DE69233558T2

DE69233558T2 - Keratinozyt-abstammende Granulate zur Verwendung als wundheilendes Mittel

Info

Publication number: DE69233558T2
Application number: DE69233558T
Authority: DE
Inventors: Hans Van Bossuyt
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1991-11-20
Filing date: 1992-11-19
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2012-11-20
Also published as: US6126935A; DK0615545T3; DE69231063D1; EP0970701A3; DK0970701T3; DE69231063T2; EP0615545A1; EP0615545B1; ATE307599T1; EP0970701B1; EP0970701A2; ES2252893T3; JPH07501214A; DE69233558D1; WO1993010217A1; US5866167A; ATE193057T1; HK1027022A1; CA2123683A1; CA2123683C

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Pellets von Keratinozyten als Substanzen zur Wundheilung.
Die Erfindung betrifft ferner die Keratinozyten-Pellets als Wirkstoffe enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
Die Erfindung betrifft ferner kosmetische Zusammensetzungen, die als Wirkstoffe Keratinozyten-Pellets enthalten.
Vermutlich ist die Haut das Organ, das am stärksten anfällig für Verletzungen ist. Die Hautreparatur ist ein komplizierter Prozess, der sich in vier Phasen unterteilen lässt. Diese Phasen werden in der Regel als Entzündung, Bildung von Granulationsgewebe, Epithelisierung und Ummodellierung der Bindegewebsmatrix beschrieben. Jede dieser Phasen ist in sich komplex und es ist klar, dass die Prozesse für eine gute Wundheilung nacheinander und koordiniert erfolgen müssen. Eine gute Wundheilung kann als Wiederherstellung der Haut, einschließlich des dermalen und epidermalen Teils, definiert werden, so dass das resultierende Narbengewebe der unverwundeten Haut strukturell, histologisch, funktionell und ästhetisch möglichst stark ähnelt. Natürlich unterscheidet sich dieses Narbengewebe von einer hypertrophischen Narbe oder einem Keloid.
Der Klarheit halber erfolgt nun eine vereinfachte Beschreibung der Zusammensetzung der menschlichen Haut. Der obere Teil besteht aus der Epidermis, die zum größten Teil Keratinozyten oder Epithelzellen, einige Melanozyten und Langerhansche Zellen und mehrere Merkel-Zellen enthält. In der Epidermis befinden sich fünf verschiedene Schichten, die den Zustand der Keratinosierung widerspiegeln. Die proliferierenden Keratinozyten auf dem Boden der Epidermis, d.h. im Stratum basale, sind über die Basalmembran an der Dermis befestigt. Die Dermis besteht aus Bindegewebe, einschließlich Fibroblasten und anderen Bindegewebszellen, und Bindegewebsmatrixsubstanzen. Blutgefäße, Nerven, sensorische Organe, Schweißdrüsen, Talgdrüsen und Haarfollikel liegen in der Dermis vor.
Klinische und tierexperimentelle Versuche haben gezeigt, dass die Applikation von (menschlichen) Keratinozyten, die in vitro gezüchtet wurden, beispielsweise als Flächenstücke, die Wundheilung in chronischen Wunden, wie z.B. Geschwüre und Verbrennungen, die gleichzeitig mit Spalthaut-Autotransplantaten aus Mesh behandelt werden können, fördert. Darüber hinaus gibt es Indikationen, bei denen die Applikation gezüchteter Keratinozyten-Transplantate hypertrophische Narbenbildung und Keloidbildung unterdrückt. Zunächst wurden Autotransplantate verwendet, die durch Züchtung von aus der eigenen Haut des Patienten isolierten Keratinozyten hergestellt wurden. Anschließend werden konfluente (differenzierte) Keratinozytenkulturen aus der Kulturschale gelöst und als Flächestück aufgebracht, wobei die Basalzellen nach unten zur Wunde zeigen. Ca. 3 Wochen sind nötig, bevor eine angemessene Menge Keratinozyten zur Applikation als Autotransplantat gezüchtet werden kann. Selbst dann kann die Menge aber noch immer nicht ausreichen, um die gesamte Wundfläche zu bedecken. Dieser Zeitraum kann jedoch für den Patienten kritisch sein, insbesondere im Fall von ausgedehnten Verbrennungen dritten Grades.
Deshalb wurden Versuche durchgeführt, in denen Keratinozyten-Autotransplantate aufgebracht wurden. Keratinozyten werden aus der Haut einer Person isoliert, gezüchtet, um konfluente Keratinozyten-Flächenstücke zu erhalten und dann auf die Wunde eines Patienten aufgebracht. Zwischen Auto- und Allotransplantaten konnte keine Unterschiede in der Wundheilungsaktivität beobachtet werden. Ein Hauptnachteil gezüchteter Allotransplantate ist das Risiko der Übertragung von Erregern, wie z.B. des humanen Immunschwächevirus, Hepatitis-B-Virus und Cytomegalievirus, aus der Spenderhaut in den empfangenden Patienten.
Diese Techniken zur Wundbehandlung verwenden frische Keratinozyten-Transplantate, die proliferierende Keratinozyten enthalten. Die Keratinozyten-Flächenstücke werden durch Behandlung mit Dispase aus dem Kulturgefäß gelöst und sofort auf die Wunde aufgebracht. Die Verfügbarkeit dieser Flächenstücke im Hinblick auf Zeit und Menge ist ein großer Nachteil frischer Keratinozyten-Transplantate. Es wird davon ausgegangen, dass proliferierende Keratinozyten-Kulturen eine höhere Wundheilungsaktivität aufweisen als differenziertere Kulturen. Darüber hinaus kann nur eine mehrschichtige Kultur als Flächenstück aus dem Kulturgefäß gelöst und über der Wunde ausgebreitet werden. Deshalb müssen gezüchtete Keratinozyten in einer optimalen Wachstumsphase entnommen werden. Es ist aber unmöglich vorherzusagen, wann ein Patient ins Krankenhaus eingeliefert wird und wie viele Keratinozyten-Transplantate dann benötigt werden. Ein weiterer Nachteil der Verwendung frischer (autologer) Keratinozyten-Flächenstücke ist, dass noch ein gewisser Zeitraum notwendig ist, bevor eine ausreichende Menge Keratinozyten-Flächenstücke gezüchtet und aufgebracht werden kann.
Kryokonservierte Allotransplantate können diese Schwierigkeiten teilweise umgehen. Kryokonservierte Keratinozyten-Transplantate können wie folgt hergestellt werden: konfluente (differenzierte) Keratinozyten-Kulturen werden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, 1 Tag ohne Zusatzstoffe (epidermaler Wachstumsfaktor, Insulin, Choleratoxin, Trijodthyronin, Transferrin, Hydrocortison) gezüchtet, aus der Schale durch Behandlung mit Dispase gelöst und an einem Transfersubstrat (z.B. Interface^® Wuhrlin- Soplamed) befestigt. Die Flächenstücke werden in Kulturmedium, dem 10% DMSO als Kälteschutzmittel zugefügt wurde, eingeweicht und tiefgekühlt in flüssigem Stickstoff für eine kürzere Zeit bei –80°C aufbewahrt. Vor dem Aufbringen wird die Probe aufgetaut und mit PBS gespült, um DMSO und Rinderserumproteine zu entfernen. Die Flächenstücke werden so aufgebracht, dass die Basalzellen wie bei frischen Flächenstücken nach unten zeigen. Nach dem Auftauen zeigt die Vitalanfärbung, dass ca. 60% der Zellen lebensfähig sind.
Zunächst wurde davon ausgegangen, dass die Keratinozyten aus gezüchteten Allotransplantaten auf den Wunden bleiben und dort wachsen, was klinisch als „Übernahme" bekannt ist. Mehrere Berichte haben in letzter Zeit aber gezeigt, dass der Wundverschluss auf das Wachstum von Wirtsepithel zurückzuführen ist.
Die Heilung wird also ohne permanente Übernahme der Keratinozyten-Transplantate eingeleitet, was darauf hinweist, dass die Wundheilungsaktivität auf eine (chemische) Substanz zurückzuführen sein kann, die mit den gezüchteten Keratinozyten in Zusammenhang steht und das Auswachsen von Keratinozyten stimuliert. Demzufolge wäre es nicht notwendig, Flächenstücke lebensfähiger Keratinozyten aufzubringen. Die gezüchteten Keratinozyten-Flächenstücke wurde deshalb lyophilisiert und die Wundheilungsaktivität wurde mit frischen und kryokonservierten Flächenstücken verglichen.
Die vorteilhafte Wirkung von gezüchteten Keratinozyten-Flächenstücken in der Wundheilung kann deshalb wahrscheinlich auf eine Substanz zurückgeführt werden, die in gezüchteten Keratinozyten vorliegt oder sie wird von Molekülen induziert, die in den gezüchteten Keratinozyten vorliegen. Bis heute sind diese Faktoren und ihre Konzentration in den gezüchteten Keratinozyten noch unbekannt. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass bestimmte bekannte Zytokine und Wachstumsfaktoren vorliegen. Viele bekannte Wachstumsfaktoren, z.B. Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), vom Thrombozyten stammender Wachstumsfaktor (PDGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), transformierender Wachstumsfaktor alpha (TGF-α), transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-β), beeinflussen die Keratinozyten und Hautfibroblasten. TGF-α, EGF und FGF induzieren beispielsweise die Proliferation von Keratinozyten. TGF-β und PDGF stimulieren die Synthese von Kollagen und anderen Bestandteilen des Bindegewebes. Neovaskularisation kann durch Basal-FGF und TGF-α beeinflusst werden. Aufgrund dieser Eigenschaften können diese Wachstumsfaktoren in der Wundheilung eine Rolle spielen.
Klinische Ergebnisse haben gezeigt, dass frische und kryokonservierte gezüchtete Keratinozyten-Flächenstücke die Reepithelisierung stimulieren und so zu einer schnelleren Wundheilung führen als die klassische Wundbehandlung oder Applikation von Spalthaut-Autotransplantaten in Meshform. Die Ergebnisse unseres Tiermodells für die Wundheilung zeigen, dass lyophilisierte gezüchtete Keratinozyten bessere Ergebnisse lieferten als Keratinozyten-Flächenstücke.
Der Begriff „lyophilisierte Keratinozyten" beschreibt ein Produkt aus menschlichen oder tierischen Keratinozyten, die in vitro bis zum subkonfluenten, konfluenten oder differenzierten Zustand gewachsen sind, wonach ein Lyophilisat aus diesen Zellen so hergestellt wird, dass kein oder nur minimaler Zerfall der mit der Zelle assoziierten Substanzen auftritt. Ein solches Lyophilisat weist Wundheilungsaktivität auf. Zellextrakte aus diesen gezüchteten Keratinozyten weisen ebenfalls Wundheilungsaktivität auf. Ein Zellextrakt kann beispielsweise nach Lyse und/oder Aufbrechen der gezüchteten Keratinozyten und anschließender Fraktionierung hergestellt werden. Das gesamte Material oder separate Fraktionen können lyophilisiert werden. Die Lyophilisierung ist nicht notwendig, aber sie ist vorteilhaft, weil die resultierende Substanz leichter an einem engen Ort aufbewahrt werden kann, leichter zu handhaben ist, in einer je nach den Umständen gewählten Formulierung aufgebracht werden kann (z.B. als Trockenpulver, Salbe, Suspension, Lösung, Gel, Creme oder biokompatible synthetische oder natürliche feste Matrix), in eine optimalen Dosis verabreicht werden kann, normalerweise eine längere Haltbarkeit aufweist und die wirksamste Zubereitung problemlos durch Screening festgestellt werden kann.
Ein Vorteil von lyophilisierten gezüchteten Keratinozyten ist, dass das Material genau in dem Moment zur Verfügung steht, in dem es gebraucht wird, was bei frischen gezüchteten Keratinozyten nicht der Fall ist. Vor dem Aufbringen auf eine Wunde müssen frische Keratinozyten-Flächenstücke einen Tag lang ohne fötales Kälberserum und Zusatzstoffe wie epidermaler Wachstumsfaktor, Choleratoxin, Trijodthyronin, Transferrin usw. gezüchtet werden. Anschließend müssen die Flächenstücke aus der Kulturschale mit Dispase entfernt, gespült und auf sterile Weise in den Operationssaal gebracht werden. Im Fall von kryokonservierten Flächenstücken wird das Aufbewahrungsmedium, das 10% DMSO als Kälteschutzmittel enthält, möglichst schnell bei 37°C aufgetaut und vor dem Verbringen in den Operationssaal gründlich mit PBS gespült. Aufgetaute kryokonservierte Keratinozyten-Transplantate müssen sorgsam behandelt werden, weil die Flächenstücke extrem zerbrechlich sind. Neben dem Bedarf an spezieller Unterbringung dauert es mindestens 1 Tag bei frischen Keratinozyten-Transplantaten und ca. 1 h bei kryokonservierten Keratinozyten-Transplantaten, bis sie auf die Wunde aufgebracht werden können. Demgegenüber ist lyophilisiertes Keratinozyten-Material sofort verfügbar und kann als solches aufgebracht oder in zuvor hergestellter steriler Gel- oder Salzlösung rehydriert werden. Von lyophilisierten Keratinozyten stammende Substanzen können in der optimalen Dosis aufgebracht werden. Im Fall von Keratinozyten-Flächenstücken wird die Wunde mit einem Flächenstück abgedeckt und es wird davon ausgegangen, dass es nutzlos ist, ein weiteres Flächenstück darüber zu legen.
Bei der Aktivität von gezüchteten Keratinozyten spielen Unterschiede zwischen Spendern eine Rolle. Die stimulierende Wirkung von lyophilisierten, von Keratinozyten abstammenden Substanzen auf die Keratinozyten-Proliferation lässt sich leicht in vitro testen. Die wirksamten Chargen können für die Behandlung des Patienten ausgewählt werden. Frische Keratinozyten-Transplantate können nicht untersucht werden und im Fall von kryokonservierten Keratinozyten-Flächenstücken erfordert die Herstellung des Materials zusätzlichen Arbeitsaufwand.
Lyophilisierte gezüchtete Keratinozyten sind als Extrakte oder Fraktionen leicht aufzubewahren. Eine große Menge kann im Voraus hergestellt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die stimulierende Wirkung auf das Keratinozytenwachstums in vitro untersucht werden kann, um die wirksamsten Zubereitungen auswählen zu können. Dies ist offensichtlich nicht möglich, wenn frische Keratinozyten-Flächenstücke verwendet werden. Darüber hinaus müssen frische Flächenstücke zum optimalen Zeitpunkt verwendet werden und können überhaupt nicht gelagert werden. Wenn zum optimalen Zeitpunkt der Kultur keine Patienten vorhanden sind, die behandelt werden müssen, werden die Zellen für diesen Zweck nutzlos. Daneben sollten kryokonservierte Keratinozyten-Flächenstücke in einem kryobiologischen Aufbewahrungsgefäß mit flüssigem Stickstoff gelagert werden. Der Vorrat an lyophilisierten Keratinozyten kann bei –20°C als Trockenpulver aufbewahrt werden.
Lyophilisierte Keratinozyten benötigen keine speziellen Transporteinrichtungen. Wenn sie aus der Kulturfläche gelöst werden, müssen frische und kryokonservierte Keratinozyten-Transplantate dagegen in einem isotonischen, sterilen gepufferten Medium transportiert werden, um Austrocknen der Keratinozyten zu verhindern. Darüber hinaus können sich diese Keratinozyten-Transplantate von der sie tragenden Gaze ablösen und schwimmen oder sich aufrollen, so dass die exakte Applikationsmethode, d.h. die basalen Keratinozyten weisen nach unten, behindert wird. Lyophilisiertes Keratinozyten-Material ist ein leichtes Pulver, das einfach in einem sterilen Fläschchen aufbewahrt wird. Es ist ratsam, das Pulver vor dem Gebrauch in Gel oder Kochsalzlösung zu rehydrieren und/oder aufzulösen. Die Zubereitung kann ohne Verlust der stimulierenden Wirkung auf die Keratinozyten-Proliferation mindestens 1 Woche bei 4°C aufbewahrt werden. Rehydrierte Substanzen können besseren Kontakt mit dem Wundgewebe haben und so den Heilungsprozess fördern.
Da die Substanz bei der Lagerung vollkommen trocken ist, sind Proteinasen nicht aktiv, so dass sich die Haltbarkeit verlängert.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Zellfraktionen, die aus Kulturen von Keratinozyten stammen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung einer Wundheilungssubstanz aus gezüchteten menschlichen Keratinozyten.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung einer Substanz, die aus gezüchteten menschlichen Keratinozyten stammt und für kosmetische Anwendungen verwendet werden kann.
Die Erfindung betrifft Kulturen von Keratinozytenzellen, die frei sind von nichtautologen Fibroblasten, Organextrakten, insbesondere Hypophysenextrakten, und von großen flachen durchscheinenden Keratinozytenzellen, die eine Zellamplifikationsrate von mindestens 1 Zellteilung alle zwei Tage, insbesondere von mindestens 1 Zellteilung alle 2,5 Tage und vorzugsweise eine Mindestkeimungsdichte von 1 × 10⁴ Zellen/cm², vorzugsweise von 3 bis 5 × 10⁴ Zellen/cm² aufweisen.
„Organextrakte" bezeichnen Rinderhirnextrakte und insbesondere Hypophysenextrakte.
Die großen durchscheinenden Keratinozytenzellen sind flache atypische Epithelzellen, die durch fadenförmiges Zytoplasma gekennzeichnet sind.
„Groß" im Ausdruck „große flache durchscheinende Keratinozytenzellen" bedeutet, dass Beobachtungen unter dem umgekehrten Lichtmikroskop zeigen, dass die Zellen ungefähr eine um das 3- bis 6-fache größere Oberfläche in der Kultur besetzen als die normale Größe der Keratinozyten im erfindungsgemäßen Kulturmedium oder als die Mehrheit der Keratinozyten in der epidermalen Wachstumsfaktoren enthaltenden, choleratoxin-freien Kultur.
„Flach" im Ausdruck „große flache durchscheinende Keratinozytenzellen" bedeutet, dass die Zellen weniger dick sind als die normalen Keratinozyten, die in der erfindungsgemäßen Kultur erhalten werden. Dicke bedeutet die fokale Stärke im Mikroskop.
„Durchscheinend" im Ausdruck „große flache durchscheinende Keratinozytenzellen" bedeutet, dass das Zytoplasma unter dem Lichtmikroskop weniger dicht ist als Keratinozyten, die im erfindungsgemäßen Kulturmedium erhalten werden. In anderen Worten handelt es sich um eine durchscheinende Zellen, wenn mehr als ca. 75% des Lichts durch die Zelle kommt. Wenn weniger als ca. 50% Licht durch die Zelle gelangt, handelt es sich um eine normale Keratinozytenzelle.
Das Verfahren zur Bestimmung der Zellamplifikationsrate wird hiernach beschrieben.
Beispielsweise werden 100 Zellen in einem erfindungsgemäßen Kulturmedium wie hiernach beschrieben geimpft. Alle 100 sind gemäß dem Typanblau-Lebensfähigkeitstest lebensfähig (d.h. lebensfähige Zellen werden nicht angefärbt, aber tote Zellen können den Farbstoff nicht ausschließend und werden deshalb blau gefärbt). Nur ein gewisser Prozentsatz der geimpften Zellen haftet and und breitet sich aus. Diese beiden Phänomene, Anheftung und Ausbreitung, sind Voraussetzungen für die Zellteilung. Die Anheftung ist das Phänomen, bei dem Zellen sich aus einer Suspension absetzen und am Träger anhaften. Die Zellen behalten in diesem Moment noch ihre runde Form. Dann kommt es zur Ausbreitung: runde Zellen können flacher werden und an einer größere Oberfläche auf dem Träger anhaften. Anschließend können sich die Zellen teilen, d.h. vervielfältigen. Eine Mutterzelle ergibt 2 Tochterzellen. Dieser Prozess wird Mitose genannt.
Proliferation oder Multiplikation kann fortlaufen und der Trägerbereich wird mit Zellen gefüllt. In diesem Moment nennt man die Kultur konfluent.
Die Zellamplifikationsrate bedeutet die Zeit, in der sich die Zellpopulation verdoppelt.
Das Verfahren zur Messung der Zellamplifikation ist wie folgt Fünf × 10⁴ trypanblau-ausschließende Zellen werden pro cm² in 6 Schalen mit einem Durchmesser von 35 mm geimpft. Nach 3 Tagen (d.h. am Tag 3) (alle Zellen, die anhaften konnte, hatten dann die Chance anzuhaften) werden drei Kulturschalen gespült, um die schwimmenden nicht anhaftenden Zellen zu entfernen. Die anhaftenden Zellen teilen sich jetzt noch nicht. Sie werden durch Behandlung mit Trypsin-EDTA (wie bei der Herstellung der Subkulturen) aus der Kulturschale entfernt und in einem Hämozytometer unter dem Lichtmikroskop gezählt. Daher ist die Gesamtmenge anhaftender Zellen bekannt. Für die drei Schalen können beispielsweise im Mittel 50.000 Zellen pro Schale erhalten werden. Wenn die anderen 3 Kulturen nach 13 Tagen (d.h. am Tag 13) Konfluenz erreichen, werden die Kulturen gespült, um die schwimmenden Zellen zu entfernen. Die anhaftenden Zellen werden dann mit Trypsin-EDTA entfernt und wie oben gezählt. Im Mittel werden 1,2 × 10⁶ Zellen pro Schale erhalten. Es ist bekannt, dass 1 Zelle sich in 2 Zellen teilt. Dies ergibt: 50.000 → 100.000 → 200.000 → 400.000 → 800.000 und ½ Teilung von 800.000 → 1.200.000. Somit erfolgen 4,5 Teilungen von der Konfluenz (Tag 13) bis zu dem Tag, an dem alle haftungsfähigen Zellen angeheftet sind (Tag 3), d.h. 4,5 Zellteilungen in 10 Tagen, entsprechend einer Teilung alle 2,2 Tage.
Wenn die Dichte geringer als 1 × 10⁴ Zellen/cm² ist, kann das Zellwachstum so sein, dass keine Konfluenz erreicht wird.
Wenn die Dichte höher als 5 × 10⁴ Zellen/cm² ist, wird schneller Konfluenz erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Kultur höchstens ca. 10%, vorzugsweise höchstens ca. 7% autologe Nicht-Keratinozytenzellen, wie z.B. sternförmige Nicht-Keratinozytenzellen, und höchstens ca. 1% und vorzugsweise höchstens ca. 0,5% autologe Fibroblasten.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung enthält die Kultur keine autologen Fibroblasten und keine autologen Nicht-Keratinozytenzellen und insbesondere keine autologen Melanozyten und keine autologen Langerhans-Zellen.
Die Proliferationsrate (d.h. die Zellteilungsrate) der Keratinozyten ist bei Vorliegen von Nicht-Keratinozytenzellen, wie z.B. Melanozyten und/oder Langerhans-Zellen, vermindert. Dies ist ein konzentrationsabhängiger Effekt. Die anhaftende Zellpopulation kann höchstens 10% dieser Zellen umfassen. Eine konfluente Keratinozytenschicht wird aber zweifellos erhalten. Diese Nicht-Keratinozyten sind sternförmige Zellen, die in Keratinozyten-Subkulturen eine untergeordnete Rolle spielen, weil die meisten sich nach der Passage im erfindungsgemäßen System nicht ausbreiten.
Die sternförmigen Nicht-Keratinozytenzellen sind beispielsweise Melanozyten und Langerhans-Zellen.
Wenn die Kultur mehr als ca. 10% autologe Nicht-Keratinozytenzellen enthält, wird die Teilung der Keratinozytenzellen am Anfang der Kultur (beispielsweise in der ersten Woche) anscheinend unterdrückt.
Nach dem Impfen sollten die Kulturen nicht mehr als ca. 1% autologe Fibroblasten der Gesamtmenge ausgebreiteter Zellen enthalten, weil kein konfluentes Keratinozyten-Flächenstück erhalten wird, wenn eine größere Fibroblastenmenge die eingeleitete Kultur kontaminiert. Wenn die Menge autologer Fibroblasten größer als ca. 1% ist, ist die Kulturoberfläche mit einer Monoschicht aus Bereichen von Fibroblasten und Inseln von Keratinozyten bedeckt, was zu einem nicht-kohäsiven Zellflächenstück führt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die erfindungsgemäße Kultur so, dass die Keratinozytenzellen ca. 10 Tage nach Beginn der Kultur der Keratinozyten, geimpft mit einer Dichte von nur 1 × 10⁴ Zellen/cm², aber vorzugsweise von 3 bis 5 × 10⁴ Zellen/cm² konfluent und örtlich differenziert sind.
Der Ausdruck „konfluent" weist darauf hin, dass die gesamte Oberfläche des Kulturgefäßes mit Zellen bedeckt ist. Die meisten Zellen in dieser Kultur sind aktiv proliferiert (d.h. haben sich geteilt). Im Fall von Keratinozyten in der erfindungsgemäßen Kultur kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass die Zelldifferenzierung in bestimmten Bereichen der Kultur sogar vor der Konfluenz erfolgt.
„Differenzierung" ist zu sehen, wenn keratohyaline Granulate enthaltende Keratinozyten in der Kultur gefunden werden. Keratohyaline Granulate werden wie folgt nachgewiesen. Keratohyaline Granulate werden in histologischen Präparaten, die mit Hämatoxilin-Eosin angefärbt sind, von gezüchteten mehrschichtigen Keratinozyten-Flächenstücken erkannt. Die Granulate sind als braune Flecken unter dem Lichtmikroskop zu sehen. Sobald die Kulturoberfläche mit Keratinozyten gefüllt ist, d.h. wenn Konfluenz erreicht ist, proliferieren die Zellen und ergeben dickere mehrschichtige Flächenstücke. Die Zellen in den oberen Schichten sind so differenziert.
„Örtlich differenziert" bedeutet, dass die Differenzierung in bestimmten Bereichen der Kultur noch vor der Konfluenz aufgetreten ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dürfen die Zellen nicht übermäßig differenziert sein. Dies hängt damit zusammen, dass die Kultur so stark sein muss, dass sich die Zellen vom Träger als Flächenstück ablösen lassen und dies erfordert eine mehrschichtige kohäsive Kultur. Eine solche mehrschichtige kohäsive Kultur enthält viele Keratinozytenzellen mit keratohyalinen Granulaten und sie ist daher differenziert.
„Kohäsiv" bedeutet, dass die Zellen aneinander haften bleiben.
Der Begriff „Flächenstück" bezieht sich auf eine konfluente Keratinozyten-Kultur, frisch oder kryokonserviert, die intakt aus der Kulturschale gelöst oder durch Dispase-Behandlung entfernt wird und die auf die Wunde eines Patienten entweder unmittelbar im Fall eines frischen Keratinozyten-Flächenstücks oder nach dem Auftauen im Fall eines kryokonservierten Flächenstücks aufgebracht werden kann. Eine bevorzugte Art von Flächenstück ist ein kryokonserviertes Keratinozyten-Transplantat, das wie oben beschrieben hergestellt werden kann.
Bei der Herstellung eines Flächenstücks ist es angemessen, Keratinozytenzellkulturen zu verwenden, die nicht weiß sind und die nirgendwo Bläschen enthalten, die für ein „übermäßig differenziertes Stadium" charakteristisch sind. Wenn die Flächenstücke zu stark differenziert sind, kann fast keine Proliferation in der Kultur erfolgen, so dass die Wundheilungseigenschaften weniger optimal sein können. Wenn die Flächenstücke zu stark differenziert sind, können sie ohne Enzym vom Träger gelöst werden, aber wenn die konfluenten Flächenstücke weniger differenziert sind, muss ein Enzym wie Dispase (beispielsweise von Boehringer Mannheim) verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Kultur der Keratinozytenzellen in 8 Durchgängen und vorzugsweise 6 Durchgängen ohne Verlust von Differenzierung mit einem Spaltverhältnis von ¼ zu ½, vorzugsweise 1/3 in Subkultur gezüchtet werden.
Es sei dann erinnert, dass eine Subkultur eine Mutterkultur ist, von der eine erste abstammende Kultur durch Trypsinisierung durchgeführt wird (zur Entfernung von Zellen vom Träger und Trennen von Zellen, die aneinander haften, um eine Suspension separater Zellen zu erhalten), und Impfen der suspendierten Zellen auf X Schalen (X wird später definiert), aus dieser abstammenden Kultur, wonach eine zweite Kultur durchgeführt wird und die Gesamtzahl abstammender Kulturen der Anzahl Subkulturen entspricht.
Der Ausdruck „Spaltverhältnis" von 1/X bezieht sich auf die Tatsache, dass es möglich ist, aus der Gesamtheit einer Mutterkultur zu impfen und Konfluenz und Differenzierung auf X Petrischalen zu erhalten.
Die Erfindung betrifft ferner die Kultur von Keratinozyten, wie die, die mit einem die folgenden Schritte umfassenden Verfahren erhalten werden:

– Impfen von Keratinozytenzellen auf einem Träger mit einer Dichte von nur 1 × 10⁴ Zellen/cm², vorzugsweise 3 bis 5 × 10⁴ Zellen/cm² in einem Kulturmedium, das Basalmedium enthält, das wiederum Medium 199 enthält, mit den folgenden Zusätzen: Serum, epidermaler Wachstumsfaktor, Hydrocortison und/oder Choleratoxin, und möglicherweise Insulin, frei von nichtautologen Fibroblasten und frei von Organextrakten, insbesondere Hypophysenextrakten; und
– Wachsen dieser Zellen bei einer Temperatur von 37°C in einer mit Wasser gesättigten Atmosphäre mit CO₂, vorzugsweise im Bereich von ca. 1% bis ca. 10%, insbesondere im Bereich von ca. 2% bis ca. 8%.

Die Erfindung betrifft ferner Extrakte von erfindungsgemäßen Keratinozytenkulturen, möglicherweise in lyophilisierter Form. Diese Extrakte können auf herkömmliche Weise von Kulturen geformt werden.
Der Begriff „Extrakt" bezieht sich auf ein Zellprodukt aus menschlichen oder tierischen Keratinozyten, das in vitro bis zur Konfluenz gezüchtet wurde und seine Wundheilungsaktivität beibehalten hat. Ein Zellextrakt kann beispielsweise nach Lyse und/oder Aufbrechen der gezüchteten Keratinozyten und anschließender Fraktionierung hergestellt werden, und die verschiedenen Fraktionen können dann wie oben beschrieben lyophilisiert werden. Solche Lyophilisate können als Trockenpulver, in einer Salbe, in einer Suspension, in einer Lösung, in einem Gel, in einer Creme oder in einer biokompatiblen, synthetischen oder natürlichen festen Matrix, die je nach Umständen gewählt wird, aufgebracht und in der optimalen Dosis verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirksubstanz einen Extrakt wie oben definiert enthält, die vorzugsweise in lyophilisierter Form vorliegt und die zur Förderung der Heilung von oberflächlichen Wunden, beispielsweise von Haut, wie z.B. menschlicher Haut, verwendet werden kann. Diese pharmazeutische Zusammensetzung umfasst vorzugsweise den lyophilisierten Extrakt in einer Formulierung, die zum Aufbringen auf oberflächliche Wunden geeignet ist. Eine solche Formulierung kann direkt auf eine Oberflächenwunde entweder als Trockenpulver oder in Form eines Gels, einer Creme, einer Salbe, einer Suspension, einer Lösung oder einer biokompatiblen synthetischen oder natürlichen festen Matrix aufgebracht werden, die jeweils auf herkömmliche Weise hergestellt werden können, wenn gewünscht mit herkömmlichen pharmazeutische annehmbaren Hilfsstoffen und Zusatzstoffen. Normalerweise wird der lyophilisierte Extrakt in einer solchen Zusammensetzung in einer Konzentration eingearbeitet, die von der Art der zu heilenden Oberflächenwunde und den Umständen, unter denen die Zusammensetzung verwendet werden soll, abhängt. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßer lyophilisierter Zellextrakt in einer solchen Konzentration aufgebracht werden, dass die Menge an Wirksubstanz für die Wundheilung pro cm² der Menge an Wirksubstanz in ca. 10³–10⁷ lebenden Keratinozyten, vorzugsweise 10⁴–10⁶ lebenden Keratinozyten, insbesondere 5 × 10⁴ – 5 × 10⁵ lebenden Keratinozyten entspricht. (Es versteht sich natürlich, dass nicht direkt gemessen werden kann, wie viel der Wirksubstanz in einer Kultur lebender Zellen vorliegt; die Wirksubstanz wurde deshalb mit Bezug auf die Menge an Wirksubstanz beschrieben, die in einer Menge von Keratinozytenzellen vorliegt.)
Beispiele für Arten von Oberflächenwunden, die mit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung behandelt werden können, sind:

– thermische, chemische, elektrische und strahlenbedingte Verbrennungen der Haut; Verbrennungen, die mit maschenförmigen Hautautotransplantaten abgedeckt sind, profitieren ebenfalls von erfindungsgemäßen Keratinozyten-Zubereitungen, die den Verschluss der Maschenzwischenräume stimulieren;
– über die volle Dicke und die teilweise Dicke gehende mechanische Wunden, wie z.B. Schnitte, Schürfwunden und Lazerationen; diese Arten von Wunden umfassen auch Operationswunden und Exzisionswunden der Haut;
– verschiedene Ulzerationen der Haut, wie z.B. Dekubitus, venöse und arterielle Geschwüre und Geschwüre durch Grunderkrankungen wie z.B. Diabetes und Vaskulitis;
– Hornhautwunden;
– Trommelfellläsionen; und
– Läsionen aufgrund von pathologischen Zuständen, wie z.B. Pemphigoid bullosa, Epidermolysis bullosa und Lupus erythematodes.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Förderung der Heilung einer Oberflächenwunde (beispielsweise von Haut, z.B. menschliche Haut) durch Aufbringen einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung auf die Oberflächenwunde.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Kultur von Keratinozytenzellen ohne nichtautologe Fibroblasten und ohne Organextrakte, insbesondere Hypophysenextrakte, umfassend:

– Keratinozytenzellen, geimpft auf einem Träger mit einer Dichte von nur 1 × 10⁴ Zellen/cm², vorzugsweise 3 bis 5 × 10⁴ Zellen/cm² in einem Kulturmedium, das Basalmedium enthält, das wiederum Medium 199 enthält, mit den folgenden Zusätzen: Serum, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Hydrocortison und/oder Choleratoxin, und möglicherweise Insulin, frei von nichtautologen Fibroblasten und frei von Organextrakten, insbesondere Hypophysenextrakten; und
– Wachsen dieser Zellen bei einer Temperatur von 37°C in einer mit Wasser gesättigten Atmosphäre mit CO₂, vorzugsweise im Bereich von ca. 1% bis ca. 10%, insbesondere im Bereich von ca. 2% bis ca. 8%.

Zum Erhalten eines Flächenstücks müssen die Keratinozyten auf einem Träger geimpft werden. Der Träger kann aus Plastik oder jeder natürliche (z.B. Kollagen oder entepithelialisierte Dermis), halbsynthetische (z.B. mit Fibronectin überzogener Kunststoff) oder synthetische Träger (z.B. Polyurethan) sein, der Zellwachstum gestattet.
In den Beispielen werden die Ergebnisse relativ zur Rolle von EGF, Choleratoxin, Hydrocortison und Insulin in speiseschichtfreiem Keratinozytenwachstum in vitro angegeben.
Medium 199 dieses Verfahrens ist im belgischen Katalog von Gibco BRL Life Technologies (1991) auf Seite 46 offenbart. Medium 199 kann durch Medium CMRL 1066 (Belgian Gibco BRL Life Technologies Katalog, Seite 39, 1991) oder Williams E. Medium (Williams E Medium: Belgian Gibco BRL Life Technologies Katalog, Seite 62, 1991) oder einer Kombination daraus ersetzt werden.
Serum dieses Verfahrens enthält Rinderserumalbumin (BSA), aber vorzugsweise wird zusätzliches BSA zugefügt, so dass die Gesamtkonzentration von BSA im Kulturmedium nicht weniger als ca. 0,5 g/l beträgt. Fötales Rinderserum enthält 13–29 g Serumalbumin pro Liter; daher ist für eine Konzentration von 10% fötales Rinderserum in 1 Liter Kulturmedium 1,3–2,9 g Serumalbumin und im Fall der Zugabe von 1 g Rinderserumalbumin pro Liter 2,3–3,9 g Serumalbumin in 1 l Kulturmedium vorhanden. Wenn 10% Serum dem Medium hinzugefügt wird, hat das zusätzliche BSA nur wenig Einfluss.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Kulturmedium für das Verfahren während des Verfahrens modifiziert werden. Beispielweise kann ein erstes Kulturmedium mit Choleratoxin als Zusatzstoff und anschließend ein zweites Kulturmedium mit epidermalem Wachstumsfaktor, Hydrocortison und Choleratoxin als Zusatzstoffe. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens enthält das Kulturmedium Medium 199, Serum und die folgenden drei Bestandteile: Hydrocortison, epidermaler Wachstumsfaktor und Choleratoxin.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem das Kulturmedium wie folgt beschaffen ist:

– das Grundmedium enthält:
• ca. 20% bis ca. 100% (m/v) Medium 199, wobei das Medium zu bis zu 80%, vorzugsweise zu bis zu 75% durch ein anderes basales Kulturmedium wie z.B. MEM-Medium ersetzt werden kann,
– Serum in der Kultur liegt in einer Konzentration von ca. 2% bis ca. 25%, insbesondere ca. 4% bis ca. 15% (v/v), ganz besonders 10% vor, wobei das Serum vorzugsweise fötales Serum oder Neugeborenenserum, insbesondere fötales Kälberserum ist;
– Hydrocortison im Kulturmedium liegt in einer Konzentration von 0 bis ca. 4 μg/ml, insbesondere ca. 0,01 μg/ml bis ca. 2 μg/ml, vorzugsweise ca. 0,1 bis ca. 0,8 μg/ml, insbesondere 0,4 μg/ml, vor,
– Epidermaler Wachstumsfaktor im Kulturmedium liegt in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 100 ng/ml, insbesondere ca. 1 bis ca. 50 ng/ml, vorzugsweise ca. 3,3 bis ca. 20 ng/ml, ganz besonders 10 ng/ml, vor,
– Choleratoxin im Kulturmedium liegt in einer Konzentration von 0 bis ca. 80 ng/ml, insbesondere ca. 1 bis ca. 50 ng/ml, vorzugsweise ca. 3 bis ca. 18 ng/ml, ganz besonders bevorzugt 9 ng/ml, vor,
– Insulin im Kulturmedium liegt in einer Konzentration von 0 bis ca. 30 μg/ml, insbesondere ca. 1 bis ca. 10 μg/ml, beispielsweise 5 μg/ml, vor. Die Konzentration des Grundmediums im Kulturmedium beträgt ca. 80% bis ca. 98%.

Wenn im Grundmedium weniger als 20% Medium 199 vorliegt ist das Wachstum wahrscheinlich langsamer und die Zellen unterstützen weniger als 8 Durchgänge.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, bei dem das Kulturmedium frei von Rinderhirnextrakt, Trijodthyronin, Transferrin, menschlicher Cohn-Fraktion V und Adenin außer dem in Medium 199 enthaltenen Adenin ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, bei dem das Kulturmedium frei von Ethanolamin, Selenit, Putrescin und Phosphoethanolamin ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Kultur von konfluenten Keratinozytenzellen, worin das verwendete Verfahren der Erfindung entspricht und folgende Schritte umfasst:

– Auswechseln des Kulturmediums der Zellen mindestens alle 4 Tage, vorzugsweise alle zwei Tage, und
– Stoppen des Wachstums der Kultur nach einer Zeit, die ausreicht, um eine konfluente kohäsive mehrschichtige Kultur zu erhalten, indem die Zellen für eine ausreichende Zeit zum Abstoßen der oben erwähnten Zusatzstoffe in ein Überlebensmedium gelegt werden, wobei das Überlebensmedium so beschaffen ist, dass die Zellen am Leben bleiben können, aber wo keine Stimulation zur Proliferation und Differenzierung von Zellen erfolgt und wobei das Medium beispielsweise das erfindungsgemäße Kulturmedium ist, das vorzugsweise kein Serum und vorzugsweise kein zusätzliches BSA, keinen epidermalen Wachstumsfaktor, kein Hydrocortison, kein Choleratoxin und kein Insulin enthält, oder ein andere Grundmedium oder ein Gemisch von beliebigen Grundmedien ist,
– Waschen der Zellen zur Entfernung des oben erwähnten Überlebensmediums, beispielsweise mit PBS.

Keine Stimulation zur Proliferation bedeutet, dass sie ohne Zwang von außen von selbst proliferieren können.
Ein Beispiel für ein Grundmedium, das als Überlebensmedium verwendet wird, kann DMEM-F12 sein.
Das Kulturmedium wird alle 4 Tage ausgetauscht, um die Nährstoffe zu ersetzen, die aufgebracht sind und um die von der Zellkultur produzierten Metaboliten zu eliminieren.
Das Wachstum der Kultur wird allgemein nach ca. 10 Tagen, vorzugsweise nach 11 Tagen gestoppt, um eine konfluente kohäsive mehrschichtige Kultur zu erhalten.
Die Zellen werden im Allgemeinen ca. 1 bis 2 Tage in ein Überlebensmedium gelegt, um die oben erwähnten Zusatzstoffe zu eliminieren. Wenn sie mehr als 2 Tage in ein Überlebensmedium gelegt werden, kann Nährstoffmangel entstehen.
Wenn die Zellen gewaschen werden, können sie direkt in Wunden oder zur Lyophilisierung oder Kryokonservierung verwendet werden.
DMEM-F12 ist im belgischen Katalog von Gibco BRL Life Technologies (1991) auf Seite 41 offenbart.
Vorzugsweise ist kein Serum vorhanden, um immunologische Reaktionen aufgrund der Anwesenheit von nichtmenschlichen Substanzen zu vermeiden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Kultur konfluenter und differenzierter Keratinozytenzellen, wobei das verwendete Verfahren der Erfindung entspricht und folgende Schritte umfasst:

– Auswechseln des Kulturmediums der Zellen mindestens ungefähr alle 4 Tage und
– Stoppen des Wachstums der Kultur nach ca. 21 Tagen, indem die Zellen für ca. 1 bis 2 Tage in ein Überlebensmedium gelegt werden, in dem die Zellen am Leben bleiben können, aber wo keine Stimulation zur Proliferation und Differenzierung der Zellen erfolgt und wobei das Medium beispielsweise das erfindungsgemäße Kulturmedium ist, das vorzugsweise kein Serum und kein zusätzliches BSA, aber keinen epidermalen Wachstumsfaktor, kein Hydrocortison, kein Choleratoxin und kein Insulin enthält, oder ein beliebiges anderes Grundmedium oder ein Gemisch von beliebigen Grundmedien oder DMEM-F12 ist,
– Waschen der Zellen zur Entfernung des oben erwähnten Überlebensmediums, beispielsweise mit PBS.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, worin die Zellen nach dem Ablösen vom Träger, beispielsweise mit Dispase, in Form von Flächenstücken gewonnen werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Keratinozytenzellen in lyophilisierter Form, worin die Zellen nach der Gewinnung gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben und anschließender Lyse (beispielsweise mittels einer hypotonischen Lösung), Ablösen vom Träger (beispielsweise mechanisch), Sammeln und möglicherweise Schallbehandlung, bei einer Temperatur von ca. –20°C bis ca. –196°C, vorzugsweise ca. –40°C eingefroren werden und dann unter Vakuum lyophilisiert werden, um eine das Lyophilisat darstellende Trockensubstanz zu ergeben. Alternativ können die Zellen zuerst vom Träger abgelöst (beispielsweise mechanisch oder durch Behandlung mit Dispase), anschließend gelöst (beispielweise mittels hypotoner Lösung oder durch Bestrahlen) und dann lyophilisiert werden.
Ein Beispiel für eine hypotone Lösung kann zehnfach in Wasser verdünntes PBS sein.
Die Zellen können vom Träger beispielsweise durch Abschaben gelöst werden, beispielweise mit einem Gummi-Schaber.
Die Schallbehandlung hat den Vorteil, dass der Zellinhalt durch Aufbrechen der Zellen freigesetzt wird.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Extrakten von Keratinozytenkulturen, worin die Zellen erfindungsgemäß erhalten werden, worin die Zellen nach der Lyse (beispielsweise mit hypotoner Lösung), dem Ablösen vom Träger (beispielsweise mechanisch) und Sammeln bestrahlt und zentrifugiert werden, um folgendes zu erhalten:

– einen Überstand mit Molekülen, die in der hypotonen Lösung löslich sind, und möglicherweise mit Substanzen, die durch Bestrahlen von der Zellmembran abgelöst wurden, und
– ein die Zellmembran und Zellkerne enthaltendes Pellet,

Die erfindungsgemäße Technik zur Herstellung von lyophilisiertem Material aus Keratinozytenkulturen umfasst im Wesentlichen die folgenden Schritte:

– Verwendung von primären oder durchlaufenen konfluenten bis differenzierten Keratinozytenkulturen, die ohne Nährschicht gezüchtet wurden, als Quelle,
– Spülen der Kulturen mit PBS, Abschaben der Zellen von der Kulturoberfläche mit einem Gummi-Schaber,
– Lyse der Zellen durch hypotonen Schock und/oder Schallbehandlung,
– Lyophilisation zur Gewinnung eines Gesamtlyophilisats oder Herstellung von Zellfraktionen durch Zentrifugation und anschließende Lyophilisation des Überstands und der Pelletfraktionen.

Um sterile Extrakte zu erhalten kann das Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alternativ können die Extrakte nach der Lyophilisation, beispielsweise durch Bestrahlen mit UV-Licht oder Gammastrahlen sterilisiert werden. Wenn notwendig können die Extrakte anschließend rehydriert und/oder als Gel, Creme, Salbe usw. neu formuliert werden, beispielsweise durch Auflösen der Extrakte in einem wassermischbaren Gel oder in einer Salzlösung.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von kryokonservierten Kulturen von Keratinozyten, worin die Zellen erfindungsgemäß erhalten werden und worin die Zellen in eine kaltes Medium gelegt werden, vorzugsweise in ein isotonisches und gepuffertes Medium, bei einer Temperatur von ca. 0 bis ca. 15°C, wobei das Medium Serum enthält, das die Zellen vor Gefrierschäden schützt und möglicherweise die Toxizität des Kälteschutzmittels verhindert, das dem kalten Medium ferner hinzugefügt wird, um Zellschäden zu vermeiden, und worin die Zellen bei einer Temperatur von –20°C bis ca. –196°C, vorzugsweise –70°C, eingefroren werden, wonach die Zellen in flüssigen Stickstoff gelegt werden.
Im Begriff „kaltes Medium" bedeutet „kalt", dass die Temperatur unter 37°C unter vorzugsweise zwischen 0 und 15°C liegen sollte.
Ein Beispiel für ein solches Medium ist eine isotonische gepufferte Lösung, die ein Grundmedium darstellt, dem 10% Serum und 10% Kälteschutzmittel, wie z.B. DMSO oder Glycerol oder ein Gemisch von DMSO und Glycerol zugefügt wird.
Die Kältekonservierung in Medium ohne Serum führt zu mehr Gefrierschäden. Wenn kein Serum vorhanden ist, werden nur wenige lebensfähige Zellen gewonnen und die Flächenstücke zerfallen in Stücke.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von kryokonservierten Kulturen, worin die Zellen erfindungsgemäß erhalten werden und das die folgenden Schritte umfasst:

– Auswechseln des Kulturmediums der Zellen mindestens ungefähr alle 4 Tage und
– Stoppen des Wachstums der Kultur nach ca. 21 Tagen, indem die Zellen in ein Überlebensmedium gelegt werden, in dem die Zellen am Leben bleiben können, aber wo keine Stimulation zur Proliferation und Differenzierung der Zellen erfolgt und wobei das Medium beispielsweise das erfindungsgemäße Kulturmedium ist, das möglicherweise Serum und möglicherweise zusätzliches BSA und Insulin, aber keinen epidermalen Wachstumsfaktor, kein Hydrocortison, kein Choleratoxin enthält, oder ein beliebiges anderes Grundmedium oder ein Gemisch von beliebigen Grundmedien oder DMEM-F12 ist,
– Waschen der Zellen zur Entfernung des oben erwähnten Überlebensmediums, beispielsweise mit PBS, und
– Gewinnung der Zellen in Form von Flächenstücken, die vom Kulturträger abgelöst werden und worin die Flächenstücke der Zellen in ein kaltes Medium gelegt werden, vorzugsweise in ein isotonisches und gepuffertes Medium, bei einer Temperatur von ca. 0°C bis ca. 15°C, wobei das Medium Serum enthält, das die Zellen vor Gefrierschäden schützt und möglicherweise die Toxizität des Kälteschutzmittels verhindert, das dem kalten Medium ferner hinzugefügt wird, um Schäden der Zellen und der Zellflächenstücke zu vermeiden, und worin die Zellen bei einer Temperatur von –20°C bis ca. –196°C, vorzugsweise –70°C, eingefroren werden.

Die Zellflächenstücke werden dann in flüssigen Stickstoff gelegt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Kulturmedium, das ein Grundmedium enthält, das wiederum Medium 199 enthält, mit den folgenden Zusatzstoffen: Serum, epidermaler Wachstumsfaktor, Choleratoxin und/oder Hydrocortison, und möglicherweise Insulin, und das keine nichtautologe Fibroblasten und keine Organextrakte, insbesondere Hypophysenextrakte, enthält.
Die Erfindung betrifft ferner eine Mediumkultur, die Medium 199 als Grundmedium und die folgenden Zusatzstoffe enthält: Serum und mindestens zwei der folgenden drei Bestandteile: Hydrocortison, epidermaler Wachstumsfaktor, Choleratoxin und möglicherweise Insulin.
Die Erfindung betrifft ferner ein Kulturmedium, das wiederum Medium 199 enthält, mit Serum und den folgenden Zusatzstoffen: Hydrocortison, epidermaler Wachstumsfaktor, und Choleratoxin und möglicherweise Insulin.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Medium enthält:

· ca. 20% bis ca. 100 (m/v) Medium 199, wobei das Medium zu bis zu 80% und vorzugsweise bis zu 75% durch ein anderes Grundmedium, wie z.B. Medium MEM ersetzt werden kann,
– das Serum im Kulturmedium ist in einer Konzentration von ca. 2% bis ca. 25%, insbesondere ca. 4% bis ca. 15% (v/v), ganz besonders 10%, enthalten, wobei das Serum vorzugsweise fötales Serum oder Neugeborenenserum, insbesondere fötales Kälberserum ist,
– Hydrocortison im Kulturmedium ist in einer Konzentration von 0 bis ca. 4 μg/ml, insbesondere ca. 0,01 bis ca. 2 μg/ml, vorzugsweise ca. 0,1 bis ca. 0,8 μg/ml, insbesondere 0,4 μg/ml, enthalten,
– Epidermaler Wachstumsfaktor im Kulturmedium liegt in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 100 ng/ml, insbesondere ca. 1 bis ca. 50 ng/ml, vorzugsweise ca. 3,3 bis ca. 20 ng/ml, ganz besonders 10 ng/ml, vor,
– Choleratoxin im Kulturmedium liegt in einer Konzentration von 0 bis ca. 80 ng/ml, insbesondere ca. 1 bis ca. 50 ng/ml, vorzugsweise ca. 3 bis ca. 18 ng/ml, ganz besonders bevorzugt 9 ng/ml, vor,
– Insulin im Kulturmedium liegt in einer Konzentration von 0 bis ca. 30 μg/ml, insbesondere ca. 1 bis ca. 10 μg/ml, beispielsweise 5 μg/ml, vor.

Die erfindungsgemäßen Keratinozytenkulturen haben wundheilende Eigenschaften.
Die Stimulation der Keratinozytenproliferation in vitro ist eine Eigenschaft der Keratinozytenzubereitung. Es ist aber nicht auszuschließen, dass eine auch eine kleine Inhibitormenge vorliegen kann.
An einem Tiermodell wurden Untersuchungen durchgeführt. Über die volle Dicke gehende wunden wurden mit renaturierten lyophilisierten Keratinozytensubstanzen (d.h. Gesamtlyophilisat und Zellextrakt), klassischer Wundbehandlung und Applikation des bekannten Wachstumsfaktors TGF-α, der durch Kultur von Keratinozyten produziert werden kann, behandelt. Über die ganze Dicke gehende Wunden, die sich bis in die Hypodermis erstrecken, gehören zu den Wunden, die am schwierigsten zu heilen sind.
Die stimulierende Aktivität des Keratinozytenmaterials auf das Epithelzellwachstum ist bekannt. Es ist aber nicht klar, ob gezüchtete Keratinozyten Substanzen enthalten, die bestimmte Phasen des Wundheilungsprozesses hemmen können. Dies kann in über die ganze Dicke gehende Wunden festgestellt werden.
Zur klinischen und histologischen Beschreibung der Wundheilung wurden rigoros definierte Kriterien verwendet. Ein wichtiges Kriterium ist die Zeit bis zum Wundverschluss. Darüber hinaus ist die Qualität der geheilten Haut von herausragender Bedeutung. Je mehr das Narbengewebe histologisch unverwundeter Haut ähnelt, desto besser ist die Qualität. Es kann daraus geschlossen werden, dass die aus Keratinozyten gewonnenen Substanzen der Erfindung wundheilende Aktivität aufweisen. Das Gesamtlyophilisat führte zu schneller Heilung und einer qualitativ besseren Narbe, im Vergleich mit den Kontrollen und der Wirkung frischer oder kryokonservierter Keratinozyten-Flächenstücke, TGF-α und klassischer Behandlung mit Duoderm^®.
LEGENDE DER ABBILDUNGEN
1 stellt die unverwundete Schweinehaut dar (Vergrößerung: 900-fach).
Dieses Bild zeigt deutlich das Vorhandensein von Rete-Leisten und die unterschiedlichen Zellschichten in der Epidermis (Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosom, Stratum corneum).
Es zeigt auch, dass keine Ablösung zwischen Epidermis und Dermis vorliegt und es zeigt das Vorhandensein von Kollagenbündeln in der Pars reticulare der Dermis (unterer Bildteil). Blutkapillaren in der Dermis sind gruppenweise geordnet.
2 zeigt Narbengewebe in Schweinehaut 91 Tage nach der Verwundung. Bis zum Wundverschluss wurde die Wunde mit erfindungsgemäßen lyophilisierten Keratinozytenkulturen behandelt. Das Bild zeigt das Vorhandenseiten von Rete-Leisten, die Anhaftung zwischen Epidermis und Dermis und das Vorhandensein von Kollagenbündeln. Es zeigt auch das Vorhandensein von dünnen Kollagenbündeln. Die Epidermis enthält die verschiedenen Zellschichten. Vergrößerung: 900-fach.
3 zeigt eine geringere Vergrößerung (Vergrößerung: 200-fach) der Schweinehaut, 84 Tage nach der Verwundung, die bis zum Wundverschluss mit Duoderm^® behandelt wurde.
Dieses Bild zeigt, dass keine Rete-Leiste vorliegen und dass es zur Ablösung zwischen Epidermis und Dermis kam. Kollagenbündel und Blutkapillaren können aufgrund der geringen Vergrößerung in diesem Bild nicht bewertet werden.
BEISPIEL 1
Hautquelle und Isolierung von Keratinozyten
Menschliche Keratinozyten werden von chirurgischen Hautpräparaten (Vorhaut, Mammoplastie, Bauchhaut und andere Körperstellen) und von Kadaverhaut isoliert.
Die Haut wird mit einem Dermatom in einer Dicke von bis zu 1 mm entnommen. Dickere Hautstücke, die manchmal Hypodermis enthalten, werden ebenfalls verwendet. Die Haut wird dann unmittelbar in mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3,1 g Na₂HPO₄ × 12 H₂O, 0, 2 g KH₂PO₄ in Milli-Q-Wasser ad 1 l; pH 7,4) gelegt und bei 4°C gehalten. Die Proben werden dann innerhalb von 4 h ins Kulturlabor gebracht. Die Haut wird umfassend mit 100 E/ml Penicillin enthaltendem PBS und 100 mg/ml Streptomycin gespült. Wenn notwendig werden die Hautproben bei 4°C in Lösung A, bei der es sich um eine isotonische gepufferte Lösung mit 30 mM Hepes, 10 mM Glucose, 3 mM KCl, 130 mM NaCl, 1 mM Na₂HPO₄ × 12 H₂O und 3,3 nM Phenolrot handelt, aufbewahrt. Dünne Hautstücke können ca. 16 h, dickere ca. 4 Tage aufbewahrt werden.
Fettgewebe wird möglichst umfassend entfernt. Die Haut wird in kleinere Stücke mit einer Größe von ca. 0,5 × 0,5 cm geschnitten und in Trypsin-Lösung gelegt (0,25% Trypsin Sigma in Lösung A). Das Verfahren hängt von der Dicke der Hautprobe ab. Dünne maschenförmige Haut wird ca. 20 Min bei 37°C trypsiniert, während dicke Haut ca. 16 h bei 4°C trypsiniert wird.
Die Epidermis wird mit einer Pinzette von der Dermis getrennt. Die Epidermis wird dann durch Auf-und-Ab-Pipettieren und Durchführen durch eine Injektionsnadel (21 G, 0,8 × 50) suspendiert. Bei einem alternativen Verfahren wird die Basalseite der entfernten Epidermis abgeschabt, um die Basalzellen aufzufangen. Das verbleibende suprabasale Epidermalgewebe wird verworfen. Der obere Teil der Dermis enthält noch zahlreiche basale Keratinozyten, aber auch Fibroblasten und wird daher vorsichtig abgeschabt, aber nur einmal. Die Trypsinierung wird durch Zugabe von 10% fötalem Kälberserum aufgehalten. Die Zellsuspension wird dann durch sterile Gaze (Perlon P6, 63 mm) filtriert und bei geringer Geschwindigkeit zentrifugiert (120 g für 8 Min).
Zellzählen
Die 0,2-ml-Zellsuspension wird mit 0,1-m1 Trypanblau-Lösung (0,4% in 0,85 Kochsalzlösung; Flow Laboratories) gemischt. Ca. 3 Minuten später werden die Zellen in einem Hämozytometer (Neubauer-Kammer) gezählt. Blau gefärbte Zellen sind tot, während nicht angefärbte Zellen lebensfähig sind.
Kultur menschlicher Keratinozyten
Die Zellen werden in Kulturmedium resuspendiert und in eine Plastik-Petrischale (100 mm Durchmesser, Becton Dickinson) in einer Dichte von 5 × 10⁴ lebensfähigen Zellen/cm² geimpft. Die Zellen werden in einem Inkubator bei 37°C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit 5% CO₂ in der Luft gezüchtet.
Ein Liter Kulturmedium (pH = 6,9–7,4, vorzugsweise = 7,1) besteht aus 2,78 g Medium 199 (Gibco; mit Hank-Salzen, mit Glutamin, ohne NaHCO₃), 8,03 g Minimal Essential Medium (Gibco, mit Hank-Salzen, mit Glutamin, ohne NaHCO₃), 1,3 g NaHCO₃ (Sigma), 1 g Rinderalbumin (Sigma), 5 mg Insulin aus Rinderpankreas (Sigma), 50 mg Glutamin (Sigma), 9 μg Cholera-Toxin (Sigma), 100 mg Streptomycinsulfat (Gibco), 100.000 E Penicillin (Gibco), 10 μg epidermaler Wachstumsfaktor (Gibco), 0,4 mg Hydrocortison (Sigma), 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (56°C, 30 Min) (Gibco). Das Medium wird in Milli-Q-Wasser (Millipore) hergestellt und durch Filtration sterilisiert (Millipore).
Das Kulturmedium wird 3 Tage später und dann alle 2 bis 3 Tage ausgewechselt. Die Kultur ist nach 10–16 Tagen konfluent. Dickere Flächenstücke mit 3–5 Zellschichten gelten nach ca. 20 Kulturtagen als differenziert und werden dann geerntet. Schweine-Keratinozyten werden mit derselben Technik isoliert und gezüchtet.
Subkultur
Die subkonfluente Keratinozyten-Kultur wird dreimal mit PBS gespült und mit Trypsin (0,05%) und EDTA (0,02%) in modifizierter Puck-Kochsalzlösung (Gibco) bedeckt. Wenn sich die Zellen gelöst haben, werden sie gesammelt und 8 Minuten bei 120 g zentrifugiert. Die pelletierten Zellen werden in Kulturmedium resuspendiert. Das Teilungsverhältnis beträgt 1:3.
Herstellung des Gesamtlyophilisats und der Zellextrakte
Subkonfluente, konfluente und sogenannte differenzierte Kulturen werden als Quelle verwendet. 24 Stunden vor Stoppen der Kultur wird die Kultur 3–4 Mal mit PBS gespült, DMEM/F12 (Gibco) wird ohne Zusatzstoffe oder fötales Kälberserum zugefügt. Am nächsten Tag werden die Kulturen zweimal mit PBS gewaschen und die Schale wird mit 5 ml sterilen 1/10 PBS (PBS 10 Mal verdünnt mit Milli-Q-Wasser) bedeckt. Fünf Minuten später werden die Zellen mit einem Gummi-Schaber abgeschabt und in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Becton Dickinson) aufgefangen. Die Schale wird zweimal mit insgesamt 5 ml 1/10 PBS gespült. Diese Lösung wird dem Falcon-Röhrchen zugefügt. Das Röhrchen wird vorsichtig ca. 5 Minuten geschüttelt und bei –30°C eingefroren. Die Proben werden innerhalb von 24 h lyophilisiert. Lyophilisiertes Material wird bei –30°C im Falcon-Röhrchen aufbewahrt.
Zellextrakt wird aus derselben Quelle gezüchteter Keratinozyten hergestellt. Die Zellen werden mit einem Gummi-Schaber in PBS oder hypotonischer PBS (1/10 PBS in Milli-Q-Wasser) abgeschabt. Die Suspension wird beschallt (15 Sek, 3 Mal) oder im Ultraturrax behandelt (13.500 U/min, 3 Mal 15 Sek in einem Eisbad); Ultraturrax T25^® Janke & Kunkel, IKA, Labortechnik, Deutschland) und anschließend 30 Min bei 4°C und 10.000 g zentrifugiert. Der resultierende Überstand und das Pellet werden getrennt lyophilisiert und bei –30°C aufbewahrt.
Die Behandlung der gezüchteten Keratinozyten mit Dispase (12 E pro Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm für ca. 15 Min bei 37°C; Boehringer) mit anschließenden 3 Wäschen mit PBS ist ein weiterer Schritt, der eingeleitet werden kann, bevor die Zellen von der Schale abgeschabt werden. Diese Behandlung hat keinen Einfluss auf die Keratinozyten-Aktivität.
Das Lyophilisat wird unter bakterizidem UV-Licht sterilisiert (15 Min, in einem Abstand von ca. 50 cm von der Lichtquelle).
Herstellung des Gels
0,2 g Idroramnosan (Federa, Brüssel) wird in 10 ml 0,9% NaCl oder in Milli-Q-Wasser gelöst. Die Sterilisation erfolgt durch 40-minütiges Autoklavieren bei 120°C.
Wiederauflösen der lyophilisierten Substanz
Vor dem Auflegen auf eine Wunde wird die lyophilisierte Substanz rehydriert und/oder wieder aufgelöst. Die Menge an sterilisierten gezüchteten Keratinozyten, die aus einer Petrischale erhalten werden, wird vor dem Auflegen auf die Wunde steril mit 1,5 ml Gel gemischt.
Tiermodell für die Wundheilung
Ziel der In-vivo-Experimente ist es herauszufinden, ob lyophilisiertes von Keratinozyten stammendes Material Wundheilungsaktivität aufweist und ob diese Aktivität besser ist als die frischer Keratinozyten-Flächenstücke, kryokonservierter Keratinozyten-Flächenstücke, einer klassischen Wundbehandlung mit Duoderm^® (ConvaTec Squibb) oder TGF-α, einem bekannten Keratinozyten-Wachstumsfaktor. Das lyophilisierte Keratinozyten-Material wurde vor dem Auftragen in Gel rehydriert.
Als Versuchstier wurde das Hausschwein gewählt, weil die histologischen Eigenschaften seiner Haut der menschlicher Haut ähneln: Beispiele sind die relative Dicke der Epidermis und Dermis, der relative Mangel an Haut und das Vorhandensein von subkutanem Fettgewebe.
Junge ausgewachsene männliche und weibliche Schweine mit einem Gewicht von ca. 60 kg werden mit Stresnil^® vorbehandelt (intramuskulär, 40 mg/20 kg; Janssen), mit Hypnodil^® narkotisiert (intravenös, 75 mg/20 kg; Janssen) und mit Fluothane^® (ICI) unter Narkose gehalten. Nach dem Rasieren des Rückens wird die Haut mit Hibiscrub^® (ICI) und Isobetadin dermicum (Asta Medica, Brüssel) desinfiziert. Operationswunden mit einer Größe von 3 × 3 cm werden auf dem Rücken in der Nähe der Wirbelsäure angebracht. Der Abstand zwischen den Wundrändern beträgt 5 cm. Eine Reihe mit 6 Wunden wird auf der linken Seite hergestellt und eine Reihe mit 6 auf der rechten Seite der Wirbelsäule. Die Wunden werden mit den unten aufgeführten Substanzen behandelt, mit einem Okklusivverband (Tegaderm^® 3M oder Opsite^® Smith and Nephew) abgedeckt und mit Fixomull^® (Beiersdorf) Verband fixiert. Schließlich wird der Rumpf mit einem elastischen nichtklebenden Verband umwickelt. Das Schwein darf sich dann in seinem Stall erholen. Die Wunden werden alle 4 bis 5 Tage begutachtet. Neues Material wird aufgebracht und die Verbände werden gewechselt, bis die Wunden geschlossen sind, was ca. drei Wochen dauert. Die Tiere erhalten normale Futterpellets und Wasser ad libitum.
Versuche wurden an 4 Tieren durchgeführt. Die Applikationseinheit des von Keratinozyten abstammenden Materials ist die Menge, die aus 1 Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm erhalten wird.
Die folgenden Substanzen wurden auf Wundheilungsaktivität geprüft:

– Duoderm^®, eine der am häufigsten verwendeten Substanzen zur Wundabdeckung (Versuche an Tier Nr. I, II, III und IV);
– Frische differenzierte Keratinozyten-Flächenstücke, erhalten ca. 20 Tage nach der Kultur (Nr. I, II, III und IV). Die Flächenstücke werden mit den Keratinozyten nach unten auf die wunde gelegt;
– Kryokonservierte differenzierte Keratinozyten-Flächenstücke werden ca. 20 Tage nach dem Impfen aus der Kultur abgelöst und in flüssigem Stickstoff gelagert (Nr. I, II, III und IV). Die Flächenstücke werden mit den basalen Keratinozyten nach unten auf die Wunde gelegt;
– Lyophilisierte Keratinozyten werden ausgehend von Keratinozyten-Flächenstücken hergestellt, die in 1/10 PBS aufgefangen und lyophilisiert werden (Nr. I, II, III und IV);
– 10.000 g Überstand wird aus Keratinozyten-Kulturen gewonnen, die in 1/10 PBS gelöst, in einem Ultra-turrax^® Janke & Kunkel, IKA, Labortechnik, Deutschland) homogenisiert und bei 10.000 g 30 Min zentrifugiert werden (Nr. I, II, III und IV). Der 10.000 g Überstand wurde in verschiedenen Konzentrationen zwischen 3% konzentriert und 1/500 verdünnt aufgebracht (Nr. 2 und II);
– das 10.000 g Pellet ist das 10.000 g Sediment des beschriebenen Verfahrens (Nr. I, II, III und IV);
– TGF-α ist eine der Faktoren, der bei der Wundheilung eine Rolle spielen kann. 400 ng, gelöst in 1,5 ml Gel, wurden auf die Wunde aufgebracht (Nr. I, II, III und IV);
– Gel ist 1,5 ml Gel, in dem Trockensubstanzen, wie z.B. lyophilisierte Keratinozyten oder TGF-α, vor dem Aufbringen auf die Wunde gelöst werden (Nr. I, II, III und IV);
– Die Kontrollwunde wird nur mit Kochsalzlösung behandelt.

Es wurden mehrere Kriterien definiert, die die makroskopische und mikroskopische Beurteilung der heilenden Wunden erlaubten. Diese Aspekte, die zu einem bestimmten Zeitpunkt untersucht werden, sind in Tabelle 1 und 2 mit einem Sternchen gekennzeichnet. Die Beurteilung erfolgt unabhängig durch 3 Prüfärzte. Das Endergebnis wird nach Absprache mit allen 3 Prüfärzten erhalten.
TABELLE 1
Für die mikroskopische Beurteilung werden Stanzbiopsien (Durchmesser 3 mm) zum Zeitpunkt des Wundverschlusses und ca. 3 Monate nach Herbeiführung der Wunde, d.h. 105 Tage beim zweiten Tier, 84 und 91 Tage beim dritten bzw. vierten Tier, entnommen. Jedes Mal werden 2 Sätze von Stanzbiopsien (Durchmesser 3 mm) entnommen, einer zur Fixierung in Formol und einer zum Einfrieren. Paraffinabschnitte werden aus den in Formol fixierten Biopsien hergestellt und anschließend mit Routine-Hämatoxylin-Eosin oder spezifischen Anfärbungen angefärbt. Zur Freilegung der Basalmembran, Melanozyten, Reticulin und Elastin werden spezifische Anfärbungen verwendet. Kryostat-Präparate werden aus gefrorenen Proben hergestellt und für immunozytochemische Versuche verwendet, bei denen die Anwesenheit von bestimmten Keratine, Langerhans-Zellen und Blutkapillaren untersucht wird.
Wundverschluss ist definiert als makroskopisch beobachtete Epithelialisierung. Der Zeitpunkt von 23 Tagen (siehe unten) ist willkürlich als Bezugspunkt aus 2 Gründen gewählt: (i) der Versuch mit dem ersten Tier musst nach 23 Tagen abgebrochen werden und (ii) die meisten Wunden der Tiere schlossen sich nach 23 Tagen.
TABELLE 2

(*) Anzahlen beziehen sich auf Cytokeratin-Arten

Da (i) die Kontraktion zum Zeitpunkt des Wundverschlusses gering ist, (ii) sich die Wunden mit der größten Kontraktion nicht zuerst schließen und (iii) Wunden, die sich zuerst schließen, keine starke Kontraktion zeigen, wird geschlussfolgert, dass der Wundverschluss in unserem Modell nicht auf Wundkontraktion sondern auf Epithelialisierung zurückgeht. Die Position der Wunde beeinflusst die Richtung und das Ausmaß der Kontraktion. Im Allgemeinen waren alle Narben nach dem Verschluss und mehrere Wochen danach schuppig. Hypertrophe Narben wurden 2,5 Monate nach dem Verschluss, d.h. am Ende der Versuche, nicht beobachtet.
Für die mikroskopischen Kriterien diente die Histologie der unverwundeten Haut als Referenz. Die mikroskopische Beobachtung des Narbengewebes lieferte wichtige Informationen zur Qualität der Narbe. Es fanden sich keine Hinweise darauf, dass die Lokalisation der Wunde die Histologie der heilenden Wunde beeinflusste. Somit wurde die Qualität der Narben hauptsächlich durch die Substanzen beeinflusst, die für die Wundbehandlung verwendet wurden. Es zeigten sich jedoch große histologische Unterschiede zwischen den Tieren. Es ist wahrscheinlich, dass diese Unterschiede auf Unterschiede zwischen den Tieren zurückgehen. Beispielsweise wurde Duoderm, das konstante Qualität aufweist, auf die Wunde am Hals von allen 4 Tieren aufgebracht und führte zu unterschiedlicher Histologie. Unterschiede zwischen Tieren wurden auch bei Verwendung von Keratinozyten stammender Substanzen beobachtet. Beispielsweise wurden nach Aufbringen von Keratinozyten-Flächenstücken oder lyophilisierten Keratinozyten ausgeprägtere Rete-Leisten zum Zeitpunkt des Wundverschlusses in Tier Nr. I und II gefunden als bei Tiere Nr. III und IV. Dies kann teilweise darauf zurückzuführen sein, dass das dritte und vierte Teil von einem anderen Lieferanten stammte als die ersten beiden Schweine.
Zum Zeitpunkt des Wundverschlusses wurde in der Regel unregelmäßige Hyperplasie beobachtet, d.h. das Epithel war dicker als die unverwundete Haut. Im Allgemeinen war die Epidermis ca. 2 Monate später dünner, aber sie war noch immer etwas dicker als normales Epithel.
Die Qualität der Narbe zu einem späteren Zeitpunkt ist von großer Bedeutung. Die Anheftung der Epidermis an die Dermis und das Vorliegen von echten Rete-Leisten sind wichtige Kriterien für die Beurteilung der Qualität von Narbengewebe. Es besteht eine Tendenz zur Normalisierung der Größe und Anzahl von Rete-Leisten in Abhängig von der Zeit. Wenn beim Wundverschluss keine oder nur wenige Grate vorlagen, waren die Grate nach 3 Monaten tatsächlich zahlreicher vorhanden und besser entwickelt. Wenn andererseits die Grate nach dem Wundverschluss viel größer waren als bei normaler Haut, waren diese Strukturen nach 3 Monaten tendenziell normaler.
Tabelle 3 fasst die Ergebnisse relativ zur Anzahl Tage, die für den Wundverschluss notwendig waren, zusammen.
Die Zahlen 1, 2, 3 und 4 entsprechen 4 verschiedenen Schweinen. In der ersten Spalte ist das Produkt gezeigt, das auf die Wunde aufgebracht wurde.
In dieser Tabelle

– sind „unbehandelte" Tiere, auf deren Wunden nur physiologische Kochsalzlösung aufgebracht wurde;
– entspricht „nur Gel" dem Fall, indem physiologische Kochsalzlösung in Form eines Gels auf die Wunde aufgebracht wurde;
– entspricht „frische KC" frischen Keratinozytenzellen, die erfindungsgemäß gezüchtet wurden;
– entspricht „Kryo-KC" kryokonservierten Keratinozytenzellen, die erfindungsgemäß gezüchtet wurden;
– entspricht „Lyophil" dem Lyophilisat der erfindungsgemäßen Keratinozytenzellen;
– entspricht „10.000 pel" dem Pellet, das nach Zentrifugation bei 10.000 g erhalten wurde;
– entspricht „10.000 su" dem Überstand, der nach Zentrifugation bei 10.000 g erhalten wurde.

TABELLE 3
Nach der Behandlung mit differenzierten frischen Keratinozyten-Flächenstücken schlossen sich die Wunden bei 2 Tieren früher als nach 23 Tagen. Auf mikroskopischer Ebene haftete die Epidermis in allen Präparaten an der Dermis an. Echte Rete-Leisten traten bei 3 von 7 Narben auf. Zwei Monate nach dem Wundverschluss haftete die Epidermis in allen 3 Narben an der Dermis.
Die Behandlung von Wunden mit kryokonservierten differenzierten Keratinozyten-Flächenstücken ergab weniger zufriedenstellende Ergebnisse als die Verwendung differenzierter frischer Flächenstücke. Die Wunde in Tier Nr. I schien nicht epithelialisiert, obwohl sie makroskopisch geschlossen aussah. Das Epithel hatte sich bei 2 von 3 Tieren ca. 3 Monate nach der Verletzung gelöst. Rete-Leisten lagen bei 3 von 7 Narben vor. Parakeratose trat bei 2 von 3 Narben kurz nach dem Wundverschluss auf.
Wunden, die mit lyophilisierten Keratinozyten behandelt wurden, die aus differenzierten Keratinozyten-Flächenstücken gewonnen wurden, schlossen sich bei allen 4 Schweinen schon eher als 23 Tage nach der Herbeiführung der Wunde. Die histologische Beobachtung zeigte, dass alle Wunden zum Zeitpunkt der Biopsie epithelialisiert waren. Die Epidermis haftete in allen Präparaten an der Dermis an, außer bei der Biopsie von Tier Nr. II nach 105 Tagen, wo das Epithel teilweise abgelöst war. Vier der 7 Narben zeigten echte Rete-Leisten. Eine leichte Hypergranulose zeigte sich beim zweiten und dritten Tier 3 Monate nach der Verwundung.
Die Abdeckung mit Duoderm führte bei 3 Tieren früher als nach 23 Tagen zum Wundverschluss (makroskopische Beurteilung). Wenige oder keine Rete-Leisten fanden sich bei Tier Nr. II und III zu früheren und späteren Zeitpunkten und bei Nr. IV nach 27 Tagen. Somit lagen nur bei 3 von 11 Narben epidermale Verlängerungen vor. Die Epidermis aller vier Narben von Nr. III war nicht vollständig befestigt. 3 Monate nach der Verwundung haftete die Epidermis nur bei Tier Nr. IV an, d.h. bei 2 von 5 Narben.
Die unbehandelten Wunden schlossen sich bei Tier Nr. II und IV früher als nach 23 Tagen. Rete-Leisten fanden sich nur bei 2 von 7 Narben. Ähnliche Ergebnisse fanden sich nach Aufbringen des Gels allein. Diese Narben waren qualitativ wenig gut als die Narben nach der Wundbehandlung mit von Keratinozyten stammenden Substanzen.
Bei Behandlung mit 10.000 g Überstand aus gelösten Keratinozyten zeigte sich bei 2 Tieren ein früherer Wundverschluss als nach 23 Tagen. Die Epidermis haftete bei 3 von 4 Narben schon kurz nach dem Wundverschluss und bei 2 von 3 Narben 2,5 Monate später an. Rete-Leisten traten bei 4 von 6 Narben auf. Die Versuche mit unterschiedlichen Konzentrationen des Überstands zeigten, dass es bei Wundverschluss keine offensichtlichen histologischen Unterschiede zwischen den verwendeten Konzentrationen gab, d.h. 3-fach konzentriert bis 1/500 verdünnt.
Aufbringen des 10.000 g Pellets aus gelösten Keratinozyten führte bei 2 der 4 Tiere zu einem früheren Wundverschluss als nach 23 Tagen. Die Epidermis haftete bei 4 der 7 Narben an der Dermis an. Echte Rete-Leisten wurden nicht gefunden. Parakeratose fand sich bei 2 von 3 Narben schon kurz nach dem Wundverschluss. Somit führte die Verwendung des 10.000 g Pellet-Materials zu Narben schlechterer Qualität als nach Aufbringen des 10.000 g Überstands. Vermutlich ist die Menge an Wirkstoffen geringer als im 10.000 g Überstand und führt so zu einer weniger zufriedenstellenden Heilung.
Die TGF-α-Wunden bei Tier Nr. II und IV schlossen sich in weniger als 23 Tagen. Mikroskopische Beobachtung zeigte, dass keine oder nur wenige Rete-Leisten vorlagen, außer bei Tier Nr. I zum Zeitpunkt des Wundverschlusses. Psoriasiforme Hyperplasie wurde im zuletzt genannten Tier gefunden. Drei Monate nach der Verwundung haftete die Epidermis bei 2 von 3 Narben an der Dermis an. Da die Heilung nach Aufbringen des Gesamt-Keratinozytenlyophilisats besser verläuft als nach Aufbringen von nur gereinigtem TGF-α, wird geschlossen, dass die Heilungsaktivität bei den lyophilisierten Keratinozyten nicht auf TGF-α oder zumindest nicht nach TGF-α allein zurückzuführen ist.
In den Narben wurden niemals Haarfollikel und Schweißdrüsen gefunden.
Nicht alle Narben wurden auf Anwesenheit von spezifischen Hautkomponenten wie Melanozyten, Langerhans-Zellen, Merkel-Zellen, Zytokeratin, Basalmembran, Reticulin und Elastin untersucht. Die Strukturen wurden nur an den repräsentativsten Narben untersucht, d.h. an frischen und kryokonservierten Keratinozyten-Flächenstücken, lyophilisierten Keratinozyten, Duoderm, Gel allein als Kontrolle und offensichtlich unverwundeter Haut. Somit wurde die Narben, die nach Wundbehandlung mit lyophilisierten Keratinozyten-Extrakten erhalten wurden, hier nicht untersucht.
Die Keratinmuster der Narben ähnelten denen von unverwundeter Haut. Der Antikörper gegen Keratine 10/11 ergab eine positive Reaktion, während Keratine 8/18/19 nicht gefunden wurden. Überraschenderweise zeigte sich mit dem Antikörper gegen Keratine 13/16 eine positive Reaktion. Diese Keratine treten in normaler menschlicher Haut nicht auf, aber scheinbar kommen sie (zumindest eines von beiden, vermutlich Keratin 16) in unverwundeter Schweinehaut und in Narben vor.
Wir haben weder in unverwundeter Haut noch im Narbenepithel Melanozyten (angefärbt mit der Fontana-Technik) beobachtet. Bisher wurde keine Langerhans-Zellen nachgewiesen, weder in unverwundeter Haut noch in Narben, durch Verwendung von Peroxidase-Enzym-Zytochemie oder Immunchemie (anti-humaner Langerhans-Antikörper OKT6). Merkel-Zellen wurden weder in Schweinehaut noch in Narben gefunden (keine Positivität für Keratine 8, 18, 19).
Die Basalmembran (gezeigt durch periodische saure Schiff-Anfärbung) spielt eine wichtige Rolle in der Anheftung des Epithels an das Bindegewebe der Dermis. Die Basalmembran war in den geheilten Wunden, die mit gezüchteten Keratinozyten behandelt wurden (frische Flächenstücke, kryokonservierte Flächenstücke und lyophilisierte Keratinozyten) gut entwickelt. Dies war nach Aufbringen von Duoderm oder bei den Kontrollen nicht der Fall.
Das Reticulin-Muster (gezeigt durch Silberimprägnierung) war ähnlich wie bei unverwundeter Haut. Dünne Elastinfasern (gezeigt durch Orcein-Anfärbung) fanden sich nur in den Narben nach Aufbringen von frischen Keratinozyten-Flächenstücken und lyophilisierten Keratinozyten, aber nicht nach Wundbehandlung mit kryokonservierten Flächenstücken, Duoderm oder nur Gel.
Es kann geschlossen werden, dass lyophilisierte gezüchtete Keratinozyten deutlich mehr Wundheilungsaktivität zeigten als eine der anderen Testsubstanzen, einschließlich frische gezüchtete Keratinozyten-Flächenstücke. Die Narbe schließt sich schneller und die Qualität ist besser.
BEISPIEL II
Rolle von EGF, Choleratoxin, Hydrocortison und Insulin in nährschichtfreien Keratinozyten, die in vitro gezüchtet wurden
Zusammenfassung
Zur Auslösung schneller Proliferation von menschlichen Keratinozyten wird der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) benötigt. Wenn nur EGF im Medium vorliegt, findet sich aber eine geringe Ausbeute an anhaftenden Keratinozyten. Choleratoxin (CT) gestattet eine hohe Ausbeute an anhaftenden und ausgebreiteten Keratinozyten. Andererseits wird das Wachstum angehalten, wenn nur CT im Kulturmedium vorliegt.
Hydrocortison induziert Keratinozytenproliferation, ist aber weniger wirkungsvoll als EGF. Insulin hat vorteilhafte Wirkungen auf Keratinozyten, obwohl seine Wirkung bedeutender ist, wenn das Medium EGF und Choleratoxin oder EGF und Hydrocortison enthält als wenn EGF, Choleratoxin und Hydrocortison vorliegen, vorzugsweise in den bevorzugten Konzentrationen.
Die optimalen Konzentrationen von EGF, Hydrocortison und Choleratoxin im Kulturmedium sind beispielsweise 10 ng, 0,13 μg bzw. 9 ng pro ml. Insulin kann vorzugsweise in einer Konzentration von 5 μg/ml zugefügt werden.
Tests wurden durchgeführt zur Untersuchung

– des Einflusses des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), Choleratoxin und Hydrocortison (HY) in Anwesenheit von Insulin auf das Wachstum und die Anhaftung und das Wachstum von primären (PO) und subgezüchteten (P1) menschlichen Keratinozyten im Vergleich mit Medium, das all 3 oder keinen der 3 Zusatzstoffe enthält,
– des Einflusses von EGF + CT, EGF + HY und HY + CT für dasselbe Phänomen,
– der Wirkung einer Senkung und Erhöhung der Konzentration eines Zusatzstoffes (EGF, CT oder HY), wobei die anderen 2 in der „Standard"-Konzentration verwendet werden,
– der Rolle von Insulin bei der Anheftung und Wachstum von menschlichen primären Keratinozyten.

Das vollständige Kulturmedium enthielt 10 ng EGF, 9 ng Choleratoxin, 0,4 μg Hydrocortison und 5 μg Insulin pro ml. Alle Experimente wurden in Platten mit 6 Vertiefungen durchgeführt. Da es zu Unterschieden zwischen Spendern kommen kann und um Schwankungen zwischen Platten zu vermeiden, enthielt jede Platte 2 interne Standards: einen, wo die Zellen in komplettem Medium gezüchtet wurden und einem in Medium ohne alle Zusatzstoffe.
Zur Untersuchung der Wirkung auf das Zellwachstum wurden die Zellen in komplettes Medium geimpft. Zwei Tage später wurden die Kulturen 3 Mal mit PBS gespült und mit dem spezifischen Medium bedeckt.
Keratinozyten wurden im spezifischen Medium geimpft, um die Wirkung der Zusatzstoffe auf die Zellanheftung, -ausbreitung und das Zellwachstum zu untersuchen. Wenn subgezüchtete (P1) Keratinozyten (KC) verwendet wurden, wurden die Zellen vor Trypsinierung und Passage in komplettem Medium gezüchtet.
Schlussfolgerungen:
A. Wirkung von EGF, CT und HY auf insulinhaltige Kulturen:
A.1. EGF:
Nur EGF im Medium ermöglichte Konfluenz, auch wenn dies langsamer geschah, wenn die Zellen in diesem spezifischem Medium geimpft wurden. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass eine geringere Ausbeute an anhaftenden Zellen gefunden wird, wenn nur EGF im Impfmedium vorliegt.
Darüber hinaus zeigten die Versuche deutlich, dass unter EGF, HY, CT und Insulin EGF der wirkungsvollste Stimulator der Keratinozytenproliferation ist. Die Kombination von HY + CT ergab ein langsameres Wachstum als EGF + CT + HY, EGF + CT, EGF + HY und EGF allein, was beweist, dass EGF für schnelles Wachstum notwendig ist. Die Tatsache, dass CT + HY + 1/3 EGF und CT + HY + 2x EGF zu einem etwas langsamerem Wachstum führte als P0 (primär) und P1 (erste Unterkultur) Keratinozyten als das komplette Medium kann darauf hinweisen, dass die optimale Konzentration von EGF für diese Kombination von Zusatzstoffen bei ca. 10 ng/ml liegt. In den Versuchen mit Anhaftung/Wachstum waren die Wirkungen von CT + HY + 1/3 EGF, CT + HY + 2x EGF und komplettem Medium ähnlich.
Wenn EGF (mit oder ohne HY) im Medium ohne CT vorlag, erschienen große flache durchscheinende teilende Keratinozyten. Diese Zellen wurden nicht beobachtet, wenn CT in der Kultur vorlag. Wenn die Kultur aber Konfluenz erreichte, waren diese Zellen nicht mehr zu sehen (bei Vorliegen von EGF, möglicherweise HY und kein CT).
Alle Zellen zeigten die typische Keratinozytenmorphologie und bildeten eine Mehrfachschicht.
A.2. Choleratoxin:
Konfluenz wurde nur selten erreicht, wenn CT allein im Medium vorlag. Anscheinend kann Konfluenz manchmal erreicht werden, wenn primäre Keratinozyten in diesem spezifischen Medium geimpft werden. CT ermöglichte eine höhere Ausbeute an anhaftenden und ausgebreiteten Keratinozyten im Vergleich mit HY und EGF allein im Medium. Nach wenigen Tagen kam es aber zum Anhalten des Wachstums. Die Tatsache, dass Konfluenz erreicht werden kann, wenn primäre Keratinozyten in Medium ohne EGF + HY + CT geimpft wurden, aber nicht, wenn CT allein vorliegt, weist auf den proliferations-„hemmenden" Effekt von CT hin. Die Kombination aus EGF + HY ergab ähnliche Ergebnisse für das Wachstum von Keratinozyten im Vergleich mit EGF + HY + 1/3 CT und kann etwas schneller sein als EGF + HY = 2 + CT. Die Anhaftungs/Wachstums-Versuche zeigten, dass EGF + HY manchmal langsamer war, wenn 1x, 1/3 oder 2x CT der Kombination hinzugefügt wurde. Im Hinblick auf das Wachstum von Keratinozyten waren 1/3 CT + EGF + HY und komplettes Medium (= EGF + HY + CT) etwas schneller als 2x CT + EGF + HY, was wiederum darauf hinweist, dass CT die Keratinozytenproliferation behindern kann. Somit beinhaltet die vorteilhafte Wirkung von CT im Wesentlichen die Verbesserung der Haftausbeute. Deshalb enthält das Kulturmedium vorzugsweise CT. Es fand sich kein Unterschied zwischen EGF + CT + HY, 1/3 CT + HY + EGF und 2x CT + EGF + HY in den Anheftungs/Wachstumsversuchen. Die optimale Konzentration von CT kann somit bei ca. 9 ng/ml in Kombination mit EGF und HY liegen.
A.3. Hydrocortison: Medium, als nur HY als Zusatzstoff enthielt, führte in bestimmten Kulturen zu Konfluenz.
Eine niedrigere Ausbeute anhaftender Zellen wurde gefunden, wenn HY allein vorlag. Die Tatsache, dass Konfluenz erhalten werden kann, zeigt aber, dass im Gegensatz zu CT das Wachstum nicht aufgehalten wird. Vermutlich induziert HY eine leichte Wachstumsstimulation, das Kulturen mit CT + HY Konfluenz erreichen, nicht aber mit CT allein. Konfluenz wird mit EGF + CT ohne HY erreicht, aber manchmal zu einem späteren Zeitpunkt als bei gleichzeitigem Vorliegen von HY. Darüber hinaus ergaben 1/3 HY + EGF + CT und 2x HY + EGF + CT in allen Versuchen ähnliche Ergebnisse wie HY + EGF + CT. Deshalb ist es ratsam, HY dem Medium hinzuzufügen, obwohl die Konzentration auf 0,13 μg/ml verringert werden kann, ohne eine negative Auswirkung auf Anheftung/Wachstum und nur Wachstum zu haben.
Die Kombination der drei Zusatzstoffe EGF, HY und CT ergibt die besten Ergebnisse. Die Anhaftungs/Wachstums-Versuche zeigten jedoch, dass die Konzentration eines Faktors zwischen 1/3 und 2x (Testbereich) der Standardkonzentration schwanken kann, vorausgesetzt, dass die beiden anderen Faktoren Standardkonzentration aufweisen.
B. Wirkung von Insulin:
Die Züchtung von Keratinozyten in Medium in Abwesenheit von EGF + HY + CT ist nicht erfolgreich, außer in bestimmten Fällen, in denen primären Zellen in diesem Medium ohne EGF + HY + CT geimpft wurden. Wenn darüber hinaus auch Insulin weggelassen wurde, konnte mit primären Keratinozyten, die in diesem Medium geimpft wurden, keine Konfluenz erreicht werden (Tabelle 8). Insulin ist somit vorteilhaft für Anheftung/Ausbreitung/Wachstum von Keratinozyten. Die Kombination von EGF + HY + CT reicht aber nicht aus, um konfluente primäre Kulturen zu erreichen.

Claims

Eine Pelletfraktion zur Verwendung als Medikament, wobei die Pelletfraktion durch ein Verfahren erhältlich ist, das folgende Schritte umfasst: a) Züchten von Keratinozyten-Zellkulturen auf einem Träger, b) Lösen der Keratinozyten-Zellen vom Trägern, c) Lyse der Zellen, d) Fraktionieren der Zellen nach der Lyse durch Zentrifugation zur Herstellung einer Pelletfraktion und eines Überstands, e) Sammeln der Pelletfraktion.
Pelletfraktion zur Verwendung als Medikament nach Anspruch 1, ferner dadurch gekennzeichnet, dass die Pelletfraktion ferner wie folgt behandelt wird: f) Einfrieren der in Schritt (e) erhaltenen Pelletfraktion bei einer Temperatur von ca. –20°C bis ca. –196°C, g) Lyophiliseren der gefrorenen Pelletfraktion unter Vakuum, um eine die Pelletfraktion darstellende Trockensubstanz zu erhalten.
Pelletfraktion zur Verwendung als Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 2, worin Schritt (c) durch hypotonen Schock oder Schallbehandlung durchgeführt wird.
Lyophilisierte Pelletfraktion zur Verwendung als Medikament nach Anspruch 2, worin Schritt (f) bei –40°C durchgeführt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Förderung der Heilung einer oberflächlichen Wunde, worin die Zusammensetzung als Wirkstoff eine Pelletfraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Zusammensetzung den Wirkstoff als Formulierung in einem Gel, einer Creme, einer Salbe, einem Trockenpulver, einer Suspension, einer Lösung oder einer biokompatiblen festen Matrix umfasst.
Nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 erhältliche Pelletfraktion zur Förderung der Heilung einer oberflächelichen Wunde.
Pelletfraktion nach Anspruch 7, worin die oberflächliche Wunde eine Verbrennungswunde der Haut, eine mechanische Hautwunde, ein Hautgeschwür, eine Hornhautwunde, eine Wunde des Trommelfells oder eine auf einen pathologischen Zustand zurückzuführende Läsion ist.
Pelletfraktion nach Anspruch 8, worin die Wunde eine Verbrennung, eine chemische Verätzung, eine elektrische Verbrennung oder eine Strahlenverletzung ist und worin der pathologische Zustand Pemphigus bullosa, Epidermolysis bullosa oder Lupus erythematodes ist.
Verwendung einer Pelletfraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Heilung von Wundoberflächen.