TW201418463A - 從胎兒組織製備親代細胞庫 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種於體外由胎兒組織製備親代細胞庫(PCB)之方法,該胎兒組織係由胎兒骨骺組織、胎兒跟腱組織及胎兒皮膚組織組成,該方法係使用快速、物理性的初級細胞培養物選擇法來選出要使用在創傷及組織修補的方法中的細胞類型。
Description
本發明係關於在體外由胎兒組織製備親代細胞庫(PCB)之方法,該胎兒組織係由胎兒骨骺組織、胎兒跟腱組織及胎兒皮膚組織組成,該方法係使用快速、物理性的初級細胞培養物選擇法來選出要使用在創傷及組織修補的方法中的細胞類型。
細胞療法已成為受人關注的作為修補、恢復、或改善組織功能的醫用療法的額外選項,且特別是與習知的手術技術結合而作為修補、恢復、或改善組織功能的醫用療法。對於病患,有些細胞選擇會比起其他更適於細胞療法。對於動物與人類在所有發育的年齡的組織選擇均可針對各個最終細胞類型評估其優點及缺點。目前,針對人類細胞系療法的限制,係關於以下事項的技術極限:細胞增殖能力(簡單培養條件)、維持初級人類細胞培養物之已分化表型、傳染病的傳播,及所選之細胞族群取決於分離程序的一致性(consistency)及穩定性。來自單一器官捐贈物的經培養的初級胎兒細胞符合針對開發醫藥用產品的緊急且嚴格的技術觀點。能在短時間內開發出來自單一胎兒器官捐贈物的種細胞庫(master cell bank)及工作細胞庫(working cell bank),且能在細胞庫製作的各階段實施安全性測試。
針對外科手術程序及特定組織之組織工程,細胞療法已被提議作為是較少侵入性的替代療法,或作為組合的療法。已有人調查一些細胞類型以利用在細胞療法:胚胎幹細胞(ES)、臍帶細胞、胎兒細胞及成體幹細胞(來自於骨髓-造血性幹細胞或HSC及骨髓幹細胞或MSC),以及脂肪組織、血小板、胎盤及羊水細胞。對於組織工程中的所有應用,細胞來源及類型是主要的重點。針對有各種優缺點的特定療法,需對各類型細胞以不同方法來處理操作其分化及自我更新的能力。
胎兒細胞已在生物學及醫學上廣泛使用多年,但對於其重要性特別是在開發必要的疫苗方面,並未有許多的公知知識。胎兒細胞為已分化的細胞,其具有高度的擴增性、再生性及低免疫原性。其可在胚胎期發育9週之後從胎兒組織分離。胎兒皮膚細胞之所以提供有效且安全的細胞療法及組織工程的理想解決法,包括以下的幾個理由;a)可從單一器官捐贈物將細胞擴增的能力;b)細胞生長需求極少;c)適應於供傳送的生物材料;及d)耐受氧化的壓迫。胎兒皮膚細胞有強大的擴增性,因其僅需要單一器官捐贈物(1-4 cm2組織)來創製出足夠的冷凍細胞,以供生產能使用於數十萬次治療的細胞庫(即,針對皮膚,可從單一專用的細胞庫產生超過350億個9 x 12 cm的胎兒皮膚建構物)。而且,比起幹細胞或間葉細胞類型,對於細胞培養的要求極少。由於胎兒皮膚細胞已經分化,且不需要導向或改變,因此在培養細胞及擴增時不需要通常需要的許多種的額外的生長因子。針對製作細胞庫,小心選擇捐贈者並且廣泛篩選捐贈者以及培養的細胞以避免會傳播的病毒性、真菌性或細菌性疾病,可將胎兒細胞安全、無危險地利用在醫療用途。此外,胎兒細胞,與新生細胞、年輕細胞或成體細胞不同,其特別適應生物材料,因而能夠有效率且簡易的傳送至患者。已有報告顯示來自捐贈者(新生至成體)的細胞,不能有效率地整合到各種生物材料,且有些的生物材料事實上對於細胞有毒性。雖然支架(scaffold)對於組織工程真的是重要,但是細胞類型最有可能是限制因子。為了處理供臨床傳送的終產物,均質的分布以及快速開發終產物均係主要重大的優點。若需要長時間的培養期,針對自體移殖或迄今的市售產品,會存在無可忽視的污染風險增加。能有一致且易重複的處理也是重要的。藉由以胎兒細胞發展一致性的細胞庫,可消除許多的風險因子,而對於臨床提供安全且有效的人類細胞系的治療法。
對於細胞系產品,包括同一性、純度、無菌性、穩定性、安定性及有效性係推薦的要因。綜之,新的法規針對製造以及用於製造用在臨床試驗及治療的細胞系產物的環境有嚴格的準則。目前針對人類細胞系治療法的限制係關於在細胞增殖能力(簡單培養條件)、維持初級人類細胞培養物之已分化表型、傳播性疾病的傳播、及所選之細胞群組視其單離步驟之一致性及安定性方面的技術限制。來自單一器官捐贈的培養的初級胎兒細胞符
合用於開發醫療產品的急切的及嚴格的技術觀點。從單一胎兒器官捐贈物可在短時間內培養出種細胞庫及工作細胞庫,且可在細胞庫製作的所有階段實施安全性測試。針對醫療用途,胎兒細胞至多可在規模擴充處理中使用其生命期的2/3期間,且可確保包括蛋白質濃度、基因表現及生物活性的數個生物學性質的一致性。
胎兒細胞在關於其收集、培養物擴增及保存上相對操作簡單,使得胎兒細胞成為細胞治療法的誘人的選項。與ES細胞不同,胎兒細胞並不會形成腫瘤,而且當移殖時似乎欠缺免疫原性。相較於迄今的間葉細胞,胎兒細胞不需要用於生長的滋養層(feeder layers)或供分化的特定的生長因子。單一器官捐贈物即能製造一致性的種細胞庫(MCB),可供數十萬次的患者治療。可以對於該完整定義的一致的細胞庫,與血清學及病原學分析已完成的原始的器官捐贈物同步地、簡單的評估關於任意潛在病毒或病原的安全性。
從特定組織(例如軟骨、腱及皮膚)而來的已分化的胎兒細胞的初級培養物,會決定所開發出的臨床細胞庫的品質,而包括軟骨細胞(軟骨細胞源祖細胞)、皮膚纖維母細胞源祖細胞、及腱源祖細胞之特定細胞來源可自該特定組織發展而來。組織的初始處理對於之後產製的細胞的生理性質為重要的觀點係已為人所接受。在初級培養中常規的技藝係將小片組織以酵素消化來放出供細胞培養的所有的活細胞。此技藝對於“硬”組織特別需要使用,但也針對軟組織使用,常規係使用多次的消化步驟。藉此,可將完整的不同的細胞族群釋出,並且在初級及次級培養物中培養(Carrascosa A,Audi L,Ballabriga A Pediatric Research 19:720-727,1985;Roche S et al,Biomaterials 22:9-18,2001;Bae H.et al.,The Spine Journal Vol.8,No.5,pages 92S-93S,2008;Reginato A.M.et al.,Arthritis and Rheumatism,Vol.37,No.9,1994)。
然而,已知酵素性處理會造成不一致,使細胞族群有不同的外型、生理性質、穩定性及功能(Diaz-Romero J,Gaillard J-P,Grogan P,Nesic,Trub T,Varlet P-M J Cellular Physiol 202:731-742,2005)。
關節的軟骨由於其無血管、無神經、無淋巴管的天性,對於外科醫師及組織工程師而言均使該組織修補變成一項挑戰。作為骨軟骨治療策略的黃金標準,特別是針對細胞來源的選擇,仍然是中心且有爭議的課題,到
目前仍未決定。迄今,成體間葉基質細胞(MSC),即便考慮到表型的均質性、可靠性及穩定性,仍係最常用的細胞來源。
因為迄今仍無對於骨關節缺陷的令人滿意的治療解決方法,對其的治療需要改善。尤其,開發出能避免軟骨未成熟退化之新的解決方法以避免要替換整個關節,特別重要。新的細胞輔助性外科技術的發展,係基於能符合嚴格的治療劑製備的要求的限定的細胞庫產品。
因此,對於開發供用在治療策略的製造新組織比如腱、軟骨、其他肌肉骨骼組織及皮膚的方法,仍有需求。更具體而言,對於提供更穩定且均一的細胞族群的細胞庫以及找尋不會有觸發免疫反應之風險且不帶有任何傳染性劑的適當細胞來源,有所需求。
為了解決上述問題,申請人建立了一非酵素方法,其係以物理性且快速釋出定義樹立親代細胞庫(PCB)之特徵的早期貼附細胞族群。在一些具體例中,該初級、已分化的細胞係來自於特定的軟骨組織、特定的腱組織,及特定的皮膚組織。對於該技術領域中具有通常知識者而言,其他具體例可包括來自皮膚及肌肉骨骼組織,例如腱、骨骼、肌肉及椎間盤的初級已分化細胞。開發PCB能完成進一步的一致且穩定的細胞庫製作。
具體而言,本發明之一具體例提供一種體外非酵素方法,其係供單離、擴增及發展選自於由胎兒骨骺軟骨細胞、胎兒跟腱細胞或胎兒皮膚纖維母細胞構成之群組的胎兒細胞,包含以下步驟:a)使用胎兒樣本,其係選自於包含胎兒骨骺軟骨細胞之胎兒尺骨軟骨;包含胎兒跟腱細胞之胎兒跟腱;或包含胎兒皮膚纖維母細胞之胎兒腹部皮膚;b)將該胎兒尺骨軟骨、胎兒跟腱或胎兒腹部皮膚樣本微切片,並藉由以物理性附著於經解剖刀刻劃的表面以分散;c)於體外以該胎兒骨骺軟骨細胞、胎兒跟腱細胞或胎兒腹部皮膚纖維母細胞增殖的條件培養該胎兒尺骨軟骨、胎兒跟腱或胎兒腹部皮膚樣本;d)從其中選擇及單離最早貼附的胎兒骨骺軟骨細胞細胞族群、最早貼附的胎兒跟腱細胞細胞族群、及最早貼附的胎兒皮膚纖維母細胞族群。
於另一具體例,本發明提供胎兒細胞,其係藉由本發明之非酵素方法獲得,該胎兒細胞,比如:胎兒骨骺軟骨細胞細胞株,命名為FE002-Cart且寄存編號ECACC 12070303-FE002-Cart;胎兒跟腱細胞細胞株,命名為FE002-Ten且寄存編號ECACC 12070302-FE002-Ten;胎兒皮膚纖維母細胞細胞株,命名為FE002-SK2且寄存編號ECACC 12070301-SK2。
於另一具體例,本發明提供由本發明之方法獲得之胎兒細胞之用途,係藉由使用整合到各種基質的該已分化的軟骨、腱或皮膚細胞,以製造新的軟骨組織及/或立體建構物、新的腱組織及/或立體建構物、新的皮膚組織及/或立體建構物。
於另一具體例,本發明提供由本發明之方法獲得之胎兒細胞,係將其作為治療劑。
於另一具體例,本發明提供由本發明之方法獲得之胎兒細胞,係將其使用在骨軟骨組織及肌肉骨骼組織之修補與再生之方法、腱組織及肌肉骨骼組織之修補與再生之方法,以及皮膚組織之修補與再生之方法,以及治療燒傷、創傷及纖維化病症。
於另一具體例,本發明提供由本發明之方法獲得之胎兒細胞之,係將其使用在治療骨軟骨疾病或缺陷、關節炎及肌肉骨骼疾病之方法;使用在治療肌肉骨骼疾病與腱病變之方法;使用在治療皮膚疾病之方法。
於本發明之又一具體例,提供一種篩選方法,其係供開發用於關節炎、骨軟骨的缺陷的治療、軟骨修補、腱修補、肌肉骨骼組織修補及皮膚修補之治療劑及/或醫學裝置,包含使用由本發明之非酵素方法獲得之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)、胎兒跟腱細胞或胎兒皮膚纖維母細胞。
圖1顯示著手製造針對胎兒皮膚源祖細胞之親代細胞庫的活組織切片,於第4天的細胞選擇物顯示有一致性。
圖2顯示在低密度接種(~2000細胞/cm2)後之胎兒皮膚源祖細胞生長情形,且冷凍儲備細胞於第6天及12天的恢復情形顯示有高穩定性、一致性且維持功能。
圖3顯示在組織被酵素性消化以製備親代細胞庫的條件下,細胞族群選擇物之外型與生長的差異,且細胞族群不一致。
圖4顯示著手製造針對胎兒腱源祖細胞(胎兒跟腱細胞)之親代細胞庫的活組織切片,於第4天的細胞選擇物顯示有一致性。
圖5顯示在低密度接種(~2000細胞/cm2)後之胎兒腱源祖細胞生長情形,且冷凍儲備細胞於第0、3、7天及10天的恢復情形顯示有高穩定性、一致性且維持功能。
圖6顯示針對胎兒腱源祖細胞之FACS分析及3D基質沉積特性。
圖7顯示處理近側尺骨的骨骺組織以著手製造針對胎兒軟骨源祖細胞(胎兒骨骺軟骨細胞)之親代細胞庫,於第6天的細胞選擇物顯示有一致性。
圖8顯示在低密度接種(~2000細胞/cm2)後之胎兒軟骨源祖細胞(胎兒骨骺軟骨細胞)生長情形,且冷凍儲備細胞於第6天及12天的恢復情形顯示有高穩定性、一致性且維持功能。
圖9顯示針對胎兒軟骨源祖細胞(胎兒骨骺軟骨細胞)之FACS分析及3D基質沉積特性。
圖10顯示胎兒細胞源祖細胞沿著經物理性刻劃的表面於組織培養皿上擴增的情形。
圖11顯示使用組織之非酵素性製備法快速開發出臨床的親代細胞庫。
雖然與在此敘述之方法或材料相似或均等者可以用在實施或測試本發明,但本發明在此仍於下敘述適當的方法及材料。所有在此提及的出版品、專利申請案、專利及其他文獻完整納入於此作為參照。在此所討論的出版品及申請案僅針對其在本發明的申請日前揭露的事項提供。不應解讀為承認本發明不能憑藉較早的發明日而早於該出版品。此外,該材料、方法以及實施例僅供便於理解,並不意欲限制。
當發生抵觸,包括定義,以本說明書為準。除非另有定義,在此使用的所有的技術及科學用語與在此之標的所屬的技術領域中有通常知識者一般理解的含意相同。以下提供定義以有助於理解本發明。
此處使用之“一(a)”或“一(an)”係指“至少一”或“一或更多”。
用語“包含”通常係以包括的含意使用,即容許存在一或更多特徵或成分。
用語“生物材料”係指天然或合成材料,包括當與細胞或生物組織接觸時
無有害作用的金屬、陶瓷及聚合物。通常,生物材料支持體係選自於如下群組:聚合性支持體,包含烯烴聚合物、氟聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯酸聚合物、聚酯聚合物、聚胺酯聚合物、矽聚合物、纖維素聚合物、環氧聚合物、矽酮系聚合物、合成水凝膠、聚碳酸酯;生體可相容性金屬支持體,包含:鈦及鈦合金、鎳鈦形狀記憶合金(nitinol)、氧化鋯、不銹鋼及鈷鉻、氧化鋁-氧化鋯複合物;及/或生體可相容性陶瓷,包含:瓷、羥基磷灰石,及其混合物。
用語“胎兒軟骨細胞或軟骨源祖細胞”、“胎兒跟腱細胞或胎兒腱源祖細胞”或“胎兒纖維母細胞或胎兒皮膚源祖細胞”,相較於未分化的胎兒細胞,其係意指已分化的細胞。與本發明相反,用語"未分化"係用以敘述未成熟或原始細胞。例如,未分化的胎兒皮膚細胞,包括能分化成為真皮纖維母細胞、表皮角質細胞,或甚至其他無關連組織的特定細胞類型者。已分化細胞,係當置於特別針對其他細胞類型的分化培養基或不同的微環境時,不會反分化(de-differentiate)成為不同的細胞族系者。比如,若將胎兒皮膚纖維母細胞置於成骨性分化培養基,其並不會成為完整的骨母細胞族群,或若將其製於脂肪細胞形成性培養基,不會成為完成的脂肪族群,且若將相同細胞置於關連於骨骼的3D基質,將不會由於環境改變而反分化為完整的骨母細胞族群者。此等限定的、已分化的細胞,在針對其作為人類及動物用藥的治療劑的潛在用途方面有重要的優點。
用語"適當的培養條件"或“胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞、胎兒腱源祖細胞或胎兒皮膚源祖細胞增殖的條件”,係一種用於培養細胞的培養基,其係含有促進增殖的營養素。該營養培養基可含有任意以下成分的適當組合及濃度:等張鹽液、緩衝液、胺基酸、血清或血清替代物,及其他外生性的添加因子。該技術領域中具有通常知識者可認識到所有普通採用的培養條件都可以採用。用於選擇最適當的培養基、培養基製備,以及細胞培養的技術在該技術領域中為周知,且在許多文獻中已敘述,包括Doyle et al.,(eds.),1995,Cell & Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley & Sons,Chichester;and Ho and Wang(eds.),1991,Animal Cell Bioreactors,Butterworth-Heinemann,Boston,該等文獻在此引入作為參考。比如,可使用任何適當類型的培養基來單離本發明的胎兒骨骺軟骨細胞,比如但不限
於DMEM、McCoys 5A培養基(Gibco)、Eagle's basal培養基、CMRL培養基、Glasgow極小必要培養基、Ham's F-12培養基、Iscove's經修飾的Dulbecco's培養基、Liebovitz' L-15培養基、RPMI 1640、無血清培養基等。該培養基可補充一或更多種成分,包括例如胎牛血清(FBS)、限定的生長因子血清替代物、馬血清(ES)、人類血清(HS)、限定的細胞培養物生長因子,及一或更多種用於控制微生物污染抗生素及/或抗真菌劑,比如盤尼西林G、鏈黴素硫酸鹽、二性黴素(amphotericin)B、見大黴素(gentamicin),及利黴菌素(nystatin),可為單獨或組合等。
用語"細胞株"係指永久性建立的細胞培養物,其在給予適當的新鮮培養基及足夠的空間下會無限的增殖。用語初級細胞株係指有受限的傳代數的已建立的細胞株。
用語"細胞庫"係指:從捐贈者胎兒組織,比如胎兒尺骨軟骨、胎兒跟腱或胎兒皮膚採集活體切片組織;在適當的培養條件使該胎兒組織生長,並使胎兒細胞增殖到高濃度;以酵素性或非酵素性處理(亦即胰蛋白酶)將最終的培養物的組織及細胞處理,使其懸浮;將懸浮的細胞集合,以製作來自該培養物的細胞係大致均勻的懸浮液;小心地與抗凍保護劑混合;將細胞懸浮液的試樣密封於安瓿內;將該等試樣冷凍。最適的冷凍速度可由實驗決定。例如,將安瓿溫度以1℃/min降溫直到-80℃,然後在約24小時後轉成-160℃,或在自動的經校正的Nano-Freezer中以程式化的周期以完整周期冷凍到-165℃。該超冷的溫度庫可保存細胞使其停止老化,俾使其維持在被收集那天的功能及活性。
本發明的冷凍保存的細胞構成一細胞庫(1-107/ml),有一部分可藉由解凍而”提取(withdrawn)",然後用於製造所需的新軟骨細胞及組織。解凍一般應快速進行,比如,將從液體氮拿出的安瓿移到37℃水浴。該安瓿中的已解凍的內容物應立即在無菌條件下移到含有適當培養基比如調配成有10% FBS之DMEM的培養容器內。建議將培養基中的細胞起始密度調整成約1-6×103-4細胞/ml。培養時,可每日檢查細胞,例如以倒置顯微鏡檢測細胞增殖,並且當細胞達到適當濃度時進行次培養,或以掃描式顯微鏡即時監控以供品質控制。
視需要,可將本發明之細胞從細胞庫提取並且以比如在此所述之立體
軟骨、腱或皮膚培養物的形式於體外製造新的軟骨、腱或皮膚組織或細胞,或是藉由以體外,例如將細胞直接投予到對象中需要新軟骨、新腱或新皮膚組織或細胞的該部位。
用語"對象"(作為治療的"對象")或“患者”意指受病症、缺陷、或疾病(如在此所特定)所折磨、或有得病傾向或已罹病的哺乳類個體。本用語未指明特定的年紀或性別。所以,成體及新生對象,不論雄或雌性,均意欲含蓋。該用語也包括人類及動物。比如對象可為比如人、人以外的靈長類、野生動物、犬、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、兔、大鼠或小鼠。較佳對象為人及馬。在此使用的用語野生動物,包括未馴養的哺乳動物、鳥、二生類或魚。此種野生動物例如但不限於獾、海狸、獅子、老虎、熊、鷹和鹿。
立體的基質意指選自膠原蛋白基質或PLA、PLGA、PEG、幾丁聚糖、彈性蛋白、水凝膠包括例如HA(透明質酸)、矽酮、幾丁聚糖或其混合物的任何基質。該基質提供立體的空間以確保有適當的覆蓋範圍,並將胎兒細胞比如胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞、胎兒腱源祖細胞、胎兒皮膚源祖細胞、或胎兒產物傳送到或與額外的移殖材料一起關連傳送。於一具體例中,本發明之方法容許使用整合到各種基質中的已分化軟骨、腱或皮膚細胞來製備立體建構物。該已分化的軟骨、腱或皮膚細胞與基質的整合,可以藉由將該細胞與基質混合、組合、將該細胞移液、接種、覆蓋、或放置到基質而發生。
用語"膠原蛋白"係指多胜肽化合物,其本性為親水性,易受胞外酵素降解。因為,該物質被研究透澈,可以控制許多關鍵的參數。膠原蛋白為弱抗原,所以引起排斥的可能性極低。本發明之方法及用途使用的較佳膠原蛋白為馬膠原蛋白或或豬膠原蛋白。
“植入物(imPlant)”可視為一醫學裝置,其係要取代缺少的生物結構、支持受損的生物結構或增強已有的生物結構。植入物可由人造或天然材料製作。醫學植入物為人造的裝置,且接觸身體的植入物的表面可由生物醫學材料製作,比如鈦、矽酮、聚合物、磷灰石、生物泡沫及生物凝膠。有些植入物可以有結合的生物活性洗提藥物,比如可植入的膠囊或藥物洗提導引管。植入物材料可以結合於特定的組織類型的已分化胎兒細胞,以針對抗纖維化的應答。
用語“傳送系”,係指提供將胎兒細胞或胎兒細胞產物單獨或與植入物一起輸送以處理組織或實施植入的機構的任意金屬、或習慣使用的骨科、創傷、頜面天然或合成植入物材料、水凝膠、矽酮或移植物。
在此使用的用語"軟骨組織",係如同該技術領域一般認為的用語,且係指包括包埋於ECM內的細胞的緻密結締組織的一特化的類型(參見例如Cormack,1987,Ham's Histology,9th Ed.,J.B.Lippincott Co.,pp.266-272)。軟骨的生物化學組成依類型而不同;但是,軟骨的一般組成包括:由以膠原蛋白、蛋白多糖及水組成的緻密ECM所包圍的軟骨細胞。在該技術領域已認識了幾種類型的軟骨,包括比如透明軟骨、關節軟骨、肋軟骨、纖維軟骨、半月板軟骨、彈性軟骨、耳軟骨,和黃軟骨。任意軟骨類型的製備均意欲包含在本發明的範疇內。依據一具體例,本發明指出供較佳為使用在人類的新軟骨組織的製造方法及組成物。但是,本發明也可實施成製造用在有需求的任意哺乳動物的新的軟骨組織,該任意哺乳動物包括馬、犬、貓、綿羊、豬等。治療該等動物也意欲含蓋於本發明的範疇內。
在此使用的用語"腱組織"係如同該技術領域一般認為的用語,且係指主要包含膠原蛋白、蛋白多糖及水的特化類型的纖維結締組織。
在此使用之用語"皮膚組織"係如同該技術領域一般認為的用語,且係指也是包含膠原蛋白、彈性蛋白及蛋白多糖的特化類型的纖維組織。
於本發明之一具體例,揭露一非酵素方法,其係以物理性地、快速地釋放定義建立親代細胞庫(PCB)之特性的早期貼附細胞族群。於一些具體例中,該初級、已分化的細胞來自於特定的軟骨組織、來自特定的腱組織,及來自特定的皮膚組織。開發PCB能達成後續細胞庫製造的一致及穩定。
因此,依本發明之一具體例,提供一種體外非酵素方法,其係供單離、擴增及發展選自於由胎兒骨骺軟骨細胞、胎兒跟腱細胞或胎兒皮膚纖維母細胞構成之群組的胎兒細胞,包含以下步驟:a)使用胎兒樣本,其係選自於包含胎兒骨骺軟骨細胞之胎兒尺骨軟骨;包含胎兒跟腱細胞之胎兒跟腱;或包含胎兒皮膚纖維母細胞之胎兒腹部皮膚;b)將該胎兒尺骨軟骨、胎兒跟腱或胎兒腹部皮膚樣本微切片,並藉由
以物理性附著於經解剖刀刻劃的表面而使其分散;c)於體外以該胎兒骨骺軟骨細胞、胎兒跟腱細胞或胎兒腹部皮膚纖維母細胞增殖的條件培養該胎兒尺骨軟骨、胎兒跟腱或胎兒腹部皮膚樣本;d)從其中選擇及單離最早貼附的胎兒骨骺軟骨細胞細胞族群、最早貼附的胎兒跟腱細胞細胞族群、及最早貼附的胎兒皮膚纖維母細胞族群。
理想的胎兒尺骨軟骨樣本,為胎兒近側尺骨骨骺的樣本。
於一特定具體例,本發明係關於從單一組織捐贈物(僅有0.2-2 cm組織)來單離、擴增及發展胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞(FEC)、胎兒跟腱源祖細胞、及胎兒皮膚源祖細胞親代細胞庫的方法。軟骨、腱及皮膚的來源對於建立一致的細胞庫而言為重要。申請人已發現胎兒尺骨軟骨為優於股骨、脛骨或肋骨軟骨的來源,胎兒跟腱為理想,且來自胎兒腹部的皮膚為理想。胎兒軟骨、腱及皮膚針對修補有卓越的能力,而且胎兒細胞顯示有免疫調節活性,且有顯著的創傷癒合能力。針對軟骨,在此等方面與其天生的在骨骺成骨後的骨軟骨生成能力、FEC之細胞特性組合在一起,使得在本發明之非酵素方法單離得到的細胞族群成為用於骨軟骨及/或軟骨組織修補與再生的非常受人關注的細胞選項。
本發明之方法並未使用習知用於釋出選擇之細胞族群之消化初級培養物的方法。消化通常是用在不會自動分解的組織(亦即,血液細胞成分、有些胎盤組織部分、一些臍帶部分)。本發明係組合組織之物理性的切片以及引導組織/細胞沿著刻痕長入組織培養板,僅選擇在生長數天後的最早貼附的細胞族群,該族群非常一致且均質。此等細胞族群生長較快,且與以酵素消化的其他細胞族群相較,有不同的外形及生理狀況。申請人已呈現將經過酵素消化的胎兒皮膚組織與對排列在表面之細胞施以物理性處理的胎兒皮膚組織,在二維的生長差異。
重要的是,若該初級培養物係以不經組織消化的狀態發育,該胎兒關節的軟骨細胞、胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞不會輕易地反分化成其他的細胞系。在製作細胞庫的程序中未經過酵素消化而發展出的軟骨細胞或軟骨源祖細胞、腱源祖細胞及皮膚源祖細胞,不會分化成神經、成脂肪及完整的成骨性細胞(如間葉幹細胞),而此等細胞卻會由其初級細胞培養物已施以酵素處理或不具有用來附著到塑膠培養皿之固體組織成分的骨髓
或胎兒關節的軟骨細胞衍生而來。另一重要的觀點在於:從非酵素性細胞初級細胞培養物而開發的細胞庫,其細胞在體外的傳代更為穩定。對於使用此等製作成細胞庫的細胞在人類的治療劑,外形及染色體的穩定性係為重要的因子。
採用了非酵素方法以及組合觀察FEC族群、腱源祖細胞族群及皮膚源祖細胞族群在培養物中的均質性及穩定性的完整的cGMP單離法,能夠容許以該所述方法在體外有可靠性地擴增FEC、腱源祖細胞及皮膚源祖細胞,並且從PCB族群發展大量的種細胞庫。而且也能使用各組織的同細胞庫供數十萬患者的臨床應用,對於新穎的骨軟骨、肌肉骨骼及皮膚再生療法開啟一扇門。
源自10-16週的胎兒組織的肌肉骨骼組織比如腱、骨骼、肌肉、盤及軟骨,以及皮膚組織,係快速開發作為供臨床用途的親代細胞庫的理想來源。若組織未經酵素消化且細胞排列係沿著有鋸齒的表面受引導時,從其而來的細胞可快速製備(在12-14天之內,相對於此,有經酵素消化的組織為數週至數個月),其族群均一,且維持著帶有相關的生物標記的特定的組織-對-細胞類型。
本發明之非酵素方法提供與已知的酵素法所獲者為不同的細胞。因此,於一具體例中,本發明提供一種胎兒骨骺軟骨細胞細胞株,其係由本發明之非酵素方法獲得,命名為FE002-Cart且已於2012年7月3日以寄存編號ECACC 12070303-FE002-Cart寄存。於另一具體例,本發明提供一種胎兒跟腱細胞細胞株(也記載為胎兒跟腱源祖細胞細胞株),其係由本發明之非酵素方法獲得,命名為FE002-Ten且已於2012年7月3日以寄存編號ECACC 12070302-FE002-Ten寄存。於另一具體例,本發明提供一種胎兒皮膚纖維母細胞細胞株(也記載為胎兒皮膚源祖細胞細胞株),其係由本發明之非酵素方法獲得,命名為FE002-SK2且已於2012年7月3日以寄存編號ECACC 12070301-FE002-SK2寄存。
一旦建立了胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞培養物,可將其使用在生產能夠製造新的軟骨細胞與組織的軟骨細胞。胎兒骨骺軟骨細胞分化為軟骨細胞及接著從其製造軟骨組織的過程,可藉由對於培養基添加或不添加特別的外生性生長因子而觸發,例如添加或不添加抗壞血酸鹽之BMP,
比如BMP-13或TGF-β。可應用與對於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞已建立者為同樣的程序。
本發明更考量軟骨細胞之培養物及包含胎兒骨骺軟骨細胞及軟骨細胞之混合培養物的建立及維持。就胎兒骨骺軟骨細胞而言,當軟骨細胞之培養物、或胎兒骨骺軟骨細胞及軟骨細胞之培養物建立,該細胞的族群藉由取決於細胞密度而更換到細胞培養基,於會進行細胞增殖但不形成軟骨的條件,比如在缺少TGF-β或其他生長因子的培養基中,以有絲分裂在體外擴增。針對軟骨細胞源祖細胞,必需在到達足夠的細胞密度時,將軟骨細胞之培養物、以及胎兒骨骺軟骨細胞及軟骨細胞之混合培養物移到新鮮的培養基。因此,應預防形成單層細胞或使此現象儘可能減少,就作法而言,可藉由例如將一部分細胞移到新的培養容器或移到新鮮培養基來實施。此種移走及轉移應在細胞單層超過約25%匯合(confluency)的任意培養容器中進行。或者,可將培養系攪動以防止細胞黏連(sticking)。此相同方法可以同樣應用在胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞。
本發明之另一具體例中,從胎兒尺骨軟骨單離的胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞的族群,係在體外以有絲分裂擴增及培養以成為能產生供作治療用途的軟骨組織與細胞的軟骨細胞。該相同方法也可同樣應用在胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞。因此於一具體例中,本發明係關於由本發明之非酵素方法獲得之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)、胎兒跟腱細胞及胎兒皮膚纖維母細胞作為治療劑的用途。
於本發明之另一具體例,從胎兒尺骨軟骨單離的胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞係冷凍保存且以冷凍保存在一"庫"中,可視需要從庫解凍並用於製造軟骨組織及細胞。從此採集或生產的該胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞,可以在"庫"中冷凍保存數年的期間。該細胞可視需要利用解凍從該庫提取,且該已解凍的細胞可使用於製造新的組織及細胞,以供修補、替換或加長軟骨,及其他間葉組織比如骨骼、腱或韌帶。該方法可相同地應用在胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞。
由於從胎兒尺骨軟骨樣本單離之細胞有"胎兒"的本質,被移植的本發明之胎兒骨骺軟骨細胞、或從其所產製之軟骨組織的免疫排斥可以極小化。因此,依本發明另一具體例,此種細胞作為供使用在任意需要之對象的"無
所不在(ubiquitous)之捐贈細胞"係為有用。相同特性針對胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞也可觀察到。
於本發明之另一具體例,將胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞細胞、胎兒跟腱源祖細胞或胎兒皮膚源祖細胞懸浮於水凝膠溶液,以能夠對於患者注射或移殖。或者,可先將細胞接種到水凝膠中,然後在移植前先培養。較佳者,將細胞在水凝膠中培養,使其在移植前先以有絲分裂擴增。
於本發明之又另一具體例,從本發明之胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞細胞製備新的軟骨組織及細胞族群,並用於以該技術領域中已知的任意修補、替換或增長的技術或未來將開發的技術來修補、替換或增長對象中的軟骨組織。例如,可將本發明之胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞細胞接種在由生體可相容性的非活體材料製成的立體的框架或支架上,該等材料有能由軟骨細胞橋接的空隙空間、開口或孔洞。在適當的體外培養條件下,該被接種的細胞會實質上包絡該立體的框架並且分泌胞外基質以形成可進行體內移植的新的、活的軟骨組織。或者,將本發明之胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞細胞接種在立體的框架,並立即移植到對象的一部位。該被接種的細胞在體內進行形成新的軟骨組織,或刺激接受者軟骨修補及重新組織。該方法可以同樣應用在胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞,以形成或刺激接受者腱或皮膚的新的腱組織或新的皮膚組織修補或重新組織。
於另一具體例,本發明之細胞被接種的立體框架,係更包含或包覆有一或更多種有生物活性的藥劑或其他選自於抗發炎劑、生長因子、免疫因子等組成的群組中的化合物。
於本發明又另一具體例,本發明之胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞細胞係接種並在立體框架上生長,並且放置於能夠容許間歇性壓力改變的容器內,或放置在特製於用來以體外產製軟骨組織構造物的生物反應器系,該生物反應系容許在生長期間將腔體加壓,並且對於軟骨細胞藉由對流(convection)提供足夠的營養素補給。相同方法可同樣應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞。
以支架為主的細胞療法提供一極明瞭的優點,即所傳送之治療用組織產生劑,在本情況中為細胞,可以輕易地定位且能與該支架一起以關節鏡
手術移殖(Iwasa et al.,2009)。此療法繞過需要重大的侵入性外科手術(整個關節置換),且儘可能保留原本的組織,所以,顯著減少可能非常負面影響該療法的發炎發生(van Osch et al.,2009)。為了提供支持3D組織生長的模板,需要小心地搭配支架的結構與組成。合成的材料,比如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)及聚甘醇酸(PGA),及天然衍生的材料,比如透明質酸、硫酸軟骨素及幾丁聚糖,已在進一步施加或未加以化學修飾及側基團的狀態被使用,以產生骨骼及軟骨(Ahmed et al.,2010;Chung et al.,2008;Khan et al.,2008)。
生物材料支架其作用為當作胞外基質,來提供保護細胞的物理性結構並導引組織生長。整合到基質中對於具有供運送到關注的手術部位的立體系是必要的。胎兒細胞,不像成體及間葉細胞,其顯示由於其固有的貼附及遷移性質,會穿透各種的生物性材料。此性質容許將該細胞快速地接種到各自的生物材料,並且在移植前對於移植物做較少的處理。不同的材料及組建方法能形成有不同性質可適應於軟骨組織工程的生物材料。已有人開發了許多的供其他手術用途的生物可降解的生物材料及水凝膠,比如止血海綿及組織填料(Mast et al.,1993;Patino et al。2002;Drury and Moony,2003)。此等生物材料提供臨床等級材料(分類為醫學裝置),需測試其生體相容性,並確保無由於生物材料傳遞系及細胞產物相關所產生的放射性衍生產物。
於另一具體例,本發明之胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞細胞,係未附著於立體框架而是直接利用例如注射以投予到體內的一部位,以在該部位產生新的軟骨組織及細胞族群。相同方法可同樣應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞。因此於一具體例中,本發明係關於一種由本發明之非酵素方法獲得之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)之用途,其係供製造新的軟骨組織及/或立體建構物;一種由本發明之非酵素方法獲得之胎兒跟腱細胞之用途,其係供製造新的腱組織及/或立體建構物,及一種由本發明之非酵素方法獲得之胎兒皮膚纖維母細胞之用途,其係供製造新的皮膚組織及/或立體建構物。
本發明之另一具體例中,本發明之胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞細胞,使用外生性補給的生長因子例如TGF-β、或BMP比如BMP-2、BMP-12及BMP-13刺激,以產生軟骨。
於本發明又另一具體例,本發明之胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞細胞可經過遺傳工程處理以產生或增加特定的生長因子、胜肽、蛋白質或其他作用於增強產生的軟骨量、或改善移植的成功率,例如降低排斥的風險或伴隨移植物的發炎或增加產量的分子。相同方法可同樣應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞。
本發明也係關於前述方法的產物,包括但不限於本發明之胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞細胞、經有絲分裂擴增者等;由其產製的新的軟骨組織;由其萃取的胞外基質;及立體軟骨/框架建構物。本發明亦係關於此等細胞、建構物及組織的用途,供在體內修補、替換或增長軟骨,或在體外形成有用於產製新的軟骨組織或有生物活性之劑的立體軟骨培養物,或測試有潛力的治療劑的細胞毒性。相同方法可同樣應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞。
本發明之一具體例中,從胎兒尺骨軟骨單離的胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞,以及從其分化的軟骨細胞,可用於產製新的軟骨組織及細胞以供修補或替換軟骨。相同方法可同樣應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞,此等可用於產製新的腱或皮膚組織及細胞以供修補或替換腱或皮膚。
本發明之另一具體例中,依本發明之方法從胎兒尺骨軟骨單離之胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞,及從其分化的軟骨細胞,可用於作為治療劑。較佳為,依本發明之方法從胎兒尺骨軟骨單離之胎兒骨骺軟骨細胞、及從其分化的軟骨細胞,用於骨軟骨修補(包括軟骨修補及腱修補)與再生之方法及用於治療骨軟骨疾病或缺陷(包括骨軟骨病變、損傷、創傷、碎裂和骨折、下軟骨的骨骼壞死和骨軟骨炎)及/或關節炎的方法。相同方法可同樣應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞以供腱及皮膚之特定治療。
因此於一具體例中,本發明係關於一種由本發明之非酵素方法獲得之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC),其係用於骨軟骨組織及肌肉骨骼組織之修補與再生的方法;一種由本發明之非酵素方法獲得之胎兒跟腱細胞,其係用於腱組
織及肌肉骨骼組織之修補與再生之方法;及一種由本發明之非酵素方法獲得之胎兒皮膚纖維母細胞,其係用於皮膚組織之修補與再生之方法,及用於處理燒傷、創傷及纖維化病症。
本發明之另一具體例中,提供:一種由本發明之非酵素方法獲得之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC),其係供使用於治療骨軟骨疾病或缺陷、關節炎及肌肉骨骼疾病之方法;一種由本發明之非酵素方法獲得之胎兒跟腱細胞,其係供使用於治療肌肉骨骼疾病及腱病變之方法;一種由本發明之非酵素方法獲得之胎兒皮膚纖維母細胞,其係供使用於治療皮膚疾病之方法。
胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)或軟骨源祖細胞在骨軟骨組織工程的用途非常有前景。事實上,在整個胎兒發育過程中,該骨骺成為二次骨化中心(SOC)的主要部位,其將FEC凝聚物(condensate)轉形成關節的軟骨的區域、以及在血管侵入後成為骨骺索前軟骨(trabecular)骨骼及骨髓的部分(Blumer et al.,2008;Onyekwelu et al.,2009)。已知胎兒軟骨,如同在胎兒皮膚所觀察到,有強大的自我修補能力。於山羊胎兒模型,顯示缺陷在無外痂或纖維組織形成的狀態被修補(Namba et al.,1998)。
本發明之細胞(胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞及軟骨細胞)以及軟骨組織,可於體外使用以篩選製藥劑、生長/調節因子、抗發炎劑等的有效性及細胞毒性的多種化合物。為此,如上述本發明之細胞、或組織培養物,係於體外維持並且暴露於待測的化合物。細胞毒性的化合物其活性可藉由其損傷或殺死培養物中之細胞的能力來測量。其可容易地利用活體染色技術評估。生長/調節因子的作用,可藉由以體外分析活細胞數目來評估,例如總細胞數計數,及計數差別的細胞數。此可藉由使用標準的細胞學及/或組織學技術來達成,包括採用能識別類型專一性的細胞抗原之抗體的免疫細胞化學技術。可以評估各種藥物對於本發明細胞在懸浮培養物或上述立體系狀態的效果。因此,從胎兒尺骨軟骨單離的胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞,也可用於開發供治療關節炎、骨軟骨缺陷、軟骨修補、腱修補的先進的治療劑及/或醫學裝置。相同方法可以同樣應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞,其也可應用於開發供治療肌肉骨骼組織的先進的治療劑及/或醫學裝置。
因此於本發明之一具體例中,提供一種篩選方法,其係供發展用於治
療關節炎的、骨軟骨缺陷、軟骨修補、腱修補、肌肉骨骼組織修補及皮膚修補之治療劑及/或醫學裝置,包括使用由本發明之非酵素方法獲得之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)、胎兒跟腱細胞或胎兒皮膚纖維母細胞。
本發明之細胞(胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞及軟骨細胞)以及軟骨組織,可用作模型系,以供研究生理情形或致病情形。例如,被固定的關節會相當快速在許多方面受損。軟骨細胞的代謝活性由於喪失蛋白多糖而受影響,且很快觀察到水含量增加。軟骨的正常白色、晶瑩的外觀變得沉悶、色調偏藍,且軟骨厚度減少。然而,至今尚不明瞭此改變量究是歸因於營養上的欠缺、壓迫依存性代謝恆定受擾亂。本發明之細胞及軟骨組織,可用於在不同的物理條件例如間歇加壓、及藉由將營養培養基以幫浦打入及打出軟骨建構物而決定軟骨的營養需求。此特別有用於研究與年紀相關或與受傷相關的關節軟骨(例如膝蓋中)的拉伸強度減低的基礎成因,其使得強度減弱的軟骨易受創傷損害。相同方法可同樣應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞,有用於研究年紀相關或受傷相關的腱及皮膚之拉伸強度減低而造成受創傷性損害或年紀相關性損害的基礎原因。
本發明之細胞(胎兒骨骺軟骨細胞或軟骨源祖細胞及軟骨細胞)及軟骨組織,也可用於研究細胞激素及其他原發炎媒介因子例如IL-1、TNF及前列腺素的作用機制,此等係由於風濕性疾病而釋放到滑膜液。因此,可在體外測試該患者自己的關節,以研究此等化合物對於本發明之細胞之生長的作用。此外,可針對特定的患者篩選最有效的細胞毒性及/或藥學製劑,比如篩選減少或防止軟骨再吸收或以其他方式增進關節軟骨的均衡生長的製劑。已證實在體外有效的藥劑,可接著用來以治療性地處置患者。同樣方法可相同地應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞,有用於研究造成組織修補不均衡的生長因子、細胞激素及其他發炎前驅媒介因子的作用機制。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可了解在此敘述的本發明在有特別敘述以外,可經改變以及修飾。應瞭解:本發明包括所有未偏離本發明精神或主要特性的所有此等改變以及修飾。本發明也包括所有在本說明書個別或共同地提到所指出的步驟、特性、組合及化合物,以及該等步驟或特性的所有組合或任意2或更多種。所以本揭示意欲視為供理解而非限
定性,本發明之範疇係由附帶的申請專利範圍所指明,且所有在含意及均等範圍內的所有改變均意欲包括在內。
前述敘述將由以下的實施例而更能被完整了解。然而,此等實施例係本發明實施的例示方法,並未意欲要限定本發明的範疇。
該近側尺骨的骨骺、跟腱及腹部皮膚,係依照嚴格的移殖法律及針對器官捐贈及篩選的細則及指南處理以創製供組織工程應用的FEC、腱及皮膚親代細胞庫(CHUV Ethics Committee protocol # 62/07)。將組織活體組織切片(軟骨,~2mm3,腱,~0.2mm3,皮膚,~2cm2)做微切片並且利用物理性附著於經解剖刀刻劃的表面而分散(未使用酵素處理,以確保僅有貼附的軟骨、腱或皮膚長出,且確保細胞族群的一致:此係對於臨床用途為必要的準則)。在1~2天至1星期觀察到FEC、腱及皮膚長出,並且在1週及2週完成擴增。以每個小玻璃瓶5-10 x106個細胞共50-200個小玻璃瓶,建立親代細胞庫,並且在液體氮的氣相中保存。對於單離的細胞進行體外定性,顯示以單層培養物的形式有出色的均質性,且有傾向於重疊的顯著的增殖潛能(3D培養物)。FEC、腱源祖細胞及皮膚源祖細胞在前6代似乎未顯示有顯著的表型變動。FEC、腱源祖細胞,當置於丸狀培養形式,能夠自發性的接合,使基質沉澱並且表現基礎的成軟骨或腱細胞標記。流式細胞儀分析顯示出單峰的分布,代表有均質的族群。與由成體骨髓所衍生之MSC比較,結果顯示FEC或腱表面標記輪廓與軟骨或腱細胞一致而非未分化的源祖細胞表型。
細胞庫係在Lausanne大學醫院建立,係從有經告知後書面同意且已由1993年起成立的當地醫學學校倫理委員會,更具體而言為自2007前成立的臨床細胞庫許可的中止懷孕的已懷孕12~14週之間獲得的胎兒活組織切片。迄今已從2名獨立的捐贈者成功地發展出臨床前的關節軟骨細胞庫。使用其中之一(FE002-Cart第0代;FE-002-Ten第0代;FE-002-SK2第0代),將能夠建立所有供臨床前及臨床試驗用的低傳代數的細胞(第3代的
MCB,第5代的WCB)。
從約0.3 cm3關節的軟骨(橈骨)(見圖7)、約0.2 mm3跟腱及約1 cm2腹部皮膚,製備0代及1代的臨床前細胞庫。將組織儘可能分切為<0.5 mm3的碎片,使生長於補充了10% FCS及麩醯胺酸的DMEM培養基,並將細胞於第3及6代或第1及9代用於定性及實驗。在切割前將其生長成匯合,並以PBS洗滌2次並計數。
儘可能將組織分入二個10 cm平盤,每盤有約5片完整組織碎片(<0.5 mm3)。先將組織培養皿於層流罩下以無菌解剖刀深深地刻畫出棋盤格樣式。將組織的碎片放入有刻畫的塑膠區,溫和的切碎並使碎片附著在塑膠的刻紋內。在各碎片的周圍放置少量的營養培養基,以防止組織在頭24小時漂浮。經過頭24小時後,對各10 cm平盤加入8 ml的培養基,並且在傳代前每週更換2次。使此等碎片在僅補充10%胎牛血清(Hyclone)的DMEM中生長,以協助確保細胞培養物的一致性。細胞培養物於37℃於95%空氣/10%二氧化碳的加溼的氛圍中生長。重要者且需提及的:所有供臨床試驗的細胞培養物所必要的營養成分,均應有完整的安全要求及追蹤。所有的動物衍生的產物,例如胎牛血清及胰蛋白酶,應採用已測試過外來劑的特定的臨床批的胰蛋白酶及經gamma輻射的血清。雖然在第1天後可觀察到細胞生長,但是在細胞再生長5-7天後,將組織及細胞碟利用胰蛋白酶分解(0.25%胰蛋白酶-0.1% ethylene diaminetetraacetic acid[EDTA])或單獨使用EDTA來從平板移走,以傳代到多組織培養燒瓶或將其冷凍以供製作細胞庫。於此點,將有些胎兒軟骨、胎兒腱或胎兒皮膚細胞以個別的單元冷凍在液態氮中,並將其他者以1,000-2,000細胞/cm2或10,000-50,000細胞/cm2傳代以供產製PCB。將細胞以2000 g離心15 min並且再懸浮於冷凍溶液DMEM(5 ml)+FCS(4 ml)+DMSO(1 ml,Fluka),於-80℃冷凍,在Nalgene Cryo 1℃冷凍容器(Nalgene)中以1 ml等份(~5-10百萬個細胞)達到1℃/min的冷卻及冷凍曲線。24小時後,將細胞移到液態氮以作更長期保存。
使用1-2瓶小玻璃瓶的臨床前胎兒關節的軟骨、胎兒腱或胎兒皮膚製備供定性用的一致的工作細胞庫(WCB)。程序的設計,如同在cGMP製造
時使用者。簡而言之,開始時將細胞以1,500細胞/cm2或1,000-100,000細胞/cm2放於含有15 ml的營養培養基(DMEM+10%臨床級胎牛血清,Invitrogen)的100個細胞培養燒瓶(T75,Nunc)。將有細胞之培養基每2天更換一次,並且細胞的產製/增殖係於37℃、濕度10%實施10-14天,或以較高密度的接種量實施3-6天。於第12-14天,將10 T75批的燒瓶實施TrypLE消化,以將細胞從燒瓶分離,並置入離心管內。在離心前於各離心管中加入等體積的營養培養基以緩衝TrypLE的作用。將從所有的燒瓶獲得的細胞丸粒再懸浮於200 ml冷凍培養基溶液(DMEM,血清,DMSO,比例5:4:1),並等分到100個Nunc冷凍小玻璃瓶(1.5 ml),稀釋度為10 x 106個細胞/ml。
經細胞於-80℃冷凍,於Nalgene Cryo 1℃冷凍容器(Nalgene)以達到-1℃/min的冷卻及冷凍曲線的速度。24小時後,將細胞移到液態氮的氣相中。該WCB處於第2傳代,且係用於細胞定性,所使用的細胞處於各種傳代數,但主要是2-8之間。
在申請人的整個研究,比較製作成細胞庫的胎兒軟骨細胞與依同樣技術條件在其實驗室製作的BM-MSC細胞庫。MSC係同種異系(allogenic)細胞,且係在組織中在軟骨再生的臨床前及臨床實驗中已提出並使用的主要的其他細胞類型的1種(但是,間葉細胞非組織專一性,必需經過程控以成為其他組織類型)。再者,MSC細胞庫較不穩定,必需在第4代以下使用。相同的方法可同樣應用在胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞。
胎兒關節的軟骨細胞庫,已與BM-MSC細胞比較,藉由FACS分析進行表面標記的定性、針對功能性試驗之基質沉積進行定性。已將衍生自關節的骨骺組織的胎兒軟骨細胞單離,且已將親代細胞庫冷凍。
在初步實驗中已比較過的標記包括:
CD105:Endoglin。TGFBeta受體複合體的一部分。MSC陽性選擇時的主要標準。
CD90:Thy-1。MSC陽性選擇時的主要標準。
CD44:PTPRC。白血球標記。bmMSC陰性選擇時的標準。
CD73:NT5E。MSC陽性選擇時的主要標準。
CD166:ALCAM。
(見圖8及9)
相同方法可同樣應用於胎兒腱源祖細胞及胎兒皮膚源祖細胞。
最初先測試供醫療用途的不同基質的生體可相容性。在最初的實驗中係使用各種組成的水凝膠、膠原蛋白,以及一些生物可降解的聚合物。針對水凝膠,將細胞培養於已插入在預製的瓊脂模型內的凝膠內。此舉對於防止細胞附著於試管,以及能容許立體生長係為必要。該模型之製備係藉由以移液管注入1 ml的熔融瓊脂糖(20%瓊脂,低熔點瓊脂)到1.5 ml的無菌圓錐狀的微量離心管(eppendorf),再於每個微量離心管的液體瓊脂插入0.5 ml的無菌圓錐狀微量離心管,使其固化,然後將該0.5 ml的微量離心管抽出,留下圓錐狀的嵌入物。在加入凝膠及細胞後,以移液管將100 μl的培養基加到各管的表面上,每週更換2次培養基。將細胞在37℃培養箱中於相對濕度95%及10%二氧化碳的條件培養達1週、2週及4週。
針對基質製備,實施調查細胞接種密度(103至104細胞cm2)以及生長週期(1至28天)的初步實驗,以決定胎兒細胞傳送的最適條件。將第3或4代的胎兒細胞及BM-MSC(由於之後的穩定性的原故,MSC最多第4代)置於10 ml培養基(DMEM,含10% FBS),並接種在基質上。將含有細胞的該基質放入37℃的培養箱,於相對濕度95%及10%二氧化碳培養。然後在1小時之後加入額外的30 ml培養基。基質每週2次以營養培養基更換。生體可相容性也藉由接觸試驗測量,作法係將細胞培養在已有水凝膠或基質的組織培養板。以目視分析在水凝膠與基質交界的細胞生長及遷移。於1週、2週及4週之後,以吉姆薩染液將樣本染色,並拍照(Sony CyberShot DSC-S70,Zeiss微距鏡頭,Zoom 6x,330萬畫素)。
Claims (18)
- 一種體外非酵素方法,其係供單離、擴增及發展選自於由胎兒骨骺軟骨細胞、胎兒跟腱細胞或胎兒皮膚纖維母細胞構成之群組的胎兒細胞,包含以下步驟:a)使用胎兒樣本,其係選自於包含胎兒骨骺軟骨細胞之胎兒尺骨軟骨;包含胎兒跟腱細胞之胎兒跟腱;或包含胎兒皮膚纖維母細胞之胎兒腹部皮膚;b)將該胎兒尺骨軟骨、胎兒跟腱或胎兒腹部皮膚樣本微切片,並藉由以物理性附著於經解剖刀刻劃的表面而使其分散;c)於體外以該胎兒骨骺軟骨細胞、胎兒跟腱細胞或胎兒腹部皮膚纖維母細胞增殖的條件培養該胎兒尺骨軟骨、胎兒跟腱或胎兒腹部皮膚樣本;d)從其中選擇及單離最早貼附的胎兒骨骺軟骨細胞細胞族群、最早貼附的胎兒跟腱細胞細胞族群、及最早貼附的胎兒皮膚纖維母細胞族群。
- 如申請專利範圍第1項之體外非酵素方法,其中,胎兒尺骨軟骨樣本係胎兒近側尺骨骨骺的樣本。
- 一種胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)細胞株,其係由如申請專利範圍第1項之體外非酵素方法獲得,命名為FE002-Cart且寄存編號為ECACC 12070303-FE002-Cart。
- 一種胎兒跟腱細胞細胞株,其係由如申請專利範圍第1項之體外非酵素方法獲得,命名為FE002-Ten且寄存編號為ECACC 12070302-FE002-Ten。
- 一種胎兒皮膚纖維母細胞細胞株,其係由如申請專利範圍第1項之體外非酵素方法獲得,命名為FE002-SK2且寄存編號為ECACC 12070301-SK2。
- 一種如申請專利範圍第3項之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)之用途,其係用於產製新的軟骨組織及/或立體建構物。
- 一種如申請專利範圍第4項之胎兒跟腱細胞之用途,其係用於產製新的腱組織及/或立體建構物。
- 一種如申請專利範圍第5項之胎兒皮膚纖維母細胞之用途,其係用於產製新的皮膚組織及/或立體建構物。
- 如申請專利範圍第3項之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)細胞株,其係用於作為治療劑。
- 如申請專利範圍第4項之胎兒跟腱細胞細胞株,其係用於做為治療劑。
- 如申請專利範圍第5項之胎兒皮膚纖維母細胞細胞株,其係用於作為治療劑。
- 如申請專利範圍第3項之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)細胞株,其係用於骨軟骨組織及肌肉骨骼組織之修補與再生之方法中。
- 如申請專利範圍第4項之胎兒跟腱細胞細胞株,其係用於腱組織及肌肉骨骼組織之修補與再生之方法中。
- 如申請專利範圍第5項之胎兒皮膚纖維母細胞細胞株,其係用於皮膚組織之修補與再生之方法中及用於治療燒傷、創傷及纖維化病症。
- 如申請專利範為第3項之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)細胞株,其係用於治療骨軟骨疾病或缺陷、關節炎及肌肉骨骼疾病之方法中。
- 如申請專利範圍第4項之胎兒跟腱細胞細胞株,其係用於治療肌肉骨骼疾病及腱病變之方法中。
- 如申請專利範圍第5項之胎兒皮膚纖維母細胞細胞株,其係用於治療皮膚疾病之方法中。
- 一種篩選方法,其係用於開發治療劑及/或醫學裝置以供治療關節炎、骨軟骨缺陷、修補軟骨、修補腱、修補肌肉骨骼組織及修補皮膚,包含使用如申請專利範圍第3項之胎兒骨骺軟骨細胞(FEC)細胞株、如申請專利範圍第4項之胎兒跟腱細胞細胞株、或如申請專利範圍第5項之胎兒皮膚纖維母細胞細胞株。
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