CN1127288C - 愈伤材料及其保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对被培养的哺乳动物上皮细胞或间质细胞进行保藏的方法及其产物。该方法包括对上皮细胞用含有低温保藏量的单糖和/或二糖的溶液进行预处理。然后将被处理过的细胞以最小体积的溶液进行冷冻、干燥、或冷冻干燥以备后用。本发明避免使用将所述组织用于伤口之前必须清洗掉的物质。本发明还可以使上皮组织以干燥状态被保存。

Description

愈伤材料及其保存方法
本发明的技术领域
本发明涉及被培养的上皮细胞的低温保藏方法以及相关的产物。
本发明的技术背景
动物细胞技术的重大成就之一是建立了低温保藏活细胞和组织，从而增强了对有价值的物质的长期保藏。由于有了低温保藏，对于生物材料例如1)有限存活的分离组织，2)临床和实验室所需要的作为细胞来源的各种组织的有限供应等所伴随着的技术和操作困难都被减低或避免了。从这个观点看，发展和建立活细胞及组织的保藏方法具有对移植所用的各种细胞和组织十分重要的作用。
在早期的低温保藏，既对于成功地应用甘油在冷冻过程中避免细胞受损进行的报道(Polge et al，1949，Nature 164：666)之后，又有多种的保藏细胞和组织结构、存活性和代谢的方法和策略被进行过尝试。细胞和组织的保藏方法包括：专用等渗缓冲液，专用融化程序，使用低温保藏试剂，使用缓慢、快速或超速冷冻技术的方法，并按照一定顺序以防止用其它方法所无法避免的由于操作而对活样品的损伤。总体而言，在使用冷冻方法时，对组织造成损伤的主要原因之一是相的改变(从液体变为晶状固体水)，因为在形成冰的同时，伴随有电解质和pH值的改变，脱水以及其它尚不清楚的因素。这些有害作用已经通过添加低温保藏试剂和采用严格控制的冷冻程序而被降低。
低温保藏可分为两类。一类是透过细胞膜并降低细胞内的水浓度(例如，甘油，二甲亚砜(DMSO)，以及单糖如甘露糖，木糖，葡萄糖，核糖和果糖)。另一类是非穿透性试剂，其作用机制尚不清楚。一般使用的这类非穿透性低温保藏制剂包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，羟基乙基淀粉(HES)，二糖(例如蔗糖)，以及糖醇(多元醇如甘露糖醇)。最近，已经出现了结合穿透性及非穿透性试剂的冷冻程序。
对被分离的细胞的冷冻，一般都使用甘油和二甲亚砜作为主要低温保藏剂(Coriell，I.L.，1979，Methods in Enzymoloty LVIII，pages29-36；Doyle et al，1994，Cell & Tissue Culture；Laboratory Procedures，J.Wiley & Sons，pages 4C：1.1-4C：2.4)。动物胚胎也已经被成功地保藏于存在甘油的条件下(Whittingham et al.1972，Science 178：411-414；Niemann et al，1993，Mol.Reprod.Develop.36：232-235)。另一方面，干燥和冻干技术只在对于保藏除哺乳动物活细胞和组织以外的其它生物材料时产生优异效果。例如，冷冻干燥技术现在被广泛用于蛋白质，蛋白质混合物以及细菌的保藏。第一次将冷冻干燥技术用于保藏哺乳动物的细胞和组织的尝试没有获得成功(GreavesR.I.N.，1960，Ann.N.Y.Acad.Sci.85：723-728)。最近发现的活体对完全脱水所采用的生物化学机制(Crowe & Madin，1975，J.Exp.Zool.193：323-334；Womersley & Smith，1981，Comp.Biochem.Physiol.70B：579-586；reviewed by Womersley，1981，Comp.Biochem.Physiol.70B 679-678)或者对冷冻所采用的生物化学机制(Constanzo et al，1993，J.Exp.Zool.181：245-255；King et al，1993，Am.J.Physiol.265：R1036-R1042；Karow et al，1991，BioScience 41：155-160；Storey，1990，Am.J.Physiol.258：R559-R568)都对哺乳动物细胞和组织的保藏方法提出了新的建议。
具信，糖类(例如，海藻糖，乳糖，麦芽糖，纤维素二糖，蔗糖，果糖等)以及多元醇(例如，山梨醇和肌醇)可能提供对脱水的防护(Womersley & Smith，supra)和对冷冻的忍耐(Storey &Storey，1988，Physiol.Rev.68：27-84)，其中的一部分作用是替换细胞包膜周围的水分(Crowe et al，1984，Arch.Biochem.Biophys.232：400-407；Crowe et al，1984，Biochem.Biophys.Acta 769：141-150)。在脱水抗性和冷冻忍耐性中所涉及的糖类中，最具有意义的是葡萄糖。这种在脊椎动物细胞代谢中具有极端重要作用的单糖，在很多种蟾蜍的冷冻忍耐性中显示出扮演着重要的角色(Kinget al，1993，supra；Constanzo et al，1993，supra；Storey & Storey，1988，supra)。从冷冻忍耐性实验中获得的数据指出，在这些动物的冷冻过程中，1)葡萄糖在血液中的浓度显著提高；2)葡萄糖在由于冷冻造成的缺氧和局部缺血的状态中可能起着能源的作用；3)葡萄糖可能起着代谢抑制物的作用(Srorey & Storey，1988，supra)。
蔗糖已经被用作角膜组织保藏中低温保藏液的成分之一(Madden et al，1993，Cryobiology 30：135-157；Rich & Armitage，1991，Cryobiology 28：159-170；MeCarey et al.，1973，Cryobiology 10：298-307)，以及被使用在胚胎组织的冷冻保藏中作为低温保藏液的成分之一(Isachenko等，1993，Cryobioloy 30：432-437)。此外，葡萄糖和其它的糖类已经被用于血红细胞的冷冻干燥中(Goodrich等，美国专利第4,874,690、5,171,661和5,178,884号)。然而，血红细胞的保藏不需要维持各种组织的结构形状，而这种结构是用于移植的组织必须具有的。在上述方法中，血红细胞的存活性仅用定量性红细胞溶解，血小板收复，或糖酵解酶的检测来确定(见Goodrich等的美国专利第4,874,690和5,178,884号)，但是，没有被用与细胞整体性和组织结构性相关的参数来确定，例如，蛋白质合成和分泌。
Green和其同行描述了培养人上皮角化细胞的方法(Rheinwald& Green，1975，Cell 6：331-343)，该方法已经被扩展应用到其它上皮细胞的培养中。在这样的培养条件下，获得了成层的适用于对大面积烧伤、溃疡、和其它皮肤创伤进行移植的上皮细胞层(Gallicoet al.1984，New Eng.J.Med.311：448-451；Heighten et al，1986.J.Am.Acad.Dermatol.14：399-405)。通过这种方法获得的经过培养的上皮细胞也已经被用作临时愈伤材料(T.J.Phillips et al.，1989，J.Am.Acad.Derm.21：191；Bolivar-Flores et al.，1990，Bums 16：3-8)，上皮细胞培养物已经成为人体表面再造的强有力的工具之一，但是，它们的有限的存活生命期限制了它们在距离生产设施并不太远的医疗机构中的使用。在将上皮层移出并送往医院之后，它们的存活期都很短。因此，建立保存这些培养的上皮层的方法将能够建立它们的保存库和在世界范围内输送。在这方面，已经进行了一些尝试，有一些人已经发展出了使用甘油或二甲亚砜作为低温保藏剂的低温保藏方法，并结合有专用的冷冻程序(见1994年Cancedda和DeLuca的美国专利第5,298,417号)。其他的人已经用含有细胞穿透性玻璃体成型制剂(具体而言是甘油)和非穿透性保护试剂(优选聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖或羟基乙基淀粉)(见1992年Tubo等的美国专利第5,145,770号)低温保藏了培养的上皮细胞层。然而，这些方法都要求特殊和复杂的冷冻程序和融化程序，从而，这些方法都显示出在广泛的临床应用方面具有相当的困难，或者在使用这些上皮细胞层的过程中由于融化和清洗程序而对医疗效果造成相当的负作用。
本发明概述
本发明提供了保藏培养的上皮细胞和间质细胞以用于创伤修复的方法和产物。该方法可以在不需要清洗低温保藏成分的条件下使用被保藏的组织。该方法还避免了操作上的困难以及先有技术中的冷冻和融化程序。本发明还进一步可以在比先有技术更高的温度条件下贮藏被保藏的细胞。在完成上述的同时，本发明还保持了在使用保藏的细胞于创伤修复中所需要的结构特征和功能特征。细胞的功能，例如蛋白质合成以及对细胞产物的分泌(例如生长因子和细胞外基质成分)的水平都与常规方法的冷冻细胞或组织的活性相似或更好。本发明的目的
本发明的目的之一是提供一种保藏培养的哺乳动物上皮细胞或间质上皮细胞的方法。细胞被培养在含有低温保藏量的单糖或二糖的溶液中，将多余的溶液从细胞中移去，然后通过存在有所述低温保藏量的糖类的条件下将细胞冷冻、干燥、或冻干以进行保藏。细胞优选成层培养的上皮角化细胞。在一个实施方案中，细胞是人体细胞，优选将过量的溶液通过吸出或排干的方法移出。在这种条件下，所存在的溶液的数量不超过30ml/50cm2培养的角化细胞层，而且更为常用的是，它们的存在量如此之小以致于一般无法测定。
优选的培养溶液含有0.05～3.5M的葡萄糖和0.1mg～40mg/ml人血清白蛋白。最优选的是该溶液中不含任何在使用所述培养细胞于创口之前需要将其清洗掉的对恢复创伤有害的外源性物质。此外，这种溶液也可以不含任何例如二甲亚砜、吡咯烷酮、甘油、和非人的血清白蛋白。
本发明的另一目的是提供根据上述方法生产的产物。所述产物之中的一种是可移植的组织。该组织是被培养的哺乳动物的上皮细胞或间质细胞，并且在优选的实施方案中是成层的上皮细胞。这些细胞被包围在胞外相中。其中所述的胞外相含有低温保藏量的单糖或二糖。该胞外相还可以不含有上述的任何在使用所述培养细胞于创口之前需要将其清洗掉的对恢复创伤有害的外源性物质。例如，细胞可以被冷冻在最小体积的含有单糖和/或二糖的溶液中。同样，细胞也可以被干燥或冻干。
本发明的另一目的是提供低温保藏的创伤修复组织。这种组织是冷冻的被培养的哺乳动物上皮细胞或间质细胞，这种组织在经过了-20℃～-70℃保藏3个月、6个月、或更长时间之后，在将其用于病人的创伤表面的时候，它们被保持的结构和功能性特征足以促成创伤的愈合。另外，成层的连生的哺乳动物上皮细胞培养物是优选的细胞。
本发明的另一目的是提供干的培养的哺乳动物上皮细胞或间质细胞，经过干态储藏之后，在用于创伤恢复时，它们的结构和功能特征都被保存并足以促进伤口愈合。同样，连生的被培养的哺乳动物上皮细胞层是优选的。根据本发明的这一方面，本发明的这些材料可以在干态下直接使用于伤口，也可以先经过湿润后再用于伤口。因此，本发明还涉及用上述各产物对患者进行处理的方法，特别是，但又不限于将所述的干态的上皮细胞培养层使用于伤口。
本发明的低温保藏溶液除了含有单糖和/或二糖之外，还可以含有但又不限于此的其它低温保藏制剂、蛋白质或蛋白质混合物作为另外的保护制剂。例如，该溶液可以含有全血清或血清白蛋白，以及有助于维持和保护组织存活、结构、和/或代谢活性的穿透性或非穿透性保藏制剂。在一个优选方案中，人的角化细胞被培养在含有葡萄糖和人血清白蛋白的低温保藏溶液中，其中所述的溶液不含有任何在使用于创口之间必须清洗掉的低温保藏制剂。因此，本发明在融化后并在使用到创口之前不需要进行冲洗就可将冷冻的上皮细胞层使用于创口。
本发明的上皮细胞培养物可以附加或不附加在基质上，如果需要，也可以结合有或不结合有背衬材料。因此，本发明还涉及对培养的上皮细胞层、皮肤等同物、间质细胞衍生出的组织和/或培养的细胞进行保藏的方法。本发明还可以采用简易的一步或两步冷冻程序并且随后将组织贮藏或进行库存。如果组织是干燥的，那么它就可以被保持在室温下，虽然低温保藏较好。如果组织被冷冻，该组织可以被贮存在-20℃，尽管更低的温度更为可取。
本发明的这些和其它的目的将在以下给以更为详细的描述。本发明的最佳实施例
本发明涉及一种新的保藏方法以保藏1)通过表皮角化细胞的培养而获得的上皮层培养物，角膜角化细胞或其它类型的上皮细胞；2)被培养的但不连生的上皮细胞；3)皮肤替代物，等同物等(此处所说的皮肤等同物是通过将表皮角化细胞培养于由胞外基质成分，例如胶原蛋白或透明质酸、或皮肤等同物例如去上皮化的碎片和含有间质细胞或不含间质细胞的胞外基质成分的凝胶上)；4)间质细胞衍生的愈伤的组织。重点在于对人体进行创伤修复的细胞。上述各类细胞可以在经过与基质相结合或不结合、具有或不具有背衬材料的条件下进行培养。这类所述的基质材料是本技术领域的技术人员所熟知的，包括凝胶、薄片、或胞外基质例如透明质酸、纤维蛋白胶及合成性产物。同样，所述的背衬材料也是本技术领域的技术人员所熟知的，包括纱布、塑料、硅树脂、水凝胶和葡聚糖。
需要被保藏的组织首先放在含有低温保藏量的单糖或二糖的营养性基质或等渗溶液中进行培养。经过一定的培养时间后，通常约为5分钟～8小时室温培养，将多余的溶液从细胞中移去，随后将细胞于存在有低温保藏试剂的条件下冷冻、干燥、或冻干。
本文中所述的低温保藏量的单糖或二糖是指在根据本发明的方法中所使用的能够对上皮细胞或间质细胞进行保藏的单糖、二糖、或单糖和/或二糖的混合物的量，并且不含有那些外源性的对伤口康复有不良影响的低温保藏试剂。例如二甲亚砜和聚乙烯吡咯烷酮是常规的低温保藏制剂，但通常都被在对伤口进行移植之前被清洗掉。本发明的低温保藏不必要使用这些制剂，因此避免了额外的不需要的清洗步骤。在本发明的优选方案中，单糖即葡萄糖的使用浓度在0.05M～3.5M之间。该下限比血液、细胞外液、或常规营养培养基中葡萄糖(0.0055M)的浓度高8～10倍。而且比营养性培养基中最高葡萄糖含量(0.25M)高2倍。优选的葡萄糖量是介于0.1M～1M之间的数量级。其它单糖或二糖的优选用量将依据具体的使用条件、具体的被培养细胞、以及是否存在有任何其它生物学相容性保护制剂例如人血清或人血清白蛋白，以及这些物质的含量来确定。在所有情况下，低温保藏量将比存在于营养培养基等中的单糖和二糖的数量高至少二倍。
本发明的溶液优选不含对创伤愈合有负面影响的外源性物质。这些外源性物质是本领域内技术人员所熟知的，并且包括一些常规的低温保藏试剂。例如二甲亚砜、聚乙烯吡咯烷酮、以及多羟基糖类等都被通常用作为低温保藏试剂，一般在将组织使用于创口之前，都要将这些物质从融化的组织中清洗出去。同样，葡聚糖以及非人体来源的蛋白质例如白蛋白等也通常都被用作低温保藏试剂，并且在将组织用到创口之前，先将这些物质清洗出去。另一方面，有许多其它的低温保藏试剂例如人血清白蛋白、脯氨酸、精氨酸、豆蔻酸、低浓度的锌等都不影响伤口愈合。因此，在本发明的优选实施方案中给出了在将保藏的组织用于伤口之前不需要额外清洗步骤的生物学相容的保藏溶液。
在本发明中，对组织的保藏可以在最小溶液体积中进行，这一点与先有技术不同，并且是本发明的优点之一。其优越之处是操作简便，并且可以将组织放在袋中或盘中，因此在保存过程中不用担心保存液的溅洒，而且不需要对盘子进行封闭等其它先有技术的缺点。本发明的一个意外的优越之处是使用本发明的低温保藏制剂对细胞和组织进行冷冻干燥的能力。具体而言，本发明使得成层的上皮细胞可以被冷冻干燥、储藏、再次湿润(或不用再次湿润)以用于创伤的修复。储藏可以在相对较高的温度下进行，可以将这些产品运往较远的地区使用，同时省去了对既昂贵又非常有限的-70℃冷冻库的需要。在进行冷冻之前将低温保藏液体尽可能地去除，促进了冷冻干燥的进行，由于使用最小体积的液体，所以，冷冻、干燥、融化等步骤都可以快速进行，而且对细胞功能的损害最小。这样，本发明就提供了被保藏的上皮创伤修复组织，它包括干燥的、连生的被培养的上皮细胞，在干燥状态下储存后，可以将其用于伤员的创伤表面，而且其结构和功能特性的完整性将被保持，并足以引起伤员的创伤得到康复。
通过重力作用和或吸取操作可以将多余的液体从细胞中去除以达到最小体积。其它的方法对本领域的技术人员来讲是显而易见的。一般使用不超过30ml/50cm2组织的体积的液体，更低一些则更好。
本发明使用的低温保藏制剂包括透过性和非透过性的制剂，以及在将被保藏的组织用于伤口之前必须清洗掉的制剂(优选具有生物学相容性的制剂)。已知的低温保藏制剂包括：单糖(例如，葡萄糖、果糖、麦芽糖、核糖、甘露糖、木糖)，二糖(例如，海藻糖、蔗糖、纤维素二糖、乳糖)，三糖(例如棉子糖)，糖醇(例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、磷酸化肌醇、甘油)，多糖(例如，羟基乙基淀粉、葡聚糖、磷酸葡聚糖、动物淀粉、硫酸乙酰肝素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、琼脂糖)，羧酸(例如，焦酒石酸盐、2，3-二磷酸甘油酸盐)，蛋白质和混合蛋白质(例如，血、动物血清、血浆、人白蛋白、小牛白蛋白、小牛凝胶、鱼凝胶)。
优选的低温保藏溶液包括单糖溶液、蛋白质溶液或混合蛋白质溶液。优选的单糖是葡萄糖，其加入浓度为0.05～3.5M之间，蛋白质和混合蛋白质的加入浓度为0.1～40.0mg/ml之间。最优选的是，溶液由营养基质组成，含有0.1～1.0M葡萄糖和1.0～5.0mg/ml人血清白蛋白(或者0.05～40mg/ml血清，最优选人血清)。需要被保藏的材料被浸没在溶液中，温度为5℃～40℃，优选室温。培养时间为5分钟至8小时，虽然也可以为更长的时间，但是，一般不需要。培养之后，通过吸取作用或者重力作用将多余的液体去除以使该材料被以最小体积的溶液进行冷冻。吸取作用或重力作用使得对每50cm2组织的溶液不超过30ml，更为经常出现的是使溶液达到最小体积(即低到一般无法测量)。该材料可以被冷冻，冷冻干燥或干燥。
可以使用常规的冷冻、冷冻干燥和干燥方法。本发明的优点之一是可以使用任何已知的冷冻方法。有一种简便的两步骤的方法更为适用，其中，首先将被培养的上皮细胞层在约-20℃保持5至12小时，然后，将细胞以历时约2小时的时间冷冻至-80℃。然后，该材料就可以储藏在该温度下。然而，应该理解的是，这些材料可以用一步冷冻程序在-20℃冷冻并储存在该温度下。被培养的上皮细胞层已经被成功地在-20℃和-80℃储藏了数年。
根据本发明的另一方面，被培养的上皮细胞被冷冻干燥。所得到的材料代表着第一种被保藏在干燥状态下、并且在长期保藏之后用于创伤表面时仍然保持着其结构和功能特性的整体性、足以引起伤口愈合的被培养的上皮细胞层。如上所述，可以将该干燥的上皮细胞层直接用于伤口，利用体液将该上皮细胞层重新湿润。
当进行冷冻干燥时，使用的是常规的方法，不同之处是将单糖和/或二糖作为低温保藏制剂，将细胞冷冻在最小体积的低温保藏溶液中。因此，上皮细胞层可以用-70℃冷冻约20分钟，然后将冷冻的上皮细胞用常规的设备冷冻干燥。然后，这些冷冻干燥的上皮细胞层可以被放在热密封的袋子内，库存于例如4℃。这是第一种将培养的上皮细胞冷冻干燥后得到的可用于伤口修复的产物。
另外，还可以将细胞在一定的温度下干燥而不需冷冻。
在上述储存条件下，体外产生的组织保持着与经过现有技术所保藏的组织同样或更好的生物合成活性。结构完整性、蛋白质合成、以及细胞分泌的活性都与现有技术所保藏的细胞相似或更好。
因为在优选的低温保藏溶液种使用的低温保藏制剂是无毒且非免疫源性的，所以，现有技术具有的对培养细胞、培养的上皮细胞层或皮肤等同物的清洗步骤就都可以省去了。同样，由于在冷冻过程使用最小体积的溶液，所以，将冷冻材料用37℃温浴进行融化的时间就最小(数分钟即可)。当然，可以将冷冻的材料直接浸没在融化介质中。
当把以上所述的具体实施例实际用于保藏被培养的上皮细胞层时，它们说明了本发明的具体步骤。然而，正如以上所描述的，同样的步骤可以扩展到保藏被培养的上皮细胞层(来自于对人类或非人类的表皮的上皮细胞、角膜、或其它类型的上皮细胞)，皮肤替代物或其它被培养的细胞。
                         实施例1
表皮细胞层通过培养人新生儿角化细胞得到，使用Rheinwald &Green(1975，supra)所提出的程序。
用最终浓度为2.5mg/ml的Dispase II(Boehringer Mannheim)将上皮细胞层从培养皿上分离下来。随后，将上皮细胞层在室温下用磷酸缓冲生理盐水清洗，加到背衬材料上，用含有所指示浓度的葡萄糖和人血清白蛋白的Dulbecco-Vogt改良最基本培养基(DMEM)组成的保藏溶液培养10分钟，如果需要的话，可以用20.0mMHEPES对该保藏溶液进行缓冲。培养之后，将保藏溶液吸出，只在含有细胞的容器内留下最小体积的该保藏溶液。此后，上皮细胞可以加到背衬材料上并放到热密封的袋子中进行所述的两步冷冻：第一步，将其在-20℃下保持5小时；第二步，在-70℃下保持过夜。最后，冷冻的上皮细胞被放在-70℃下库存。
上皮细胞层被放在培养基(Dulbecco-Vogt改良最基本培养基)或含有海藻糖和血清白蛋白的缓冲生理盐水中融化，细胞的存活性由定量分析被释放到培养基中的蛋白质所结合的35S-甲硫氨酸来确定。被融化了的上皮细胞以含有35S-甲硫氨酸(4.0μCt/ml)的低甲硫氨酸(6μg/ml)DMEM在37℃进行培养。被结合到TCA沉淀物中的放射性从培养基的等份式样来确定。
表1给出了这一试验的具体结果。为了校正放射活性的结合数值，将被培养的上皮细胞层作为对照并放在含有10％(v/v)动物或人血清和10％(v/v)甘油(标准程序)的DMEM中培养10分钟，然后进行上述的两步冷冻。融化后，上皮细胞的存活性由检测被结合到释放出的蛋白质中的35S-甲硫氨酸来确定。从这些对照的上皮细胞所获得的结果被换算成单位值。所表达的是三份重复上皮细胞的平均值。
                                表1
              本发明方法对被培养的上皮细胞层的低温保藏
    低温保藏溶液 上皮细胞层所合成和释放的蛋白质(校正后)
   DMEM+10％(v/v)动物血清+10％甘油(对照)     1.00
   DMEM+0.5M葡萄糖+5.0mg/ml血清白蛋白     1.95
   DMEM+0.5M葡萄糖+20mg/ml血清白蛋白     1.40
   DMEM+0.25M葡萄糖+20mg/ml血清白蛋白     1.59
   DMEM+2.0M葡萄糖+5.0mg/ml血清白蛋白     1.32
                         实施例2
在其它试验中，当完成在保藏溶液中的培养之后，上皮细胞被冷冻干燥或干燥。将被培养的上皮细胞层移取下来并放置到背衬材料上，然后，在上述保藏溶液中进行培养。将保藏溶液吸出使含有上皮细胞的容器内的保藏溶液为最小体积。然后，将上皮细胞以-70℃冷冻至少20分钟。将该上皮细胞在Lyphlock6冷冻干燥/外壳冷冻系统(Labconco)中进行冷冻干燥。被冷冻干燥了的上皮细胞可以被放置在热密封的袋子中并于4℃下贮藏。在保藏至少48小时之后，将上皮细胞浸没在DMEM中进行恢复，上皮细胞的存活性按实施例1所述进行测定，其结果见于表2。在此说明性的实验中，35S-甲硫氨酸的结合数值用DMEM+10％(v/v)FBS和10％(v/v)甘油对表皮细胞层进行预培养后的冷冻上皮细胞层来校正。当使用其它类型的溶液例如含有血清白蛋白和/或单糖或二糖的磷酸盐缓冲生理盐水或等渗生理盐水对上皮细胞层、皮肤等同物、或细胞进行恢复时，也得到相似的结果。
                                    表2
                    被保护的被培养的表皮细胞层的冷冻干燥
           低温保藏溶液 上皮细胞层所合成和释放的蛋白质(校正后)
  DMEM+0.5M葡萄糖+20.0mg/ml血清白蛋白     0.80
  DMEM+0.5M葡萄糖+10.0mg/ml血清白蛋白     0.72
                        实施例3
由于通过细胞生长参数或特异性染色来确定细胞存活性时需要将细胞层用胰酶消化为单个细胞，而且由于该胰酶消化过程本身会有损于细胞并使其存活性和生长能力被降低，所以，被培养的人表皮角化细胞被用1∶1的胰蛋白酶0.15％和EDTA0.02％的混合物在指数生长期进行收获。然后，将该细胞用保藏介质进行重悬浮和培养。培养之后，对细胞用上述两步冷冻程序进行冷冻或按实施例2所述进行冷冻干燥。低温保藏的细胞的悬浮液被贮藏于～-20℃或更低，冷冻干燥的细胞被贮存于室温或更低温度24小时。用培养基将细胞融化或恢复然后用锥虫蓝染色排除法对等份式样进行分析以确定细胞存活率。本实验的结果见于表3。
                          表3
        用冷冻或冷冻干燥对角化细胞悬浮液的保藏
  低温保藏溶液 排除锥虫蓝的细胞(％)
a)冷冻细胞DMEM+10％(v/v)动物血清+10％(v/v)甘油(对照) 97.15+/-0.15
  DMEM+0.5M葡萄糖+5.0mg/ml血清白蛋白     93.10+/-0.80
b)冷冻干燥的细胞DMEM+10％(v/v)动物血清+10％(v/v)甘油(对照) 66.00+/-0.58
  DMEM+0.5M葡萄糖+5.0mg/ml血清白蛋白     80.30+/-2.82
                    实施例4
按与实施例3所述的方法相似地对人表皮角化细胞进行收获、清洗，当细胞成块以后，对细胞用含有DMEM+0.005M～3.5M的葡萄糖、0.1mg/ml～40.0mg/ml血清白蛋白+1.0％～10％(v/v)甘油或1％～10％(v/v)DMSO的保藏培养基进行重悬浮和培养。培养之后，对细胞用上述步骤进行冷冻或按实施例2所述进行冷冻干燥。低温保藏的细胞悬浮液被在约-20℃或更低进行贮藏，被冷冻干燥的细胞以室温或更低温度贮藏至少24小时。对这些细胞用培养基进行恢复或融化并进行培养以确定其繁殖能力。从这些实验所得的结果见
实施例1。
以上所述的步骤已经被成功地用于对被冷冻的、冷冻干燥的、或干燥的培养的上皮细胞层或上皮细胞悬浮液进行保藏。
在以上所述各实验中，所用的纱布材料、细胞或组织样品都用含有葡萄糖(0.005M～3.5M)和血清白蛋白(0.1mg/ml～40.0mg/ml)或葡萄糖(0.005M～4.0M)和动物或人血清(0.05mg/ml～40.0mg/ml)，或葡萄糖(0.005M～3.5M)+血清白蛋白0.1mg/ml～40.0mg/mlDMSO(1％～10％)或甘油(1％～10％)的低温保藏溶液进行培养。
以上所述的方法保证了细胞或组织的结构完整性以及其代谢活性，例如蛋白质的合成或释放(作为生长因子或细胞外基质成分的例子)。这些方法对于通过培养人或非人的来自于表皮、角膜、或其它表皮类型以及皮肤替代物或其它被培养的细胞而获得的上皮细胞层为十分有用的，因此它们对于诸多领域例如诊断和治疗、药物学研究等都是十分具有价值的。
对于本领域的技术人员来说，本发明的修饰、改型和等同物等都是显而易见的。

Claims (30)

1.一种被保藏的组织，其包括：
被胞外物质包围着的被培养的哺乳动物上皮细胞层或间质细胞层，其中所述的胞外物质含有主要包括单糖或二糖的低温保藏剂，所述的被保藏的组织是被冷冻的、冰冻干燥的、或干燥的。
2.根据权利要求1所述的被保藏的组织，其中所述的胞外物质不含有在将所述组织用于伤口之前必需清洗掉的物质。
3.根据权利要求1所述的被保藏的组织，其中所述的胞外物质不含有二甲亚砜、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、和非人血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的被保藏的组织，其中所述的细胞是成层的被培养的上皮细胞。
5.根据权利要求1所述的被保藏的组织，其中所述的单糖或二糖是葡萄糖。
6.根据权利要求1～5之任一项所述的被保藏的组织，其中所述的成层的被培养的细胞被冷冻。
7.根据权利要求1～5之任一项所述的被保藏的组织，其中所述的成层的被培养的上皮细胞被冷冻干燥。
8.根据权利要求1～5之任一项所述的被保藏的组织，其中所述的成层的被培养的细胞被干燥。
9.根据权利要求6所述的被保藏的组织，其中所述的成层的被培养的细胞被冷冻于最小体积的含所述单糖或所述二糖的溶液中。
10.根据权利要求1～5之任一项所述的被保藏的组织，其中所述的低温保藏剂是葡萄糖。
11.根据权利要求10所述的被保藏的组织，其中所述的成层的被培养的细胞是被冷冻的。
12.根据权利要求4所述的被保藏的组织，其中所述的成层的被培养的细胞是连生的被培养的上皮细胞层。
13.根据权利要求12所述的被保藏的组织，其中所述的低温保藏剂是葡萄糖。
14.根据权利要求13所述的被保藏的组织，其中所述的成层的被培养的细胞是被冷冻的。
15.一种对被培养的哺乳动物上皮细胞或间质细胞进行保藏的方法，该方法包括：
对所述细胞层在含有低温保藏量的单糖或二糖低温保藏溶液中进行培养，
然后通过冷冻、干燥或冷冻干燥将所述的被培养的细胞层保存在所述的溶液中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的溶液不含有在将所述的成层的被培养的细胞用于伤口之前必需清洗掉的物质。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述的被培养的细胞层是成层的被培养的上皮细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的成层的被培养的细胞是连生的被培养的上皮细胞层。
19.根据权利要求15所述的方法，该方法进一步包括：从被培养的细胞层中去除多余的溶液，在保藏细胞之前形成保藏细胞的最小溶液体积，然后在该最小体积溶液中保藏细胞。
20.根据权利要求17所述的方法，该方法进一步包括：从被培养的细胞层中去除多余的溶液，在保藏细胞之前形成保藏细胞的最小溶液体积，然后在该最小体积溶液中保藏细胞。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述的低温保藏剂是葡萄糖。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述的低温保藏剂是葡萄糖。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述的低温保藏剂是葡萄糖。
24.根据权利要求19所述的方法，其中所述的低温保藏剂是葡萄糖。
25.根据权利要求15～24之任一项所述的方法，其中所述的被培养的细胞层是被冷冻保藏的。
26.根据权利要求15～24之任一项所述的方法，其中所述的被培养的细胞层是被冷冻干燥保藏的。
27.根据权利要求15～24之任一项所述的方法，其中所述的被培养的细胞层是被干燥保藏的。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述的细胞被保藏在含有0.05-3.5M葡萄糖的溶液中。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的溶液进一步含有0.1-40mg/ml人血清白蛋白。
30.根据权利要求15-29之任一项的方法所获得的被保藏的组织。
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