JP5746639B2 - 細胞、人工細胞構築物または三次元複合組織集合体の凍結保存方法 - Google Patents
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Description
凍結保存は細胞の短期および長期保存に重要な役割を果たし、かくして、組織および細胞バンキングにおける中心的な重要性を有するものである。ヒト造血幹細胞のごとき凍結保存細胞は、何十年間も白血病の日常の臨床的処置のため成功裡に移植されてきている。ますます、バンクに預けた組織を用いる細胞ベースの治療は、再生医療の他の領域でも同様に使用されてきている。新しい知見が臨床的使用のための新製品の生成に導くので、これらの適用の大きな潜在力は増大している。
また、凍結保護物質に加えて、適当な種類の細胞担体は、凍結保存プロセスに主要な重要性を有するものである。理想的には、その厚みは、コロニー形成するほぼ細胞のもの、すなわち、150μm未満であるべきである。それらのより大きな貯熱能力のために、より厚い細胞担体は、特に凍結および解凍プロセス中に緩衝液として働き、標準化された凍結または解凍速度にネガティブに影響する温度勾配を生成しかねない。感受性でかつ高価な細胞、複合細胞集合体または細胞ベースで再生成された組織を保存しなければならない場合には、再現性および標準化はさらにより重要となる。凍結または解凍の速度および雰囲気圧は、凝固点が達成された場合に結晶化が起こる範囲を決定するのを助ける。加えて、結晶化も、液体を吸収するある種の能力を持つ細胞担体の物質内部に発生し得ることは留意しなければならない。より薄い細胞担体は、凍結保護物質が内部にまで急速に浸透するというさらなる有利さを有する。
また、本発明は、本発明方法によって得られる凍結コラーゲン担体細胞集合体、および凍結人工細胞構築物または三次元複合組織集合体、および解凍後のその使用に言及する。
a)150μm未満の厚み、10〜170g/m2の単位面積当たりの質量および以下の組成:
i)コラーゲン[%重量]:30〜80、
ii)アミド窒素[%重量]:0.06〜0.7、
iii)ポリオール[%重量]:0〜50、
iv)脂質[%重量]:0〜20、
v)水[%重量]:5〜40
を有する安定なコラーゲン細胞担体(CCC)に、細胞構築物または三次元組織集合体に適合する1もしくはいくつかのタイプの細胞または異なるタイプの細胞を接種し、
b)CCCへのそれらの付着まで細胞を培養し、
c)非付着性細胞を洗い流し、
d)凍結媒体中で付着性細胞を含むコラーゲン細胞担体を凍結することを含む、1またはいくつかのタイプの細胞、細胞構築物または三次元複合組織集合体の凍結保存および長期保存のための方法をいう。
a)150μm未満の厚み、10〜170g/m2の単位面積当たりの質量および以下の組成:
i)コラーゲン[%重量]:30〜80、
ii)アミド窒素[%重量]:0.06〜0.7、
iii)ポリオール[%重量]:0〜50、
iv)脂質[%重量]:0〜20、
v)水[%重量]:5〜40
を有する安定なコラーゲン細胞担体(CCC)に、細胞構築物または三次元組織集合体に適合する1もしくはいくつかのタイプの細胞または異なるタイプの細胞を接種し、
b)CCCへのそれらの付着まで細胞を培養し、
c)非付着性細胞を洗い流し、
d)凍結媒体中で付着性細胞を含むコラーゲン細胞担体を凍結することを含む、1またはいくつかのタイプの細胞、細胞構築物または三次元複合組織集合体の凍結保存および長期保存のための方法をいう。
コラーゲン[%重量]:50〜70、
アミド窒素[%重量]:0.14〜0.4、
グリセロール[%重量]:12〜35、
脂肪[%重量]:1〜5、
ソルビトール[%重量:]:0〜20、
水[%重量]:5〜40。
a)幹細胞(胚、胎児、新生児、成人)およびそれらの前駆細胞
−胚幹細胞株
−誘導多能性幹細胞
−精原(Spermatogonal)幹細胞
−胚幹細胞
−間葉系幹細胞
−内皮幹細胞、
−造血幹細胞
−神経幹細胞
−神経冠幹細胞
−胃腸幹細胞
b)体細胞
−内皮細胞、
−胃腸からの上皮細胞
−乳腺上皮細胞
−メラノサイト
−肺上皮細胞
−腎上皮細胞
−角化細胞
−尿路上皮細胞
−肝細胞
−角膜細胞
−レンズ細胞
−骨芽細胞、
−骨細胞
−象牙芽細胞
−軟骨細胞、
−靭帯細胞
−腱細胞
−腺細胞(脳下垂体細胞、唾液腺細胞、副腎、外分泌および内分泌腺膵細胞、ライディッヒ細胞)
−脂肪細胞、
−線維芽細胞
−網膜細胞
−ニューロン(ドーパミン作動性、GABA作動性、グルタミン作動性、コリン作動性、アドレナリン作動性ニューロン)
−膠細胞(星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞)
−平滑筋細胞
−骨格筋細胞
−心筋細胞
−免疫細胞(Bリンパ球、Tリンパ球、マクロファージ、好中性、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、M細胞、マイクログリア)
c)遺伝子組換え細胞
d)癌細胞株
−HeLa、子宮頚部腺癌ヒト
−CCF−STTG1、星状細胞腫脳ヒト
−Hep G2、癌腫、肝細胞性肝臓ヒト
−SK−MEL−5、黒色腫、悪性皮膚ヒト
−Saos−2、骨肉腫骨ヒト
−WERIRb−1、網膜芽細胞腫目、網膜ヒト
e)不死化細胞株
−NuLi、ヒト気管支上皮
−CuFi、ヒト気管支上皮
−CHON−001、ヒト骨軟骨線維芽細胞、
−BJ−5ta、ヒト包皮線維芽細胞、
−hTERT−HME1(ME16C)、ヒト乳腺上皮、
−hTERT−HPNE、ヒト膵管上皮様、
−hTERT RPE−1、ヒト網膜色素上皮、
−NeHepLxHT、ヒト肝臓上皮様
−T HESC、ヒト子宮内膜線維芽細胞様ハイブリドーマ細胞株
f)植物細胞
−ブラウナンサス(Brownanthus corallinus)
−カルパンテア(Carpanthea pomeridiana)
−メイエラエ(Conophytum meyerae)
−デロスペルマ(Delosperma ecklonis)
−ハマミズナ(Sesuvium portulacastrum)
−スパルマンサス・トリコモナス(Sphalmanthus trichomotus)
−アオゲイトウ(Amaranthus retroflexus)
−ガラパゴスプレウロペタルム(Pleuropetalum darwinii)
−ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)
−クリヌム・モーレイ(Crinum x powellii hort.)
−カサランサス・ロンギフォリアス(Catharanthus longifolius)
−ディクティオフレバ・レオネンシス(Dictyophleba leonensis)
−サンユウカ(Ervatamia coronaria)
g)真菌細胞
糸状菌
−ダクリマイセス・デリクエスセンス(Dacrymyces deliquescens)
−フェンネルマイセス・リンデリ(Fennellomyces linderi)
−カニングハメラ・ブラケスリナ(Cunninghamella blakesleeana)
−トリポクラジウム・インフラタム(Tolypocladium inflatum)
−ラジオミセス・スペクタビリス(Radiomyces spectabilis)
−ワレミア・セビ(Wallemia sebi)
−ロフォデルミウム・セジチオサム(Lophodermium seditiosum)
酵母
−出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)
−カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)
−デバリオマイセス・ジャポニカス(Debaromyces japonicus)
−フェロマイセス・ポリボーラス(Fellomyces polyborus)
−ブレタノマイセス・アブチエンス(Brettanomyces abstinens)
−ハイフォピキア・バートニイ(Hyphopichia burtonii)
−クレクケラ・ブレビス(Kloeckera brevis)
h)細菌
−アシドバクテリウム・カプスラタム(Acidobacterium capsulatum)
−大腸菌
−サッカロコッカス・サーモフィラス(Saccharococcus thermophilus)
−ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)
−バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)
−緑膿菌
−エンテロコッカス−フェカーリス(Enterococcus faecalis)
1.1−本発明による平坦なフィルムとしての生成
50.0kgのウシ皮革スプリットを機械的に予め切断し、水で3回洗浄した(3回で50kg)。引き続いて、原料を150時間11.8のpH値の50kgの水中の0.29kgの水酸化カルシウムの懸濁液中でアルカリ処理した。アルカリ処理は、そのフロートのpHが0.6の値に達するまで、塩酸(水中の10重量%)の添加によって停止させた。次いで、フロートが2.8のpHを取るまで、反応混合物を水で再び濯いだ。次いで、得られた「コラーゲン皮」を、それらを粗く挽き、次いでそれぞれの穴部の連続的なより小さな直径を持つ一連の穴を空けたディスクを介して刻まれた物質を押圧することにより、温度制御(<24℃)下でゲル様の粘弾性塊に機械的に処理した。その収率は、78.1kgの「濃縮」コラーゲン塊であった。
「濃縮」塊を1.1と同様に製造したが、アルカリ処理の期間は、48時間まで低下させた。60.0kgの得られた「濃縮」コラーゲン塊を捏和機に移し、厳密な温度制御(<24℃)下で水(36.0kg)の徐々の追加によって混練下で希釈した。同時に、コラーゲン塊のpH値を2.8に調節した。得られたドウ(dough)をホモジナイザーに通過させ、次いで、一晩貯蔵して、20℃にて緩和させた。翌日、そのように得たコラーゲン塊を環状ノズルを介して押し出し、次いで、エンドレスの管状フィルムを生成した。チュービングが崩壊するのを防止し、コラーゲンを中和するために、空気および気体アンモニアの混合物を押出ヘッドにてチュービングに注入した。次いで、膨張した管状フィルムを一連の洗浄シャワー(水)を介して移し、最後の散水浴において、それに水中の4%グリセリンの溶液を撒いた。最後に、管状フィルムをトンネル乾燥機に通過させ、その終りにて、それをスキージー間の平面とし、リール上に捲いた。1.2下で記載した手順を異なる押出ヘッドを用いて2回行い、直径60mmを持つ1つの管状フィルムおよび直径115mmを持つものを得た。
1.1または1.2から得た平坦または管状フィルムのpH値をカルシウムおよびマグネシウム含有リン酸緩衝液[Ca++およびMg++を含有するリン酸緩衝液(PBS)(PAA H15−001)を用いることにより実験室の押出ラインから離して調節して、pH7.5〜pH7.2の生理的範囲を達成した。この終りにて、その対応するコラーゲンフィルムを5日間まで、撹拌下、緩衝系で洗浄した。緩衝液は1日2回交換した。
蒸留水中で短い平衡後、コラーゲン膜を100%アセトンで処理して、水溶性蛋白質画分を沈殿させた。アセトンの除去後、乾燥した膜をカルシウムおよびマグネシウム含有リン酸緩衝液(g/l単位:KCl 0.2;KH2PO4 0.2;NaCl 8.0;無水Na2HPO4 1.15;H15−001中のCaCl22H2O 0.132;H15−001中のMgCl2−2H2O 0.1)を各々用いて、1時間で3回洗浄した。その緩衝塩を除去するために、得られたフィルムを各々蒸留水中で1時間再度3時間洗浄した。
前記の手順(1.1〜1.4)のいずれかにより得た乾燥したコラーゲン平坦または管状フィルムをいずれかの方法で切断し、フィルム寸法と一致するいずれかの形状またはサイズのシートにパンチした。次いで、得られたシートを、25kGyまたは50kGyのベータまたはガンマ線照射により滅菌した。また、乾燥した管状フィルムも、同一方法でカットに切断し、照射した。
ヒドロキシプロリン/アミド窒素アナログEP1676595(Geistlich Soehne AG)/HPLCでのグリセリン/Soxhlet抽出を介する脂肪/HPLCでのソルビトール/600℃、5時間のマッフルファーネス中の焼却後重量測定灰分)/150℃の乾燥キャビネット中の乾燥後の重量測定水含量/小片へのフィルムの切り取り、5%NaCl溶液中へのその切取部の挿入および10分後のガラス電極を用いる測定によるpH値/平衡湿度での10cm×10cm片の秤量による単位面積当たりの質量/パンチした試料ボディーの21℃/60%の相対湿度の空調および100mm/分の反転速度後のUTS万能試験機(モデル3/205, UTS Testsysteme GmbH)による縦(機械方向)および横の引張り強さの測定によるコラーゲンの定量化。
培養した幹細胞および/または初代心臓細胞、例えば、心筋細胞の成功裡の凍結保存は、心疾患分野における将来の細胞ベースの治療の必須条件である。
これらの培養条件下で、付着性心筋細胞はそれらの自律的拍動能力を示した。
付着性細胞の長期的凍結保存を分析するために、骨肉腫細胞株SAOS−2を、実施例1により調製したコラーゲン細胞担体上で培養し、液体窒素中で230日間貯蔵した。解凍プロセス後、付着性細胞を細胞増殖アッセイによって分析した。
Rothamel ら (2003 Clin. Oral Imbl. Res. 15:443-449)は、細胞培養実験において商業的に入手可能なコラーゲン膜の異なる性能を報告した。より詳しくは、彼らは、4つの異なるコラーゲン膜上にSaos−2細胞(200/mm2)を接種し、7日間培養後に膜上に存在する細胞数をカウントした。得られた結果を以下にまとめる。
Saos−2細胞を「Collagen vitrigel」(Asahi Glass Co., LTD., Tokyo, Japan)として知られたコラーゲンマトリックス上に25,000/cm2の密度にて接種し、37℃および5%CO2にて湿潤培養器中で4日間培養した。培養媒体は1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1% Lグルタミンおよび10%(v/v)FCSを補足したHEPES緩衝DMEM(PAA)からなった。凍結保存のために、細胞を接種した骨格をそれらのプラスチック支持リングから切り抜き、cryotubeに移した。さらなる進行は実施例3に開示したものと類似した。細胞を接種した骨格を8日間−150℃未満の液体窒素中に貯蔵した。その後、構築物を解凍し、事前に暖めた培養媒体で3回洗浄し、さらに3日間培養を維持した。984,000個の死滅細胞および112,600個の生細胞を洗浄後の上清中に見出した。BrdUおよびDAPIでの免疫組織学的染色は、細胞担体に付着する細胞がもはや存在しないことを明らかにした。
Claims (15)
- a)150μm未満の厚み、10〜170g/m2の単位面積当たりの質量および以下の組成:
i)コラーゲン[%重量]:30〜80、
ii)アミド窒素[%重量]:0.06〜0.7、
iii)ポリオール[%重量]:0〜50、
iv)脂質[%重量]:0〜20、
v)水[%重量]:5〜40
を有する安定なコラーゲン細胞担体に、細胞構築物または三次元組織集合体に適合する1もしくはいくつかのタイプの細胞または異なるタイプの細胞を接種し、
ここに、コラーゲン細胞担体のコラーゲンは架橋され、
b)コラーゲン細胞担体へのそれらの付着まで細胞を培養し、
c)非付着性細胞を洗い流し、
d)凍結媒体中で付着性細胞を含むコラーゲン細胞担体を凍結することを含む、1またはいくつかのタイプの細胞、細胞構築物または三次元複合組織集合体の凍結保存および長期保存のための方法。 - 所望の細胞構築物または三次元組織集合体を形成する1つのタイプまたはいくつかのタイプの細胞が、コラーゲン細胞担体の両側上に接種されることを特徴とする請求項1記載の方法。
- コラーゲン細胞担体の厚みが、80μm未満または40μm未満であることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- コラーゲンが、I型コラーゲン、またはI型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合物、またはI型コラーゲンおよび/もしくはIII型コラーゲンとエラスチンとの混合物であることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- ポリオールが、グリセロール、エチレングリコール、ブテンジオール、プロペンジオール、ソルビトールもしくは他のヘキシトール、キシリトールもしくは他のペンチトールならびにその混合物から選択されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 脂質が植物油であることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- コラーゲン細胞担体が、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンまたはヒアルロン酸から選択される細胞間マトリックスの構造蛋白質で、あるいはアパタイトで、または成長因子、サイトカイン、誘導分子もしくは抗体から選択される機能分子で被覆されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 凍結媒体が、ジメチルスルホキシド(DMSO)、トレハロース、グリセリンまたはヒドロキシエチル澱粉(HES)を含むことを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 付着性細胞が、真核細胞もしくは原核細胞であるか、または遺伝子組み換え真核細胞もしくは原核細胞であることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 真核細胞が植物または動物の細胞であることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 動物細胞が、初代細胞または不死化細胞のいずれかの哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項10記載の方法。
- 細胞が、非ヒト胚幹細胞株、誘導多能性幹細胞、精原幹細胞、胚幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、神経冠幹細胞または胃腸幹細胞、内皮細胞、胃腸からの上皮細胞、乳腺上皮細胞、メラノサイト、肺上皮細胞、腎上皮細胞、角化細胞、尿路上皮細胞、肝細胞、角膜細胞、レンズ細胞、骨芽細胞、骨細胞、象牙芽細胞、軟骨細胞、靭帯細胞、腱細胞、脳下垂体細胞、唾液腺細胞、副腎細胞、外分泌および内分泌腺膵細胞、ライディッヒ細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、網膜細胞、ドーパミン作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、グルタミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、マクロファージ、好中性、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、M細胞またはマイクログリア、遺伝子組換え細胞、
HeLa、CCF−STTG1、Hep G2、SK−MEL−5、Saos−2またはWERI−Rb−1、NuLi、CuFi、CHON−001、BJ−5ta、hTERT−HME1(ME16C)、hTERT−HPNE、hTERT RPE−1、NeHepLxHTまたはHESC、ブラウナンサス(Brownanthus corallinus)、カルパンテア(Carpanthea pomeridiana)、メイエラエ(Conophytum meyerae)、デロスペルマ(Delosperma ecklonis)、ハマミズナ(Sesuvium portulacastrum)、スパルマンサス・トリコモナス(Sphalmanthus trichomotus)、アオゲイトウ(Amaranthus retroflexus)、ガラパゴスプレウロペタルム(Pleuropetalum darwinii)、ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)、クリヌム・モーレイ(Crinum x powellii hort.)、カサランサス・ロンギフォリアス(Catharanthus longifolius)、ディクティオフレバ・レオネンシス(Dictyophleba leonensis)またはサンユウカ(Ervatamia coronaria)から選択されることを特徴とする請求項9〜11のいずれか1記載の方法。 - 請求項1または2に記載の方法により得ることができる凍結コラーゲン細胞担体細胞集合体または凍結人工細胞構築物もしくは三次元複合組織集合体。
- 再生医療に用いる請求項13記載の解凍されたコラーゲン担体細胞集合体、人工細胞構築物または三次元複合組織集合体。
- 基礎研究またはin vitro試験系のための請求項13に記載の解凍されたコラーゲン担体細胞集合体、解凍された人工細胞構築物または三次元複合組織集合体の使用。
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