶中的细胞图片；
图3为本发明实施例1中在稀释比例为1:3的PNIPAAM-PEG水凝胶中的细胞图片；
图4为本发明实施例1中在稀释比例为1:4的PNIPAAM-PEG水凝胶中的细胞图片；
图5为本发明实施例1中在稀释比例为1:5的PNIPAAM-PEG水凝胶中的细胞图片；
图6为本发明实施例1中在稀释比例为1:7的PNIPAAM-PEG水凝胶中的细胞图片；
图7为本发明实施例1中对照组的细胞图片；
图8为本发明实施例1中细胞在水凝胶的细胞毒性检测图片；
图9为本发明实施例1中对照组细胞毒性检测图片；
图10为本发明实施例1中的细胞增殖曲线图；
图11为本发明实施例1中对照组的细胞培养形态图；
图12为本发明实施例1中从水凝胶释放出的细胞继续培养的形态图；
图13为本发明实施例1中流式细胞仪检测MSCs与PNIPAAm-PEG水凝胶共培养后细胞表面标记物的图谱。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不限于下面公开的具体实施例的限制。
实施例1
MSCs在不同浓度水凝胶中的细胞形态观察
将0.1g聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇(PNIPAAm-PEG)粉末置于高温高压锅中进行灭菌处理，灭菌条件为121℃，20min，灭菌完成后，将0.1g PNIPAAm-PEG粉末置于10ml离心管中，加入1ml DMEM/F-12完全培养基，将离心管置于摇床上，在4℃振荡2-3h至粉末完全溶解，得到淡粉色透明状温敏性水凝胶，浓度为10％。
将提前配好的水凝胶在无菌条件下配制浓度梯度温敏水凝胶，利用完全培养基稀释水凝胶，稀释比分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:7，整个配制过程保持在冰浴上进行。
每个浓度水凝胶设置3个复孔并在96孔板上做标记，向每孔中加入1万个MSCs，于无菌、冰浴条件下缓慢将细胞和温敏水凝胶吹打混匀，动作轻柔，防止气泡产生。
同时，以MSCs在DMEM/F-12完全培养基中作为对照。
1、细胞形态的生长观察
将96孔板转移进37C、5％CO2培养箱中培养，第四天观察细胞生长状态。具体为Calcein-AM/PI活细胞/死细胞染色液染色后，于倒置荧光显微镜下观察细胞形态。结果如图1-图7所示。
在稀释比例为1:1、1:2、1:3的PNIPAAm-PEG水凝胶中呈细胞团样生长(见图1-图3)，但以浓度过高会出现凝胶挤压细胞的情况；当水凝胶浓度稀释至1:4时96孔板底部开始出现贴壁细胞，且贴壁细胞比例随着稀释倍数增加而逐渐变多(见图4-图6)；对照组中，MSCs贴壁生长，呈长梭形(见图7)。因此，稀释比例为1:3即温度敏感性水凝胶的质量浓度为2.5％时最为适当。
2、MSCs的细胞毒性检测
MSCs在质量浓度为2.5％水凝胶中培养第14天，对照组也培养第14天，Calcein-AM/PI活细胞/死细胞染色液染色后，于倒置荧光显微镜下观察。结果如图8和图9所示。
培养14天后，细胞在水凝胶中形态保持良好，呈细胞团样存活，且死细胞比例较少(见图8)；而对照组细胞培养至第14天，细胞状态老化，死细胞比例较高(见图9)。
3、增殖曲线测定
CCK-8测得对照组以及在水凝胶中保存的MSCs培养的第1天、第4天和第7天的OD值。图10为MSCs在两种培养条件下的细胞增殖曲线，其中，上面的曲线为对照组中的MSCs的细胞增殖曲线，下面的曲线为水凝胶中保存的MSCs的细胞增殖曲线。从该图中可以看出，间充质干细胞在水凝胶中不发生增殖，处于静息状态。
4、保存后细胞表面标记物的鉴定
MSCs与2.5％水凝胶共培养第10天收集细胞，经低温(在4-10℃范围内)离心分离后，MSCs中加入细胞培养液后继续培养3天(试验组)；对照组在DMEM/F-12完全培养基中培养，每三天换液一次，与试验组培养相同天数，观察细胞形态。结果如图11(对照组)和图12(试验组)所示。
从图中可以看出，试验组和对照组培养的细胞状态无明显差别。
另外，还利用MSCs鉴定试剂盒(BD 562245)检测细胞表面标记物的表达。结果如图13所示。
MSCs阳性指标：FITC MouseAnti-Human CD90、APC Mouse Anti-Human CD73、PerCP-CyTM5.5Mouse Anti-Human CD105表达率均大于95％。
MSCs阴性指标：PE hMSC Negative Cocktail(CD11b,CD19,CD34,CD45,HLA-DR)表达率均小于2％。
结果表明水凝胶保存后的MSCs再进行培养，并不影响MSCs的细胞表面标记物的表达。
在本说明书的描述中，术语“一些实施方式”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种间充质干细胞的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
将溶胶状态下的温度敏感性水凝胶溶液与间充质干细胞混合，得到含有间充质干细胞的液态混合液；
所述液态混合液放置于不低于20°C的温度下保存，此时，所述温度敏感性水凝胶为凝胶状态，所述间充质干细胞进入静息状态，所述温度敏感性水凝胶为聚N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇的嵌段共聚物。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的保存方法，其特征在于，所述温度敏感性水凝胶溶液的溶剂为细胞培养溶液。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞的保存方法，其特征在于，所述温度敏感性水凝胶溶液的溶剂为液态的DMEM/F-12完全培养基。
4.根据权利要求3所述的间充质干细胞的保存方法，其特征在于，所述温度敏感性水凝胶溶液中，所述温度敏感性水凝胶的质量浓度为2.5%±0.5%。
5.根据权利要求4所述的间充质干细胞的保存方法，其特征在于，所述温度敏感性水凝胶溶液与间充质干细胞混合步骤中，所述间充质干细胞在所述温度敏感性水凝胶溶液的细胞密度为102-103个/µl。
6.根据权利要求1-5任一项所述的间充质干细胞的保存方法，其特征在于，所述液态混合液放置于25-37°C的温度下保存。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞的保存方法，其特征在于，所述保存的时间为1-15天。
8.根据权利要求6所述的间充质干细胞的保存方法，其特征在于，所述保存的时间为1-7天。
9.一种间充质干细胞的运输方法，其特征在于，将权利要求1-8任一项保存的间充质干细胞在不低于20°C的温度下运输。
10.一种保存的间充质干细胞的处理方法，其特征在于，将权利要求9运输的间充质干细胞通过在低于20°C的温度下离心分离，获得间充质干细胞。
11.根据权利要求10所述的保存的间充质干细胞的处理方法，其特征在于，运输的间充质干细胞通过在4-10°C的温度下离心分离。
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