CN102317445A

CN102317445A - 细胞、人工细胞构建体或三维复合组织装配体的冷冻保存方法

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Publication number: CN102317445A
Application number: CN2010800081808A
Authority: CN
Inventors: 蒂莫·施米特; 洛塔尔·贾斯特; 弗朗茨·马泽尔; 霍尔格·贝克
Original assignee: Naturin GmbH and Co
Current assignee: Naturin GmbH and Co; Naturin Werk Becker and Co
Priority date: 2009-02-19
Filing date: 2010-02-18
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2030-02-18
Also published as: CA2751985A1; US20120077181A1; MX2011008373A; PL2398898T3; AU2010215506A1; SG173740A1; EP2398898B1; KR20110127185A; CN102317445B; BRPI1008297B1; IL214486A; JP2012517823A; JP5746639B2; KR101679889B1; CA2751985C; EP2398898A1; WO2010094747A1; RU2573307C2; HK1166100A1; AU2010215506B2

Abstract

本发明属于细胞和组织培养物的冷冻保存领域，更特别地，本发明涉及细胞、细胞构建体或三维复合组织装配体的冷冻保存和长期保存的方法。该方法基于使用具有特定组成以及高度特定的厚度和适当机械特性的胶原细胞载体，其在解冻后保持这些特性。此类胶原细胞载体(CCC)的使用为冷冻保存提供了一种非常适合的支持物，使其在解冻后具有非常高的存活率并提供已粘附在机械稳定且生物相容性支持物上的细胞和组织装配体。本发明还涉及冷冻胶原载体-细胞装配体，以及可通过本发明方法得到的冷冻人工细胞构建体或三维复合组织装配体，及其解冻后的用途。

Description

细胞、人工细胞构建体或三维复合组织装配体的冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及细胞和组织培养物的冷冻保存领域，更特别地，涉及细胞、细胞构建体或三维复合组织装配体的冷冻保存和长期保存的方法。该方法基于具有特定组成以及高度特定的厚度和适当机械性能的胶原细胞载体，其在解冻后保持这些特性。此类胶原细胞载体(collagen cell carrier，CCC)的使用为冷冻保存提供了一种非常适合的支持物，使其在解冻后具有非常高的存活率，并提供了已粘附在机械稳定且生物相容性支持物上的细胞和组织装配体。

本发明还涉及冷冻的胶原载体-细胞装配体和可通过本发明方法得到的冷冻人工细胞构建体或三维复合组织装配体，及其解冻后的用途。

背景技术

冷冻保存

冷冻保存在细胞的短期和长期保存中起着重要作用，因此对组织和细胞建库具有至关重要的意义。经冷冻保存的细胞(如人造血干细胞)已在白血病常规临床治疗中具有数十年的成功移植历史。利用库存组织的基于细胞的治疗也越来越多地被用于再生医学的其他领域。这些应用的巨大潜力随着新发现而不断增长，引领临床应用新产品的产生。

借助于冷冻保存技术，细胞悬液、粘附细胞甚至人工产生的组织可通过细胞库而“实时”提供。不过，此类项目的实施需要提供相应的基于细胞的再生组织以及冷冻保存系统，使粘附细胞或复合组织装配体能够以其天然三维形式在严密监控的、可再现的和成本效益高的条件下进行生产和保存。

为在冻融过程中保护细胞，向冷冻介质中加入特殊的化学物质如二甲亚砜(DMSO)、海藻糖、甘油或羟乙基淀粉(HES)。

这些所谓的冷冻保护剂保护细胞及其细胞器不受冰晶造成的膜损伤，且在水从液相转为结晶相的过程中不会产生细胞内脱水。已知冻融与细胞活力和功能的丧失有关，丧失的程度取决于所冷冻细胞的类型。在常规方法中，二甲亚砜以多至10％(v/v)的浓度单独使用或与羟乙基淀粉组合使用。DMSO主要通过降低冰点而作用于细胞内区室，这减少了冰晶的形成并因此使冷冻过程中细胞脱水程度降至最低。相比之下，大分子如羟乙基淀粉的作用则是发生于细胞外，通过形成细胞的保护性外壳而防止冷冻过程中细胞中的液体丧失。

细胞载体

除冷冻保护剂外，合适的细胞载体类型在冷冻保存过程中也非常重要。理想地，其厚度应当大致为其上所定殖细胞的厚度，即小于150μm。由于蓄热能力更强，所以更厚的细胞载体可用作缓冲，尤其是在冻融过程中，其产生对标准化冻融速率有负影响的温度梯度。当敏感且昂贵的细胞、复合细胞装配体(assembly)或基于细胞的再生组织必须被保存时，再现性和标准化变得尤为重要。冻融速率和环境压力有助于确定到达冰点时会发生何种程度的结晶。此外，必须牢记，具有一定流体吸收能力的细胞载体材料的内部也可发生结晶。更薄的细胞载体具有额外的优势，即冷冻保护剂快速渗透到内部。

几种材料已作为细胞载体用于细胞或组织的培养和/或冷冻保存。透明质酸、海藻酸、琼脂糖、纤维蛋白、几丁质/壳聚糖、聚交酯(PLA)、聚乙二醇(PGA)或聚L-乳酸(PPLA)是一些现有技术中已知用作细胞培养和/或冷冻保存的支架或载体的材料。

含有胶原的载体已被广泛用作细胞培养及其冷冻保存的基质。胶原是结缔组织(例如皮肤、血管、韧带、肌腱和软骨)结构中以及骨骼与牙齿结构中的主要成分之一。迄今为止已鉴定出超过28种在个体物种间略有差异的不同类型胶原。这一事实加上胶原降解不会产生任何毒性降解产物的事实，使得胶原具有生物相容性并在医药领域中非常有用。

不过，迄今用于粘附细胞冷冻保存的胶原细胞载体通常为水凝胶的形式，即高粘度和极高含水量的果冻状材料。所述基于胶原的水凝胶通常以不同的构造用于冷冻保存。最常见和最简单的构造为单层，即细胞或组织直接接种于包被有简单胶原凝胶单层的培养皿上。另一种广泛用于细胞或组织冷冻保存的基于胶原的水凝胶构造为三明治构造，即细胞在两层胶原凝胶之间被冷冻保存。

然而，这些基于胶原的水凝胶的缺点为其通常厚度超过150μm，这在解冻后会对细胞活力产生负影响，其原因阐释如上。此外，纯的胶原水凝胶不具备足够的机械稳定性以使得能够在解冻后可控地将构建体转移进入机体中。

因此，需要开发由解冻后具有足够机械稳定性的细胞载体支持的细胞、细胞构建体或复合组织装配体的冷冻保存方法。就再生医学而言，这将允许将细胞-载体构建体直接植入并固定在受损机体中，但同时保留胶原载体已知的在生物相容性和可降解性方面的有益作用。

目前可用于粘附细胞冷冻保存的所有机械稳定的载体基质均基于合成或复合材料，或是厚度超过150μm。细胞在合成的细胞载体中不发生整合，或仅在有限的程度上可能发生。

本文所提供的冷冻保存细胞、细胞构建体和组织装配体的方法基于新开发的、简单且标准化的胶原膜(CCC)的特征，其综合了高机械稳定性和极薄的厚度。CCC是用于冷冻保存的可生物降解细胞载体，其允许对粘附细胞进行非破坏性冷冻，并在解冻后易于转移细胞装配体。本文所述方法中所用CCC的制备在申请PCT/EP/2008/006660中有教导。

附图说明

图1：CCC表面的显微镜视图。A.表面的电镜图像。比例尺为500μm；B.膜的横截面。比例尺为10μm。

图2：A.CCC的力应变，实线：干的CCC，虚线：湿的CCC；B.显示了拉伸测试的设置；C.试样的几何学特征。

图3：A.用于培养粘附细胞的冷冻插入物(cryoinsert)(平放的)和用于贮存该插入物的冻存管；B.带有基于胶原的载体膜的冷冻插入物。

图4：A/B.膜顶侧间充质干细胞(MSC)(A)和膜底侧Caco-2细胞(B)的DAPI核染色。图像用倒置荧光显微镜获得。比例尺为100μm；C.MSC(波形蛋白，红色)和Caco-2细胞(细胞角蛋白，绿色)的组合免疫细胞化学染色。激光扫描荧光显微镜下的三维重建。比例尺为50μm。

图5：A.在CCC上培养的鼠胚心肌细胞。培养7天后α-辅肌动蛋白的免疫细胞化学；B.冷冻保存的心肌细胞的α-辅肌动蛋白免疫细胞化学。鼠胚心肌细胞在胶原细胞载体上培养并在液氮中贮存3周。比例尺为20μm。

图6：冷冻保存的SAOS-2细胞中波形蛋白和BrdU的免疫细胞化学。该细胞在胶原细胞载体上培养并在液氮中贮存230天。解冻后，将细胞与BrdU孵育并进行免疫细胞化学分析。箭头指示BrdU阳性细胞。比例尺为40μm。

发明内容

本发明的第一个主题涉及冷冻保存和长期保存一种或多种类型的细胞、细胞构建体或三维复合组织装配体的方法，包括：

a)将一种或多种类型的细胞或者构成细胞构建体或三维组织装配体的不同类型细胞接种至稳定的胶原细胞载体(CCC)上，所述CCC厚度小于150μm，单位面积质量为10至170g/m²，且组成如下：

i)胶原[重量百分比％]：30至80，

ii)酰胺态氮[重量百分比％]：0.06至0.7，

iii)多元醇[重量百分比％]：0至50，

iv)脂质[重量百分比％]：0至20，

v)水[重量百分比％]：5至40，

b)培养所述细胞，直到其粘附在所述CCC上；

c)洗去未粘附的细胞；

d)在冷冻介质中冷冻带有粘附细胞的所述胶原细胞载体

本发明的冷冻保存方法特别令人感兴趣，因为它允许冷冻粘附细胞或细胞构建体或三维组织装配体，它们在解冻后仍然粘附在CCC上。附着于胶原膜的机械稳定支持物的CCC-细胞装配体或细胞构建体或三维组织构建体可在任何需要的时候解冻，并实时用于其应用或用途中。

在现有技术方法中，冷冻前通常用蛋白酶如胰蛋白酶使粘附细胞从细胞培养表面脱离，通过一系列离心步骤清洗，然后加入冻存介质进行冷冻。在需要时解冻细胞并铺板。其他一些现有技术方法中，细胞在载体内或附着于载体进行冷冻，解冻后从载体表面脱落，通过相同方法进行分离。然而，蛋白酶处理(伴随着对细胞-细胞接触和细胞-基质接触的破坏)和离心和吸打的机械应力都导致细胞存活率降低或细胞损伤。

如本发明方法所述的生长于生物相容性载体膜上的粘附细胞的冷冻保存比细胞分离方法具有更大的优势，即不再需要使细胞脱离其生长表面。该方法提高了解冻后细胞的存活率以及活力。本发明特别适用于敏感细胞(如原代心肌细胞或肝细胞)的冷冻保存。根据本发明方法得到的高存活率还具有可使少量细胞深度冷冻的优势。与最少需要100,000细胞数才能在离心后获得可见细胞团的细胞分离方法相比，这同样适于转移到新鲜培养基中，然后接种。

本发明方法的一个具体变化形式或实施方案包括将一种或多种类型的细胞接种并培养于胶原细胞载体的每个侧面上，以获得其在胶原膜两侧的特定空间构造。该方法的这种变化在开发复合组织构造时可以是有用的。胶原界面为不同细胞的多层细胞体系提供了暂时性支架。具有个体特征的受控细胞层和所产生的功能为复合的“体内样”细胞体系提供了基础。图4描绘了该实施方案的一个例子，其中两种不同类型的细胞(骨髓间质干细胞和Caco-2细胞)各自培养在CCC的一侧。

如前所述，本发明冷冻保存方法的优点很大程度上来自于所使用CCC的特定特性。具有上述特征的CCC提供了空间化学和物理学特性，使其特别适合于细胞培养及其冷冻保存。已观察到本文所述CCC确实在冻融过程后没有表现出任何显著的生物相容性或机械稳定性丧失，即使在长期冷冻保存后也是如此。

CCC的特殊机械特性通过相应胶原膜的制造过程中胶原组合物的晾干而产生。该不可逆过程使其高稳定和强耐久。胶原组合物优选地形成拉伸强度可达约20-100N/mm²的晾干的、稳定且薄的平面膜。图2使用拉伸测试装置UTS软件209.00 V 4.06.04(根据德国工业标准DIN 53 455进行测试)，以外力-应变图显示了CCC的机械行为。图2还显示了该测试所用试验设置。

在需要更强拉伸强度的特定实施方案中，胶原组合物可通过与化学交联剂的交联而获得，所述化学交联剂例如双功能醛如戊二醛、异氰酸酯如六亚甲基二异氰酸酯(HMDI)、碳二亚胺如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)或任何其他本领域已知且不会向最终产品引入不想要的毒性水平的化学交联剂。交联也可通过物理学方法完成，例如干热交联(dehydrothermal crosslinking)或辐射(UV或电离辐射)，或通过酶反应完成，例如使用转谷氨酰胺酶。

为实施本发明方法，胶原膜可存在于任何类型的细胞培养支持物中，如细胞培养板、皿或瓶、微珠。它还可存在于细胞培养板的孔的插入结构或任何其他结构类型中(见图3)。后者允许在实施本发明的实施方案时将不同类型细胞同时培养在CCC的每一侧。

除薄的平面膜构造外，胶原组合物还可形成管状膜以用作细胞贮库。胶原管可在充入液态细胞悬液后被冷冻保存。解冻后，它们可用于将促进再生的细胞悬液转移至体内的组织缺损处。

为了不对冷冻过程产生负影响，本发明方法所用干的胶原膜的厚度总是小于150μm。在本发明的一个优选实施方案中，干CCC的厚度小于80μm；在另一优选实施方案中，厚度等于或小于40μm。小的壁厚度允许冷冻保护剂迅速渗透，解冻后也实现其快速洗出。

来自任何动物来源的任何类型纤维胶原均可用于制备本发明方法所用的CCC。尽管如此，本发明一个优选实施方案包括使用来自牛皮或牛革的I型牛胶原。另一些特定实施方案包括I型和III型胶原的混合物或者I型和/或III型胶原与弹性蛋白的混合物。

本发明方法所用胶原组合物的一个重要组分为多元醇。它发挥湿润剂作用，防止CCC的不当干燥。虽然膜在制备过程中被晾干，但便利的是，它仍保持一定的湿度使其不致变得易碎。许多不同的多元醇可用于本发明的情况，如甘油、乙二醇、丁烯二醇类(butene diols)、丙二醇类(propenediols)、山梨醇或其他己糖醇、木糖醇或其他戊糖醇，及其混合物。优选的实施方案包括使用甘油或山梨醇或其混合物。

CCC的另一组分可以为脂肪。优选地，所用脂肪基本为植物来源。植物油的使用提高了胶原膜的弹性。

本发明的一个具体的优选实施方案的代表是这样的CCC，其在干燥状态下厚度为20μm、单位面积质量为25至35g/m²，并且组成如下：

胶原[重量百分比％]：50至70，

酰胺态氮[重量百分比％]：0.14至0.4，

甘油[重量百分比％]：12至35，

脂肪[重量百分比％]：1至5，

山梨醇[重量百分比％]：0至20，

水[重量百分比％]：5至40，

虽然不是实施本发明方法的必要特性，但CCC任选地可用不同类型分子在其表面进行修饰。例如，CCC可包被有细胞外基质的结构蛋白，如层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白或透明质酸，也可包被有磷灰石或诸如生长因子、细胞因子、导向分子(guidance molecule)或抗体的功能性分子。这些因子可影响细胞活力、细胞粘附、细胞取向、细胞增殖和细胞分化。

培养细胞使其粘附的具体条件可根据细胞类型而改变。对所有细胞来说都很重要的是，它们都在保证细胞不会变干的营养培养基或营养气氛中以浸没条件培养。此外还需要细胞特异性气氛和使细胞能够附着于其上的生物相容性表面，如本发明所用CCC的Tehone。通常需要营养培养基、原核和真核细胞特异性气氛和特定的温度。各细胞在CCC上的细胞培养基和培养条件与常规细胞培养中相同。

在冷冻之前，用缓冲溶液进行一次或多次清洗步骤，以洗去未粘附细胞。

细胞-CCC装配体或细胞构建体或三维组织装配体在CCC中的冷冻在冷冻保存介质存在下进行。这通常包括补充有冷冻保护剂如二甲亚砜(DMSO)、海藻糖、甘油或羟乙基淀粉(HES)的介质。本发明的优选实施方案包括在冷冻保存方法中使用DMSO。冷冻通常在液氮中进行，但也可使用其他已知方法和/或冷冻方案。

本发明方法已在非常广泛的真核或原核细胞(无论是否经过基因改造)范围的冷冻保存中获得成功。

在真核细胞中，若干动物、植物或真菌细胞已成功进行了培养和深度冷冻。在原核细胞中，若干菌种也已在解冻后表现出活力。

本发明的冷冻保存方法特别适合于哺乳动物细胞，无论是原代细胞或是永生化细胞系。

以下是可用于本发明冷冻保存方法的细胞类型：

a)干细胞(胚胎、胎儿、新生儿、成体)及其祖细胞

-胚胎干细胞系

-诱导的多能干细胞

-精原干细胞

-生殖干细胞(germ stem cell)

-间充质干细胞

-内皮干细胞

-造血干细胞

-神经干细胞

-神经嵴干细胞

-胃肠道干细胞

b)体细胞

-内皮细胞

-来自胃和肠的上皮细胞

-乳腺上皮细胞

-黑色素细胞

-肺上皮细胞

-肾上皮细胞

-角质形成细胞

-尿路上皮细胞

-肝细胞

-角膜细胞

-晶状体细胞

-成骨细胞

-骨细胞

-成牙本质细胞

-软骨细胞

-韧带细胞

-腱细胞

-腺体细胞(垂体腺细胞、唾液腺细胞、肾上腺细胞、胰腺外分泌和内分泌细胞、睾丸间质细胞(Leydig cell))

-脂肪细胞

-成纤维细胞

-视网膜细胞

-神经元(多巴胺能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、肾上腺素能神经元)

-神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞、施旺细胞)

-平滑肌细胞

-骨骼肌细胞

-心肌细胞

-免疫细胞(B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞、M-细胞或小胶质细胞)

c)基因改造的细胞

d)癌细胞系

-HeLa，腺癌，人宫颈

-CCF-STTG1，星形细胞瘤，人脑

-Hep G2，癌，人肝细胞

-SK-MEL-5，黑色素瘤，人恶性皮肤

-Saos-2，成骨肉瘤细胞，人骨

-WERI-Rb-1，视网膜母细胞瘤，人视网膜

e)永生化细胞系

-NuLi，人支气管上皮

-CuFi，人支气管上皮

-CHON-001，人骨软骨成纤维细胞

-BJ-5ta，人包皮成纤维细胞

-hTERT-HME1(ME16C)，人乳腺上皮

-hTERT-HPNE，人胰管上皮样

-hTERT RPE-1，人视网膜色素上皮

-NeHepLxHT，人肝上皮样

-T HESCs，人子宫内膜成纤维细胞样杂交瘤细胞系

f)植物细胞

-Brownanthus corallines

-Carpanthea pomeridiana

-Conophytum meyerae

-Delosperma ecklonis

-海马齿(Sesuvium portulacastrum)

-Sphalmanthus trichomotus

-反枝苋(Amaranthus retroflexus)

-Pleuropetalum darwinii

-石蒜科(Amaryllidaceae)

-Crinum×powellii hort.

-Catharanthus longifolius

-Dictyophleba leonensis

-Ervatamia coronaria

g)真菌细胞

丝状真菌

-Dacrymyces deliquescens

-Fennellomyces linderi

-短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleeana)

-Tolypocladium inflatum

-Radiomyces spectabilis

-Wallemia sebi

-Lophodermium seditiosum

酵母

-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

-白念珠菌(Candida albicans)

-Debaromyces japonicas

-Fellomyces polyborus

-Brettanomyces abstinens

-Hyphopichia burtonii

-Kloeckera brevis

h)细菌

-Acidobacterium capsulatum

-大肠杆菌(Escherichia coli)

-嗜热糖球菌(Saccharococcus thermophilus)

-嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)

-苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

-绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

-粪肠球菌(Enterococcus faecalis)

本发明的另一主题为可通过本发明方法获得的冷冻的CCC-细胞装配体或冷冻的人工细胞构建体或冷冻的三维复合组织装配体。它们代表了可长期贮存并在需要时“实时”提供的细胞、细胞构建体或组织装配体的潜在且近乎恒久的来源。该复合材料在解冻后保持其三维组织方式，保证细胞固定在需要的位点上。

最后，本发明的另一个主题为可通过本发明方法获得的冷冻的CCC-细胞装配体或冷冻的人工细胞构建体或冷冻的三维复合组织装配体在解冻后的用途。

第一个应用包括将胶原载体-细胞装配体、人工细胞构建体或三维复合组织装配体在解冻后用于再生医学中，即用于细胞或受损组织的体内植入。体内植入研究已表明，CCC是生物相容性的，且不会触发受者的免疫反应。这一点同机械稳定性和减少的厚度一起，使得这些解冻的产品作为动物和人类不同临床应用中的细胞定殖植入物特别有前景。冷冻保存允许提前产生植入物并在移植时“实时”将其解冻。

CCC的高机械稳定性(甚至在解冻后)也提供了对移植情况下最初阶段的保护和稳定作用，直至其被周围组织再吸收。

为避免或减少植入受者中任何可能的免疫反应，冷冻/解冻的植入物优选地包含自体细胞而非异源细胞。

第二个应用包括将胶原载体-细胞装配体、人工细胞构建体或三维复合组织装配体在解冻后用于体外测试系统中。它们可用于基础研究应用中，或用作药理学物质、化学品或化妆品的测试系统，使得可以分析细胞活性物质而无需进行动物试验。一种已建立的公知的药理学物质或化妆品测试系统为皮肤模型。当然，该模型可根据本发明方法再现和冷冻。

如本发明所述，将复合细胞装配体与其载体基质一起冷冻/解冻而同时保存其三维结构的可能性开辟了制药业或生物技术产业应用中的新选择。根据本发明制备的冷冻保存的测试系统可进行运送而不会有任何污染或因运输过程中培养条件波动而造成细胞活力降低的风险。

以下具体实施例旨在阐释本发明，而不认为是对本发明范围的限定。

实施例1.制备胶原细胞载体

1.1生产本发明的平面膜

将50.0kg牛内层皮(hide split)经机械预切割后用水清洗三次(3×50kg)。随后将原材料置于0.29kg氢氧化钙的50kg水悬液(pH值为11.8)中进行碱处理，持续150小时。通过加入盐酸(水中的重量比为10％)直至悬液的pH值达到0.6来终止碱处理。然后再用水漂洗反应混合物直至悬液达到pH 2.8。随后将所得“胶原壳”在温度控制(＜24℃)下机械加工成凝胶状粘弹性团块，这通过粗研磨并将破碎的材料压过一系列有孔盘(其孔径依次递减)来实现。产量为78.1kg“浓缩”胶原团块。

取60.0kg所述“浓缩”团块，转移至装有搅拌器和冷却套的容器中。在搅拌条件下加入水(376.4kg)和甘油(2.15kg)。同时，用盐酸调节pH值至2.9。随后使混合物经过匀浆器，除去气体，之后从狭缝喷嘴中挤出至传送带上，在所述传送带上使得到的凝胶膜通过隧道式干燥器。在进入干燥器之前，用氨气中和凝胶膜，从而提高凝胶的pH值。在干燥器末端，经干燥的膜经过再水化区域后被卷起来。

1.2生产本发明的管状膜

“浓缩”团块以类似于1.1所述方法制造，但碱处理过程的持续时间降至48小时。取60.0kg所得“浓缩”胶原团块，转移至捏合机中，在严格温度控制(＜24℃)下逐渐加入水(36.0kg)在捏合过程中进行稀释。与此同时，调节胶原团块的pH值至2.8。使所得面团状物经过匀浆器，然后在20℃存放过夜以使其松弛。次日，将所得胶原团通过环形喷嘴挤出，由此产生连续的管状膜。为防止管塌陷并中和胶原，从挤出头处将空气与氨气的混合物注入管中。然后使充气的管状膜通过一系列(水)冲洗喷淋，在最后一次喷雾浴中以4％甘油水溶液进行喷淋。最后，使得到的管状膜通过隧道式干燥器，在干燥器末端将其平放在橡胶刷(squeegee)之间，绕于卷筒上。使用不同的挤出头将1.2部分中所述过程进行两次，以产生一种直径为60mm、另一种直径为115mm的管状膜。

所得管状膜的一部分被切开后产生平面膜。

1.3调节pH值

由1.1或1.2所述方法得到的平面或管状膜在脱离挤出流水线后在实验室中进行pH值调节，通过使用含有钙和镁的磷酸盐缓冲液(含有Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的磷酸盐缓冲液(PBS)，(PAA H15-001))调节至pH 7.2～pH 7.5的生理范围。为达到这一目的，将相应的胶原膜在搅拌条件下用该缓冲体系冲洗5天。每天两次更换缓冲液。

另一种操作程序中，将根据1.1或1.2所述方法得到的胶原膜在含有甘油的pH值为7.3的磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液：15.6g KH₂PO₄，71.3g Na₂HPO₄×2H₂O和492.9g甘油，溶于7722g蒸馏水中)中浸泡1小时。然后，使经处理膜的水分流干，置于拉伸框中，在室温下过夜干燥。

1.4进一步的任选处理

在蒸馏水中短暂平衡后，将胶原膜用100％丙酮处理，以沉淀水溶性蛋白级分。除去丙酮后，将干燥的膜用含钙和镁的磷酸盐缓冲液(以g/L计：KCl 0.2，KH₂PO₄ 0.2，NaCl 8.0，无水Na₂HPO₄ 1.15，溶于H15-001的CaCl₂-2H₂O 0.132，溶于H15-001的MgCl₂-2H₂O 0.1)清洗3次，每次1小时。为消除缓冲液中的盐，将所得膜再用蒸馏水清洗3次，每次1小时。

1.5成形与灭菌

将通过上述任何操作流程(1.1-1.4)所得干燥的胶原平面膜或管状膜以任意方式切割，或冲压成与膜尺寸相容的任意形状或大小的片。然后将所得片通过β或γ射线以25kGy或50kGy进行消毒。干燥的管状膜也被切割成多份并以同样方式进行照射。

下表显示了根据实施例1.1和1.2得到的一些典型膜的参数。

^*--＝未测定

应用以下分析方法：

进行以下定量：通过测定羟脯氨酸来定量胶原/定量酰胺态氮类似物EP1676595(Geistlich

AG)/通过HPLC定量甘油/通过索氏提取(soxhlet extraction)定量脂肪/通过HPLC定量山梨醇/在马弗炉中600℃焚烧5小时后进行灰分重量分析/在干燥箱中150℃干燥后进行水分重量分析/pH值，将膜剪成小片，插入5％NaCl溶液中，10分钟后用玻璃电极测定/单位面积质量，以平衡湿度称重10cm×10cm小块膜/纵向(＝机内方向)和横向拉伸强度，UTS通用测试机(3/205型UTS TestsystemeGmbH)在空调控制21℃条件下/冲压样品本体60％相对湿度和100mm/分钟的移动速度。

实施例2：粘附原代心肌细胞的冷冻保存

培养的干细胞和/或原代心脏细胞(如心肌细胞)的成功冷冻保存是未来心血管疾病领域中基于细胞治疗的先决条件。

与冷冻单细胞悬液相比，在生物相容性支架上粘附培养的原代心肌细胞的冷冻保存提供了在细胞存活、细胞组织性和细胞生物功能方面的若干优势。

为评估粘附原代心肌细胞的冷冻保存，从胎儿小鼠(E15)中分离心脏细胞，并在根据实施例1(见图5)制备的胶原细胞载体上培养。随后，将接种有细胞的支架在液氮中冷冻3周，在解冻后进行分析。

胎儿小鼠心脏在Hanks平衡缓冲盐溶液(PAA，Pasching，Austria)中制备和收集。将心室分离后置于含0.05％(w/v)DNase I(Sigma，Frickenhausen，Germany)和0.2％(w/v)木瓜蛋白酶(Sigma)的木瓜蛋白酶消化液(DMEM/F12，PAA)中在37℃下孵育30～60分钟。孵育过程中，每隔15分钟用烧圆的蓝色吸头将组织小心地磨碎。为中止酶促反应，加入马血清至终浓度为10％(v/v)。然后，用烧圆的黄色吸头磨碎心室组织以获得单细胞悬液。所得细胞悬液在200g下离心5分钟，残留的细胞团用补充有10％(v/v)FCS的DMEM/F12培养基重悬。第二次离心步骤后，用血细胞读数器通过台盼蓝染色测定细胞数和细胞活力。然后，将心肌细胞以每平方厘米20,000～100,000个细胞的密度接种在如实施例1所述制备的胶原细胞载体上，在37℃和5％CO₂条件下的湿润培养箱中培养7天。培养基每3天更换一次，由以下成分组成：DMEM/F12(PAA)、10％成年马血清(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)、青霉素(100U/ml，PAA)、链霉素(100μg/ml、PAA)、L-谷氨酰胺(2mM，PAA)、胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸盐混合物(1∶100，Invitrogen)、Albumax(1mg/ml，Invitrogen)、氢化可的松(1μM，Sigma)、胰高血糖素(14.3nM，Sigma)、3，3′，5′-三碘-l-甲腺原氨酸(1nM，Sigma)、抗坏血酸-2-磷酸(200μM，Sigma)、亚油酸(20μM、Sigma)、雌二醇(10nM，Sigma)。在上述培养条件下，粘附的心肌细胞显示出自主搏动能力。

为进行冷冻保存，将接种有细胞的支架转移至冻存管(Nalge NuncInternational Corp.，Roskilde，Denmark)中，并将培养基换成冷冻介质(以HEPES缓冲的DMEM培养基，补充有青霉素/链霉素、20％(v/v)FCS和10％(v/v)DMSO(Sigma))。含有支架的冻存管用标准的冷冻容器(“Mr.Frosty”，Nalge Nunc International Corp.，Roskilde，Denmark)进行冷却。冷却、贮存和解冻过程均依据制造商推荐操作进行。

接种有细胞的支架在低于-150℃的液氮中贮存22天。然后解冻构建体并用预温热的培养基清洗3次。在解冻后的前两天中，培养的心肌细胞开始其自主细胞收缩。解冻后的接种有细胞的胶原细胞载体的收缩能力(每分钟收缩26次)通过视频显微镜进行记录。

这是本领域中第一次提到，接种于胶原细胞载体上的心肌细胞在经历冷冻保存及随后解冻过程之后重新开始其自主细胞收缩。

实施例3：粘附SAOS-2细胞的长期冷冻保存

为分析粘附细胞的长期冷冻保存，将骨肉瘤细胞系SAOS-2在根据实施例1制备的胶原细胞载体上进行培养，并在液氮中保存230天。解冻后，通过细胞增殖测定来分析粘附细胞。

将SAOS-2细胞以每平方厘米25,000个细胞的密度接种于实施例1所述胶原细胞载体上，在湿润的保温箱中37℃和5％CO₂条件下培养3天。培养基由补充有青霉素/链霉素和10％(v/v)FCS的以HEPES缓冲的DMEM培养基(PAA)组成。为进行冷冻保存，将这些接种有细胞的支架转移至冻存管中，并将培养基换成冷冻介质(以HEPES缓冲的DMEM培养基，补充有青霉素/链霉素、20％(v/v)FCS和10％(v/v)DMSO(Sigma))。将含有胶原细胞载体的冻存管用标准的冷冻容器(“Mr.Frosty”，Nalge Nunc International Corp.)进行冷却。冷却、贮存和解冻过程均依据制造商推荐操作进行。

将接种有细胞的支架在低于-150℃的液氮中贮存230天。然后解冻构建体，用预温热的培养基清洗3次，再培养4天。为分析解冻细胞的增殖能力，依据制造商推荐操作进行溴脱氧尿苷(BrdU)增殖测定(Roche，Mannheim，Germany)。因此，将粘附的SAOS-2细胞在BrdU(10μM)中孵育1小时，用冰冷的70％(v/v)乙醇固定并用BrdU免疫荧光染色。BrdU阳性细胞的定量结果显示，在1小时的培养时间内，41％±7的总细胞群体在细胞周期的S期中掺入了BrdU(见图6)。

该数据表明，接种于胶原细胞载体的粘附细胞即使在长期冷冻保存后依然保持其高水平的增殖能力。

实施例4：比较多种胶原基质在SAOS-2细胞培养中的性能

Rothamel等人(2003 Clin.Oral Imbl.Res.15：443-449)报道了市售胶原膜在细胞培养实验中的不同性能。更具体地，他们将SAOS-2细胞(200个/mm²)接种于4种不同的胶原膜上，培养7天后对膜上的细胞进行计数。所得结果总结如下：

^*方法细节参见原始参考文献

与在经细胞培养基处理的塑料上进行的培养以及接种细胞的原始数量相比，所研究的胶原膜上的细胞数极低(0％-21％)。此外，报道中称细胞形状呈圆形，表明其对基质的粘附效率低。

为评估另一种市售胶原细胞载体“Collagen vitrigel”(Asahi GlassCo.，LTD.，Tokyo，Japan)的性能，将SAOS-2细胞接种(250个/mm²)于该胶原膜上，根据产品说明书的指示培养6天(n＝4)。

与经细胞培养基处理的塑料相比，在“Collagen vitrigel”上的培养也导致了细胞数的显著降低(46％)。与此同时观察到细胞也呈圆形，该基质看来使粘附细胞粘附和扩增的能力有限。

在一个类似试验中，将SAOS-2细胞接种(250个/mm²)于构成本发明冷冻保存方法一部分的胶原细胞载体(CCC)。培养4天后，获得以下数据(n＝6)：

与经细胞培养基处理的塑料相比，培养4天后CCC上的细胞数仅稍低(85％)。显微镜下细胞呈平坦、伸展的形状，证实CCC基质提供了促进粘附依赖性细胞附着和扩增的极佳环境条件。

总之，结果表明，不同胶原基质在细胞培养方面的性能存在巨大差异。具有实施例1所述具体特征的胶原细胞载体(CCC)的使用代表了与其他胶原基质相比在细胞培养方面的显著提高。其作为冷冻保存介质的应用与现有技术相比代表了显著的方法学改进。

实施例5：“Collagen vitrigel”(Asahi Glass Co.，LTD.，Tokyo，Japan)在冷冻保存实验中的应用

将SAOS-2细胞以25.000个/mm²的密度接种于称为“Collagenvitrigel”(Asahi Glass Co.，LTD.，Tokyo，Japan)的胶原基质上，在湿润的培养箱中37℃和5％CO₂条件下培养4天。培养基由补充有1％青霉素/链霉素、1％L-谷氨酰胺和10％(v/v)FCS的以HEPES缓冲的DMEM培养基(PAA)组成。为进行冷冻保存，将接种有细胞的支架从其塑料支架环上切下，转移至冻存管中。后续操作与实施例3中所述类似。接种有细胞的支架在低于-150℃的液氮中贮存8天。然后解冻构建体，用预温热的培养基清洗3次，再培养3天。清洗后在上清液中发现984.000个死细胞和112.600个活细胞。用BrdU和DAPI进行的免疫组织化学染色表明，细胞均不再粘附在细胞载体上。

通过将实施例2和实施例3的结果与实施例5所得结果进行比较，本文所述冷冻保存方法(尤其是包括胶原细胞载体)的优越性变得更为明显。

Claims

1.用于对一种或多种类型的细胞、细胞构建体或三维复合组织装配体进行冷冻保存和长期存储的方法，其包括：

a)将一种或多种类型的细胞或者构成所述细胞构建体或三维组织装配体的不同类型细胞接种至稳定的胶原细胞载体上，所述胶原细胞载体的厚度小于150μm，单位面积质量为10至170g/m²，并具有以下组成：

i)胶原[重量％]：30至80，

ii)酰胺态氮[重量％]：0.06至0.7，

iii)多元醇[重量％]：0至50，

iv)脂质[重量％]：0至20，

v)水[重量％]：5至40，

b)培养所述细胞直到其粘附在所述胶原细胞载体上；

c)洗去未粘附的细胞；

d)在冷冻介质中冷冻带有粘附细胞的所述胶原细胞载体。

2.根据权利要求1的方法，其中形成期望的细胞构建体或三维组织装配体的一种或多种类型细胞被接种在所述胶原细胞载体的两侧。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述胶原细胞载体中的胶原是交联的。

4.根据权利要求1或2的方法，其中所述胶原细胞载体的厚度小于80μm或小于40μm。

5.根据权利要求1或2的方法，其中所述胶原为I型胶原或者I型胶原与III型胶原的混合物或者I型和/或III型胶原与弹性蛋白的混合物。

6.根据权利要求1或2的方法，其中所述多元醇选自甘油、乙二醇、丁烯二醇类、丙二醇类、山梨醇或其他己糖醇、木糖醇或其他戊糖醇及其混合物。

7.根据权利要求1或2的方法，其中所述脂质为植物油。

8.根据权利要求1或2的方法，其中所述胶原细胞载体可包被有细胞外基质的结构蛋白，优选层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白或透明质酸，或者包被有磷灰石或者选自生长因子、细胞因子、导向分子或抗体的功能性分子。

9.根据权利要求1或2的方法，其中所述冷冻介质包含二甲亚砜(DMSO)、海藻糖、甘油或羟乙基淀粉(HES)。

10.根据权利要求1或2的方法，其中所述粘附细胞为真核或原核细胞，或经基因改造的真核或原核细胞。

11.根据权利要求10的方法，其中所述真核细胞为植物细胞、动物细胞或真菌细胞。

12.根据权利要求11的方法，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞，原代细胞或永生化细胞均可，优选地为人细胞。

13.根据权利要求10至12中任一项的方法，其中所述细胞选自：干细胞，如非人胚胎干细胞系、诱导的多能干细胞、精原干细胞、生殖干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、造血干细胞、神经干细胞、神经嵴干细胞或胃肠道干细胞；体细胞，如内皮细胞、来自胃和肠的上皮细胞、乳腺上皮细胞、黑色素细胞、肺上皮细胞、肾上皮细胞、角质形成细胞、尿路上皮细胞、肝细胞、角膜晶状体细胞、成骨细胞、骨细胞、成牙本质细胞、软骨细胞、韧带细胞、腱细胞、垂体腺细胞、唾液腺细胞、肾上腺细胞、胰腺外分泌和内分泌细胞、睾丸间质细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、多巴胺能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、肾上腺素能神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、施旺细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞、M-细胞或小胶质细胞；基因改造的细胞；癌细胞系如HeLa、CCF-STTG1、Hep G2、SK-MEL-5、Saos-2或WERI-Rb-1；永生化细胞系如NuLi、CuFi、CHON-001、BJ-5ta、hTERT-HME1(ME16C)、hTERT-HPNE、hTERT RPE-1、NeHepLxHT或HESCs；植物细胞如来自Brownanthus corallinus、Carpanthea pomeridiana、Conophytum meyerae、Delosperma ecklonis、海马齿(Sesuviumportulacastrum)、Sphalmanthus trichomotus、反枝苋(Amaranthusretroflexus)、Pleuropetalum darwinii、石蒜科(Amaryllidaceae)、Crinumx powellii hort.、Catharanthus longifolius、Dictyophleba leonensis或Ervatamia coronaria的细胞；真菌细胞如Dacrymyces deliquescens、Fennellomyces linderi、短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleeana)、Tolypocladium inflatum、Radiomyces spectabilis、Wallemia sebi、Lophodermium seditiosum、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白念珠菌(Candida albicans)、Debaromyces japonicus、Fellomyces polyborus、Brettanomyces abstinens、Hyphopichia burtonii或Kloeckera brevis；细菌细胞如Acidobacterium capsulatum、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热糖球菌(Saccharococcus thermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。

14.可通过权利要求1或2的方法获得的冷冻的胶原细胞载体-细胞装配体或冷冻的人工细胞构建体或三维复合组织装配体。

15.解冻的根据权利要求14所述胶原载体-细胞装配体、人工细胞构建体或三维复合组织装配体，其用于再生医学。

16.解冻的根据权利要求14所述胶原载体-细胞装配体、解冻的人工细胞构建体或三维复合组织装配体用于基础研究或用于体外测试系统的用途，如用于药理学物质、化学品或化妆品的测试系统。