CN105238747A - 人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，所述三维细胞培养支架包括骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆中的至少两种。采用两种及以上的三维细胞培养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞培养支架机械性能弱，不稳固等问题，从而可真正实现骨髓间充质干细胞的三维培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨髓间充质干细胞的扩增率。

Description

人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨MSCs体外大量扩增具有深远意义。

目前骨髓间充质干细胞的体外扩增多采用二维培养方式进行的，也有部分采用三维细胞培养支架进行培养，但均是采用单一的三维细胞培养支架，由于单一的三维细胞培养支架存在机械性能弱，不稳固等问题，因此，在培养过程中，容易从三维细胞培养支架的三维培养方式转变成二维培养方式，从而使得骨髓间充质干细胞活性差，扩增不明显。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用单一的三维支架培养骨髓间充质干细胞的方法因支架机械性能弱，不稳固，生物相容性差等造成骨髓间充质干细胞扩增率不高、细胞活性差等缺陷，提供一种能够采用两种及以上三维支架的人工模拟骨髓微环境进行骨髓间充质干细胞的培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；

其中，所述三维细胞培养支架由骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆中的至少两种材料制成。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入所述培养基进行培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例接种进行传代培养至细胞生长到融合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，采用三维培养支架进行体外培养的步骤为：取三维培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰L^-1细胞浓度与复溶后三维培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，三维培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述助溶剂为乙醇，且乙醇的质量分数为5％-15％。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述壳聚糖季铵盐水凝胶的制备过程为：按1:2～1:5的质量比将壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵于70～95℃水浴中反应7-10小时，加入无水乙醇，析出壳聚糖季铵盐，将壳聚糖季铵盐再溶于乙醇中凝胶化，即获得壳聚糖季铵盐水凝胶。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的骨基质明胶和0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶组合而成；

或，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的骨基质明胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆组合而成；

或，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆组合而成。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的骨基质明胶、0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆组合而成。

实施本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，可以达到以下有益效果：通过采用骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆中的两种或两种以上的组合作为三维培养支架，不仅能够维持模拟骨髓微环境的三维多孔结构，而且能够提高骨髓间充质干细胞的吸附能力及生长增殖能力等，从而提高了骨髓间充质干细胞的增殖率及细胞活性，解决了现有技术中，采用单一三维培养支架培养骨髓间充质干细胞存在支架生物相容性差，机械性能弱等缺陷造成细胞活性差、易死亡、增殖率低等问题。

具体实施方式

为解决现有技术中采用单一的三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在细胞活性差，增殖率低等缺陷，本发明的创新点在于提供一种采用两种及以上的三维细胞培养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞培养支架生物相容性差，机械性能弱，不稳固等问题，从而可真正实现骨髓间充质干细胞的三维培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨髓间充质干细胞的扩增率。

具体地，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

S1、获取骨髓间充质干细胞；

S2、采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，三维细胞培养支架是由骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆中的两种或两种以上材料组合制成的。

进一步地，步骤S1中还包括原代骨髓间充质干细胞的获取，及原代骨髓间充质干细胞的传代培养，具体为：

S11、原代骨髓间充质干细胞的获取：

采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

S12、对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养至第三代骨髓间充质干细胞：

将原代骨髓间充质干细胞调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入培养基进行培养，优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。当细胞生长到融合时，PBS漂洗2～3次，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例传代接种培养至细胞生长到融合，重复上述操作继续传代，即PBS漂洗2～3次，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例传代接种培养至细胞生长到融合，即获得第三代骨髓间充质干细胞。

步骤S2的具体过程为：

取三维培养支架于蒸馏水中复溶，复溶过程中可添加助溶剂促进三维培养支架溶解，优选地，助溶剂为乙醇，且乙醇的质量分数为5％-15％。取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰个/L细胞浓度与复溶后三维培养支架共同接种于培养基中进行培养。

优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。其中，氢化可的松能够参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，调节骨髓间充质干细胞的增值，促进骨髓间充质干细胞功能表达。青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；链霉素能够作用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人为产生的抗药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为优选地是将青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细菌对骨髓间充质干细胞的生长及活性造成的不良影响。因此，采用该血清培养基培养间充质干细胞不仅可以促进骨髓间充质干细胞生长和增殖，而且可避免培养过程中产生的细菌对细胞活性造成的影响。

进一步地，步骤S2中所采用的三维细胞培养支架可以是由骨基质明胶和壳聚糖季铵盐水凝胶组合制成，或骨基质明胶和脱细胞软骨匀浆组合制成，或壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆组合制成，亦或是骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆三者组合制成。

骨基质明胶为三维多孔海绵状结构，可塑性强，有弹性，并有适宜的强度，能够保持其三维多孔结构；但单独使用骨基质明胶，虽然可以模拟骨髓微环境，但本发明通过大量实验发现其生物相容性较弱。而壳聚糖及其衍生物水凝胶与骨细胞具有较好的组织相容性，其生物功能性亲水表面，可促进细胞黏附、增殖、分化；但壳聚糖季铵盐单独作为支架材料也有其本身的局限性，如机械性能弱、不稳固不能保持既定性状，可塑性不强，不能很好的模拟骨髓微环境。因此，将骨基质明胶与壳聚糖季铵盐水凝胶组合在一起作为三维培养支架，骨基质明胶可以拟补壳聚糖季铵盐水凝胶机械性能弱的缺陷，能够为细胞提供一个稳定的三维多孔结构，而且骨基质明胶是骨相关成分，能够更好地模拟骨髓微环境，壳聚糖季铵盐水凝胶则能够拟补骨基质明胶的生物相容性及促进细胞黏附。优选地，三维培养支架是由0.2～1g的骨基质明胶，和0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶制成的。

脱细胞软骨匀浆是生物新鲜组织经过物理方法处理，脱去组织中的所有细胞、抗原等物质后所得到的产物，主要包括胶原、弹性蛋白、非胶原糖蛋白、蛋白多糖和糖胺多糖，具有良好的生物相容性、柔韧性、低抗原性，在体外培养过程中无降解变形，保留了培养前的结构，且保留了大量对细胞黏附、增殖有利的蛋白多糖和Ⅱ型胶原等，其力学性质与天然的软骨很相近，还具有能提供对细胞黏附有益的信号分子，但脱细胞软骨匀浆不具有三维孔隙结构，细胞黏附面积较少，且造成细胞分布不均匀，接触培养基的面积较少等缺陷，因此，将脱细胞软骨匀浆配合具有三维多孔结构的骨基质明胶共同作为三维培养支架可解决单独使用脱细胞软骨匀浆所存在的缺陷。优选地，三维细胞培养支架是由0.2～1g的骨基质明胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆制成的。

脱细胞软骨匀浆相比壳聚糖季铵盐水凝胶具有较强的生物相容性和可塑性，同时脱细胞软骨匀浆又是一种骨相关成分，因此，脱细胞软骨匀浆与壳聚糖季铵盐水凝胶共同使用，不仅改善了壳聚糖季铵盐水凝胶机械性能弱、不稳固的问题，而且壳聚糖季铵盐水凝胶也赋予了脱细胞软骨匀浆三维多孔结构，从而能够更好的模拟骨髓微环境。优选地，三维细胞培养支架是由0.2～1g骨基质明胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆制成的。

另外，本发明通过大量实验进一步验证了，同时使用骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆共同作为三维培养支架，不仅能够维持培养骨髓间充质细胞的三维多孔结构，而且能够提高三维培养支架的生物相容性，促进细胞黏附，同时，还能够释放有利于细胞生长和增殖的营养因子等，从而达到提高细胞活性、促进细胞生长增殖的目的。优选地，三维细胞培养支架是由0.2～1g的骨基质明胶、0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆制成的。

另外，在本发明中，壳聚糖季铵盐水凝胶的制备方法过程为：按1:2～1:5的质量比将壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵于70～95℃水浴中反应7～10小时，加入无水乙醇，析出壳聚糖季铵盐，除去溶剂，然后将壳聚糖季铵盐再溶于乙醇中于恒温恒湿条件下凝胶化，待乙醇挥发完即获得壳聚糖季铵盐水凝胶。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

S1a、制备三维培养支架；

在本实施例中，三维培养支架是由骨基质明胶和壳聚糖季铵盐水凝胶制成的；

S11a、骨基质明胶的制备过程为：

取新鲜牛四肢长管状骨干，剔除软组织、骨膜，凿成碎片，流水冲洗2h彻底去除骨髓，室温下风干；置入液氮速冻后，粉碎机将骨片粉碎成骨粒，30-80目标准分样筛筛取200μm～600μm粒径的骨粉；室温下，1：l氯仿甲醇溶液脱脂6h；4℃环境下0.6M的HCl脱钙24小时，每6h更换液体一次，每克骨粉共需脱钙液约l00ml；反复洗涤除酸后，再以1:1氯仿甲醇溶液脱脂一次；脱钙、脱脂过程均在持续搅拌下完成，每一步前后均需用3mM的NaN₃反复洗涤3次及大量蒸馏水冲洗；然后，依次以2M的CaC1₂、0.5M的EDTA(乙二胺四乙酸)、8M的LiCl于4℃下分别处理24h，55℃水浴24h，蒸馏水反复冲洗，冷冻干燥机冻干，分装后环氧乙烷灭菌，备用。

S12a、壳聚糖季铵盐水凝胶的制备过程为：

称取5mg的壳聚糖溶于10ml的稀醋酸溶液中，待完全溶解后，滤掉不溶物，用胶头滴管逐滴加入NaOH溶液(PH＝8)10ml使壳聚糖析出，过滤并洗涤至中性，将壳聚糖放入烧瓶中，加入15ml蒸馏水和20mg的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(EPTMAC)，搅拌，90℃水浴中反应8小时，得到壳聚糖羟丙基三甲基季按盐(HACC)的溶液。然后在HACC溶液中加入500ml无水乙醇，使壳聚糖季按盐析出，滤出溶剂，将壳聚糖季按盐析出物和适量乙醇混合放入培养皿中，恒温恒湿条件下，凝胶化，待溶剂乙醇挥发后，形成凝胶膜，取出凝胶膜，干燥，得到壳聚糖季铵盐水凝胶，相较于现有技术中的普通壳聚糖水凝胶，本实施例所提供的壳聚糖季铵盐水凝胶的溶胀性、吸湿保湿性、力学性能均高于现有技术中的普通壳聚糖水凝胶。

S2a、获取原代骨髓间充质干细胞；

采集骨髓标本，肝素抗凝。每份标本按1：2的比例加在密度为1.073g/ml的percoll分离液上，2300rpm转速下离心30min，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，1000rpm离心10min，洗涤3次，弃上清液，即获得原代骨髓间充质干细胞。

S3a、原代骨髓间充质干细胞的传代培养；

将步骤S2a中所获得的骨髓间充质干细胞调整至1×10⁷个/培养瓶(25ml)密度，并添加血清培养基进行培养，其中，血清培养基为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基，葡萄糖的浓度为1500-4500mg/l。当细胞生长到95％以上完全融合时，倾去旧培养基，用PBS液漂洗2～3次，倾去PBS液，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶，加入量以使胰蛋白酶可以完全覆盖瓶底的细胞为准。将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养终止消化，吸管顺序轻轻吹打瓶底，倒置显微镜下观察细胞完全脱壁后，按1：2～1：3比例传代接种于25ml培养瓶，放置于37℃、5％CO₂、95％湿度的培养箱中培养，直至细胞生长到几乎完全融合时，再次进行传代。

S4a、取步骤S3a中获得的第三代骨髓间充质干细胞于三维培养支架中进行培养；

取0.5g骨基质明胶、0.5g壳聚糖季铵盐水凝胶、3ml的10％乙醇以及12ml蒸馏水复溶后，取步骤3a中获得的第3代骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1细胞浓度与三维培养支架共同接种，并采用步骤3a中的血清培养基继续进行培养。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤所采用的培养基为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维培养支架是由骨基质明胶和脱细胞软骨匀浆制成的。

具体地，本实施例提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

S1b、制备三维培养支架；

S11b、骨基质明胶的制备过程为：

与实施例1中步骤S11a骨基质明胶的制备过程相同，在此不再赘述。

S12b、脱细胞软骨匀浆的制备过程为：

取牛股骨，将股骨头关节面软骨用手术刀切下，蒸馆水冲洗2遍，室温下将关节软骨浸泡于含0.035mmol/L的PMSF(蛋白酶抑制剂)的PBS缓冲液(pH7.5)中，经粉碎机粉碎、梯度离心制成软骨微丝；软骨微丝经脱细胞液(0.035mmol/L的PMSF、l％TritonX-100及pH7.5的Tris-HCl缓冲液)脱细胞处理，持续震荡48h，7000r/min×5min离心，PBS缓冲液冲洗，然后37℃下加入50U/ml的DNA酶和1U/ml的RNA酶消化2h，重复7000r/min×5min离心，沉淀用超纯水冲洗3遍后再配成浓度为30g/L的乳糜状悬液，-20℃冰箱中保存备用。

S2b、获取骨髓间充质干细胞；

与实施例1中步骤S2a获取原代骨髓间充质干细胞的过程相同。

S3b、原代骨髓间充质干细胞的扩增培养；

与实施例1中步骤3a的不同之处仅在于，该过程中所采用的培养基为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、80U/ml的青霉素及80mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基。

S4b、取步骤S3b中获得的第三代骨髓间充质干细胞于三维培养支架中进行培养；

取1g骨基质明胶、5ml的15g/L脱细胞软骨匀浆、3ml的5％乙醇以及7ml蒸馏水复溶后，取步骤3b中获得的第3代骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹个L^-1细胞浓度接种，第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该过程中所采用的培养基为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、80U/ml的青霉素及80mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基。

实施例3

与实施例1不同的是，本实施例中的三维培养支架是由壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆组合制成的。

该实施例具体步骤为：

S1c、制备三维培养支架；

S11c、壳聚糖季铵盐水凝胶的制备；

与实施例1中，步骤S12a壳聚糖季铵盐水凝胶的制备过程相同；

S12c、脱细胞软骨匀浆的制备；

与实施例2中，步骤S12b脱细胞软骨匀浆的制备过程相同。

S2c、获取骨髓间充质干细胞；

与实施例1中，步骤S2a获取原代骨髓间充质干细胞的过程相同。

S3c、原代骨髓间充质干细胞的传代培养；

与实施例1中步骤3a的不同之处仅在于，该过程中所采用的培养基为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基。

S4c、取步骤S3c中获得的第三代骨髓间充质干细胞于三维培养支架中进行培养的过程具体为：

取1g壳聚糖季铵盐水凝胶、50ml的50g/L脱细胞软骨匀浆、10ml的蒸馏水复溶后，取第3代骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1细胞浓度接种。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤中所采用的培养基为含有10％胎牛血清、10^-7mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基。

实施例4

与实施例1不同的是，本实施例中所采用的三维培养支架是由骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆组合制成的；

该实施例具体步骤为：

S1d、制备三维培养支架；

S11d、骨基质明胶的制备；

与实施例1中步骤S11a骨基质明胶的制备过程相同；

S12d、壳聚糖季铵盐水凝胶的制备；

与实施例1中步骤S12a壳聚糖季铵盐水凝胶的制备过程相同；

S13d、脱细胞软骨匀浆的制备；

与实施例2中步骤S12b脱细胞软骨匀浆的制备过程相同。

S2d、获取骨髓间充质干细胞；

与实施例1中步骤S2a获取原代骨髓间充质干细胞的过程相同。

S3d、原代骨髓间充质干细胞的传代培养；

与实施例1中步骤3a的不同之处仅在于，该过程中所采用的培养基为含有10％胎牛血清、10^-8mol/L的氢化可的松、120U/ml的青霉素及120mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基。

S4d、取步骤S3d中获得的第三代骨髓间充质干细胞于三维培养支架中进行培养；

取0.2g壳聚糖季铵盐水凝胶、0.2g骨基质明胶、5ml的15g/L脱细胞软骨匀浆、3ml15％乙醇和10ml蒸馏水复溶后，取第3代骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1细胞浓度接种。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤中所采用的培养基为含有10％胎牛血清、10^-8mol/L的氢化可的松、120U/ml的青霉素及120mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基。

为进一步验证本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。

检测对象

检测组1-4分别对应本发明实施例1-4骨髓间充质干细胞与三维培养支架共培养第3天所获得的细胞；

对照组1—与本发明的不同之处在于，该组为仅采用骨基质明胶培养骨髓间充质干细胞第3天所获得的细胞；

对照组2—与本发明的不同之处在于，该组为仅采用壳聚糖季铵盐水凝胶培养骨髓间充质干细胞第3天所获得的细胞；

对照组3—与本发明的不同之处在于，该组为仅采用脱细胞软骨匀浆培养骨髓间充质干细胞第3天所获得的细胞。

检测一、台盼蓝法进行细胞计数

取检测组1-4及对照组1-3的细胞，分别执行以下操作：

用75％酒精清洗计数板和盖玻片，用吸水纸擦干；在每次细胞补液前取10ul细胞悬液和10ul的0.4％苔盼蓝充分混合，再加80ul的PBS缓冲液稀释细胞悬液；吸取少量细胞悬液，加入在计数板上的盖玻片内，一定注意不要溢出至计数板上的小槽内，也不要过少或带气泡，在倒置显微镜下观察血球计数板上计数4个大方格内的细胞总数，并根据以下公式计算出细胞密度：细胞悬液密度计算公式—细胞密度＝(4个大格细胞总数/4)×10⁴×10(稀释倍数)个/ml。

表1：

检测结果：由表1中的数据可知，检测组1-4中的细胞密度均远大于对照组1-3中的细胞密度，由此说明，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法提高了骨髓间充质干细胞的增殖率。

检测二、流式细胞仪检测细胞表型CD44，CD90，CD105的阳性率，检测结果如下：

表2：

	CD44阳性率	CD90阳性率	CD105阳性率	CD34阳性率	CD45阳性率
						检测组1	99.34％	99.93％	99.67％	1.47％	1.56％
检测组2	99.28％	99.71％	99.58％	1.34％	1.29％
						检测组3	99.50％	99.41％	99.77％	1.03％	1.28％
检测组4	99.79％	99.81％	99.10％	1.37％	1.40％
						对照组1	92.01％	91.34％	90.87％	9.07％	9.35％
对照组2	89.37％	88.91％	90.03％	9.01％	9.08％
						对照组3	92.61％	90.88％	91.09％	8.25％	9.97％

检测结果：由表2中的数据可知，检测组1-4均大于对照组1-3中的数据，由此说明，检测组1-4所获得的骨髓间充质干细胞的活性较强。

综上所述，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，通过采用骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆中的两种或两种以上的组合作为三维培养支架，不仅能够维持模拟骨髓微环境的三维多孔结构，而且能够提高骨髓间充质干细胞的吸附能力，从而提高了骨髓间充质干细胞的增殖率及细胞活性，解决了现有技术中，采用单一三维培养支架培养骨髓间充质干细胞存在支架机械性能弱、生物相容性差等缺陷造成细胞活性低、易死亡、增殖率低等问题。

以上结合对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；

其中，所述三维细胞培养支架由骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆中的至少两种材料制成。

2.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入所述培养基进行培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例接种进行传代培养至细胞生长到融合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，采用三维培养支架进行体外培养的步骤为：取三维培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰个/L细胞浓度与复溶后三维培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。

5.根据权利要求4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，三维培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂。

6.根据权利要求5所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述助溶剂为乙醇，且乙醇的质量分数为5％-15％。

7.根据权利要求3或4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。

8.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述壳聚糖季铵盐水凝胶的制备过程为：按1:2～1:5的质量比将壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵于70～95℃水浴中反应7～10小时，加入无水乙醇，析出壳聚糖季铵盐，将壳聚糖季铵盐再溶于乙醇中凝胶化，即获得壳聚糖季铵盐水凝胶。

9.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的骨基质明胶和0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶组合而成；

或，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的骨基质明胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆组合而成；

或，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆组合而成。

10.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的骨基质明胶、0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆组合而成。