DE69523166T2

DE69523166T2 - Wundbesserungsverband und verfahren zur dessen konservierung

Info

Publication number: DE69523166T2
Application number: DE69523166T
Authority: DE
Inventors: Castro Munozledo Frederico; Salazar Olivo Luis; Marsch Moreno Meytha; Kuri Harcuch Walid
Original assignee: Celadon Science LLC
Current assignee: Advanced BioHealing Inc
Priority date: 1994-11-09
Filing date: 1995-11-09
Publication date: 2002-07-25
Anticipated expiration: 2015-11-10
Also published as: EP0790767A2; DK0790767T3; US20020192191A1; EP0790767B1; JP2008188434A; US6582696B2; CN1162901A; WO1996014738A2; DE69523166D1; ATE206583T1; US6548297B1; JPH10509610A; CN1127288C; US6962775B2; WO1996014738A3; US20020192197A1; AU4106796A; KR970706727A; CA2204751A1; ES2165436T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Gefrierkonservieren von Lappen von kultivierten Epithelzellen und daraus abgeleiteten Produkten.
Ein wesentlicher Vorteil der Zelltechnologie von tierischem Gewebe besteht darin, daß sie die Schaffung optimaler Bedingungen für die Gefrierkonservierung von lebenden Zellen und Gewebe ermöglicht. Durch Gefrierkonservierung können die intrinsischen technischen oder praktischen Schwierigkeiten, die mit der Handhabung von Biomaterialien verbunden sind, wie (i) die begrenzte Haltbarkeit von isolierten Geweben und (ii) die begrenzte Verfügbarkeit von Geweben als Ausgangsbasis für Zellen für Forschungs- und klinische Zwecke, vermindert oder ganz vermieden werden. So gesehen, hat die Entwicklung von Konservierungsverfahren für lebende Zellen und Gewebe eine bemerkenswerte Wichtigkeit für transplantierbare Gewebe erlangt.
Gemäß früheren Arbeiten zur Gefrierkonservierung, in denen über die erfolgreiche Anwendung von Glyzerin berichtet wurde, um die Beschädigung von Zellen während des Einfrierens zu verhindern (Polge et al. 1949, Nature 164:666), wurden mehrere Strategien zur Aufrechterhaltung der Strukturen, der Lebensfähigkeit und des Stoffechsels von Zellen und Geweben versucht. Die Verfahren zur Konservierung von Zellen und Geweben umfassen: spezielle isotonische Pufferlösungen; spezielle Auftauvorschriften; die Verwendung von Kälteschutzmitteln und Lösungsansätze, bei denen langsames, schnelles oder ultraschnelles Gefrieren angewandt wurde, alles, um die ansonsten unvermeidliche Zerstörung der lebenden Proben durch die Präparation zu verhindern. Im allgemeinen besteht, wenn Gefriermethoden benutzt werden, ein wesentlicher Faktor, der für die Beschädigung des Gewebes verantwortlich ist, im Phasenübergang (flüssiges in kristallines festes Wasser), da die Entstehung von Eis mit Veränderungen in der Elektrolytkonzentration und im pH-Wert verbunden ist, in der Dehydration, und in anderen nicht verstandenen Faktoren. Diese schädigenden Einflüsse konnten durch die Zugabe von Kälteschutzmitteln und durch sorgfältig kontrollierte Gefrierprozeduren vermindert werden.
Es gibt zwei Kategorien von Kälteschutzmitteln. Eine Kategorie wirkt, indem sie die Zellmembran durchdringt und die Konzentration im Inneren der Zelle herabsetzt (z. B. Glyzerin, Dimethyl-Sulfoxid (DMSO), und Monosaccharide, wie Mannose, Xylose, Glucose, Ribose und Fructose). Die andere besteht aus nicht-eindringenden Substanzen, deren Wirkmechanismus unklar ist. Üblicherweise verwendete nicht- eindringende Kälteschutzmittel umfassen Polyvinyl- Pyrrolidon (PVP), Hydroxyethyl-Stärke (HES), Disaccharide (wie Sucrose) und Zuckeralkohole (Polyalkohole, wie Mannitol). Kürzlich wurden Gefrierverfahren entwickelt, die sowohl eindringende als auch nicht-eindringende Kälteschutzmittel miteinander kombinieren.
Das Gefrieren von isolierten Zellen wurde zur Routine, wobei Glyzerin und DMSO die überwiegend verwendeten Kälteschutzmittel sind (Coriell, L. L., 1979, Methods in Enzymology LVIII, Seiten 29-36; Doyle et al. 1994, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures. J. Wiley & Sons, Seiten 4C: 1.1-4C:2.4). Tierische Embryonen wurden ebenfalls unter Verwendung von Glyzerin erfolgreich konserviert (Whittingham et al. 1972, Science 178:411- 414; Niemann et al. 1993, Mol. Reprod. Develop. 36:232- 235). Auf der anderen Seite haben Trocknung und Gefriertrocknung nur dann hervorragende Ergebnisse geliefert, wenn sie für die Konservierung von Biomaterialien verwendet wurden, die nicht aus Säugetierzellen oder -geweben bestanden. Zum Beispiel wird die Gefriertrocknung jetzt ausgiebig für Proteine, Proteinmischungen und Bakterien verwendet; die ersten Versuche zur Lyophilisierung von Säugetierzellen und - geweben waren jedoch nicht erfolgreich (Greaves, R. I. N., 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:723-728). Die kürzliche Entdeckung, daß biochemischen Adaptationen von lebenden Organismen die vollständige Dehydration (Anhydrobiose) überlebt haben (Crowe & Madin, 1975, J. Exp. Zool. 193:323 -334; Womersley & Smith, 1981, Comp. Biochem. Physiol. 70B:579-586; reviewed by Womersley, 1981, Comp. Biochem. Physiol. 7013:679-678) oder das Gefrieren (Constarizo et al. 1993, J. Exp. Zool. 181 : 245-255; King et al. 1993, Am. J. Physiol. 265:R1036-R1042; Karow et al. 1991, BioScience 41:155-160; Storey, 1990, Am. J. Physiol. 258:R559-R568) legen neue Verfahren zur Konservierung von Säugetierzellen oder -geweben nahe.
Es wird angenommen, daß Carbohydrate (wie Trehalose, Lactose, Maltose, Cellobiose, Sucrose, Glucose, Fructose, unter anderen) und Polyole (wie Sorbitol und Myo-Inositol) Dehydrationschutz (Womersley & Smith, supra) und Gefriertoleranz verleihen könnten (Storey & Storey, 1988, Physiol. Rev. 68:27-84), zum Teil durch das Ersetzen von Wasser in den Zellmembranen (Crowe et al. 1984, Arch. Biochem. Biophys. 232:400-407; Crowe et al. 1984, Biochem. Biophys. Acta 769:141-150). Eines der interessantesten Carbohydrate, das am Dehydrationschutz und an der Gefriertoleranz beteiligt sein könnte, ist Glucose. Dieses Monosaccharid besitzt extrem wichtige Funktionen beim Stoffwechsel von Gehirnzellen, scheint eine wichtige Rolle bei der Gefriertoleranz einer Reihe von Frosch- Spezies zu spielen (King et al. 1993, supra; Constanzo et al. 1993, supra; Storey & Storey. 1988, supra). Die bei der Analyse von gefriertoleranten Spezies erhaltenen Daten deuten darauf hin, daß beim Einfrieren dieser Tiere (i) der Blutgehalt signifikant zunimmt; (ii) die Glucose als Energiequelle im anoxischen und ischemischen Zustand dient, der durch das Gefrieren verursacht wird; und (iii) Glucose als den Stoffwechsel unterdrückend fungieren könnte (Storey & Storey, 1988, supra).
Sucrose wurde als Komponente in Kälteschutzlösungen für die Aufbewahrung von Corheal-Gewebe (Madden et al. 1993, Cryobiology 30:135-157; Rich & Armitage, 1991, Cryobiology 28:159-170; McCarey et al. 1973, Cryobiology 10:298-307) und das Einfrieren von embryonischem Gewebe verwendet (Isachenko et al. 1993, Cryobiology 30:432- 437). Auch Glucose und andere Carbohydrate wurden für die Lyophilisation von roten Blutkörperchen verwendet (Goodrich et al. U.S. Patente 4,874,690; 5,171,661 und 5,178,884). Die Konservierung von roten Blutkörperchen erfordert jedoch nicht die Aufrechterhaltung einer gewebetypischen Struktur, wie sie für die Gewebetransplantation erforderlich wäre. Bei den oben genannten Verfahren wurde die Überlebensfähigkeit der roten Blutkörperchen lediglich durch die Quantifizierung der Lyse der Erythrocyten, durch Häemoglobin-Bestimmung oder durch Untersuchung der glycolytischen Enzyme bestimmt (siehe Goodrich et al. U.S. Patente 4,874,690 und 5,178,884), aber nicht durch Parameter, die sich auf die Integrität der Zellen und Gewebeverbände beziehen, wie Proteinsynthese und -sekretion.
Green und Mitarbeiter beschreiben ein Verfahren zur Kultivierung von menschlichen epidermen Keratinocyten (Rheinwald & Green, 1975, Cell 6:331-343), das auf andere kultivierte Epithelzellen ausgeweitet wurde. Unter derartigen Strukturbedingungen werden geschichtete Epithellappen, die für eine Transplantation auf großflächig verbrannte Oberflächen, Geschwüre und andere Hautwunden geeignet sind, erhalten (Gallico et al. 1984, New Eng. J. Med. 311:448-451; Heighten et al. 1986, J. Am. Acad. Dertnatol. 14:399-405). Das mit diesem Verfahren kultivierte Epithel wurde auch als Transplantat für die vorübergehende Wundbehandlung verwendet (T. J. Phillips et al., 1989, J. Am. Acad. Derm. 21:191; Bolivar-Flores et al. 1990, Bums 16:3-8). Epithelzell-Kulturen sind zu einem extrem wirksamen Instrument bei der Rekonstruktion von körperlichen Oberflächen geworden, ihre nur begrenzte Lebensdauer hat ihren Nutzen jedoch auf diejenigen medizinischen Einrichtungen beschränkt, die nicht zu weit vom jeweiligen Herstellungsort entfernt liegen. Nach dem Dispase-Abtrennen der Epithelzellen für den Transport in das Krankenhaus ist ihre Lebensdauer kurz. Daher sollte die Einführung eines Konservierungsverfahrens für die kultivierten Lappen ihre Aufbewahrung und die Speicherung in einer Bank und ebenso ihren weltweiten Versand erlauben. In diesem Zusammenhang wurden bereits einige Versuche bezüglich geeigneter Strategien unternommen. Mehrere Autoren haben Verfahren zur Gefrierkonservierung entwickelt, die auf der Verwendung von Glyzerin oder Dimethylsulfoxid als Kälteschutzmittel basieren und die einer speziellen Einfriervorschrift folgen (siehe Cancedda und De Luca, 1994, U.S. Patent 5,298,417). Andere haben kultivierte Epithellappen mit Lösungen gefrierkonserviert, die sowohl zell-durchdringende Glasbildner (insbesondere Glyzerin) als auchd nicht-durchdringende Schutzmittel enthielten (vorzugsweise Polyvinylpyrrolidon (PVP), Dextran oder Hydroxyethylstärke) (siehe Tubo et al. 1992, U.S. Patent 5, 145,770). Geraci et. al. haben ein Verfahren zur Gefrierkonservierung von in vitro kultivierten Epithelzellen beschrieben, bei dem sie eine Kälteschutzlösung verwenden, die (a) Polyethylenglycole mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 20 kD; (b) wenigstens ein quervernetzendes Agens, das aus Polyolen, Aminen, Mono- oder Oligosacchariden und Polyethylenglycolen mit einem Molekulargewicht von weniger als 1 kD enthält (siehe WO 94/13135). Diese Methoden erfordern jedoch ein besonderes und anspruchsvolles Gefrierverfahren und ein Auftauverfahren, das Schwierigkeiten zu verursachen scheint, die einer breiten Anwendung dieser Gewebe auf dem klinischen Sektor entgegenstehen; oder eine mögliche Beeinträchtigung der medizinischen Wirksamkeit aufgrund von Schwierigkeiten bei den Auftau- und Spülverfahren, die anzuwenden sind, um derartige Epithellappen zu verwenden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und Produkte zum Konservieren kultivierten Epithel- und Mesenchymzellen für die Wundbehandlung bereit. Es gestattet den Gebrauch von konserviertem Gewebe ohne die Notwendigkeit, kälteschützende Bestandteile abzuwaschen. Es vermeidet außerdem die Notwendigkeit von aufwendigen Handhabungs-, Gerfrier- und Auftautechniken, die charakteristisch sind für den Stand der Technik. Die Erfindung ermöglicht ferner die Aufbewahrung von konservierten Zellen bei höheren Temperaturen, als dies bei Verfahren gemäß dem Stand der Technik möglich war, und sie ermöglicht sogar die trockene Konservierung und Aufbewahrung von Gewebe. Das Vorangehende wird erreicht, während die strukturellen und funktionalen Eigenschaften beibehalten werden, die erforderlich sind, um den Gebrauch der konservierten Zellen bei der Wundbehandlung von Patienten zu gewährleisten. Zellfunktionen, wie die Proteinsynthese und Sekretion von Zellprodukten (z. B. Wachstumsfaktoren und extrazellulare Matrixkomponenten), sind in etwa gleich oder sogar besser als die Aktivitäten, die kennzeichnend für mit Standardverfahren gefrorene Zellen oder Gewebe sind.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Konservierung von kultivierten Säugetier- oder Mesenchym- Epithelzellen bereitgestellt. Die Zellen werden in einer Lösung inkubiert, die eine kälteschützende Menge eines Monosaccharids oder eines Disaccharids enthält, das im wesentlichen frei von Vernetzungen mit einem Polyethylenglycol ist und das ein Molekulargewicht von maximal 20 kDa aufweist oder frei ist von Materialien, die aus den Zellen oder dem Gewebe vor dem Aufbringen des Gewebes auf ein Wundbett ausgewaschen werden müssen, oder frei ist von exogenen Materialien, die mit der Wundheilung interferieren, wenn sie auf ein Wundbett aufgebracht werden. Die überschüssige Lösung wird dann von den genannten Zellen entfernt, und die Zellen werden in Gegenwart des genannten Kälteschutzmittels durch Gefrieren, Trocknen oder Gefriertrocknen konserviert. Vorzugsweise bestehen die Zellen aus einem Lappen kultivierter epithelischer Keratinocyten. In einer Ausführungsform bestehen die Zellen aus menschlichen Zellen. Vorzugsweise wird die überschüssige Lösung durch Aufsaugen oder Ableiten entfernt. In diesen Fällen ist die Lösung in nicht mehr als 30 ml pro 50 cm² der Lage der kultivierten Keratinocyten vorhanden und noch typischer ist sie in einer Menge vorhanden, die unterhalb der Meßgrenze liegt.
Eine bevorzugte Inkubationslösung enthält zwischen 0.05 M und 3.5 M Glucose und zwischen 0.1 mg und 40 mg pro ml humanes Serumalbumin. Vorzugsweise ist die Lösung frei von Anteilen an von exogenen Materialien, die mit der Wundheilung interferieren, wenn sie auf ein Wundbett aufgebracht werden und die von den Zellen vor dem Aufbringen auf das Wundbett abgewaschen werden müssen. Auf diese Weise kann die Lösung frei sein von Materialien wie DM50, PVP, Glyzerin und nicht-humanem Serumalbumin.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden Produkte gemäß den vorangehenden Verfahren bereitgestellt. Ein solches Produkt ist ein transplantierbares Gewebe. Das Gewebe besteht aus kultivierten Säugetier- oder Mesenchym- Epithelzellen, und in einer bevorzugten Ausführungsform besteht es aus einem Lappen aus kultivierten Epithelzellen. Die Zellen sind von einer extrazellularen Phase umgeben, wobei die extrazellulare Phase eine kälteschützende Menge eines Monosaccharids oder eines Disaccharids enthält, das im wesentlichen frei von Vernetzungen mit einem Polyethylenglycol ist und das ein Molekulargewicht von maximal 20 kDa aufweist oder frei ist von Materialien, die aus den Zellen oder dem Gewebe vor dem Aufbringen des Gewebes auf ein Wundbett ausgewaschen werden müssen, oder das frei ist von exogenen Materialien, die mit der Wundheilung interferieren, wenn sie auf ein Wundbett aufgebracht werden. Die extrazellulare Phase kann ebenfalls frei sein von Materialien, die mit der Wundheilung interferieren oder die aus dem Gewebe ausgewaschen werden müssen, wenn sie auf ein Wundbett aufgebracht werden, wie oben beschrieben. Die Zellen können zum Beispiel in einem minimalen Volumen einer Lösung, die das Monosaccharid und/oder das Disaccharid enthält, eingefroren sein.
Gleichermaßen können die Zellen getrocknet oder gefriergetrocknet sein.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein kältekonserviertes Wundheilgewebe bereitgestellt. Das Gewebe besteht aus gefrorenen kultivierten Säugetier- oder Mesenchym-Epithelzellen, die, nachdem sie zwischen -20ºC und -70ºC über drei, sechs oder sogar mehr Monate aufbewahrt wurden, bei ihrem Aufbringen auf die Oberfläche einer Wunde eines Patienten ihre strukturellen und funktionalen Eigenschaften so weit beibehalten haben, daß dies ausreicht, um den Wundheilungsprozeß bei dem Patienten zu initiieren. Die Zellen bestehen vorzugsweise aus einer Lage von zusammenhängenden kultivierten Epithelzellen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung besteht aus trockenen kultivierten Säugetier- oder Mesenchym- Epithelzellen, die, nachdem sie in diesem trockenen Zustand gespeichert und auf die Oberfläche einer Wunde eines Patienten aufgebracht wurden, ihre strukturellen und funktionalen Eigenschaften so weit beibehalten haben, daß dies ausreicht, um den Wundheilungsprozeß bei dem Patienten zu initiieren. Wiederum stellt eine Lage von zusammenhängenden kultivierten Säugetier-Epithelzellen eine bevorzugte Ausführungsform dar. Gemäß dieses Aspektes der Erfindung kann das Material in einem trockenen Zustand auf die Wunde aufgebracht werden oder aber es kann vor seinem Aufbringen auf die Wunde rehydratisiert werden. Damit beinhaltet die Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten unter Verwendung eines der vorangegangenen Produkte, und insbesondere schließt sie, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, das Aufbringen eines getrockneten Lappens kultivierter Epithelzellen auf ein Wundbett ein.
Die kältekonservierenden Lösungen gemäß der Erfindung können, zusätzlich zu Monosacchariden und/oder Disacchariden, andere Kälteschutzmittel enthalten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Proteine oder Mischungen von Proteinen als zusätzliche Kälteschutzmittel. Zum Beispiel kann die Lösung Ganzserum oder Serumalbumin enthalten, ebenso wie andere eindringende sowie nicht- eindringende Kälteschutzmittel, die geeignet sind, die Lebensfähigkeit, Struktur und/oder Stoffwechselaktivitäten aufrechtzuerhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden humane Keratinocyten in einer Kälteschutzlösung kultiviert, die Glucose und humanes Serumalbumin enthält, wobei die Lösung frei ist von jeglichem Kälteschutzmittel, das vor dem Aufbringen der kultivierten Zellen auf ein Wundbett ausgewaschen werden müßte. Damit behandelt die Erfindung das Auftauen eines gefrorenen Lappens von Epithelzellen und die Aufbringung dieses Lappens auf ein Wundbett, ohne die Notwendigkeit eines Auswaschens nach dem Auftauen und vor dem Aufbringen auf ein Wundbett.
Die kultivierten Epithelzellen können auf ein Substrat aufgebracht sein und mit einem Trägermaterial kombiniert sein, falls gewünscht. Damit behandelt die Erfindung die Konservierung von Lappen aus kultivierten Epithelzellen, Hautersatz, mesenchym-abgeleiteten Geweben und/oder kultivierten Zellen. Die Erfindung ermöglicht außerdem einfache Ein-Schritt- oder Zwei-Schritt- Gefrierverfahren mit dem anschließenden Aufbewahren der Gewebe oder ihrer Speicherung in einer Gewebebank. Wenn das Gewebe getrocknet ist, kann es sogar bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, obwohl niedrigere Temperaturen wünschenswert sein können. Wenn das Gewebe gefroren ist, kann es bei -20ºC aufbewahrt werden, obwohl niedrigere Temperaturen wünschenswert sein können.
Diese und andere Aspekte und Merkmale der Erfindung sollen nachfolgend im Detail beschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein neues Verfahren zum Konservieren von Lappen von entweder (i) kultivierten Epithellappen, die durch Kultivieren von epidermen Keratinocyten, cornealen Keratinocyten oder anderen Typen von Epithelzellen erhalten wurden; (ii) kultivierten, aber nicht-zusammenhängenden Epithelzellen; (iii) Hautersatz, Äquivalenten oder dergleichen (wobei unter Hautersatz ein Epithellappen verstanden wird, der durch Kultivieren von epidermen Keratinocyten auf einem Gel aus extrazellularen Matrixkomponenten, wie Collagen oder Hyaluronsäure erhalten wird, oder ein Hautäquivalent, wie de-epidemisierter Dermis und das Mesenchymzellen enthalten kann); oder (iv) von Mesenchym abgeleitete Zellen oder Gewebe zur Wundheilung. Insbesondere werden Zellen betrachtet, die für die Wundheilung von menschlichen Patienten geeignet sind. Zellen der vorstehend genannten Art können kultiviert, zusammenhängend, mit Substrat und mit oder ohne Trägermaterial kombiniert sein. Beispiele für Substrate sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Gele, Filme und extrazellulare Matrices, wie Hyaluronsäure, Collagen, Fibrinkleber und synthetische Produkte. Trägermaterialien sind dem Fachmann gleichfalls bekannt und umfassen Gaze, Plastik, Silikon, Hydrogele und Dextran.
Die zuerst zu konservierende Gewebeprobe wird in einer Lösung inkubiert, die aus einem Nährmedium oder einer isotonischen Lösung bestehen kann, die einen kälteschützenden Anteil eines Monosaccharids oder eines Disaccharids enthält. Nach einer Inkubationsperiode, typischerweise zwischen etwa 5 Minuten und 8 Stunden bei Raumtemperatur, wird die überschüssige Lösung von den Zellen entfernt und die Zellen werden bei Anwesenheit des Kälteschutzmittels eingefroren, getrocknet oder gefriergetrocknet.
Ein kälteschützender Anteil eines Monosaccharids oder eines Disaccharids ist derjenige Anteil eines Monosaccharids allein, eines Disaccharids allein oder einer Mischung aus Monosacchariden und/oder Disacchariden, der die Kältekonservierung von Epithel- oder Mesenchymzellen gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht, ohne die Erfordernis von exogenen Kälteschutzmitteln, die mit der Wundheilung interferieren, wenn sie auf ein Wundbett aufgebracht werden. Zum Beispiel werden DM50 und PVP routinemäßig für den Kälteschutz verwandt, müssen aber stets vor dem Aufbringen des Transplantats auf das Wundbett aus dem Transplantat ausgewaschen werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Kältekonservierung ohne derartige Mittel, wodurch die Notwendigkeit zusätzlicher, unnötiger Waschvorgänge entfällt. Im Fall der bevorzugten Monosaccharide wird Glucose mit Konzentrationen zwischen etwa 0.05 M und 3.5 M benutzt. Die untere Grenze ist 8-10 mal größer als die Konzentration von Glucose in Blut, extracellularer Flüssigkeit oder typischen Nährlösungen (.0055 M) und ist etwa doppelt so hoch wie in Nährlösungen mit dem höchsten Glucosegehalt (.025 M). Die bevorzugte Menge an Glucose liegt in der Größenordnung zwischen 0.1 M und 1 M. Die bevorzugten Mengen anderer Monosaccharide und Disaccharide hängen von den speziellen benutzten Bedingungen ab, den speziellen kultivierten Zellen und von der Anwesenheit und Konzentration irgendeines anderen biokompatiblen Schutzmittels, wie Humanserum oder humanes Serumalbumin. In allen Fällen liegen die Mengen an Kälteschutzmitteln um wenigstens den Faktor zwei höher als die Mengen an Monosacchariden und Disacchariden, die in Nährlösungen und dergleichen enthalten sind.
Die Lösungen gemäß der Erfindung sind vorzugsweise frei von Anteilen an exogenen Materialien, die mit der Wundheilung interferieren, wenn sie auf ein Wundbett aufgebracht werden. Solche exogenen Materialien sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Materialien, die gemeinhin als Kälteschutzmittel verwendet werden. Zum Beispiel werden DMSO, PVP und Polyhydroxy-Carbohydrate häufig als Kälteschutzmittel benutzt. Es ist allgemeine Praxis, solche Substanzen aus dem aufgetauten Gewebe vor dem Aufbringen auf ein Wundbett durch Auswaschen zu entfernen. Gleichermaßen werden Dextran und nicht-humane Proteinquellen, einschließlich Albumin, bei Kältekonservierungsverfahren benutzt und werden vor dem Aufbringen des konservierten Gewebes auf ein Wundbett sorgfältig entfernt. Auf der anderen Seite werden Materialien wie humanes Serumalbumin, Prolin, Spennine, Myristizinsäure, niedrige Konzentrationen an Zink und viele andere nicht mit der Wundheilung interferieren. Damit behandelt die vorliegende Erfindung in ihren bevorzugten Ausführungsformen biokompatible Konservierungslösungen, die vor dem Aufbringen des konservierten Gewebes auf ein Wundbett keine zusätzlichen Waschvorgänge erfordern.
Die Erfindung behandelt die Konservierung von Gewebe in einem minimalen Volumen an Lösung. Dies weicht vom Stand der Technik ab und ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung. Ein Vorteil ist die vereinfachte Handhabung, durch die das Gewebe in Beuteln oder Schalen gelegt und ohne die Gefahr eines Verderbens konserviert werden kann, ohne daß die Schalen versiegelt werden müßten und ohne andere mühsame Verfahren, wie sie für den Stand der Technik typisch sind. Ein unerwarteter Vorteil liegt in der Möglichkeit, kultivierte Zellen und Gewebe unter Verwendung der Kälteschutzmittel gemäß der Erfindung gefrierzutrocknen. Insbesondere erlaubt es die vorliegende Erfindung, daß Lappen von Epithelzellen gefriergetrocknet, aufbewahrt, rehydratisiert (oder nicht) und zur Wundbehandlung benutzt werden. Die Aufbewahrung kann bei relativ hohen Temperaturen erfolgen, die einen Versand und die Anwendung auch an entfernte Orte ermöglichen und die Notwendigkeit teurer, nur begrenzt verfügbarer -70ºC Gefrierräume vermeiden. Das Gefriertrocknen wird durch das Entfernen von so viel Kälteschutzlösung, wie vor dem Einfrieren praktisch möglich, erleichtert; mit einem Minimum an Flüssigkeitsvolumen erfolgt das Einfrieren, Trocknen und Auftauen rasch und mit minimaler funktionaler Schädigung der Zellen. Die vorliegende Erfindung stellt damit ein konserviertes epitheles Wundheilungsgewebe mit einem trockenen, zusammenhängenden Lappen kultivierter Epithelzellen bereit, das, nachdem es in trockenem Zustand aufbewahrt und auf die Oberfläche der Wunde eines Patienten aufgebracht wurde, genügend strukturelle und funktionale Eigenschaften beibehalten hat, um den Wundheilungsprozeß bei dem Patienten zu initiieren.
Minimale Volumina können durch das Absaugen von überschüssiger Lösung und/oder durch Schwerkraft-Ableitung von Lösung aus den Zellen erreicht werden. Andere Verfahren werden dem Fachmann geläufig sein. Es ist wünschenswert, nicht mehr als 30 ml Lösung pro 50 cm² an transplantierbarem Gewebe zu haben, obwohl noch niedrigere Anteile bevorzugt werden.
Kälteschutzmittel, die im Sinne der Erfindung einsetzbar sind, umfassen sowohl eindringende als auch nicht- eindringende Substanzen sowie Substanzen, die vor dem Aufbringen des konservierten Gewebes auf ein Wundbett ausgewaschen werden müssen (obwohl biokompatible Substanzen bevorzugt werden). Substanzen, die als Kälteschutzmittel einsetzbar sind, umfassen die folgenden: Monosaccharide (z. B. Glucose, Fructose, Maltose, Ribose, Mannose, Xylose); Disaccharide (z. B. Trehalose, Sucrose, Cellobiose, Lactose); Trisaccharide (z. B. Raffinose); Zuckeralkohole (z. B. Mannitol, Sorbitol, Myo-Inositol, phosphorylierte Inoitole, Glyzerin); Polysaccharide (z. B. Hydroxyethylstärke (NES), Dextran, phosphoryliertes Dextran, Heparin, Heparansulfat, Hyaluronsäure, Dermatansulfat, Chondrollinsulfat, Agarose); Carboxylsäuren (z. B. Pyruvat, 2,3,-Diphosphoglycerat); Protein und Proteinmischungen (z. B. Blut, tierisches Serum, Plasma, Humanalbumin, bovines Albumin, bovine Gelatine, Fischgelatine).
Die bevorzugte Kälteschutzlösung umfaßt ein Monosaccharid und ein Protein oder eine Mischung von Proteinen. Das bevorzugte Monosaccharid, Glucose, ist in einer Konzentration zwischen 0.05 und 3.5 M, und das Protein oder die Proteinmischung ist in einer Konzentration zwischen 0.1 und 40.0 mg/ml enthalten. Vorzugsweise besteht die Lösung aus einem Nährmedium, das zwischen 0.1 und 1.0 M Glucose plus 1.0-5.0 mg pro ml humanes Serumalbumin (oder 0.05-40 mg/ml Serum, vorzugsweise humanes) enthält. Das zu konservierende Material wird in die Lösung bei einer Temperatur im Bereich zwischen 5ºC und 40ºC, und vorzugsweise bei Raumtemperatur, eingetaucht. Die Inkubationszeit beträgt zwischen 5 Minuten und 8 Stunden, obwohl längere Zeiträume möglich, aber nicht notwendigerweise wünschenswert sind. Nach der Inkubation wird das Material in dem minimalen Volumen an Lösung, das nach der vollständigen Absaugung oder Ableitung der Lösung verbleibt, eingefroren. Das Absaugen oder das Ableiten läßt nicht mehr als etwa 30 ml an Lösung pro 50 cm² Gewebe zurück und hinterläßt typischerweise minimale Volumina (d. h. praktisch nicht mehr meßbare Mengen). Das Material kann eingefroren, gefriergetrocknet oder getrocknet werden.
Herkömmliche Gefrier-, Gefriertrocknungs- und Trocknungsverfahren können verwendet werden. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß gemäß der vorliegenden Erfindung jedes der bekannten Gefrierverfahren verwendbar ist. Ein einfaches Zwei-Schritt-Verfahren hat sich als besonders geeignet erwiesen, bei dem die kultivierten Epithellappen zuerst bei einer Temperatur von etwa -20ºC für 5 bis 12 Stunden gehalten werden, wonach die Zellen auf -80ºC über etwa 2 Stunden gefroren werden. Das gefrorene Material kann dann in einer Bank bei diesen Temperaturen aufbewahrt werden. Es sei angemerkt, daß das zu gefrierende Material jedoch in einem Ein-Schritt- Verfahren auf eine Temperatur von -20ºC gefroren und bei dieser Temperatur aufbewahrt oder in einer Gewebebank gespeichert werden kann. Kultivierte Epithellappen wurden erfolgreich bei -20ºC oder -80ºC über ein Jahr aufbewahrt.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden die kultivierten Epithellappen gefriergetrocknet. Das so erhaltene Material besteht aus ersten kultivierten Epithellappen, die in trockenem Zustand konserviert sind und die, nachdem sie sogar über einen längeren Zeitraum aufbewahrt wurden, auf eine Wundoberfläche aufgebracht werden können, wobei sie ihre strukturelle Integrität und ihre funktionalen Eigenschaften beibehalten haben, die ausreichen, um den wundheilungsprozeß zu initiieren. Wie oben erwähnt, ist es sogar möglich, den getrockneten Epithellappen direkt auf die Wunde aufzubringen, wobei der Epithellappen durch die körpereigenen Flüssigkeiten rehydriert wird.
Beim Gefriertrocknen können herkömmliche Verfahren verwendet werden, außer daß Monosaccharide und/oder Disaccharide als Kälteschutzmittel verwendet werden und die Zellen in einem minimalen Volumen an Kälteschutzlösung eingefroren werden. Auf diese Weise können die Epithellappen durch Kühlung eingefroren werden, zum Beispiel auf -70ºC für etwa 20 Minuten, und nachfolgend kann das gefrorene Epithel mit einer herkömmlichen Ausrüstung lyophilisiert werden. Die gefriergetrockneten Epithellappen können dann in heißversiegelten Beuteln in einer Gewebebank gespeichert oder aufbewahrt werden, zum Beispiel bei 4ºC. Dies ist das erste bekannte Beispiel einer Gefriertrocknung von kultivierten Epithelzellen, die ein brauchbares Produkt zur Wundheilung erbracht hat.
Alternativ dazu können diese Zellen in einem Temperaturbereich getrocknet werden, ohne eingefroren zu werden.
Unter den vorgenannten Lagerbedingungen behält das in vitro erzeugte Gewebe eine biosynthetische Aktivität bei, die in etwa in der gleichen Größenordnung oder höher ist als sie bei Geweben gefunden wird, die nach einem Verfahren gemäß dem Stand der Technik konserviert wurden. Die strukturelle Integrität, die Proteinsynthese und die Zellsekretionsfähigkeit bleibt gleich oder höher als die entsprechenden Merkmale bei Zellen, die nach einem Verfahren gemäß dem Stand der Technik konserviert wurden.
Da die bevorzugten Konservierungslösungen Kälteschutzmittel verwenden, die nicht toxisch und nicht immunogen sind, wird das Spülen der kultivierten Zellen, kultivierten Epithellappen oder des Hautersatzes, das typisch für Verfahren gemäß dem Stand der Technik ist, vermieden. Gleichermaßen erfolgt, da ein Minimum an Lösung für den Einfriervorgang verwendet wurde, das Auftauen mit einem nur minimalen Zeitbedarf (in etwa nur einer Minute), wobei das Material in einem 37ºC warmen Bad angewärmt werden kann. Das Material kann natürlich direkt in das Auftaumedium eingebracht werden.
Die nachfolgenden speziellen Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung bei der Anwendung zur Konservierung kultivierter Hautlappen näher erläutern. Wie oben erwähnt, können die gleichen Verfahren auch zur Konservierung kultivierter Epithellappen (die durch die Kultivierung humaner oder nicht-humaner Epithelzellen aus der Epidermis, Cornea oder anderen Typen von Epithelzellen gewonnen werden), Hautsubstitute oder anderen kultivierten Zelltypen angewendet werden.

BEISPIEL 1

Epidermislappen wurden durch die Kultivierung humaner neonataler Vorhaut-Keratinocyten unter Verwendung des von Rheinwald & Green (1975, supra) entwickelten Verfahrens hergestellt.
Die Epithellappen wurden aus Kulturschalen mittels Dispase II (Boehringer Mannheim) mit einer Endkonzentration von 2.5 mg/ml entnommen. Nach der Entnahme aus den Kulturschalen werden die Epithellappen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur gewaschen, auf einem Trägermaterial angeordnet und für 10 Minuten mit der Konservierungslösung, die aus einer Dulbecco-Vögt Modifizierung von Minimal Esential Medium (DMEM) besteht, das Glucose und humanes Serumalbumin in den genannten Konzentrationen enthält, inkubiert; falls gewünscht, kann die Konservierungslösung mit 20.0 mM HEPES gepuffert werden. Nach der Inkubation wird die Konservierungslösung abgesaugt, wobei ein minimales Volumen an Lösung in dem die Epithele enthaltenden Gefäß zurückbleibt. Anschließend wird das Epithel, das auf einem Trägermaterial angeordnet sein kann, in hitzeversiegelte Beutel eingebracht und in einem Zwei-Schritt-Verfahren eingefroren: Zunächst werden diese bei -20ºC über 5 Stunden gehalten; dann werden sie über Nacht auf -70ºC gekühlt. Schließlich werden die gefrorenen Epithele bei -70ºC in einer Gewebebank gespeichert oder aufbewahrt.
Epithellappen wurden in Kulturmedium (Dulbeeco-Vögt Modifizierung von Minimal Esential Medium; DMEM) oder in gepufferter Salzlösung, die Trehalose und Serumalbumin enthält, aufgetaut, und ihre Lebensfähigkeit wurde durch Quantifizierung von [35S]-Methionin-Einbringung in Protein bestimmt, die in Kulturmedium freigesetzt wurde. Die aufgetauten Epithele wurden mit DMEM mit niedrigem Methioningehalt (6 ug/ml), die [355]-Methionin (4.0 uCi/ml) bei 37ºC inkubiert und es wurde die in TCA-percipitables Material eingebrachte Radioaktivität in Aliquots mit Kulturmedium bestimmt.
Tabelle I zeigt die in diesem Experiment erzielten Ergebnisse. Um die Radioaktivitätsgehalte zu normieren, wurden kultivierte Epithellappen zur Kontrolle mit DMEM, die 10%(v/v) tierisches oder humanes Serum und 10%(v/v) Glyzerin enthielt, für 10 Minuten inkubiert (Standardverfahren) und gemäß dem obigen Zwei-Schritt- Verfahren eingefroren. Nach dem Auftauen wurde die Lebensfähigkeit der Epithel durch Messen der [³&sup5;S]-Methionin-Einbringung in freigesetztes Protein bestimmt und die Ergebnisse dieser Kontrollepithele wurden als Referenzwert benutzt. Es ist der Mittelwert von drei Epithelen angegeben.

TABELLE 1

Gefrierkonservierung von kultivierten Epithellappen entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren

Gefrierkonservierungslösung Proteinsynthese und Freisetzung durch Epithellappen (normiert)

DMEM + 10% (v/v) tierisches Serum + 10% (v/v) Glyzerin (KONTROLLE) 1.00
DMEM + 0.5M Glucose + 5.0 mg/ml Serumalbumin 1.95
DMEM + 0.5 M Glucose + 20 mg/ml Serumalbumin 1.40
DMEM + 0.25 M Glucose + 20 mg/ml Serumalbumin 1.59
DMEM + 2.0 M Glucose + 5.0 mg/ml Serumalbumin 1.32

BEISPIEL II

In anderen Experimenten wurden Epithele nach der Inkubation in Konservierungslösung lyophilisiert oder getrocknet. Kultivierte Epithellappen werden entnommen, auf einem Trägermaterial angeordnet und in der Konservierungslösung wie oben inkubiert. Die Konservierungslösung wird abgesaugt, wobei ein minimales Volumen an Lösung in dem die Epithele enthaltenden Gefäß zurückbleibt. Dann werden die Epithele durch Kühlen auf -70ºC über wenigstens 20 Minuten eingefroren. Anschließend werden die gefrorenen Epithele in einem Lyphlock 6 Freeze Dry/Shell Freeze System (Labconco) lyophilisiert. Die gefriergetrockneten Epithele können in hitzeversiegelten Beuteln bei 4ºC in einer Gewebebank gespeichert oder aufbewahrt werden. Nach der Konservierung über wenigstens 48 h wurden die Epithele durch Immersion in DMEM rekonstituiert und die Lebensfähigkeit der Epithele wurde wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt. In diesem Beispielexperiment wurden die Werte für die [³&sup5;S]-Methionin-Gehalte ebenfalls normiert, indem Epithellappen, die nach der Präinkubation mit DMEM plus 10%(v/v) FBS und 10%(v/v) Glyzerin eingefroeen wurden, als Referenz benutzt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn andere Lösungen, wie phosphatgepufferte Salzlösung oder isotonische Salzlösung mit Serumalbumin und/oder Mono- oder Disacchariden, zur Rekonstitution der Epithellappen, Hautäquivalente oder Zellen benutzt wurden.

TABELLE II

Gefriertrocknung von geschützten kultivierten Epidermislappen.

Konservierungslösung Proteinsynthese und -freisetzung durch Epithellappen (normiert)

DMEM + 0.5 M Glucose + 20.0 mg/ml Serumalbumin 0.80
DMEM + 0.5 M Glucose + 10.0 mg/ml Serumalbumin 0.72

BEISPIEL III

Da die Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen durch Zellwachstumsparameter oder spezifisches Anfärben eine Trypsinisierung der Zellappen in einzelne Zellen erfordert und da dieses Verfahren der Trypsinisierung selbst Zellschädigungen verursacht und die Lebensfähigkeit der Zellen und die Zellwachstumsfähigkeit herabsetzt, wurden kultivierte menschliche epidermale Keratinocyten während der exponentiellen Wachstumsphase mittels einer (1 : 1) Mischung von Trypsin 0.15% und EDTA 0.02% entnommen. Die Zellen wurden ausgiebig mit Kulturmedium gewaschen und pelletiert. Dann wurden Zellen resuspendiert und mit Konservierungslösung inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen in dem oben beschriebenen Zwei-Schritt-Verfahren eingefroren oder, wie in Beispiel II, gefriergetrocknet. Die kältekonservierten oder darunter aufbewahrt, und gefriergetrocknete Zellen wurden bei Raumtemperatur oder niedrigeren Temperaturen über wenigstens etwa 24 Stunden aufbewahrt. Die Zellen wurden aufgetaut oder mit Kulturmedium rekonstituiert und Aliquots wurden benutzt, um die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau-Färbeausschluß zu bestimmen. Ergebnisse dieser Art von Experiment sind dargestellt.

TABELLE III

Konservierung von Keratinocyt-Suspensionen durch Einfrieren oder Gefriertrocknung

Konservierungslösung Zellen mit Trypanblau-Ausschluß (%)

a) Gefrorene Zellen
DMEM + 10% (v/v) tierisches Serum + 10% (v/v) Glyzerin (KONTROLLE) 97.15 +/- 0.15
DMEM + 0.5M Glucose + 5.0 mg/ml Serumalbumin 93.10 +/- 0.80
a) Gefriergetrocknete Zellen
DMEM + 10% (v/v) tierisches Serum + 10% (v/v) Glyzerin (KONTROLLE) 66.00 +/- 0.58
DMEM + 0.5M Glucose + 5.0 mg/ml Serumalbumin 80.30 +/- 2.82

BEISPIEL IV

In ähnlichen Experimenten wie den in Beispiel III gezeigten wurden menschliche Epidermal-Keratinocyten entnommen, gewaschen, und nach dem Pelletieren wurden die Zellen resuspendiert und mit Konservierungslösung, bestehend aus DMEM plus 0.005 M bis 3.5 M Glucose plus 0.1 mg/ml bis 40.0 mg/ml Serumalbumin plus entweder 1.0%. 10% (v/v) Glyzerin oder 1% - 10% (v/v) DMSO, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gemäß der oben beschriebenen Stufenprozedur eingefroren oder, wie in Beispiel II, gefriergetrocknet. Die kältekonservierten Zellsuspensionen wurden bei Temperaturen von etwa -20ºC oder niedriger aufbewahrt und gefriergetrocknete Zellen wurden über wenigstens 24 Stunden bei Raumtemperatur oder niedrigeren Temperaturen aufbewahrt. Die Zellen wurden aufgetaut oder mit Kulturmedium rekonstituiert und kultiviert, um die Zellproliferationsfähigkeiten zu bestimmen. Die in diesen Experimenten erzielten Ergebnisse sind wie die in Beispiel 1 gezeigten.
Die oben erläuterten Verfahren wurden erfolgreich bei der Konservierung von kultivierten Epithellappen oder Epithelzellsuspensionen entweder mittels Einfrieren, Gefriertrocknen oder Trocknen angewandt.
In allen Fällen wurden die Trennungen, Zellen oder Gewebeproben mit Kälteschutzlösungen inkubiert, die entweder Glucose (0.005 M bis 3.5 M) und Serumalbumin (0.1 mg/ml bis 40.0 mg/ml) oder Glucose (0.005 M bis 4.0 M) und tierisches oder menschliches Serum (0,05 mg/ml bis 40.0 mg/ml), oder Glucose (0.005 M bis 3.5 M) plus Serumalbumin 0.1 bis 40.0 mg/ml DMSO (1%-10%) oder Glyzerin (1%- 10%) enthielten.
Die beschriebenen Verfahren stellen die strukturelle Integrität und die Stoffwechselaktivitäten, wie die Proteinsynthese und -freisetzung der Zellen/Gewebe (als Beispiele für die Wachstumsfaktoren oder extrazellularen Matrixkomponenten) sicher. Diese Verfahren sind bei der Konservierung von Epithellappen nützlich, die durch Kultivierung von humanen oder nicht-humanen Epithelzellen der Epidermis, Cornea oder anderen Typen von Epithelzellen, Hautsubstituten oder anderen Typen von kultivierten Zellen hergestellt wurden; daher sollten sie in vielen Bereichen, wie der Therapie, Pharmakologie und auch der Forschung, wertvoll sein.
Dem Fachmann auf diesem Gebiet ergeben sich verschiedene Modifikationen und Äquivalente.
Folgendes wird beansprucht:

Claims

1. Transplantierbares Gewebe, umfassend:

kultivierte Epithel- oder Mesenchymzellen von Säugetieren, die von einer extrazellulären Phase umgeben sind, wobei die extrazelluläre Phase eine kälteschutzeffektive Menge eines Monosaccharids oder eines Disaccharids enthält, das im Wesentlichen frei von Vernetzungen mit einem Polyethylenglykol mit einer relativen Molekülmasse von maximal 20 kDa ist.

2. Transplantierbares Gewebe, umfassend:

kultivierte Epithel- oder Mesenchymzellen von Säugetieren, die von einer extrazellulären Phase umgeben sind, wobei die extrazelluläre Phase eine kälteschutzeffektive Menge eines Monosaccharids oder eines Disaccharids enthält, wobei die extrazelluläre Phase frei von Materialien ist, die vor dem Auftragen des Gewebes auf ein Wundbett von dem Gewinde abgewaschen werden müssen.

3. Gewebe nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die extrazelluläre Phase frei von Dimethylsulfoxid, Polyvinyl- Pyrrolidon, Glycerol und anderen Polyhydroxy- Kohlenwasserstoffen und Nichthumanserumalbumin ist.

4. Gewebe nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die Zellen ein Lappen von kultivierten Epithelzellen sind.

5. Gewebe nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem das genannte Monosaccharid oder Disaccharid Glukose ist.

6. Gewebe nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem das Gewebe gefroren, gefriergetrocknet oder getrocknet ist.

7. Gewebe nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem das Gewebe in einem Mindestvolumen einer Lösung gefroren wird, die das genannte Monosaccharid oder das genannte Disaccharid enthält.

8. Kältekonserviertes Wundheilungsgewebe, umfassend:

gefrorene kultivierte Epithel- oder Mesenchymzellen von Säugetieren, die, nach der Inkubation in einer Lösung, die eine kälteschutz-effektive Menge eines Monosaccharids oder eines Disaccharids enthält, das im Wesentlichen frei von Vernetzungen mit einem Polyethylenglykol mit einer relativen Molekülmasse von maximal 20 kDa ist, einer dreimontlichen Lagerung bei einer Temperatur zwischen -20ºC und -70ºC, Auftauen und Aufbringen auf die Oberfläche einer Wunde an einem Patienten, ihre strukturellen und funktionellen Eigenschaften in einem ausreichenden Maß behalten, um eine Wundheilung in dem Patienten zu induzieren.

9. Gewebe nach Anspruch 8, wobei das Gewebe in einem Mindestlösungsvolumen gefroren wird.

10. Konserviertes Wundheilgewebe, umfassend:

getrocknete kultivierte Epithel- oder Mesenchymzellen von Säugetieren, die, nach der Inkubation in einer Lösung, die eine kälteschutz-effektive Menge eines Monosaccharids oder eines Disaccharids enthält, das im Wesentlichen frei von Vernetzungen mit einem Polyethylenglykol mit einer relativen Molekülmasse von maximal 20 kDa ist, der Lagerung in einem trockenen Zustand und dem Aufbringen auf die Oberfläche einer Wunde an einem Patienten, ihre strukturellen und funktionellen Eigenschaften in einem ausreichenden Maß behalten, um eine Wundheilung in dem Patienten zu induzieren.

11. Gewebe nach Anspruch 8 oder 10, bei dem die Zellen ein Lappen von konfluenten kultivierten Epithelzellen sind.

12. Verfahren zum Konservieren kultivierter Epithel- oder Mesenchymzellen von Säugetieren, umfassend die folgenden Schritte:

Inkubieren der genannten Zellen in der Lösung, die eine kälteschutz-effektive Menge eines Monosaccharids oder eines Disaccharids enthält, das im Wesentlichen frei von Vernetzungen mit einem Polyethylenglykol mit einer relativen Molekülmasse von maximal 20 kDa ist, Beseitigen von Lösungsüberschüssen von den genannten Zellen zur Bildung eines Mindestvolumens, und anschließend Konservieren der Zellen in dem genannten Mindestvolumen in Anwesenheit der genannten kälteschutz-effektiven Menge von Monosaccharid oder Disaccharid durch Frieren, Trocknen oder Gefriertrocknen der genannten Zellen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die genannte Lösung frei von exogenen Materialien ist, die die Wundheilung beeinträchtigen, wenn sie auf ein Wundbett aufgebracht werden, und frei von Materialien ist, die vor dem Auftragen der Zellen auf ein Wundbett abgewaschen werden müssen.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, bei dem die Zellen gefroren, gefriergetrocknet oder getrocknet werden.

15. Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem die Lösungsüberschüsse durch Absaugen oder Drainage von überschüssiger Flüssigkeit beseitigt werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-15, bei dem die Zellen in einer Lösung inkubiert werden, die etwa 0,05 bis 3,5 M Glukose enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die genannte Lösung ferner 0,1 mg bis 40 mg/ml Humanserumalbumin enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, bei dem die Lösung frei von Dimethylsulfoxid, Polyvinyl-Pyrrolidon und Glycerol ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-18, bei dem die Zellen ein Lappen von kultivierten Epithelzellen sind.

20. Konserviertes Wundheilgewebe, das verwendet werden kann, ohne dass es vor dem Auftragen gewaschen werden müsste, herstellbar mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 12-19.

21. Gewebe oder Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüch, bei dem das genannte Monosaccharid oder das genannte Disaccharid das einzige Kälteschutzmittel ist, das in der genannten extrazellulären Phase/Lösung vorhanden ist.