CN111925982A - 一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺 - Google Patents

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许峻荣
黄里
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Abstract

本发明提供一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，包括包括三维细胞培养载体和人骨髓间充质干细胞，所述三维细胞培养载体配方是1.5%巯基化透明质酸溶于DMEM低糖基础培养基和4%聚乙二醇二丙烯酸酯溶于DMEM低糖基础培养基，两种溶液互相混匀后于室温形成的原位交联透明质酸水凝胶，该培养工艺利用三维培养的水凝胶载体以提供细胞生长的支撑，在较少的培养基体积内生产更多的骨髓间充质干细胞，降低无血清培养基的消耗和培养空间以实现大规模的细胞生产应用于后续细胞治疗产品的产业化。

Description

一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺
技术领域
本发明是一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，属于细胞培养技术领域。
背景技术
因为动物血清来源自动物体内，其生物复杂性和不确定性及批次间的差异增加了细胞制品生产及质量控制的难度，同时血清容易引起细菌、真菌、病毒及支原体的污染，增加生物制品生产的安全性隐患。并且动物血清本身价格也比较安规，这些都使得动物血清在生产和研究中的应用存在诸多不利。在培养基中添加血清对人们所造成的这些困扰，已经使得不论是科研人员还是工业生产企业对于无血清培养基产生了强烈需求。有大量实践证明无血清培养基不仅能在很大程度上避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷，而且也能取得良好的培养效果。同时以干细胞和免疫细胞为主的细胞治疗产品生产过程中，应用无血清培养体系可以杜绝大多数外源微生物的污染，符合干细胞治疗药物上市申报的质量要求。因此，无血清培养体系是骨髓间充质干细胞体外培养工艺的必然方向。
无血清培养基是在合成培养基的基础上发展起来，旨在寻求血清的替代成分，使其既能满足细胞培养的要求又能避免血清所带来不利影响。从1975 年垂体细胞株Gh3在无血清介质中生长获得成功到现在，无血清培养基的发展大致经历了3代。第1代无血清培养基不含血清，但含有大量成分不明确的动、植物蛋白。因此，其不利于目标蛋白的分离纯化，成本也高，而且无法完全避免病原体污染的风险。第2代无血清培养基是基于生产重组药物的安全性考虑而开发的，其主要特点是无安全不用动物来源蛋白，称之为无血清，无动物衍生蛋白培养基。它的优点既可降低生产成本，又能加快报批的速度。由于生物工程的要求，第3代无血清培养基近年已出现，即完全没有蛋白或含量极低，组成成分全为化学已知物的培养基，称之为双无培养基。其优点在于细胞培养与生产很容易做到恒定，目标蛋白的分离纯化更为容易，细胞培养基的原材料成本大为下降，生产中品质管理更加容易。但其对培养的细胞具有更高的特异性。目前预测第4代无血清培养基将会进入研究与开发，这将是一种无血清、无蛋白、又可以高温消毒的适合于许多种不同细胞生长的全能型培养基。因为无血清培养基需要添加明确且经过纯化生物活性物质，其生产成本较高。商业化无血清培养体系应用于大规模的间充质干细胞生产其成本远高于传统的血清培养体系。
二维细胞贴壁培养基于的一个主要假设是单层细胞可以再现生物细胞在体内的生理学行为。然而已经有大量研究表明，在体外培养条件下所观察到的许多复杂的生物学反应如受体表达、RNA转录、细胞迁移和细胞凋亡等于在体内器官或组织中所观察到的并不相同。从正常的细胞分裂、细胞增殖到细胞迁移及细胞凋亡等细胞生物学行为都是需要依赖于空间和时间的精密调控。显然，在二维的玻璃或聚苯乙烯支持物上生长的真核细胞并不能准确的反映自然条件下组织中细胞的生长及细胞外基质的准确的相互作用。其次，生物医药行业的发展中，对于细胞产品及其衍生产物的需求量日益增长。采用二维的细胞单层培养技术需要占用较多的空间，并不能满足大规模生产的效率和成本要求。因此，细胞三维培养技术应运而生。
三维细胞培养技术(three-dimensional cell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同类型的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长、构成三维的细胞-载体复合物，三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中，细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)蛋白充当生物支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构，所创建的细胞生长环境，则最大程度地模拟体内环境。
现有的第一代三维培养系统运用人工合成的生物高分子微纤维支架，如聚乳酸羟基乙酸、壳聚糖等，从而模拟三维微型生活环境，但合成高分子的降解产物可能危害细胞生长。自三维培养系统问世并投入实际运用，主要以更接近体内ECM如胶原蛋白作为生长支架，并且多使用含有血清的培养基孵育细胞。由于ECM和血清中包含大量未鉴定组分，尤其是目前实验室大量采用的ECM商品化产品Matrigel,Matrigel是从小鼠肿瘤组织中提取的抽提物，这为三维培养介导的生物制品生产带来了风险，尤其是针对人体的干细胞临床治疗。以Matrigel为代表的天然材料支架来源于细胞或动物组织，其复杂的生化反应、质量不一致、不明确来源等属性限制了其应用目前已经发展出多种新型的商业化合成材料支架细胞外基质产品，如聚L-乳酸 (poly-L-lactic，PLLA)和聚己内酯(polycaprolactone)等，同时也利用生物发酵和蛋白质纯化方法等生物化学方法生产多种生物大分子生物支架，如间充质干细胞培养中常见的Cytodex3型微载体和Cultisphere微载体。 Cytodex3是一种葡聚糖基质表面交联变形凝胶的失信圆形微粒，它可以同细胞紧密链接。而Cultisphere微载体有明胶组成。明胶是由胶原蛋白部分水解得到的产物，有大面积结构相同的区域。大部分细胞将黏附在明胶结构上创造了一种三维空间结构，模拟了组织的细胞合作构象。
在三维细胞培养过程中，生物反应器是整个过程的关键设备，它要为细胞提供适宜的生长环境并决定细胞的质量和产量。按照细胞的生长要求，具备低的剪切效应、较好的传递效果和流体力学性质是这类反应器的原则。目前已经开发多种形式的生物反应器应用于三维细胞培养中，如搅拌式生物反应器、旋转式生物反应器、中空纤维生物反应器和膜生物反应器。不同的生物反应器对于细胞的产量和质量各自的优势，选择合适的三维细胞培养方法，能够为细胞创造良好环境，能够为细胞创造良好的环境用以保持培养过程中细胞产品的生物学特性。优化反应条件，包括建立最佳培养环境，改良生物反应器结构，实现大规模的细胞生物产品生产流程，现在急需一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺来解决上述出现的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，以解决上述背景技术中提出的问题，本发明生产工艺简单，对牙齿进行增白去臭效果，适用范围广。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，包括三维细胞培养载体和人骨髓间充质干细胞，所述三维细胞培养载体配方是1.5％巯基化透明质酸溶于DMEM低糖基础培养基和4％聚乙二醇二丙烯酸酯溶于DMEM低糖基础培养基，两种溶液互相混匀后于室温形成的原位交联透明质酸水凝胶，所述人骨髓间充质干细胞为从成人捐献的骨髓液中分离并连续传代培养获得的间充质干细胞，在细胞的培养过程中全部采用无外源动物成分的无血清培养体系进行培养，该培养工艺以传统的二维细胞培养获得足够的骨髓间充质干细胞后，待三维细胞培养载体充分混匀但仍为液体状态是与细胞悬液经过充分混匀完成细胞接种，后续的培养过程中，该接种细胞的透明质酸水凝胶充分浸没于无血清完全培养体系中，进行细胞扩增培养，最终经透明质酸酶酶解水凝胶回收细胞，从而实现人骨髓间充质干细胞的体外三维立体培养扩增细胞。
进一步地，一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，包括以下步骤：
步骤一：原代骨髓间充质干细胞的分离；
步骤二：骨髓间充质干细胞采用无血清培养体系利用二维细胞培养技术连续传代扩增至P3代收获；
步骤三：透明质酸水凝胶的原位交联；
步骤四：P3代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P4 代培养扩增；
步骤五：消化收获P4代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P5代培养扩增；
步骤六：消化收获P5代骨髓间充质干细胞冻存作为产品。
进一步地，所述原代骨髓间充质干细胞的分离包括以下步骤：
(1)在无菌条件下新鲜采集的骨髓液按照每5ml可以接种1个T150细胞培养瓶的体积分装至离心管中加入等体积的PBS缓冲液稀释；
(2)稀释后的骨髓液缓慢添加到Ficoll人外周血淋巴细胞分离液上层， Ficoll的体积与稀释后的骨髓液体积比为1:1；
(3)进行密度梯度离心，离心条件为300g,20min，20℃,离心加速度和减速度设置为离心机允许的最小值；
(4)离心完成后弃去上层清液吸取中间白膜层细胞，回收的细胞悬液使用4倍体积的无血清培养基洗涤混匀后离心，离心条件为1100rpm，5min，室温；
(5)离心后倾倒弃去全部上清液，按照每5ml骨髓液回收的细胞接种1 个T150培养瓶的比例加入24ml无血清培养基重悬后接种于T150培养瓶内；
(6)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
(7)原代骨髓间充质干细胞的分离中所用的溶液均为无外源微生物污染的商品化溶液，操作过程中严格遵循无菌操作技术；
(8)骨髓液的供者在采集骨髓前已经确认为无传染病风险成年人，包括但不限于以下传染病：乙肝、丙肝、梅毒、HIV，其骨髓组织采集的过程中无细菌，真菌，支原体污染；
(9)本操作中所提及的无血清培养基及无血清培养体积均基于GIBCO CTSTMStemProTMMSC SFM人间充质干细胞无血清培养基，配制完成后在4℃有效期为30天。
进一步地，所述骨髓间充质干细胞采用无血清培养体系利用二维细胞培养技术连续传代扩增至P3代收获包括以下步骤：
(1)紧接上述1的操作，P0代原代骨髓间充质干细胞在融合率到达90％前维持每3天进行一次半量换液；
(2)半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
(3)待确认P0代细胞融合率达到90％以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLETMSelect Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
(4)消化获得的P0代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
(5)按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在 10000～20000个/平方厘米；
(6)调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P1代细胞传代接种；
(7)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
(8)P1代骨髓间充质干细胞在融合率到达90％前维持每3天进行一次半量换液；
(9)半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
(10)待确认P1代细胞融合率达到90％以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLETMSelect Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
(11)消化获得的P1代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
(12)按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在 10000～20000个/平方厘米；
(13)调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P2代细胞传代接种；
(14)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
(15)P2代骨髓间充质干细胞在融合率到达90％前维持每3天进行一次半量换液；
(16)半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
(17)待确认P2代细胞融合率达到90％以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLETMSelect Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
(18)消化获得的P2代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
(19)按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在 10000～20000个/平方厘米；
(20)调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P3代细胞传代接种；
(21)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
(22)P3代骨髓间充质干细胞在融合率到达90％前维持每3天进行一次半量换液；
(23)半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
(24)待确认P3代细胞融合率达到90％以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLETMSelect Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
(25)消化获得的P3代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数。
进一步地，所述透明质酸水凝胶的原位交联包括以下步骤：
(1)1.5％(w/v)巯基化透明质酸(hyaluronie acid thiolation,HA-SH) 溶于DMEM低糖基础培养基中，混匀后用0.22um过滤灭菌；
(2)4％(w/v)聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol acrylate,PEGDA)溶于DMEM低糖基础培养基，混匀后用0.22um过滤灭菌；
(3)完成配制的1.5％HA-SH和4％PEGDA混合后涡旋5s,完成原位交联；
(4)在透明质酸水凝胶开始原位交联时立即与调整好密度的细胞悬液进行混匀完成接种；
进一步地，所述P3代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P4代培养扩增包括以下步骤：
(1)紧接上述2的操作，重悬P3代骨髓间充质干细胞用无血清培养基调整至合适的细胞密度，保证透明质酸水凝胶内细胞浓度为2*10^6/ml；
(2)1.5％HA-SH和4％PEGDA混匀立即添加合适密度的细胞悬液混匀；
(3)在水凝胶尚未凝固前按照每个T150瓶添加100ml已经接种细胞的透明质酸水凝胶；
(4)确认T150培养瓶内的水凝胶完全凝固后，添加150ml的无血清培养基至培养瓶内；
(5)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的三维细胞培养；
(6)完成接种的P4代骨髓间充质干细胞每隔72h进行细胞半量换液，半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取75ml的培养上清，再补充75ml 新鲜的无血清培养基；
进一步地，所述消化收获P4代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P5代培养扩增包括以下步骤：
(1)在完成P4代细胞接种后120h，倾倒回收所有的细胞培养上清；
(2)按200ml/瓶T150培养瓶添加氯化钠注射液洗涤水凝胶，连续洗涤 2次后倾倒所有的洗涤液；
(3)每个T150细胞培养瓶添加50ml 300ug/LⅣ型透明质酸酶工作液 37℃消化2小时，待透明质酸水凝胶彻底降解后加入100ml回收的细胞培养上清终止消化；
(4)吸取回收所有细胞悬液添加生理盐水稀释洗涤，按照细胞悬液：生理盐水＝1:1的比例添加，所有的细胞悬液离心，条件为1100rpm,5min,室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
(5)重悬P4代骨髓间充质干细胞用无血清培养基调整至合适的细胞密度，保证透明质酸水凝胶内细胞浓度为2*10^6/ml；
(6)准备无菌的1.5％HA-SH和4％PEGDA混匀立即添加合适密度的细胞悬液混匀；
(7)在水凝胶尚未凝固前按照每个T150瓶添加100ml已经接种细胞的透明质酸水凝胶；
(8)确认T150培养瓶内的水凝胶完全凝固后，添加150ml的无血清培养基至培养瓶内；
(9)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的三维细胞培养；
(10)完成接种的P5代骨髓间充质干细胞每隔72h进行细胞半量换液，半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取75ml的培养上清，再补充75ml 新鲜的无血清培养基。
进一步地，所述消化收获P5代骨髓间充质干细胞冻存作为产品包括以下步骤：
(1)在完成P5代细胞接种后120h，倾倒回收所有的细胞培养上清；
(2)按200ml/瓶T150培养瓶添加氯化钠注射液洗涤水凝胶，连续洗涤 2次后倾倒所有的洗涤液；
(3)每个T150细胞培养瓶添加50ml 300ug/LⅣ型透明质酸酶工作液37℃消化2小时，待透明质酸水凝胶彻底降解后加入100ml回收的细胞培养上清终止消化；
(4)吸取回收所有细胞悬液添加生理盐水稀释洗涤，按照细胞悬液：生理盐水＝1:1的比例添加，所有的细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用DMEM低糖基础培养基重悬细胞沉淀计数；
(5)完成计数的细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液，后用BAMBANKER无血清冻存液重悬细胞沉淀；
(6)按照1*10^7个细胞对应1ml冻存液的比例重悬沉淀，完成重悬后的细胞悬液分装至2ml细胞冻存管或5ml细胞冻存管内；
(7)完成冻存分装的细胞悬液密封后置于-80℃超低温冰箱内程序降温 24小时后转移至液氮罐内长期保存。
本发明的有益效果：一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，该培养工艺利用三维培养的水凝胶载体以提供细胞生长的支撑，在较少的培养基体积内生产更多的骨髓间充质干细胞，降低无血清培养基的消耗和培养空间以实现大规模的细胞生产应用于后续细胞治疗产品的产业化，构建透明质酸原位交联制备的三维细胞培养载体，并接种原代分离的人骨髓间充质干细胞于无血清细胞培养体系中进行细胞培养扩增，以开发一种可以大批量扩增骨髓间充质干细胞的培养工艺用于后续采用该工艺大批量制备骨髓间充质杆细胞作为细胞治疗产品，实现产业化生产。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为P3代骨髓间充质经二维细胞培养时的形态；
图2为P5代骨髓间充质经三维细胞培养时的形态；
图3为三组应用应用三维细胞培养技术分离扩增制备P5代骨髓间充质干细胞流式细胞检测间充质干细胞表型；
图4为三组应用应用三维细胞培养技术分离扩增制备P5代骨髓间充质干细胞三系诱导分化鉴定结果；
图5为透明质酸水凝胶三维培养和传统二维培养时P5代骨髓间充质的增殖曲线。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
作为本发明的一个实施例：一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，包括三维细胞培养载体和人骨髓间充质干细胞，所述三维细胞培养载体配方是1.5％巯基化透明质酸溶于DMEM低糖基础培养基和4％聚乙二醇二丙烯酸酯溶于DMEM低糖基础培养基，两种溶液互相混匀后于室温形成的原位交联透明质酸水凝胶，所述人骨髓间充质干细胞为从成人捐献的骨髓液中分离并连续传代培养获得的间充质干细胞，在细胞的培养过程中全部采用无外源动物成分的无血清培养体系进行培养，该培养工艺以传统的二维细胞培养获得足够的骨髓间充质干细胞后，待三维细胞培养载体充分混匀但仍为液体状态是与细胞悬液经过充分混匀完成细胞接种，后续的培养过程中，该接种细胞的透明质酸水凝胶充分浸没于无血清完全培养体系中，进行细胞扩增培养，最终经透明质酸酶酶解水凝胶回收细胞，从而实现人骨髓间充质干细胞的体外三维立体培养扩增细胞。
一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，包括以下步骤：
步骤一：原代骨髓间充质干细胞的分离；
步骤二：骨髓间充质干细胞采用无血清培养体系利用二维细胞培养技术连续传代扩增至P3代收获；
步骤三：透明质酸水凝胶的原位交联；
步骤四：P3代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P4 代培养扩增；
步骤五：消化收获P4代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P5代培养扩增；
步骤六：消化收获P5代骨髓间充质干细胞冻存作为产品。
原代骨髓间充质干细胞的分离包括以下步骤：
(1)在无菌条件下新鲜采集的骨髓液按照每5ml可以接种1个T150细胞培养瓶的体积分装至离心管中加入等体积的PBS缓冲液稀释；
(2)稀释后的骨髓液缓慢添加到Ficoll人外周血淋巴细胞分离液上层， Ficoll的体积与稀释后的骨髓液体积比为1:1；
(3)进行密度梯度离心，离心条件为300g，20min，20℃，离心加速度和减速度设置为离心机允许的最小值；
(4)离心完成后弃去上层清液吸取中间白膜层细胞，回收的细胞悬液使用4倍体积的无血清培养基洗涤混匀后离心，离心条件为1100rpm，5min，室温；
(5)离心后倾倒弃去全部上清液，按照每5ml骨髓液回收的细胞接种1 个T150培养瓶的比例加入24ml无血清培养基重悬后接种于T150培养瓶内；
(6)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
(7)原代骨髓间充质干细胞的分离中所用的溶液均为无外源微生物污染的商品化溶液，操作过程中严格遵循无菌操作技术；
(8)骨髓液的供者在采集骨髓前已经确认为无传染病风险成年人，包括但不限于以下传染病：乙肝、丙肝、梅毒、HIV，其骨髓组织采集的过程中无细菌，真菌，支原体污染；
(9)本操作中所提及的无血清培养基及无血清培养体积均基于GIBCO CTSTMStemProTMMSC SFM人间充质干细胞无血清培养基，配制完成后在4℃有效期为30天。
骨髓间充质干细胞采用无血清培养体系利用二维细胞培养技术连续传代扩增至P3代收获包括以下步骤：
(1)紧接上述1的操作，P0代原代骨髓间充质干细胞在融合率到达90％前维持每3天进行一次半量换液；
(2)半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
(3)待确认P0代细胞融合率达到90％以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLETMSelect Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
(4)消化获得的P0代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
(5)按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在 10000～20000个/平方厘米；
(6)调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P1代细胞传代接种；
(7)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
(8)P1代骨髓间充质干细胞在融合率到达90％前维持每3天进行一次半量换液；
(9)半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
(10)待确认P1代细胞融合率达到90％以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLETMSelect Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
(11)消化获得的P1代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
(12)按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在 10000～20000个/平方厘米；
(13)调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P2代细胞传代接种；
(14)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
(15)P2代骨髓间充质干细胞在融合率到达90％前维持每3天进行一次半量换液；
(16)半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
(17)待确认P2代细胞融合率达到90％以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLETMSelect Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
(18)消化获得的P2代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
(19)按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在 10000～20000个/平方厘米；
(20)调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P3代细胞传代接种；
(21)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
(22)P3代骨髓间充质干细胞在融合率到达90％前维持每3天进行一次半量换液；
(23)半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
(24)待确认P3代细胞融合率达到90％以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLETMSelect Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
(25)消化获得的P3代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数。
透明质酸水凝胶的原位交联包括以下步骤：
(1)1.5％(w/v)巯基化透明质酸(hyaluronie acid thiolation,HA-SH) 溶于DMEM低糖基础培养基中，混匀后用0.22um过滤灭菌；
(2)4％(w/v)聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol acrylate,PEGDA)溶于DMEM低糖基础培养基，混匀后用0.22um过滤灭菌；
(3)完成配制的1.5％HA-SH和4％PEGDA混合后涡旋5s,完成原位交联；
(4)在透明质酸水凝胶开始原位交联时立即与调整好密度的细胞悬液进行混匀完成接种；
P3代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P4代培养扩增包括以下步骤：
(1)紧接上述2的操作，重悬P3代骨髓间充质干细胞用无血清培养基调整至合适的细胞密度，保证透明质酸水凝胶内细胞浓度为2*10^6/ml；
(2)1.5％HA-SH和4％PEGDA混匀立即添加合适密度的细胞悬液混匀；
(3)在水凝胶尚未凝固前按照每个T150瓶添加100ml已经接种细胞的透明质酸水凝胶；
(4)确认T150培养瓶内的水凝胶完全凝固后，添加150ml的无血清培养基至培养瓶内；
(5)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的三维细胞培养；
(6)完成接种的P4代骨髓间充质干细胞每隔72h进行细胞半量换液，半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取75ml的培养上清，再补充75ml 新鲜的无血清培养基；
消化收获P4代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P5 代培养扩增包括以下步骤：
(1)在完成P4代细胞接种后120h，倾倒回收所有的细胞培养上清；
(2)按200ml/瓶T150培养瓶添加氯化钠注射液洗涤水凝胶，连续洗涤 2次后倾倒所有的洗涤液；
(3)每个T150细胞培养瓶添加50ml 300ug/LⅣ型透明质酸酶工作液 37℃消化2小时，待透明质酸水凝胶彻底降解后加入100ml回收的细胞培养上清终止消化；
(4)吸取回收所有细胞悬液添加生理盐水稀释洗涤，按照细胞悬液：生理盐水＝1:1的比例添加，所有的细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
(5)重悬P4代骨髓间充质干细胞用无血清培养基调整至合适的细胞密度，保证透明质酸水凝胶内细胞浓度为2*10^6/ml；
(6)准备无菌的1.5％HA-SH和4％PEGDA混匀立即添加合适密度的细胞悬液混匀；
(7)在水凝胶尚未凝固前按照每个T150瓶添加100ml已经接种细胞的透明质酸水凝胶；
(8)确认T150培养瓶内的水凝胶完全凝固后，添加150ml的无血清培养基至培养瓶内；
(9)完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的三维细胞培养；
(10)完成接种的P5代骨髓间充质干细胞每隔72h进行细胞半量换液，半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取75ml的培养上清，再补充75ml 新鲜的无血清培养基。
消化收获P5代骨髓间充质干细胞冻存作为产品包括以下步骤：
(1)在完成P5代细胞接种后120h，倾倒回收所有的细胞培养上清；
(2)按200ml/瓶T150培养瓶添加氯化钠注射液洗涤水凝胶，连续洗涤 2次后倾倒所有的洗涤液；
(3)每个T150细胞培养瓶添加50ml 300ug/LⅣ型透明质酸酶工作液37℃消化2小时，待透明质酸水凝胶彻底降解后加入100ml回收的细胞培养上清终止消化；
(4)吸取回收所有细胞悬液添加生理盐水稀释洗涤，按照细胞悬液：生理盐水＝1:1的比例添加，所有的细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用DMEM低糖基础培养基重悬细胞沉淀计数；
(5)完成计数的细胞悬液离心，条件为1100rpm,5min,室温，去除所有上清液，后用BAMBANKER无血清冻存液重悬细胞沉淀；
(6)按照1*10^7个细胞对应1ml冻存液的比例重悬沉淀，完成重悬后的细胞悬液分装至2ml细胞冻存管或5ml细胞冻存管内；
(7)完成冻存分装的细胞悬液密封后置于-80℃超低温冰箱内程序降温 24小时后转移至液氮罐内长期保存。
(1)制备P5代骨髓间充质干细胞在透明质酸水凝胶中作三维细胞培养的形态
实施方案：实验组和对照组
实验组：按照本发明的具体实施方式，应用三维细胞培养技术分离扩增制备P4代骨髓间充质干细胞。300ug/LⅣ透明质酸酶37℃消化回收的P4代骨髓间充质干细胞调整细胞密度至1*10^6/ml的密度。无菌的1.5％HA-SH和 4％PEGDA混匀，用尚未凝固的透明质酸水凝胶混合液重悬细胞沉淀，移液器反复吹打混匀。在凝成胶体前迅速转移至96孔板中，每孔100ul。待透明质酸水凝胶凝固后，每孔再添加150ul的无血清完全培养基，然后置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱。
对照组：按照本发明的实施方案，P3代收获的细胞密度至1*10^6/ml的密度。用无血清完全培养基重悬后接种至96孔板中，每孔100ul。每孔再添加150ul的无血清完全培养基，然后置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的培养箱中培养。
图1中经过72h培养后，96孔板中的水凝胶和贴壁细胞用生理盐水洗涤 2次，40g/L多聚甲醛室温固定30min,体积分数0.1％Triton X-100室温孵育5min。用FITC-Phalloidin在37℃避光孵育1h,DAPI孵育10min.然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞形态。
图2中F-actin为纤维状肌动蛋白，能与鬼笔环肽(Phalloidin)特异性结合。用荧光标记的鬼笔环肽与F-actin结合后可以显示细胞微丝骨架在细胞中的分布，以观察和比较骨髓间充质干细胞在二维细胞培养和三维细胞培养过程中的细胞形态。显微图像显示实验组P5代骨髓间充质干细胞在透明质酸水凝胶中向四周均匀铺展，在水凝胶内分布均匀。对比对照组的P3代骨髓间充质干细胞传统二维细胞贴壁培养的形态，实验组应用三维细胞培养技术，其P5代骨髓间充质干细胞形态更为舒展，能尽可能的模拟细胞在体内的环境。图2采用无血清培养体系经透明质酸水凝胶中三维细胞培养的P5代骨髓间充质干细胞的流式表面分子表型。
实施方案：按照本发明的具体实施方式，应用三维细胞培养技术分离扩增制备P5代骨髓间充质干细胞。300ug/LⅣ透明质酸酶37℃消化回收的P5 代骨髓间充质干细胞用PBS缓冲液调整细胞密度至1*10^6/ml的密度。分别加入单克隆抗体CD29-PE、CD44-FITE、CD73-PE、CD90-FITC、CD29-PE、 CD105-FITC、CD166-PE、CD34-PE、CD45-FITC.同时每管设立同型阴性对照，避光冰上孵育45min,用体积分数2％小牛血清洗涤细胞3次，以出去未结合抗体，用PBS重悬细胞，流式细胞仪检测分析。
图3中连续检测3批次不同供者来源的P5代骨髓间充质干细胞流式细胞表型，其表面标记分子CD29,CD44,CD73,CD90,CD105,CD166均为阳性， CD34,CD45均为阴性，符合骨髓间充质干细胞的表面标记分子特征，证明通过该工艺能够培养出所需的间充质干细胞，采用无血清培养体系经透明质酸水凝胶中三维细胞培养的P5代骨髓间充质干细胞的成脂肪分化、成骨分化和成软骨分化能力鉴定。
实施方案：按照本发明的具体实施方式，应用三维细胞培养技术分离扩增制备P5代骨髓间充质干细胞。300ug/LⅣ透明质酸酶37℃消化回收的P5 代骨髓间充质干细胞用采用Cyagen OriCell成人骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、成人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基和成人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基分别诱导培养14天到21天。培养环境为饱和湿度37℃5％体积分数二氧化碳。完成诱导分化后分别进行油红O染色、茜素红染色和阿利新蓝染色鉴定细胞的成脂肪、成骨和成软骨分化能力。
结论：图4中第一横行为成脂组，第二横行为成骨组，第三横行为成软骨组，连续检测3批次不同供者来源的P5代骨髓间充质干细胞的成脂肪、成骨和成软骨分化能力，均能向这3类组织分化，符合本工艺制备的骨髓间充质干细胞具有多向分化能力复核间充质干细胞的定义和特征，证明通过该工艺能够培养出所需的间充质干细胞。图4采用无血清培养体系经透明质酸水凝胶中三维细胞培养的P4代骨髓间充质干细胞与传统二维细胞培养的增殖率的对比。
实施方案：实验组和对照组
实验组：按照本发明的具体实施方式，应用三维细胞培养技术分离扩增制备P3代骨髓间充质干细胞。300ug/LⅣ透明质酸酶37℃消化回收的P4代骨髓间充质干细胞调整细胞密度至1*10^6/ml的密度。无菌的1.5％HA-SH和 4％PEGDA混匀，用尚未凝固的透明质酸水凝胶混合液重悬细胞沉淀，移液器反复吹打混匀。在凝成胶体前迅速转移至96孔板中，每孔100ul接种1*10^5 个细胞。待透明质酸水凝胶凝固后，每孔再添加150ul的无血清完全培养基，然后置于饱和湿度37℃、5％体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱。
对照组：按照本发明的实施方案，P3代收获的细胞密度至1*10^6/ml的密度。用无血清完全培养基重悬后接种至96孔板中，每孔100ul接种1*10^5 个细胞。每孔再添加150ul的无血清完全培养基，然后置于饱和湿度37℃、 5％体积分数二氧化碳的培养箱中培养。实验组和对照组96孔细胞培养板内的细胞每隔24小时通过细胞计数法检测三维细胞培养计数和传统二维细胞培养技术的骨髓间充质干细胞增殖能力。分别吸取96孔板内的培养基，生理盐水洗涤为此后，实验组没空添加200ul的300ug/LⅣ型透明质酸酶工作液37℃消化，对照组添加200ul工作液浓度的Gibco TrypLETMSelect Enzyme重组蛋白胰酶消化，待水凝胶降解和贴壁细胞脱落后用无血清完全培养基终止消化。收集骨髓间充质干细胞1100rpm室温离心5min，用DMEM低糖基础培养基重悬细胞沉淀，混匀并吹打成单细胞悬液，分别用血球计数板进行细胞计数。
结论：本专利中应用透明质酸水凝胶三维培养计数能在相同的体积内消耗相同的无血清培养基的情况下比传统二维细胞培养技术收获更多的骨髓间充质干细胞，图5采用本发明专利的人骨髓间充质干细胞培养工艺收获的细胞数量
实施方案：采用本发明所提及的骨髓间充质干细胞连续制备3批次来源于不同供者的骨髓间充质干细胞，根据本专利的工艺进行传代扩增，其中P4 代和P5代分别接种于透明质酸水凝胶内进行三维细胞培养，所选用的无血清培养体系如本专利所述。血球计数板进行细胞计数，统计P5代每瓶T150瓶内100ml透明质酸水凝胶内能够消化收集的P5代骨髓间充质干细胞数量。
结果：每瓶T150瓶内各含有100ml的透明质酸水凝胶，按照相同的密度进行接种，各回收5.48*10^8cells、5.94*10^8cells、5.88*10^8cells、 6.29*10^8cells、6.02*10^8cells。
结论：运用本发明内的三维细胞培养技术结合无血清培养体系的细胞培养工艺能够制备P5代骨髓间充质干细胞。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：包括三维细胞培养载体和人骨髓间充质干细胞，所述三维细胞培养载体配方是1.5%巯基化透明质酸溶于DMEM低糖基础培养基和4%聚乙二醇二丙烯酸酯溶于DMEM低糖基础培养基，两种溶液互相混匀后于室温形成的原位交联透明质酸水凝胶；
所述人骨髓间充质干细胞为从成人捐献的骨髓液中分离并连续传代培养获得的间充质干细胞，在细胞的培养过程中全部采用无外源动物成分的无血清培养体系进行培养，该培养工艺以传统的二维细胞培养获得足够的骨髓间充质干细胞后，待三维细胞培养载体充分混匀但仍为液体状态是与细胞悬液经过充分混匀完成细胞接种，后续的培养过程中，该接种细胞的透明质酸水凝胶充分浸没于无血清完全培养体系中，进行细胞扩增培养，最终经透明质酸酶酶解水凝胶回收细胞，从而实现人骨髓间充质干细胞的体外三维立体培养扩增细胞。
2.根据权利要求1所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：原代骨髓间充质干细胞的分离；
步骤二：骨髓间充质干细胞采用无血清培养体系利用二维细胞培养技术连续传代扩增至P3代收获；
步骤三：透明质酸水凝胶的原位交联；
步骤四：P3代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P4代培养扩增；
步骤五：消化收获P4代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P5代培养扩增；
步骤六：消化收获P5代骨髓间充质干细胞冻存作为产品。
3.根据权利要求2所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：所述原代骨髓间充质干细胞的分离包括以下步骤：
（1）在无菌条件下新鲜采集的骨髓液按照每5ml可以接种1个T150细胞培养瓶的体积分装至离心管中加入等体积的PBS缓冲液稀释；
（2）稀释后的骨髓液缓慢添加到Ficoll人外周血淋巴细胞分离液上层，Ficoll的体积与稀释后的骨髓液体积比为1:1；
（3）进行密度梯度离心，离心条件为300g，20min，20℃，离心加速度和减速度设置为离心机允许的最小值；
（4）离心完成后弃去上层清液吸取中间白膜层细胞，回收的细胞悬液使用4倍体积的无血清培养基洗涤混匀后离心，离心条件为1100rpm，5min，室温；
（5）离心后倾倒弃去全部上清液，按照每5ml骨髓液回收的细胞接种1个T150培养瓶的比例加入24ml无血清培养基重悬后接种于T150培养瓶内；
（6）完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度 37℃、5%体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
（7）原代骨髓间充质干细胞的分离中所用的溶液均为无外源微生物污染的商品化溶液，操作过程中严格遵循无菌操作技术；
（8）骨髓液的供者在采集骨髓前已经确认为无传染病风险成年人，包括但不限于以下传染病：乙肝、丙肝、梅毒、HIV，其骨髓组织采集的过程中无细菌，真菌，支原体污染；
（9）本操作中所提及的无血清培养基及无血清培养体积均基于GIBCO CTS™ StemPro™ MSC SFM人间充质干细胞无血清培养基，配制完成后在4℃有效期为30天。
4.根据权利要求2所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞采用无血清培养体系利用二维细胞培养技术连续传代扩增至P3代收获包括以下步骤：
（1） 紧接上述1的操作，P0代原代骨髓间充质干细胞在融合率到达90%前维持每3天进行一次半量换液；
（2）半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
（3）待确认P0代细胞融合率达到90%以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLE™ Select Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
（4）消化获得的P0代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
（5）按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在10000~20000个/平方厘米；
（6）调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P1代细胞传代接种；
（7）完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度 37℃、5%体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
（8） P1代骨髓间充质干细胞在融合率到达90%前维持每3天进行一次半量换液；
（9）半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
（10）待确认P1代细胞融合率达到90%以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLE™ Select Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
（11）消化获得的P1代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
（12）按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在10000~20000个/平方厘米；
（13）调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P2代细胞传代接种；
（14）完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度 37℃、5%体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
（15）P2代骨髓间充质干细胞在融合率到达90%前维持每3天进行一次半量换液；
（16）半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
（17）待确认P2代细胞融合率达到90%以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLE™ Select Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
（18）消化获得的P2代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
（19）按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在10000~20000个/平方厘米；
（20）调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P3代细胞传代接种；
（21）完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度 37℃、5%体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
（22）P3代骨髓间充质干细胞在融合率到达90%前维持每3天进行一次半量换液；
（23）半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
（24）待确认P3代细胞融合率达到90%以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的Gibco TrypLE™ Select Enzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
（25）消化获得的P3代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数。
5.根据权利要求2所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：所述透明质酸水凝胶的原位交联包括以下步骤：
（1）1.5%（w/v）巯基化透明质酸（hyaluronie acid thiolation,HA-SH）溶于DMEM低糖基础培养基中，混匀后用0.22um过滤灭菌；
（2）4%（w/v）聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol acrylate,PEGDA）溶于DMEM低糖基础培养基，混匀后用0.22um过滤灭菌；
（3）完成配制的1.5% HA-SH和4% PEGDA混合后涡旋5s,完成原位交联；
（4）在透明质酸水凝胶开始原位交联时立即与调整好密度的细胞悬液进行混匀完成接种。
6.根据权利要求2所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：所述P3代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P4代培养扩增包括以下步骤：
（1）紧接上述2的操作，重悬P3代骨髓间充质干细胞用无血清培养基调整至合适的细胞密度，保证透明质酸水凝胶内细胞浓度为2*10^6/ml；
（2）1.5% HA-SH和4% PEGDA混匀立即添加合适密度的细胞悬液混匀；
（3）在水凝胶尚未凝固前按照每个T150瓶添加100ml已经接种细胞的透明质酸水凝胶；
（4）确认T150培养瓶内的水凝胶完全凝固后，添加150ml的无血清培养基至培养瓶内；
（5）完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度 37℃、5%体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的三维细胞培养；
（6）完成接种的P4代骨髓间充质干细胞每隔72h进行细胞半量换液，半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取75ml的培养上清，再补充75ml新鲜的无血清培养基。
7.根据权利要求2所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：所述消化收获P4代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P5代培养扩增包括以下步骤：
（1）在完成P4代细胞接种后120h，倾倒回收所有的细胞培养上清；
（2）按200ml/瓶T150培养瓶添加氯化钠注射液洗涤水凝胶，连续洗涤2次后倾倒所有的洗涤液；
（3）每个T150细胞培养瓶添加50ml 300ug/L Ⅳ型透明质酸酶工作液37℃消化2小时，待透明质酸水凝胶彻底降解后加入100ml回收的细胞培养上清终止消化；
（4）吸取回收所有细胞悬液添加生理盐水稀释洗涤，按照细胞悬液：生理盐水=1:1的比例添加，所有的细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
（5）重悬P4代骨髓间充质干细胞用无血清培养基调整至合适的细胞密度，保证透明质酸水凝胶内细胞浓度为2*10^6/ml；
（6）准备无菌的1.5% HA-SH和4% PEGDA混匀立即添加合适密度的细胞悬液混匀；
（7）在水凝胶尚未凝固前按照每个T150瓶添加100ml已经接种细胞的透明质酸水凝胶；
（8）确认T150培养瓶内的水凝胶完全凝固后，添加150ml的无血清培养基至培养瓶内；
（9）完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度 37℃、5%体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的三维细胞培养；
（10）完成接种的P5代骨髓间充质干细胞每隔72h进行细胞半量换液，半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取75ml的培养上清，再补充75ml新鲜的无血清培养基。
8.根据权利要求2所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：所述消化收获P5代骨髓间充质干细胞冻存作为产品包括以下步骤：
（1）在完成P5代细胞接种后120h，倾倒回收所有的细胞培养上清；
（2）按200ml/瓶T150培养瓶添加氯化钠注射液洗涤水凝胶，连续洗涤2次后倾倒所有的洗涤液；
（3）每个T150细胞培养瓶添加50ml 300ug/L Ⅳ型透明质酸酶工作液37℃消化2小时，待透明质酸水凝胶彻底降解后加入100ml回收的细胞培养上清终止消化；
（4）吸取回收所有细胞悬液添加生理盐水稀释洗涤，按照细胞悬液：生理盐水=1:1的比例添加，所有的细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用DMEM低糖基础培养基重悬细胞沉淀计数；
（5）完成计数的细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液，后用BAMBANKER无血清冻存液重悬细胞沉淀；
（6）按照1*10^7个细胞对应1ml冻存液的比例重悬沉淀，完成重悬后的细胞悬液分装至2ml细胞冻存管或5ml细胞冻存管内；
（7）完成冻存分装的细胞悬液密封后置于-80℃超低温冰箱内程序降温24小时后转移至液氮罐内长期保存。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113133445A (zh) * 2021-04-28 2021-07-20 河南省人民医院 一种间充质干细胞的保存方法、运输方法及其处理方法
CN113699094A (zh) * 2021-08-26 2021-11-26 深圳钧兴生物科技有限公司 一种无血清培养细胞的方法
CN114146226A (zh) * 2021-11-30 2022-03-08 浙江大学 一种骨髓间充质干细胞/可降解水凝胶复合材料及其制备方法和用途
CN115386544A (zh) * 2022-08-23 2022-11-25 广东唯泰生物科技有限公司 用于间充质干细胞培养的水凝胶、培养基及其制备方法
CN116121184A (zh) * 2022-12-17 2023-05-16 广东格林邦卡新材料生物科技有限公司 自体干细胞制剂、其制备方法及其在制备提高免疫力和修复机体组合物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1994478A (zh) * 2006-12-21 2007-07-11 大连理工大学 一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法
CN105238747A (zh) * 2015-09-24 2016-01-13 深圳华毓造血干细胞研究有限公司 人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1994478A (zh) * 2006-12-21 2007-07-11 大连理工大学 一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法
CN105238747A (zh) * 2015-09-24 2016-01-13 深圳华毓造血干细胞研究有限公司 人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU L等: "3D Culture of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells (BMSCs) Could Improve Bone Regeneration in 3D-Printed Porous Ti6Al4V Scaffolds." *
李凯;吕少一;周建业;商青青;邵自强;胡盛寿;: "不同浓度透明质酸水凝胶的细胞相容性" *
梁嘉碧;李俊;汪婷;梁雨虹;邹学农;周光前;周治宇;: "原位交联透明质酸水凝胶的制备及体外生物相容性研究" *
雷群;陈江;黄文秀;吴东;林东;: "磷离子对三维培养下人骨髓间充质干细胞的影响" *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113133445A (zh) * 2021-04-28 2021-07-20 河南省人民医院 一种间充质干细胞的保存方法、运输方法及其处理方法
CN113133445B (zh) * 2021-04-28 2022-09-06 河南省人民医院 一种间充质干细胞的保存方法、运输方法及其处理方法
CN113699094A (zh) * 2021-08-26 2021-11-26 深圳钧兴生物科技有限公司 一种无血清培养细胞的方法
CN114146226A (zh) * 2021-11-30 2022-03-08 浙江大学 一种骨髓间充质干细胞/可降解水凝胶复合材料及其制备方法和用途
CN115386544A (zh) * 2022-08-23 2022-11-25 广东唯泰生物科技有限公司 用于间充质干细胞培养的水凝胶、培养基及其制备方法
CN115386544B (zh) * 2022-08-23 2024-01-05 广东唯泰生物科技有限公司 用于间充质干细胞培养的水凝胶、培养基及其制备方法
CN116121184A (zh) * 2022-12-17 2023-05-16 广东格林邦卡新材料生物科技有限公司 自体干细胞制剂、其制备方法及其在制备提高免疫力和修复机体组合物中的应用
CN116121184B (zh) * 2022-12-17 2023-09-26 广东赛尔生物科技有限公司 自体干细胞制剂、其制备方法及其在制备提高免疫力和修复机体组合物中的应用

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