CN111031792A

CN111031792A - 低温保存

Info

Publication number: CN111031792A
Application number: CN201880049439.XA
Authority: CN
Inventors: 保罗·德·科皮; 卢卡·乌尔巴尼; 马西莫·品扎尼; 吉塞佩·马扎; 克莱尔·克劳利
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2017-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2020-04-17
Also published as: WO2018220179A1; JP2020521483A; EP3629727A1; GB201708729D0; US20200163326A1

Abstract

本发明提供一种用于治疗或药理测试目的细胞化支架的低温保存的方法和材料，该方法包括：(i)提供一种已在其上接种了细胞的培养支架；(ii)用包含培养基和5％～30％的低温保护剂例如DMSO的低温保存组合物平衡该细胞化支架；(iii)通过以约‑1℃/分钟的速率连续降温至约‑80℃来冷冻该平衡的细胞化支架；(iv)将该冷冻的细胞化支架保存于‑135℃～‑198℃之间的温度下。

Description

低温保存

技术领域

本发明主要涉及用于细胞化支架的低温保存的方法和材料。

背景技术

组织工程(TE)被证明是受损或患病的器官和组织的常规治疗的一种可行且重要的替代方法[1-3]。目前，各种工程器官和组织正在进行临床前试验(气管，心脏瓣膜，喉，血管，膀胱)[4，5]。

一种特别有前途的TE方法是使用脱细胞作用创建非免疫原性基质，然后将其与自体或其他相容性细胞重新细胞化。脱细胞过程使用洗涤剂和酶去除组织和器官的细胞室。重要的是，保留了支架的细胞外基质，从而保持了组织的原始结构和组成[3，4，6-8]，但避免了任何潜在的免疫排斥反应[9]。供体组织不必是人源的，但可以从解剖学上匹配的物种中获得[10]，因此有可能解决严重的供体器官短缺问题。

有关组织工程学脱细胞基质的出版物例如包括与肠[11，12]，食管[7]，肺[14]和隔膜[15]有关的组织。在一个例子中，一种组织工程化的气管使用自体干细胞制备，并被移植到一名儿童体内[5]。后来的报道表明，气管仍然是整合的，并且该工程器官随儿童一起生长，展示了TE的巨大效用[16]。

WO201742232描述了一种用于制备植入物，特别是腔组织植入物的改进方法，其中该植入物通过使用肌肉细胞前体和成纤维细胞接种无细胞支架或基质工程化，例如，使用特定比例的细胞进行注射接种。

随着组织工程应用在临床中越来越多地使用，一个主要的限制因素就是在需要时迅速提供足够数量的合适的细胞化支架的能力。能够按需提供这种“现成”工程器官可以显著增加受益于这种治疗方法的患者数量。

因此，人们希望能够预先制备再细胞化支架并以一种能充分保存该构建体的结构和功能的方式存储它们。

现有技术中已经提出了脱细胞支架或天然组织的低温保存方法。例子包括：Franchini等人，Blood Transfus.，2009年7月，100-105页；Bonenfant等人，Biomaterials，2013，34，3231-3245；Gallo等人，Heart Vessels，2016：1862-1873；Brockbank等人，CellTissue Banks，2012，13，663-671；Poornejad等人，Organogenesis，2015，11，30-45。

然而，这些支架或组织的结构和性质与细胞化支架的结构和性质不同，因此可能适用于这些无细胞支架或天然组织的方法并不能合理预期可应用于细胞化支架。

Chen等人(Biomaterials，2011，32，8426-8435)研究了海藻糖对上皮层的低温保存方法。将接种有角质细胞的壳聚糖-明胶膜使用不同的低温保存溶液(包括海藻糖，以及除海藻糖以外的一种物质)冻存，方法是将样品在4℃下放置30分钟，然后放入液氮中。通过分步冷冻(4℃下30分钟，-20℃下2小时，-80℃下过夜，然后液氮)低温保存细胞悬液。

Costa等人(组织工程，2012，18，852-858)研究了多孔支架的低温保存方法，该多孔支架是基于淀粉和聚己内酯混合物的纤维网为载体，并接种了山羊骨髓干细胞。该作者显然是直接在-196℃下的液氮中进行低温保存。

US 6638709 B2涉及一种由培养的成纤维细胞和培养的角质细胞的分离层组成的低温保存复合活构建体(CCLCs)，并且涉及一种制备CCLCs的方法。采用基于非细胞渗透组分和细胞渗透组分的一种低温保护剂溶液平衡，冷冻并在低温下储存来制备CCLCs。在使用之前，将它们解冻并冲洗以充分去除低温保护剂。通过指定的降温程序进行冷冻，该程序使用特定的变化的降温速率和保持阶段。

US 8367059 B2涉及一种低温保存的骨构建体。在一个实施方案中，在灌注生物反应器中提供多孔羟基磷灰石-壳聚糖-明胶(HCG)支架，然后将细胞接种在该灌注生物反应器中的HCG支架中，灌注细胞培养基并操作生物反应器以允许细胞接种并在HCG支架中生长。随后，用合适的低温保存液灌注该HCG细胞构建体，然后以特定的梯度方式进行冷却。

然而，从前述可见，通过低温保存实现工程器官等的长期保存的新颖方法将对本领域提供有益贡献。

发明内容

本发明提供了一种用于细胞化支架的特定的“慢速冷却”介质和方法，其已显示出在许多不同类型的细胞化支架中解冻后能够维持支架的细胞功能和完整性。在优选的实施方案中，本发明利用已经被GMP批准用于临床应用的组分，提供了一种无菌且相对便宜的用来保存材料的方法。

本发明的方法已经成功地用于支架(例如食管和肝脏工程构建体)的低温保存。举例来说，对再细胞化的肝脏的解冻显示，细胞与维持在培养物中的再细胞化支架中的细胞相比能够产生水平相当的白蛋白。

这一发现尤其令人惊讶，因为据报道，在低温保存脱细胞支架和天然组织的过程中使用的其他慢速冷却方法会给材料带来伤害(参见Gallo等人和Brockbank等人，同上)。

一种新颖有效的TE器官低温保存系统的提供为该领域开辟了新的临床应用可能性。

在多个方面，本发明提供了用于细胞化支架的低温保存的方法和材料，其可以用于治疗或药理测试目的，所述方法包括：(i)提供已在其上接种了细胞的培养支架；(ii)使用包含培养基和5％～30％的低温保护剂例如DMSO的低温保存组合物平衡所述细胞化支架；(iii)通过以限定的速率将温度降低至限定的温度来冷冻平衡的细胞化支架；(iv)将冷冻的细胞化支架保存于-135℃至-198℃之间的温度下。

因此，在第一方面，本发明提供了一种用于低温保存细胞化支架的方法，该方法包括：(i)提供一种细胞化支架；(ii)用包含培养基和5％～30％的低温保护剂的低温保存组合物平衡所述细胞化支架；(iii)通过以-0.5℃～-2℃(例如，-0.8℃～-1.2℃，例如大约-1℃)/分钟的速度降温至-75℃～-85℃(例如-78℃～-82℃，例如，约-80℃)来冷冻平衡的细胞化支架；(iv)将该冷冻的细胞化支架保存于-135℃至-198℃之间的温度下，例如大约-160℃。

在本发明的“慢速冷却”方法中，步骤(iii)优选连续进行，而不是梯度或阶梯式进行。

“细胞化支架”是指无细胞支架被细胞接种和培养后获得的支架。在一个具体的实施方案中，该细胞化支架可以是再细胞化支架(即，来自脱细胞的组织的细胞接种支架)。下文描述了再细胞化支架和其他细胞化支架(即，利用人工或合成的支架)的实例。

无细胞支架或基质的来源为本领域众所周知。例如，WO0214480引用了本领域中的五大种类支架：(1)不可降解的合成聚合物；(2)可降解的合成聚合物；(3)无孔的非人源胶原蛋白凝胶；(4)被加工成期望孔隙率的非人源胶原蛋白网；以及(5)人源(尸体)脱细胞的胶原组织。

“无细胞”支架通常不包含细胞或细胞组分。但是，应当理解的是，例如，在使用来自生物来源的支架(例如脱细胞的支架)的情况下，有可能的是，例如脱细胞后一些细胞仍然会保留在支架上，如下所述。

在本文的一个实施方案中，支架是一种人造的或合成的聚合物支架。合成聚合物的例子包括涤纶和聚四氟乙烯，它们可以加工成各种纤维和编织物。用作合成组织基质的其他聚合物包括聚半乳糖和聚二恶烷酮。

其他合成支架在性质上可以本质上是蛋白质的，例如，主要由纯化蛋白(例如胶原蛋白)组成。

非合成支架在性质上也可以本质上是蛋白质的，或主要由胶原细胞外基质(ECM)组成。

优选地，支架将是脱细胞的(生物)基质。支架可以是异种的，即它源自或取自与受体(例如人类受体)不同物种的供体。或者，支架可以是同种异体的。

就此而言，适合于脱细胞的底物尤其是脱细胞的动物来源的支架可以是，例如，猪源，大鼠源或兔源。

可以采用任何已知的脱细胞方法来提供支架。通常，脱细胞方法采用多种化学、生物化学和/或物理手段来分裂，降解和/或破坏细胞组分和/或修饰其中含有细胞的基质，从而促进细胞和细胞成分的去除，通常将留下ECM支架。除非上下文另外要求，否则术语“支架”和“基质”在本文可互换使用。WO0214480(同上)描述了一种使天然组织脱细胞的方法，所述方法尤其包括本领域已知的多种洗涤剂，乳化剂，蛋白酶和/或高或低离子强度溶液中的任何一种。本发明包括使用通过任何脱细胞技术制备的脱细胞支架，所述脱细胞技术去除了大部分细胞的同时基本上保持了基质完整。

去除“大部分”细胞通常是指去除至少50％，例如，至少60、70、80、90、95或99％的细胞，尤其是去除所有或基本上所有的细胞。提到保持基质“基本上完整”是指保留基质，例如ECM的至少40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。

因此，可选地，根据本发明的第一方面的方法的步骤(i)包括：(ia)提供一种无细胞支架；(ib)采用细胞对该无细胞支架进行接种；(ic)培养该接种的支架以制备所述细胞化支架。

可选地，步骤(ia)包括：(ia-1)提供组织或器官或其样品；(ia-2)使用洗涤剂和酶中的一种或两种使所述组织或器官或其样品脱细胞以提供一种无细胞支架。

或者，步骤(ia)包括：(ia-1)提供一种人工或合成的无细胞支架。

培养基

为了接种目的，可以在例如本领域众所周知的那些合适的介质中培养细胞。例如：补充的MegaCell培养基(5％FBS；1％青霉素链霉素；1％L-谷氨酰胺；1％非必需氨基酸；0.1mM β-巯基乙醇；5ng/ml碱性FGF)，达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)等，或凝胶，比如，基底膜基质胶等。介质可以包含胶原蛋白，纤连蛋白等。本文提及的出版物和以下实施例中描述了适用于细胞化支架的培养基的合适实例。

在低温保存之前，将培养基或生长培养基与5％～30％的低温保护剂混合。例如，在一个实施方案中，最终的低温保存组合物包含：50％胎牛血清(FBS)；和40％补充的MegaCell培养基，以及10％DMSO。

接种和培养条件

用于细胞化支架的接种和培养条件为本领域公知，并且在本文提及的出版物中有所描述。

需要注意的是，接种到支架上的细胞数量将取决于多个因素，包括支架的大小，支架上所需的细胞密度，接种后支架将被培养的时间以及支架的使用。因此，可能不需要将细胞接种于整个支架上，例如，如果要进行后续培养步骤。然而，特别地，可以接种细胞以覆盖至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％的支架。还将理解的是，例如，取决于细胞化支架的最终使用，可以在支架的多个表面之一上接种细胞。

来自任何来源的任何类型的细胞都可被用来制备本文定义的细胞化支架。例如，细胞可以是成纤维细胞，中成血管细胞，上皮细胞等。如下所述，当细胞化支架形成适于移植入受试者以修复或替换受损器官或组织的构建体时，接种于支架上的细胞通常可以是对应于那些存在于将要修复或替换的器官或组织中的细胞。这种细胞的来源将在下面讨论。

通常，接种的构建体的培养将在“生物反应器”中进行。

正如所讨论的，例如在US2014/0341862中，在现有技术中已知适用于非常多种类不同组织构建体的反应器。特别适合于管状构建体的是例如DE 199 15 610(Bader)中描述的反应器，或EP 0 320 441(Sulzer)中描述的反应器。可以将一根(例如)管状血管夹置于这样的反应器中，并因此使介质或血液贯穿流动，使其达到最接近随后整合到体内的自然状态。

该生物反应器可以结合有可移除的盒，该盒可以从脱细胞生物反应器转移，进行接种，然后引入到再细胞生物反应器中(参见例如WO2017042232)。

治疗相关的构建体

因此，在优选的实施方案中，本发明涉及模拟需要修复或替换的组织或器官的构建体的制备和低温保存。在这种情况下，采用可填充支架的细胞对支架进行接种，从而制备出可移植到受试者体内的人工构建体。因此，细胞化支架可以形成用于组织或器官修复的构建体。

在这种方法中使用的细胞通常是自体的，即来自或源自组织或器官构建体的预期受体。但是，用于该方法的细胞也可以是同种异体的，即从受试者体内获得或衍生，该受试者并非为制备的组织或器官构建体的受体。此外，可以使用异种细胞，即源自与组织/器官构建体的受体不同的物种的细胞。

除非上下文另外要求，术语“组织”或“器官”在本文中相对于构建体可互换使用。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指任何哺乳动物，例如家养动物，诸如狗，猫等，例如农业动物，诸如马，猪或牛等，或人。在一个实施方案中，受试者或患者可以是新生儿或婴儿，特别是人类新生儿或婴儿。

制备替代组织的一般策略是利用哺乳动物细胞，将其接种到合适的支架上进行细胞培养。细胞可以从预期的受体(例如，从活检组织)获得，在这种情况下，它们通常在用于接种支架之前在培养基中扩增。细胞也可以从其他来源(例如，已建立的细胞系)获得。接种后，通常在植入工程化组织(例如包含细胞化支架或由细胞化支架组成)后，在实验室和/或患者体内继续细胞生长。

药物测试

在其他实施方案中，本发明的细胞化支架可用于药理研究。实例包括基于WO2017017474中描述的支架的细胞化支架，其描述了(特别是)由来自源组织的无细胞的细胞外基质(ECM)组成的脱细胞组织支架的制备，其保留了源组织的三维结构、ECM组成以及ECM的生物活性。这些细胞可以用适合于正在检测研究中的细胞重新填充。WO2017017474中描述的构建体的实例包括肝组织块。

本发明的这些和其他方面以及实施例将更详细地描述：

在一个实施方案中，所述构建体是腔组织植入物。

所谓“管腔”构建体或类似物，是指适合于替代或植入诸如以下描述的管腔器官或组织的构建体，而并非严格地构建体本身的结构。例如，构建体可以简单地为片的形式，其可以根据需要使用或施加。对组织构建体的参考应据此理解。因此，提到食管构建体是指适合植入食管或作为食管替代物的构建体，肠构建体是指适于植入肠中或作为肠替代物的构建体。在一实施方案中，构建体可具有腔或管状形状。

在一个实施方案中，支架本身是管状的。

在一个实施方案中，支架源自已脱细胞的管腔器官。

在一个实施方案中，支架是非人源的。

在一个实施方案中，细胞化支架是腔组织植入物，其已通过用肌肉细胞前体和成纤维细胞接种无细胞支架或基质而进行工程改造，如WO2017042232中所述。因此，细胞可以是接种到基质中和/或基质上的中成血管细胞和成纤维细胞的组合，其中，所述中成血管细胞和成纤维细胞分别、同时或顺序地接种。支架也可以接种神经c细胞，例如小鼠源神经c细胞。

在一个实施方案中，培养基是胎牛血清/MegaCell培养基。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括：(i)提供一种支架；(ii)将中成血管细胞和成纤维细胞的组合(以及可选地其他细胞，例如神经c细胞)接种到支架的基质中和/或基质上，其中所述中成血管细胞和成纤维细胞分别、同时或顺序地接种；(iii)培养该接种的支架以制备可植入的构建体；(iv)根据前述方法低温保存该构建体。

在一个实施方案中，细胞化支架是组织工程化的食管，其可选地是一种适合于新生儿或婴儿的食管。

作为非限制性实例，适合于新生儿的典型食管构建体当处于松弛状态时约为宽8-10mm且长为4-5cm。

在一个实施方案中，细胞化支架是接种有中成血管细胞(例如人)和成纤维细胞(例如小鼠或人)的脱细胞食管。

在一个实施方案中，支架源自已脱细胞的实体器官。支架可以是任何三维实体结构，例如，实际上或近似上：球形，长方体形，圆柱形，六角棱柱形，圆锥形，截头圆锥形，金字塔形等。

在一个实施方案中，细胞化支架是组织工程化的肝脏，例如，如WO2017017474或WO2015185912中所述。

在一个实施方案中，细胞化支架是接种有人肝细胞，例如干细胞、iPS细胞或人肝细胞系(可选为HepG2细胞系)的脱细胞肝组织。

在一个实施方案中，支架是水凝胶支架，例如，如WO2015185912A1中所述的源自人肝ECM支架的支架。

在一个实施方案中，细胞化支架是接种有人肝细胞系的水凝胶支架，所述人肝细胞系可选地是HepG2细胞系。

在一个实施方案中，培养基是胎牛血清/αMEM培养基。

在一个实施方案中，细胞化支架是用于药理研究或治疗目的的模型组织(例如肝模型组织)。这样的支架可以是如上所述的成形的固体，最大尺寸为3mm～30mm。

在一个实施方案中，细胞化支架是具有例如大约3、4、5、6、7、8、9、10mm边长尺寸的长方体。

在其他实施方案中，细胞化支架可以选自组织工程化的肺，肠，胰腺肌肉或膀胱。

这种细胞化支架可用于治疗目的或药理研究。

低温保存液

在一些实施方案中，低温保存组合物包含80％或更多的培养基。例如，低温保存组合物可以包含少于20％，优选地在5％～15％，更优选地8～12％，更优选地约10％的低温保护剂。

所述低温保护剂可以选自由以下组成的列表中的任意一种：二甲亚砜(DMSO)；乙二醇；甘油；2-甲基-2，4-戊二醇；丙二醇；蔗糖；海藻糖。

低温保存条件

在一个实施方案中，步骤(ii)在环境温度以下进行，例如在小于20、15、10或5℃的温度下，可选地在约0～4℃的温度下进行。

随后是步骤(iii)，其包括通过以-0.5℃～-2℃/分钟的速度降温至-75℃～-85℃来冷冻已平衡细胞化支架。优选的冷却速率为约-1℃/分钟，即，-0.8、-0.9、-1.1或-1.2℃/分钟。

该冷却步骤优选持续至例如约-80℃，比如，-78，-79，-81，-82℃。

步骤(iii)中的冷却可通过将平衡的细胞化支架置于约-80℃的一个或多个容器内来实现。

步骤(iv)中的后续冷却可以通过将平衡的细胞化支架置于一个或多个容器内液氮的气相中来实现。这将达到约-160℃的温度。

优选地，一个或多个冷却步骤是连续的，即不包括按梯度降低温度，由此将细胞化支架移除并返回到冷却环境。

在一些实施方案中，步骤(iv)进行至少1、2、3或4周或更长时间。例如，步骤(iv)可以进行至少12、16、20、24周。

一旦期望利用冷冻的细胞化支架，可以通过在37℃水浴中快速解冻该冷冻的细胞化支架来便利地实现。这可以在存储地点，护理点或使用点进行。

细胞存活率

在一个实施方案中，解冻的细胞化支架的细胞存活率表示为细胞化支架中存在的活细胞总数的百分比，该细胞化支架中存在的活细胞总数占未低温保存的细胞化支架中原始存在的活细胞原始数目的至少约70％。

在一实施方案中，解冻的细胞化支架保留占未低温保存的细胞化支架中的细胞的原始数目的至少约50％。

在一个实施方案中，活细胞的代谢活性是最初存在于细胞化支架中的活细胞的原始代谢活性的至少50％。

在一个实施方案中，支架结构的完整性基本上不受低温保存的影响。

下文描述了定量和评估细胞存活率、细胞数目和代谢活性以及支架完整性的方法。用于细胞存活率的分析方法的例子包括组织学分析，生物发光成像和白蛋白定量。

其他方面和效用

一方面，本发明提供了根据本文描述的方法获得的低温保存的细胞化支架，及其在治疗或手术方法中的应用。

一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的低温保存的细胞化支架和一个或多个容器。

可选地，试剂盒进一步包括说明书或标签，以用于所述试剂盒的治疗或药理研究目的。

具体地，试剂盒可选地包含说明书或标签，其描述了如何维护，储存，解冻和/或使用低温保存的细胞和构建体。试剂盒还可选地包含用于低温保存的细胞化支架的储存，维护，解冻和/或生长的培养基。

本发明的一个方面提供了一种用于患有慢性疾病的患者的新颖治疗方法，其中如果患者的病情严重恶化，则最终可能需要器官置换。这可能导致一种不期望的紧急情况，可用于准备治疗的时间有限，但是组织工程构建体或器官置换可能要花费数月的准备时间。

通过使用本发明，可以预先制备这种材料并低温保存直到需要它们。

因此，本发明提供了一种患有导致器官衰竭的慢性疾病的受试者的治疗方法，该方法包括：(i)提供细胞化支架，其是使用受试者的自体细胞的组织工程器官替代物；(ii)根据本文所述的方法对器官替代物进行低温保存；(iii)在所述受试者需要时解冻该器官替代物；(iv)使用所述器官替代物治疗所述受试者。

诱导多能干(iPS)细胞是有前景的组织工程细胞的来源。例如，据报道，使用“通用供体”创建的100个iPS细胞库可用于40％的人口。

这使得可以以各种尺寸预先制备和低温保存再细胞化器官替代物，从而向适合的急需的大部分人口提供替代物，而无需收集和扩增自体细胞。这种同种异体材料可随时向护理点提供。

因此，本发明提供了一种用于提供同种异体组织工程器官替代物的系统，该系统包括：(i)提供多个细胞化支架，其是使用通用供体iPS细胞的同种异体组织工程化的器官替代物；(ii)根据本文所述方法对该器官替代物进行低温保存；(iii)确定需要器官置换的受试者；(iv)确定兼容的低温保存的同种异体组织工程器官替代物；(v)在所述受试者需要时解冻该器官替代物；(vi)使用所述器官替代物治疗所述受试者。

可选地，一个或多个细胞化支架可远离受试者的护理点保存。

关于本文所述的在人或动物体上实践的各种可能的治疗或手术方法、用途和效用，本文还提供了：该材料(细胞化支架)在制备用于治疗或手术环境的药物或植入物中的应用，以及在该治疗或手术环境中用作药物或植入物的材料(细胞化支架)。

工程微支架在药物测试中具有很大的效用，因为它们的三维结构提供了比使用二维细胞培养更为真实的模型。

一种示例系统基于人类肝脏ECM水凝胶和肝脏微支架(请参见例如Muβbach，Franziska等人，“生物工程肝脏：一种药物测试的新工具和一种有希望的解决方案，以满足日益增长的供体器官需求”欧洲外科研究57.3-4(2016)：224-239)。在WO2017017474中也提供了示例。

这样的系统通常是按需准备以进行测试或植入，并在理想的生理条件下快速运输。根据本发明的低温保存方法使得可以提前制备。

因此，本发明提供了一种制备用于药理研究目的的三维工程微支架的方法，该方法包括：(i)提供一种细胞化支架，该细胞化支架是适合药理研究目的的三维工程微支架；(ii)根据本文所述的方法对该工程微支架进行低温保存；(iii)在需要时解冻该微支架。

可选地，该方法进一步包括根据需要利用解冻的支架，例如，通过使其与推定的药理学试剂接触，确定该解冻的支架的生理学或其他参数，将该参数与未与推定的试剂接触的相应支架进行比较，等等。

在整个说明书中，包括所附的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包括”和“包含”的变型将被理解为暗示包括所述整数或步骤或整数组，或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数组或步骤组。

当本文描述的材料被公开为包括或包含特定的组分混合物时，应理解的是，类似地，同样公开了一种“由这些组分组成”或“基本上由这些组分组成”的材料。

必须注意的是，如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”，“一个”和“该”包括复数，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一干燥步骤”包括两个或更多个这样的干燥步骤的组合等。

范围可以在本文中表示为从“大约”一个特定值，和/或到“大约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，将理解的是，该特定值形成另一实施例。

本公开包括可用于理解本发明的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，或明确或隐含引用的任何出版物均为现有技术。

此处包括的任何标题和副标题仅是为了方便起见，而不应以任何方式解释为限制本公开。

现在将参考以下非限制性附图和实施例进一步描述本发明。鉴于这些，本领域技术人员将想到本发明的其他实施例。

由于本领域技术人员可以用来实施本发明，因此本文引用的所有参考文献的公开内容通过交叉引用特别地结合在本文中。

附图说明

图1和2：再细胞化工程食管的低温保存。

将大鼠脱细胞的食管接种Luc⁺Zs-Green⁺人中成血管细胞、小鼠成纤维细胞以及小鼠GFP⁺神经c细胞，在生物反应器中培养长达11天，然后用已开发的实验方法低温保存两周，再用已开发的实验方法解冻并培养14天。

在低温保存之前和之后，使用具有活体成像系统(IVIS，Perkin Elmer)的生物发光成像来追踪细胞。H&E染色显示低温保存后14天支架中的细胞(A，B)。在B中，每个时间点处，“MABs”结果显示在左侧，而“MABs+FBs”显示在右侧。

在C中，低温保存的典型食管切片，包含人成血管细胞和成纤维细胞以及小鼠GFP⁺神经c细胞。

图3：再细胞化人肝脏支架和肝脏水凝胶的低温保存。

将0.5M HepG2接种在16个水凝胶和16个HL-68上。使用开发的方法将每种支架的一半进行低温保存2周。低温保存后，新鲜支架和解冻的低温保存支架之间没有显著差异。在直方图中，每个时间点处，HL-68的结果显示在左侧，水凝胶的结果显示在右侧。

图4：保存后细胞存活率的维持。

食管支架接种Luc⁺ZsGreen⁺hMAB+mFB，在静态条件下培养，然后低温保存2周。结果表明，采用慢速冷却工艺低温保存的生物工程肌肉在保存后显示出仍能维持细胞存活率。

在生物发光图像中，显示了用Luc⁺ZsGreen⁺hMAB+mFB接种并静态培养8天(低温保存前)和低温保存2周后再培养7天的代表性支架的图像。检测到的生物发光的位置通过箭头指示。在B中，显示了低温保存后对接种支架进行MTT比色测定的代表性图像。比例尺：1mm。

C显示了在低温保存之前和之后的不同时间点使用生物发光成像检测到的平均发光强度。数据：平均值±SEM(n＝3)。

具体实施方式

示例1-材料和方法

确认支架完整性

组织学

将样品在室温下于含有10％中性缓冲福尔马林溶液的PBS(pH 7.4；Sigma，UK)中固定24小时，在dH₂O中洗涤，在分级酒精中脱水，包埋在石蜡中，以5μm尺寸切片。组织切片用苏木精和曙红染色(H&E；Leica，德国)。

DNA定量

按照制造商的说明书，使用组织DNA分离试剂盒(PureLink Genomic DNAMiniKit，Invitrogen，英国)分离DNA。

ECM成分定量

胶原蛋白，弹性蛋白以及糖胺聚糖(GAG)的含量可以分别通过总胶原蛋白测定试剂盒(Biocolor，UK)，FASTIN弹性蛋白测定试剂盒以及GAG测定试剂盒(Biocolor，UK)进行定量[14]。

生物力学测试

为了评估食管的生物力学性能，可以对标本进行测试，并对其进行单轴纵向拉伸直至失效[12]。可以使用Instron 5565施加单轴张力，以100毫米/分钟的恒定张力速率加载扁平哑铃(20毫米)形式的样品。样品的厚度可以使用数字电子千分尺(RS组件，US)在样品的三个位置进行测量并取平均值。

扫描电子显微镜检查(SEM)

将样品固定于含有2.5％戊二醛(Sigma，英国)的0.1M磷酸盐缓冲液中，并在4℃下静置24小时。SEM可以如参考文献[14]中所述进行。

确认细胞存活率，数量以及代谢活性

细胞存活率可以根据本领域众所周知的方法进行，例如，如US6638709中所述。这些包括评估“构建体细胞密度”，即每单位面积的活细胞总数；“细胞存活率”，即存活细胞总数的百分比；“代谢活性”，即以活细胞代谢养分和执行其他细胞维持功能的能力来衡量其总体活力的指标。额外的测量包括对细胞化的构建体进行组织学检查，以检查构建体内及其上的细胞的存在，构型和分布。

简而言之，可以通过以下方式来测量细胞数量和细胞存活率：从构建体中释放细胞，并通过血细胞计数器使用台盼蓝染料排斥法将活细胞与死亡细胞区分开来确定细胞存活率和细胞数量。

代谢活性可通过将样品与指示剂染料一起孵育来测量。该测定法使用非细胞毒性的指示剂染料(Alamar Blue dye)测量线粒体活性，该染料扩散进入细胞线粒体中并进行还原氧化反应，得到荧光产物，该荧光产物可通过荧光分光光度计读取。代谢活性可以使用MTT测定法测量。代谢活性细胞在脱氢酶的作用下，将黄色MTT(3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑溴化物)还原，生成还原当量，如NADH和NADPH，从而产生一种可以溶解并通过分光光度法定量的紫色甲瓒。以这种方式，MTT测定法可用于测量细胞存活率。

细胞存活率也可以使用检测凋亡标志物的测定法，例如caspase-3测定法来测量。实施例中描述了一种示例性的caspase-3测定。

组织学要求对构建体和其中的细胞的结构与形态进行视觉评估(参见本文实施例)。

IVIS成像：

慢病毒制备

慢病毒转移载体pHIV-LUC-ZsGreen(用于图2A)来自Bryan Welm博士(犹他大学外科系，通过美国马萨诸塞州Addgene Inc.购得，质粒#39196)，并用其产生一种同时包含来自EF1-alpha启动子的ZsGreen荧光蛋白和萤火虫萤光素酶的慢病毒。该第三代慢病毒需要包装质粒pRSV-Rev(Addgene质粒#12253)、pMDLg/pRRE(Addgene#12251)以及VSV-G包膜质粒pMD2.G.(Addgene质粒#12259)。

简而言之，通过将293T细胞与上述质粒共转染来制备慢病毒载体。根据生产商的说明书，使用jetPEI/质粒混合物将质粒转染到293T细胞中。在37℃下6小时后，交换介质(含有10％FBS的DMEM；Gibco，英国)以收集病毒。24小时后，通过以2500rpm(4℃)离心纯化该含病毒的介质，并通过0.45μm膜过滤。将介质在4℃于50,000g下超速离心2小时(SW28转子，最佳地，LE80K超速离心机，Beckham，High Wycombe，英国)。将病毒沉淀重悬于100μL预冷的无血清DMEM(Gibco，英国)中，并将病毒储存于-80℃直至使用。

通过在HeLa细胞中的转导效率计算病毒滴度(Hela细胞是已知的允许病毒转导的细胞系)。HeLa细胞在完整的DMEM中扩增。将细胞以每孔5×10⁴个细胞的数量接种在24孔板中。每孔的接种总体积为500μl，病毒浓度为20μl/ml到0.0032μl/ml的浓度系列(稀释比1∶5)。将细胞培养过夜，并在第二天更换为新鲜介质。转染72小时后，通过流式细胞术分析表达荧光蛋白ZsGreen的细胞比例来确定转导效率。病毒滴度采用以下公式计算：

以15-25％的转导效率转导细胞的病毒体积计算病毒滴度。

基质细胞的慢病毒转导与FACS分选。

源自肌肉的基质细胞采用如上所述的慢病毒转导，但将其缩放至T25烧瓶并在提高的MOI下进行测试。通过FACs确定的转导效率为转导细胞的百分比。为了获得转导细胞的纯种，在细胞扩增一次之后对细胞进行FACS分选。简要地，将细胞用胰蛋白酶消化，离心，并以1x10⁶个细胞重悬于500μl FACS缓冲液中，并使用FACSAria(BD Biosciences)进行分选。通过进一步传代使分选的细胞扩增，并通过流式细胞术检查以确保纯的转导细胞得以维持并将其用于下游实验。

生物反应器中的生物发光成像

将含有150μg/ml D-萤光素的培养基通过三路鲁尔接头注入生物反应器的内室，并如上所述进行成像。将生物反应器放置在平台上并成像。平台D用于缩小整个反应器的图像，平台C用于所有其他图像和分析。

其他材料

MegaCell培养基包含：5％FBS，1％青霉素链霉素，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，0.1mM β-巯基乙醇以及5ng/ml碱性FGF。

对于低温保存，培养基组成为50％胎牛血清(FBS)，40％含补充剂的MegaCell培养基(如上所述)以及10％二甲亚砜(DMSO，Me2SO；Sigma，英国)。

慢速冷却可使用“Mr Frosty”(Nalgene)冷冻容器实现。将Nalgene冷冻容器保持在-80℃下过夜。

示例2-食管

将接种人中成血管细胞(MABs)、小鼠成纤维细胞(FBs)以及小鼠神经c细胞的大鼠脱细胞食管在生物反应器中培养长达11天，然后按以下方案冷冻：

-将接种的支架(尺寸7÷20mm长度)放置在具有500μL FBS的冷冻小瓶(尺寸：2mL)中。

-在整个过程中将小瓶置于冰中。

-再添加500μL含20％DMSO的MegaCell培养基溶液。

-将小瓶转移至Nalgene冷冻容器中，并保持于-80℃过夜。

-然后将样品放置并储存于约-160℃的液氮的气相中。

-在液氮容器中放置2～4周后，将小瓶在37℃下快速解冻，然后将样品转移至10-20mL培养基(补充有FBS和抗生素的MegaCell培养基)中于37℃下温和搅拌20分钟。

-然后将样品转移到具有新鲜培养基的培养皿中，并静置培养7天。

通过生物发光和组织学验证细胞存活率和定位。单独接种MABs的支架或MABs+FBs一起接种的支架在冷冻后显示出相当的存活率，低温保存前后采用IVIS测量发光强度(图2A，B)。解冻后细胞立即开始生长，在低温保存后培养的整整14天中，接种的支架发出的生物荧光持续增加。在培养结束时，支架通过组织学进行分析以确认细胞的存在和正确定位于食管肌肉层。这些结果不仅表明低温保存后的细胞存活与种子细胞的类型无关，而且还突出显示了它们在解冻后能够完美生长的能力。

采用hNuclei和GFP的免疫染色进一步评估支架内的细胞分化和定向(图2C)。将MABs、FBs和GFP+神经c细胞的组合一起接种的支架在动态条件下培养11天，低温保存14天，解冻并再培养7天。免疫荧光成像显示在低温保存后细胞如何定向，GFP+神经c细胞形态以及细胞间相互作用，其结果均与未保存的支架相当。

示例3-肝脏

人脱细胞肝块(5x5x5mm)或人脱细胞肝水凝胶块(5x5x5mm)采用HepG2细胞系接种，静态条件下培养长达10天，然后按照如下方案进行冷冻：

-将接种的支架置于含500μL FBS的冷冻小瓶中(大小：2mL)。

-在整个过程中将小瓶置于冰中。

-再加入500μL含20％DMSO的α MEM溶液。

-将小瓶转移至Nalgene冷冻容器中，并保持于-80℃过夜。

-然后将样品放置并储存于约-160℃下的液氮的气相中。

-在液氮容器中放置2周后，将小瓶在37℃下快速解冻，并将样品转移至5～10mL培养基中(αMEM：含有10％FBS，1％抗生素，1％1mM丙酮酸钠，1％非必需氨基酸溶液100X)于37℃下轻微搅拌20分钟。

-然后将样品转移到具有新鲜培养基的培养皿中，静置培养3天。

随后的分析表明，这些细胞在冷冻后仍能存活，并显示出与预冷冻样品相当的白蛋白产量。

白蛋白测量：使用Abcam的体外血清白蛋白(ALB)体外

(酶联免疫吸附测定)试剂盒进行。该试剂盒设计用于人血清和血浆中的血清白蛋白的定量测定。

该

试剂盒采用亲和标签标记的捕获抗体和报道分子偶联的检测器抗体，以免疫捕获溶液中的样品分析物。整个复合物(捕获抗体/分析物/检测抗体)又通过包被孔的抗标签抗体的免疫亲和力固定。为了进行测定，将样品或标准品加入孔中，然后加入抗体混合物。孵育后，将孔洗涤以除去未结合的物质。加入TMB底物，并在孵育过程中通过HRP催化，产生蓝色。然后通过添加终止溶液终止反应，从而完成从蓝色到黄色的所有颜色变化。与结合分析物的量成比例地产生信号，并在450nm处测量强度。可选地，取代终点读数，可以在600nm处动力学记录TMB的变化。

示例4-保存后细胞存活率的维持

设计实验以进一步证明采用已开发方案制备并低温保存的支架在保存后细胞存活率的维持。

静态条件下培养接种有Luc⁺ZsGreen⁺MAB+FB的食管支架，然后以与实施例2所述相同的方式低温保存2周。保存后，将样品解冻并静置培养生长7天。使用生物发光(图4A，C)和MTT分析(图4B)在低温保存前后的各个阶段检测细胞存活率。

培养7天后，使用免疫荧光测定半胱天冬酶3阳性(caspase3⁺)细胞的数量。将组织样品固定于多聚甲醛中并冷冻。采用低温恒温器切割7-10μm厚度的切片，并与稀释在1％山羊血清/PBS/0.01％Triton X-100中的一抗和二抗一起孵育。使用Zeiss LSM 710共聚焦显微镜(Zeiss)采集图像，并使用ImageJ和Adobe Photoshop对其进行处理。进行手动细胞计数，以计算来自支架不同区域的随机切片中的半胱天冬酶3阳性(caspase3⁺)细胞与DAPI标记的(DAPI⁺)细胞总数的比值。

结果表明，经过慢速冷却过程低温保存的生物工程肌肉在保存后显示出仍能保持细胞存活率。解冻后，与低温保存之前相比，支架显示出细胞存活率略有下降。但是，通过生物发光读数和MTT分析(图4)证实，细胞在静置培养中能够恢复并生长长达7天。培养7天后，在低温保存的支架中发现极少量的半胱天冬酶3阳性细胞(＜0.1％)(数据未显示)。

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13.删除

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18.KR 1020140112465 A

19.WO 2015/151047 A1

20.EP 2885969 A1

21.WO99/38952 A2

Claims

1.一种细胞化支架的低温保存方法，该方法包括：

(i)提供细胞化支架；

(ii)使用包含培养基和5～30％的低温保护剂的低温保存组合物平衡所述细胞化支架；

(iii)通过以-0.8℃～-1.2℃/分钟的速度降温至-78℃～-82℃来冷冻该平衡的细胞化支架；

iv)将该冷冻的细胞化支架保存于-135℃～-198℃之间的温度下。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(iii)包括通过以约-1℃/分钟的速度连续降温至约-80℃来冷冻该平衡的细胞化支架。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(i)包括：

(ia)提供一种无细胞支架；

(ib)使用细胞对该无细胞支架进行接种；

(ic)培养该接种的支架以制备所述细胞化支架。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(ia)包括：

(ia-1)提供组织或器官或其样品；

(ia-2)使用洗涤剂和酶中的一种或两种使所述组织或器官或其样品脱细胞以提供一种无细胞支架。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，，所述支架是片状支架，其优选是管状的。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述支架源自已经脱细胞的器官或组织，其中所述器官优选是腔体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述支架是非人源的。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞化支架是组织工程化的食管构建体，其可选地适合于新生儿或婴儿。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述细胞化支架源自接种有中成血管细胞和成纤维细胞的脱细胞的食管。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养基是补充胎牛血清的MegaCell培养基，其包含：1％青霉素链霉素；1％L-谷氨酰胺；1％非必需氨基酸；0.1mMβ-巯基乙醇以及5ng/ml碱性FGF。

11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述支架是球形，长方体形，圆柱形，六角棱柱形，圆锥形，截头圆锥形或金字塔形。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述支架是立方体形。

13.根据权利要求1至4或权利要求11或12中任一项所述的方法，其特征在于，所述支架源自已经脱细胞的实体器官。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞化支架是组织工程肝脏。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞化支架是接种有人肝细胞的脱细胞肝组织，所述人肝细胞可选地是HepG2细胞。

16.根据权利要求1至4或权利要求11或12中任一项所述的方法，其特征在于，所述支架是水凝胶支架。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述细胞化支架是接种有人肝细胞的水凝胶支架，所述人肝细胞可选地是HepG2细胞。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述培养基包括补充胎牛血清的肝细胞支持培养基。

19.根据权利要求14、15、17或18中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞化支架是用于药理研究的肝模型组织。

20.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞化支架是组织工程化的肺，肠，胰腺，肌肉或膀胱。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其特征在于，所述低温保存组合物包含80％或更多的培养基。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述低温保存组合物包含5％～15％，优选8％～12％，更优选约10％的低温保护剂。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述低温保护剂选自：二甲基亚砜(DMSO)；乙二醇；甘油；2-甲基-2，4-戊二醇；丙二醇；蔗糖；海藻糖。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(ii)在低于环境温度下进行，可选地在约0至4℃下进行。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(iv)是通过将平衡的细胞化支架置于液氮的气相中的一个或多个容器内进行的，以达到约-160℃的温度。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(iv)进行至少1、2、3或4周。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其特征在于，还包括：

(v)在水浴中，可选地在37℃下，快速解冻该冷冻的细胞化支架。

28.一种根据权利要求1-26中任一项所述的方法获得的低温保存的细胞化支架。

29.一种根据权利要求27所述的方法获得的解冻的低温保存的细胞化支架。

30.一种试剂盒，其包含根据权利要求28所述的低温保存的细胞化支架以及一个或多个容器。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括用于所述试剂盒用于治疗目的或用于药理研究目的的说明书或标签。

32.一种治疗患有导致器官衰竭的慢性疾病的受试者的方法，该方法包括：

(i)提供一种细胞化支架，其是使用受试者的自体细胞的组织工程器官替代物；

(ii)根据权利要求1-26中任一项所述的方法低温保存器官替代物；

(iii)在所述受试者需要时解冻该器官替代物；

(iv)使用所述器官替代物治疗所述受试者。

33.一种用于提供同种异体组织工程器官替代物的系统，该系统包括：

(i)提供多个细胞化支架，其是使用通用供体iPS细胞的同种异体组织工程化的器官替代物；

(ii)根据权利要求1至26中任一项所述的方法低温保存器官替代物；

(iii)确定需要器官置换的受试者；

(iv)确定兼容的低温保存的同种异体组织工程化的器官替代物；

(v)在所述受试者需要时解冻该器官替代物；

(vi)使用所述器官替代物治疗所述受试者。

34.一种提供用于药理研究目的的三维工程微支架的方法，该方法包括：

(i)提供一种细胞化支架，该细胞化支架是一种适用于药理研究目的的三维工程化微支架；

(ii)根据权利要求1至33中任一项所述的方法低温保存该工程化微支架；

(iii)在需要时解冻该微支架。

35.一种用于权利要求32至34中任一项所述的方法或系统的细胞化支架或低温保存的细胞化支架。

36.一种细胞化支架或低温保存的细胞化支架在制备医疗植入物或材料中的应用，所述细胞化支架用于权利要求32所述的方法或权利要求33所述的系统中。