JP4896516B2 - 組織切片チップとこれを用いた解析データベースの作成方法および細胞または組織の特性診断システム - Google Patents
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Description
<1>生物組織を薄切した特性既知の組織切片からなる切片培養担体が、支持体に付着または付着伸展されているとともに、この支持体に前記切片培養担体の付着および微細構造の位置を計測する標識が付与されている組織切片チップを用いた解析データベース作成方法であって、解析対象の試料となる特性未知の細胞を前記組織切片チップに播種して培養し、この細胞の組織切片チップにおける位置情報を観察手段で観察して位置画像データとして取得してコンピュータに送るとともに、細胞の挙動を観察手段で経時的に観察して挙動画像データとして取得してコンピュータに送り、送られてきた位置画像データと挙動画像データを基に、細胞と組織切片チップの切片培養担体との間の相互作用をコンピュータによって解析して蓄積用解析データとして蓄積することを特徴とする解析データベースの作成方法。
<2>生物組織を薄切した特性未知の組織切片からなる切片培養担体が、支持体に付着または付着伸展されているとともに、この支持体に前記切片培養担体の付着および微細構造の位置を計測する標識が付与されている組織切片チップを用いた解析データベース作成方法であって、特性既知の細胞を前記組織切片チップに播種して培養し、この細胞の組織切片チップにおける位置情報を観察手段で観察して位置画像データとして取得してコンピュータに送るとともに、細胞の挙動を観察手段で経時的に観察して挙動画像データとして取得してコンピュータに送り、送られてきた位置画像データと挙動画像データを基に、細胞と組織切片チップの切片培養担体との間の相互作用をコンピュータによって解析して蓄積用解析データとして蓄積することを特徴とする解析データベースの作成方法。
<3>播種される細胞の挙動が、培養時間に比した接着の度合い、増殖の度合い、分化の度合いおよび形態変化の度合いの少なくとも1つ以上である前記<1>または<2>に記載の解析データベースの作成方法。
<4>播種される細胞が、正常細胞または異常細胞である前記<1>から<3>に記載の解析データベースの作成方法。
<5>前記<1>から<4>いずれかに記載の方法によって作成された解析データベースを用いた細胞または組織の特性診断システムであって、播種された細胞の挙動を観察手段で経時的に観察して挙動画像データとして取得し、この挙動画像データをデータベースにフィードバックするとともに、データベースに蓄積されている特性既知の細胞または組織の解析データとコンピュータで照合し、解析することを特徴とする細胞または組織の特性診断システム。
本願発明の切片培養担体を診断システム等に展開していくため、ラットインスリノーマ細胞(RIN5F)とヒト肝癌細胞株HepG2の2種類の細胞を利用して、各種臓器に由来する切片培養担体上で培養し、その挙動を評価した。
1. 各種臓器からの切片培養担体の作成
図3は、各種臓器から切片培養担体を作成する概略を例示した模式図である。
(1) 上記各種の臓器を摘出して、凍結保存した。
(2) 凍結した臓器を薄切(厚さ5μm)して、カバーグラスに伸展した。
(3) 次いで、温度10℃および湿度40%で、12時間の風乾を行うことで、切片培養担体とした。
(4) これら切片培養担体を、24wellプレートに入れて使用した。
2. 切片培養担体への細胞の播種・培養、解析
切片培養担体へ播種・培養する細胞として、ラットインスリノーマ細胞(RIN5F)および肝癌細胞(HepG2)それぞれを使用し、検討した。
<A> ラットインスリノーマ細胞(RIN5F)における検討
図4に、細胞の播種・培養および解析の概略を模式的に例示した。なお、本実施例においては、コントロールとして、プラスティックおよびカバーグラス(APSカバーグラス)を培養担体として用いた。
(1) まず、上記各種臓器由来の切片培養担体上に、それぞれ培養細胞として、インスリンを分泌するラットインスリノーマ細胞(RIN5F)を2×105 cells/cm2で播種し、培養した。
(2) 生細胞を判別するためにカルセイン AM (Molecular Probes#C-3099)による染色を行った。カルセイン AMは細胞膜透過性で、細胞内エステラーゼの作用でカルセインを発現する。
(3) 具体的には、2日おきに培地交換を行いながら、培養2日後、4日後および6日後の培養上清を回収して、レビスインスリンキット(シバヤギ#AKRIN-010)を用いて、メーカーのプロトコールに従って培養液中のインスリン量を測定した。
<B> ヒト肝癌細胞(HepG2)における検討
図10に、細胞の播種・培養および解析の概略を模式的に例示した。基本的な解析方法、手順は、上記RIN5F細胞と同様である。なお、コントロールとして、プラスティックプレートおよびカバーグラスをそれぞれ培養担体として用いた。
(1) まず、上記各種臓器由来の切片培養担体上に、培養細胞としてヒト肝癌細胞株(HepG2)を4.5×104cells/cm2で播種し、培養した。
(3) また、培養2日後、4日後および6日後における増殖を評価した。具体的には、上記と同様に、カルセイン陽性細胞から細胞面積を算出した。
(4) なお、培養2日後および4日後にて、培養液の交換を行った。培養液は、10%牛胎児血清、20mM HEPES、100units/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地 (GIBCO#11875-093)を用いた。
3. 測定結果
<A> ラットインスリノーマ細胞(RIN5F)の検討結果
上記測定結果を図5〜図8に示した。また、図9(A)(B)にインスリン量測定の概略を例示した。
(1) 図5は、各臓器からの作成した切片培養担体上でのRIN5F細胞の経時形態変化を、HE染色によって観察した結果である。図5に示したとおり、各切片培養担体いずれにおいても、RIN5F細胞は、時間経過とともに細胞形態が異なる、すなわち成長することが確認できた。
(2) 図6は、各種臓器由来の切片培養担体に対する、RIN5F細胞の初期接着率を示したグラフ図である。図6に示したとおり、特に、大脳および肝臓由来の切片培養担体において、初期細胞接着率が高いことが確認できた。
(3) 図7は、各種臓器由来の切片培養担体上でのRIN5F細胞の増殖率を示したグラフ図である。図7に示したとおり、各切片培養担体ではRIN5細胞の増殖速度が異なることが確認された。具体的には、例えば、胸腺および再生肝由来の切片培養担体においては、RIN5Fの細胞増殖の抑制が見られたが、その他の切片培養担体においては、速度が異なるものの、細胞増殖が確認された。
(4) 図8は、各種臓器由来の切片培養担体上でのRIN5F細胞のインスリン産生能を示したグラフ図である。図8に示したように、肝臓および膵臓(頭部)を除く、各臓器由来の切片培養担体上では、6日目まで産生能を維持し、特に、4日目以降では再生肝、胸腺および精巣由来の切片培養担体上で、インスリン産生能が増強されることが確認できた。
で算出することができる。
(5) 以上の結果を、表1にまとめた。
<B> 肝癌細胞(HepG2)の検討結果
測定結果を図11および図12に示した。
(1) 図11は、各種臓器由来の切片培養担体に対する、HepG2細胞の初期接着率を示したグラフ図である。図11に示したとおり、HepG2細胞では、精巣由来の切片培養担体上で最も細胞接着が良好であり、RIN5F細胞とは異なって、胸腺由来の切片担体上でHepG2細胞の初期接着が良好であった。また、RIN5F細胞の接着率が高い膵臓由来の切片担体上ではHepG2細胞の初期接着率は低かった。RIN5F細胞と同様に、HepG2細胞もそれぞれ臓器由来の切片上で初期接着、および形態が異なった。
(2) 図12は、各種臓器由来の切片培養担体上でのHepG2細胞の増殖率を示したグラフ図である。播種後2日、4日および6日目に細胞の増殖について評価したところ、図12に示したとおり、膵臓由来の切片培養担体上ではRIN5F細胞は増殖するのに対し、HepG2細胞はほとんど増殖が見られなかった。また、胸腺由来の切片培養担体上では、RIN5F細胞の増殖は抑制されるが、HepG2細胞は増殖していた。RIN5F細胞と同様に、HepG2細胞もそれぞれ臓器由来の切片上で成長の速度が異なった。
(3) 以上の結果を表2にまとめた。
4. RIN5F細胞とHepG2細胞それぞれの細胞挙動における比較検討
以上の結果から、RIN5F細胞とHepG2細胞は、同じ臓器由来の切片培養担体上であっても、それぞれ異なる挙動を示した。さらに、同一の細胞でも異なる切片培養担体上では、細胞挙動が異なることが示された。
実施例2:肝再生モデルマウスの肝組織由来の切片培養担体における解析
肝再生モデルマウスの肝組織から切片培養担体を作成し、さらに解析を行った。
1. 実験手順
図13は、本実施例の概略を例示した模式図である。
(1) 溶媒としてオリーブオイルを使用した四塩化炭素(CCl4)をマウスの腹腔内に投与して、軽度の肝障害を惹起させ、肝再生モデルマウスを作成した。
(2) この肝再生モデルマウスの再生過程における肝組織より、組織切片チップ(切片培養担体)を作成した。肝組織は、オリーブオイルのみ投与(24 h:肝再生モデルのコントロール)、CCl4投与8時間後(8 h)、投与24時間後(24 h)、投与2日後(2 d)、投与4日後(4 d)、投与8日後(8 d)、投与15日後(15 d)それぞれを使用した。また、コントロールとして、カバーグラスのみからなる担体も用意した。本実施例における切片培養担体の作成手順や条件は、上記実施例1と同様であるが、切片培養担体を伸展する支持体にスライドグラスを用いた。
(3) 次いで、作成した切片培養担体上に、ALB-ES細胞を播種して、培養した。培養条件は、まず、ALB-ES細胞を有血清培養液で培養し、細胞播種2時間後に、無血清培養液に交換して、培養した。
(4) そして、経時的に観察して、切片培養担体に接着したALB-ES細胞の面積およびGFP陽性を呈したALB-ES細胞の面積をNIH Image 1.63ソフトウェアで測定し、ALB-ES細胞が切片培養担体上でGFP陽性細胞に分化する過程の接着率、増殖性、分化効率を解析した。さらに、GFP陽性細胞の形態学的特徴と、分子生物学的性質を解析した。
2. 実験結果
(1) 細胞播種前の切片培養担体の解析
障害(細胞壊死領域)の解析手段として、HE染色およびHoechst 33342染色を行った(図14(A))。また、肝臓における細胞増殖を増殖細胞核抗原(PCNA)陽性細胞数から、CCl4投与4日後(4 d)の切片培養担体がもっとも高い数値を示した(図14(B))。これらを基に、図14(C)に、障害の進行と、再生の進行状況を例示した。
(2) 切片培養担体上でのALB-ES細胞の接着率
切片培養担体上におけるALB-ES細胞の培養24時間後の接着率について、位相差顕微鏡で観察した。結果は、図15(A)に示したように、CCl4投与4日後(4 d)の切片培養担体において、もっとも顕著に細胞が付着していることが確認できた。
(3) 切片培養担体上でのALB-ES細胞の増殖性
経時的に同一視野の観察像を取得して、各切片培養担体上のALB-ES細胞の面積をNIH Image 1.63で測定した。
(4) ALB-ES細胞のGFP陽性細胞への分化効率
ALB-ES細胞を各切片培養担体上に播種し、培養24時間後を蛍光顕微鏡で観察した。
(5) CCl4投与4日後(4 d)の切片培養担体の作用効果
以上の結果をまとめると、ALB-ES細胞は、コントロールあるいは障害進行過程の肝組織より作製した切片培養担体上では、培養初期の接着率が低く、GFP陽性細胞も殆ど認められなかった。
実施例3:CCl4-4d切片培養担体における解析
上記実施例2から、CCl4投与4日後(4 d)の切片培養担体(以下、CCl4-4d切片培養担体とする)が、もっとも優れた作用効果を有していることが確認できた。
(1) CCl4-4d切片培養担体上のGFP陽性細胞の経時観察
CCl4-4d切片培養担体上にALB-ES細胞を播種して、培養8時間後、16時間後、24時間後、7日後および13日後で、経時観察を行った。
(2) CCl4-4d切片培養担体上の各GFP陽性細胞コロニーの面積変化(増殖性)
CCl4-4d切片培養担体上における、各GFP陽性細胞コロニーの培養2時間後の面積を、NIH Image 1.63で測定した。
(3) 細胞コロニーの増殖率の差における分化効率の差異
コロニー番号7および10をサンプルとして、増殖率の差における分化効率の差異を検討した。具体的には、位相差顕微鏡による観察と、蛍光顕微鏡による観察を経時的に行った。
(4) ALB-ES細胞の分化状態の解析
ALB-ES細胞の分化状態の解析するため、アルカリフォスファターゼ染色(Alkaline Phosphatase Detection Kit:CHEMICON#SCR004を使用)およびES細胞関連遺伝子を公知のRT-PCR法(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)を行った。
(5) GFP陽性細胞の細胞形態
上記のように、ALB-ES細胞はCCl4-4d切片培養担体上で、短時間で効率良くGFP陽性細胞へ分化することが分かった。そこで、GFP陽性細胞の形態についてヘマトキシリン染色を行ってさらに検討した。
<1>初期接着率が高いこと(約30%);
<2>細胞集団の成長が優れていること(培養16時間後までに約4倍);
<3>分化効率が高いこと(培養24時間後までに約70%);
<4>二核細胞も存在すること;および
<5>短時間で分化すること;
から、本発明の切片培養担体上で、例えば、ES細胞を培養することで、短時間で、しかも効率よく、細胞分化を誘導することができる。
Claims (5)
- 生物組織を薄切した特性既知の組織切片からなる切片培養担体が、支持体に付着または付着伸展されているとともに、この支持体に前記切片培養担体の付着および微細構造の位置を計測する標識が付与されている組織切片チップを用いた解析データベース作成方法であって、解析対象の試料となる特性未知の細胞を前記組織切片チップに播種して培養し、この細胞の組織切片チップにおける位置情報を観察手段で観察して位置画像データとして取得してコンピュータに送るとともに、細胞の挙動を観察手段で経時的に観察して挙動画像データとして取得してコンピュータに送り、送られてきた位置画像データと挙動画像データを基に、細胞と組織切片チップの切片培養担体との間の相互作用をコンピュータによって解析して蓄積用解析データとして蓄積することを特徴とする解析データベースの作成方法。
- 生物組織を薄切した特性未知の組織切片からなる切片培養担体が、支持体に付着または付着伸展されているとともに、この支持体に前記切片培養担体の付着および微細構造の位置を計測する標識が付与されている組織切片チップを用いた解析データベース作成方法であって、特性既知の細胞を前記組織切片チップに播種して培養し、この細胞の組織切片チップにおける位置情報を観察手段で観察して位置画像データとして取得してコンピュータに送るとともに、細胞の挙動を観察手段で経時的に観察して挙動画像データとして取得してコンピュータに送り、送られてきた位置画像データと挙動画像データを基に、細胞と組織切片チップの切片培養担体との間の相互作用をコンピュータによって解析して蓄積用解析データとして蓄積することを特徴とする解析データベースの作成方法。
- 播種される細胞の挙動が、培養時間に比した接着の度合い、増殖の度合い、分化の度合いおよび形態変化の度合いの少なくとも1つ以上である請求項1または2に記載の解析データベースの作成方法。
- 播種される細胞が、正常細胞または異常細胞である請求項1から3いずれかに記載の解析データベースの作成方法。
- 請求項1から4いずれかに記載の方法によって作成された解析データベースを用いた細胞または組織の特性診断システムであって、播種された細胞の挙動を観察手段で経時的に観察して挙動画像データとして取得し、この挙動画像データをデータベースにフィードバックするとともに、データベースに蓄積されている特性既知の細胞または組織の解析データとコンピュータで照合し、解析することを特徴とする細胞または組織の特性診断システム。
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