JPH07501214A - 新規なケラチノサイト培養物，その調製方法及び創傷治療物質としてのその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なケラチノサイト培養物、その調製方法及び創傷治療物質としてのその用途 本発明は、新規なケラチノサイト培養物に関する。

本発明は、同様に、このケラチノサイト培養物の調製方法にも関する。

本発明は又、創傷治療物質としての新規なケラチノサイト培養物の用途にも関す る。

本発明は又、有効物質として前記ケラチノサイト培養物を含む医薬組成物にも関 する。

本発明は同様に、有効物質として新規なケラチノサイト培養物を含む化粧品組成 物にも関する。

皮膚はおそらく最も外傷を受けやすい器官である。皮膚の修復は、通常、炎症、 肉芽組織形成、上皮形成及び結合組織基質の再建として記載される４つの段階に 分けることができる複雑なプロセスである。これらの段階の各々はそれ自体複雑 であり、優れた創傷治癒のためには、このプロセスが連続的に調和のとれた形で 起こらな（ではならないということは明らかである。優れた創傷治癒というのは 、結果として得られる癖痕組織が構造的、組織学的、機能的及び美観的に創傷が ない皮膚に最大限に類似しているような形での、真皮及び表皮部分を含む皮膚の 回復として定義することができる。

明らかに、このような廠痕組織は、過形成性搬痕やケロイドとは異なるものであ る。

明確化を目的として、以下に、ヒトの皮膚の組成について簡単に記載する。上部 部分は、大部分がケラチノサイト又は上皮細胞、いくつかのメラノサイト及びラ ンゲルハンス細胞、及びいくつかのメルケル細胞を含む表皮で構成されている。

表皮内には、ケラチン化（角質化）の状態を反映する５つの異なる層が見られる 。表皮の基部すなわち基底層内にある増殖中のケラチノサイトは、基底膜を介し て真皮に接着している。真皮は、線維芽細胞及びその他の結合組繊細胞を含む結 合組織、及び結合組織基質物質で構成されている。

真皮内には血管、神経、感覚器官、汗腺、皮脂腺及び毛のうが存在する。

臨床実験及び動物実験により、例えばシートとしてインビトロ培養された（ヒト ）ケラチノサイトの適用が、網状自己中間層皮膚移植片（ｍｅｓｈｅｄ　５ｐｌ ｉｔ　５ｋｉｎ　ａｕｔｏｇｒａｆｔｓ）で同時に治療してもよい潰瘍などの慢 性的創傷及びやけどにおける創傷治癒をひき起こすことが立証されている。その 上、培養されたケラチノサイト移植片の適用が過形成性暉痕及びケロイドの形成 を抑制することも示されている。最初は、患者自身の皮膚から分離されたケラチ ノサイトを成長させることによって調製された自己移植片が使用された。次に、 集密的（分化した）ケラチノサイト培養物を培養皿から分離させ、創傷上で基底 細胞が下方に向いた状態で、シートとして適用する。自己移植片としての適用の ために適量のケラチノサイトが培養されつるには約３週間が必要とされる。この 時点でも、量は創傷表面全体を覆うのに充分でない可能性もある。しかしながら 、この時間は、特に広範な第３度のやけどの場合には、患者にとって極めて重大 なものとなる可能性がある。

従って、ケラチノサイト同種移植片を適用する実験が行なわれた。ケラチノサイ トは１人の人物の皮膚から分離され、集密的ケラチノサイトシートを得るべ（培 養され、次に患者の創傷上に適用される。自己移植片と同種移植片との間では、 創傷治療活性におけるいかなる差異も見られなかった。培養された同種移植片の 主たる欠点は、皮膚ドナー（供与者）からアクセプター（受容者）患者へと、ヒ ト免疫不全症ウィルス、Ｂ型肝炎及びサイトメガロウィルスのような病原体を移 入する危険性があることである。

創傷治療のためのこれらの技術では、増殖中のケラチノサイトを含む新鮮なケラ チノサイト移植片が使用される。ケラチノサイトシートは、デイスパーザ（Ｄｉ ｓｐａｓｅ）での処理により培養容器から分離させ、創傷上に直ちに適用する。

時間及び量の点から見たこれらのシートの利用可能性は、新鮮なケラチノサイト 移植片の主要な欠点である。増殖中のケラチノサイトの培養物は、より分化の進 んだ培養物に比べて高い創傷治療活性を含むと仮定されている。その上、培養容 器からシートとして多層培養のみを分離させ得、創傷上に伸展させることが可能 である。従って、培養されたケラチノサイトは、最適な成長段階で取り上げられ なくて（よならない。しかしながら、いつ患者が病院に入院し、そのときどれだ けのケラチノサイト移植片が必要となるかを予測することは不可能である。新鮮 な（自己由来の）ケラチノサイトシートを用いることのもう１つの欠点は、充分 な量のケラチノサイトシートを成長させ次に適用できるようになるまでに、なお 一定の時間が必要とされるという点にある。

低温保存された同種移植片はこれらの欠点を一部回避することができる。低温保 存されたケラチノサイト移植片は、以下のように調製できる：集密的（分化した ）ケラチノサイト培養をリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）で洗い、添加剤（表 皮成長因子、インシュリン、コレラトキシン、トリョードチロニン、トランスフ ェリン、ヒドロコルチゾン）無しで一日培養し、Ｄｉｓｐａｓｅでの処理により 皿から分離させ、移入基材（例えばＩｎｔｅｒｆａｃｅ＠　Ｖｌｕｈｒｌｉｎ− ３ｏｐｌａｍｅｄ）に付着させる。シートを低温保護物質としての１０％のＤＭ ＳＯを添加した培地の中に浸し、液体窒素内で又はより短い時間の場合には一８ ０℃で、凍結状態で貯蔵する。適用前に、ＤＭＳＯ及びウシ血清タンパク質を除 去するべく、標本を解凍しＰＢＳで洗う。シートは、新鮮なシートの場合と同様 に、基底細胞が下を向いた状態で適用する。解凍後、生体染色から判断されるよ うに、約６０％の細胞が生存可能である。

当初、培養された同種移植片からのケラチノサイトは、創傷上にとどまり成長す ると仮定された。これは臨床的に「生着（善感）」として知られている事象であ る。しかしながら、最近、いくつかの報告書が、創傷の閉鎖が宿主上皮の成長に よるものであることを実証した。

従って、治癒はケラチノサイト移植片の永久的生着無しに誘発され、このことは すなわち、創傷治療活性が、ケラチノサイトの派生を刺激する培養されたケラチ ノサイトと関連する（化学的）物質（単数又は複数）のせいでありうるというこ とを示唆している。その結果、生存可能なケラチノサイトのシートを適用する必 要はないことになる。従って、培養されたケラチノサイトシートを凍結乾燥し、 新鮮なシート及び低温保存されたシートを用いて、創傷治療活性を比較した。

このため、創傷治癒における培養されたケラチノサイトシートの有益な効果は、 恐らくは培養ケラチノサイトに存在する物質のせいであるとすることもできるし 、或は培養ケラチノサイトに存在する分子により誘発されつる。これまでのとこ ろ、この（これらの）因子及び培養ケラチノサイト内でのその濃度は未知である 。ある種の既知のサイトカイン及び成長因子が存在するという可能性も否定でき ない。例えば線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ） 、表皮成長因子（ＥＧＦ）　、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質 転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）のような数多くの既知の成長因子が、ケラチ ノサイＩ・及び皮膚線維芽細胞に影響を及ぼす。例えば、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ及 びＦＧＦはケラチノサイト増殖を誘発する。ＴＧＦ−β及びＰＤＧＦは、コラー ゲン及びその他の結合組織成分の合成を刺激する。血管新生は、塩基性ＦＧＦ及 びＴ　Ｇ　Ｆ　−ａによって影響されつる。これらの特性のため、このような成 長因子が、創傷治癒に一役かっている可能性がある。

臨床的結果は、新鮮なシート及び低温保存された培養ケラチノサイトシートが再 上皮形成を刺激し、その結果、従来の創傷治療又は網状自己中間層皮膚移植片の みの適用に比べて治癒が速くなるということを示した。創傷治癒に関する我々の 動物モデルの結果によると、凍結乾燥された培養ケラチノサイトは、ケラチノサ イトシートよりも優れた結果を示した。

「凍結乾燥されたケラチノサイト」という語は、亜集密的、集密的又は分化状態 までインビトロで成長させられたヒト又は動物のケラチノサイトから得られた産 物を指し、その後、これらの細胞について細胞関連物質の分解が全く又は最小限 しか起こらないような形で凍結乾燥品が調製される。このような凍結乾燥品は創 傷治療活性を含んでいる。これらの培養されたケラチノサイトからの細胞抽出物 も又、創傷治療活性を含んでいる。細胞抽出物は、例えば、培養ケラチノサイト の溶解及び／又は破壊、及びそれに続く分画の後、調製してもよい。全材料又は 個別の分画を凍結乾燥させてもよい。

凍結乾燥は必須ではないが、結果として得られた物質が、より容易に貯蔵でき、 小さな場所に保存でき、取り扱いがより容易で、状況に応じて選ばれた製剤形態 （例えば乾燥粉末、軟こう剤、懸濁液、溶液、ゲル、クリーム、又は生体適合性 のある合成又は天然の固体マトリックスの形）で適用でき、最適な用量で投与で き、通常、より長い貯蔵寿命を有し、最も活性の高い調製物について容易にスク リーニングできる、という点で有利である。

凍結乾燥された培養ケラチノサイトの１つの利点は、新鮮な培養ゲラチノサイト シートとは対照的に、まさに必要な時に材料が直ちに利用可能となるという点に ある。創傷に適用する前に、新鮮なケラチノサイトシートは、ウシ胎児血清、及 び表皮成長因子、コレラトキシン、トリョードチロニン、トランスフェリンなど の添加剤無しに１日間培養しなくてはならない。その後シートをＤｉｓｐａｓｅ を用いて培養皿から除去し、洗い、無菌的に処置室に移送しなくてはならない。

低温保存されたシートの場合、低温保護物質として１０％のＤＭＳＯを含む貯蔵 培地を、３７℃でできるかぎり迅速に解凍し、ＰＢＳで徹底的に洗ってから、処 置室に移送する。解凍された低温保存のケラチノサイト移植片は、シートがきわ めて脆いことから注意深（取り扱わなくてはならない。専門的設備を必要とする ほかに、創傷上に適用できるようになるまでに、新鮮ケラチノサイト移植片は少 なくとも１日、低温保存されたケラチノサイト移植片の場合は約１時間を必要と する。これとは対照的に、凍結乾燥されたケラチノサイト材料は、瞬時に利用可 能となり、そのまま適用することもできるし、或は予め調製した無菌的ゲル又は 塩溶液の中で再水和させることもできる。凍結乾燥されたケラチノサイト由来の 物質は、最適な用量で適用されつる。ケラチノサイトシートの場合、創傷は一枚 のシートで覆われ、上にもう一枚シートを置（ことは不要と考えられている。

培養ケラチノサイトの活性においては、ドナー間の差がある役割を果たす。凍結 乾燥されたケラチノサイト由来の物質のケラチノサイｉ・増殖刺激活性は、イン ビトロで容易にテストされる。最も活性が高いバッチを、患者の治療のために選 択することができる。新鮮ケラチノサイト移植片はテストすることができず、低 温保存されたケラチノサイトシートの場合、材料の調製に付加的な作業が必要と なる。

凍結乾燥された培養ケラチノサイト、抽出物又は分画け、貯蔵が容易である。前 もって大量に調製することも可能である。別の利点は、最も活性が高い調製物を 選択するために、インビトロでケラチノサイト成長刺激活性をテストすることが できるということにある。これは、新鮮ケラチノサイトシートを使用した場合、 明らかに不可能である。その上、新鮮なシートは最適な時点で使用されなくては ならず、全（貯蔵不可能である。培養の最適な時点で処置すべき患者が全（いな い場合、細胞はこの用途には価値の無いものとなる。その上、低温保存されたケ ラチノサイトシートは、液体窒素を含む低温生物学的貯蔵容器の中に貯蔵されな くてはならない。凍結乾燥されたケラチノサイトのストックは、乾燥粉末として 一２０’Ｃに保つことができる。

凍結乾燥されたケラチノサイトは特別な輸送設備を必要としない。これとは対照 的に、培養表面から分離させると、新鮮及び低温保存ケラチノサイト移植片は、 ケラチノサイトの乾燥を防ぐべく等強性の無菌的緩衝培地中で輸送しなくてはな らない。その上、これらのケラチノサイト移植片は、支持ガーゼから分離して浮 遊又は巻き上がりを始め、正確な適用方法、すなわち基底ケラチノサイトを下に 向けた状態での適用を妨げる可能性がある。凍結乾燥されたケラチノサイト材料 は、無菌バイアル内に単純に保たれた軽量粉末である。使用前にゲル又は生理食 塩水の中で粉末を再水和及び／又は再溶解させることが推奨される。こうすると 、調製物は、ケラチノサイト増殖刺激活性を損失すること無く、４℃で一週間以 上保つことができる。再水和された物質は創傷がある組織とより良く接触し、か くして治癒プロセスに有利に作用する。

物質は貯蔵中完全に乾燥していることがら、プロティナーゼは活性ではなく、か くして貯蔵寿命が延びる。

皮膚の移植、創傷治癒又は基礎的研究のいずれかのために使用されるケラチノサ イトの培養物のい（っがは、３Ｔ３のような線維芽細胞を含む培養を必要とする ものもある。

例えば、「ヒト表皮ケラチノサイトの細胞株の系列培養：単一の細胞からのケラ チン化コロニーの形成Ｊ　（，１，Ｇ、　Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ、　Ｖｏｌ、６．　ｐｐ、３３１−３４４．１９７５年１１月）という 題の文献は、ヒト表皮ケラチノサイトのコロニー形成を開始させるための線維芽 細胞の存在について記載しているが、線維芽細胞の増殖は、表皮細胞集団が過剰 に成長しないように制御されな（ではならないと述べている。両方の条件は、致 死的照射を受けた適正な密度の３７３細胞を使用することによって達成できる。

３Ｔ３細胞が使用される別の例は、「移植に適した多重上皮への培養ヒト表皮細 胞の成長Ｊ　（Ｈ，Ｇｒｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、７６、　Ｎｏ、　１１．　ｐｐ、５６６５−５６ ６８．１９７９年１１月）の中で記載されているケラチノサイトの培養物である 。

開放側への適用のための培養における、新生物性細胞、つまり３Ｔ３線維芽細胞 の使用を避けることを目的として、い（っがの報告には、支持細胞Ｍ（フィーダ ー４無しのケラチノサイト培養技術について記載されてきた。支持細胞層無しの ケラチノサイト培養は、特殊な基材上［例えばフィブロネクチン（Ｇｉ、１ｃｈ ｒｅｓｔ　Ｂ、Ａ、Ｊ。

Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、　１９８２年）又はコラーゲンでコ ーティングされた基材（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ　Ｐ、Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ 、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、、　１９８０年）］で行なわれるか、又はコーティング されていない培養プラスチック面上でより高い密度にて細胞がブレーティングさ れた（Ｅｉｓｉｎｇｅｒ　Ｍ。

ＰＮＡＳ　１９７９年）。

著者の中には、線維芽細胞を含まず、しかしウシ下垂体抽出物又はウシ脳抽出物 を含む培地上でケラチノサイトを培養することを提案する者もあった。

より正確に言うと、Ｍａｒｋ　Ｒ，Ｐｉｔｅｌｌｋｏｗらは「ヒト皮膚ケラチノ サイトのインビトロ培養のための新しい技術及び広範なやけどを負った患者の移 植のためのその利用に関する展望Ｊ　（Ｍａｙｏ　Ｃ１Ｃ１１ｎｉｃＰｒｏｃｅ ｅｄｉｎ、　Ｖｏｌ、６１．　ｐｐ、７７１−７７７、１９８６年）の中で、増 殖（段階１）及び分化（段階２）という２段階技術が関与する培養方法を開示し ている。第１段階は、血清無しの培地中で、及び間葉細胞支持細胞層無しの欅準 組織フラスコ内で行なわれる。

第１段階のために用いられる培地は、指定された完全ＭＣＤ８１５３であり、表 皮成長因子、インシュリン、ウシ下垂体抽出物、エタノールアミン、ホスホエタ ノールアミン及びヒドロコルチゾンから成る。

第２段階には、血清を含むダルベツコの改変イーグル培地中でのケラチノサイト の培養が関与し、か（して細胞の層形成及び分化が促進される。

Ｂ、Ａ、　Ｇ１１ｃｈｒｅｓｔらは「血清を含まない環境におけるヒトケラチノ サイトの接着と成長Ｊ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｐｈｙｓ ｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、１１２、　ｐｐ、１９７−２０６．１９８２年）の中 で、ウシ脳抽出物を含むケラチノサイトのための培地について記載している。こ の文献中には、創傷治療特性についての言及は全（無い。

しかしながら、これらの培地（上述のＰｉｔｔｅｌｋｏｗ　ｅｔ　ａｌ、及びＧ １１ｃｈｒｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ、のもの）は、ウシ下垂体抽出物又はウシ脳抽出 物を含んでおり、このことは、以下のことを意味しているニー　前記培地が欅準 化されていないこと；−集密状態（コンフルエント）に、難な（到達しないこと 、及び −特殊な基材が必要とされること。

いかなる線維芽細胞もウシ器官抽出物も含んでいない培地も、同様に開発された 。

Ｃ，Ｌ、　ＭａｒｃｅＬｌｏらは［−次ケラチノサイト培養の層形成、特殊化及 び増殖Ｊ　（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、７９．　ｐｐ、３ ５［５−３７［）、　１９７８年１１月）という題の出版物の中で、Ｍｅｄｉｕ ｍｌ　９９　（１９９培地）及びウシ胎児血清を含む培地中でのマウスのケラチ ノサイトの培養について記載している。培１１１？ｎ度は３２〜３３℃である。

このプロセスにおいては、播種密度は高＜　（２ＸｌＯ’細胞／ｃｍ２）、４〜 ６週間で集密状態に達する。欠点は、このプロセスがケラチノサイトシートの低 い収率という結果をもたらすという点にある。この文献では、創傷治療特性につ いての言及は全（無い。

Ｙ、　Ｋｉｔａｎｏらは、［血清の成長因子を補足した定義された培地における ヒトケラチノサイトの成長）　（Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、　Ｖｏｌ１８０ ゜ｐｐ、２３６−２３９．１９９０年）の中で、細胞接着に関する実験について 以外、ケラチノサイトの培養は２０％のウシ胎児血清を補足したイーグルの最少 必須培地中に懸濁されたケラチノサイトを接種することによって開始したと記し ている。基本培地は、インシュリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セ レナイト、ヒドロコルチゾン及び表皮成長因子を補足した、同量のＩ　５ｃｏｖ ｅの培地とＩｌａｍのＦ−１２培地で構成されていた。その後、ウシ血清を分画 するため、従来の要領で、ウシ血清の塩析が行なわれた。この文献中には、創傷 治療特性の言及は全く無い。この論文からは、集密状態が達成されるか否かは明 らかではなく、このため培養された細胞は創傷治療に不適当なものとなっている 。

Ｍ、　Ｅｉｓｉｎｇｅｒらは、「ヒト表皮細胞培養：真皮成分又は培地補足物の 無い状態での成長と分化Ｊ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、 　ＵＳＡ。

Ｖｏｌ、７６、　Ｎｏ、１０．　ｐｐ、５３４０−５３４４．１９７９年１０月 ）の中で、ｐ）Ｉが５．６〜５．８、播種密度が２．５Ｘ１０１′細胞、温度が ３５〜３７℃に維持されていることを条件としたインビトロでのヒト表皮細物の 成長及び分化について記載した。

この培地は、イーグルの最少培地に、非必須アミノ酸、２ｍＭのし一グルタミン 、０．４ｕｇ／−のヒドロコルチゾン、１０％のウシ胎児血清、ペニシリン、ス トレプトマイシン及びファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）を含んでいた。集密 的培養物（細胞抽出物の調製のために使用できるもの）が得られるのに３〜６週 間かかる。欠点は、高い播種密度が必要であること及び細胞培養の成長が緩慢で あることにある。

Ｐ、　Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎらは、［培養中のヒト表皮細胞の成長のため の最適条件Ｊ　（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ 　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ。

７５、　ｐｐ、１７６−１８２．１９８０年）の中で、以下の培地中でのヒトケ ラチノサイトの成長を最適化する方法を記載した：ＣＭＲＬ１．０６６、非必須 アミノ酸を含むダルベツコのＭＥＭ、−ノ１必須アミノ酸を含むイーグルのＭＥ Ｍ、Ｌ−バリンとＤ−バリンが置換されｔ：非必須アミノ酸を含むイーグルのＭ ＥＭ及びＢＧＪｂＦｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ改変。２つの特注培地も同様に テストされた：すなオつち、４倍高いアミノ酸及びビタミンを含むイーグルＭＥ Ｍの改変（Ｆｕｓｅｎｉｎｇ　ＮＥ、　Ｗｏｒｓｔ　ｌ”ＫＭ：マウス表皮細胞 培養。■１周産期のマウスの皮膚からの表皮細胞の単離、特徴づけ及び培養。Ｅ ｘｐ、　Ｃｅ１ｌＲｅｓ、　９３：　４４３−４５７．１９７５年）、及び非必 須アミノ酸、プトレッシン、インシュリン、ピルビン酸塩、アルギニン、ヒドロ コルチゾン及び表皮成長因子を添加したＷａｙｍｏｕｔｈのＭＢ７５２／１の改 変（Ｓｔｅｅｌｅ　ＶＥ、　Ｍａｒｃｈｏｋ　ＡＣ，Ｎｅｔｔｅｓｈｅｉｍ　Ｐ 、、インビトロでＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮ Ｇ）にさらされた気管上皮の形質転換。Ｉｎｔ　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　２０：　 ２３４−２３８．１９７７年）である。

一次表皮細胞は、１０’／ｃｍ”のブレーティング投入量について２週間以内で 集密状態まで成長する。

さらに、表皮成長因子の露呈の結果、特徴的なケラチノサイト形態を欠き、急速 に増殖した細胞タイプが急速に出現した。これらの細胞の由来がまだ決定されて いないことがら、表皮成長因子はそれ以上使用されなかった。上述の論文におい ては、創傷治療特性についての言及は全くない。

本発明の目的は、非自己由来の線維芽細胞を含まず、器官抽出物も含まないケラ チノサイト細胞の培養物を提供することにある。

本発明の別の目的は、最小限の播種密度に関して高い細胞増幅速度によって特徴 づけられるケラチノサイト細胞の培養物を提供することにある。

本発明の別の目的は、その創傷治療特性のために使用できる集密的及び凝集性（ ｃｏｈｅｓｉｖｅｌケラチノサイトシートを提供することにある。

本発明の別の目的は、上述の培養細胞を得るためのケラチノサイト細胞の培養物 の調製方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、支持細胞層及び器官抽出物の使用が関与しないケラチノサ イト培養のための方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、ケラチノサイト細胞の上述の培養の獲得を可能にする培地 を提供することにある。

本発明の別の目的は、ケラチノサイトの培養物から誘導された全細胞ライセード 及び細胞分画を提供することにある。

本発明の別の目的は、培養されたヒトケラチノサイトから誘導された創傷治療物 質を提供することにある。

本発明の別の目的は、化粧品としての応用を有しつる、培養されたヒ１〜ケラチ ノサイトから誘導された物質を提供することにある。

本発明は、非自己由来の線維芽細胞を含まず、器官抽出物、特に下垂体抽出物を 含まず、大きい扁平な半透明のケラチノサイト細胞を含まず、細胞増幅速度が、 好ましくはｌＸ１０“細胞／ｃｍ２の最小播種密度、好ましくは３〜５Ｘ１０’ 細胞／ｃｍ２細胞−て、少なくとも２日に１回の細胞分裂、特に少な（ども２． ５日に１回の細胞分裂である、ケラチノサイト細胞の培養物に関する。

［器官抽出物ｊというのは、ウシ脳抽出物、より具体的には下垂体抽出物のこと を指す。

大きい半透明のケラチノサイト細胞は、繊維状細胞質により特徴づけられる扁平 な異型上皮細胞である。

「大きい扁平な半透明のケラチノサイト細胞」という表現の中の「大きい」とい う語は、倒立光学顕微鏡で行なった観察から、細胞が、本発明の培地中のケラチ ノサイトの通常のサイズ又は表皮成長因子を含みコレラトキシンを含まない培養 中の大部分のケラチノサイトよりも、培養において約３〜６倍大きい表面積を占 めていることを意味する。

「大きい扁平な半透明のケラチノサイト細胞」という表現の中の「扁平な」とい う語は、細胞が、本発明の培養において得られる通常のケラチノサイトよりも薄 いものとして認識されうることを意味する。厚みというのは、顕微鏡における焦 点厚を意味する。

「大きい扁平な半透明のケラチノサイト細胞」という表現の中の「半透明の」と いう語は、細胞質が、本発明の培地中で得られるケラチノサイトよりも光学顕微 鏡の下での密度が低いことを意味する。換言すると、細胞を透過する光が約７５ ％を超える場合、それは半透明の細胞である。細胞を透過する光が約５０％未満 である場合、それは通常のケラチノサイト細胞である。

細胞増幅速度を測定するための方法は、以下に記されている。

例えば、以下に規定されているように本発明の培地中に１００個の細胞を播種す る。トリバンブルー生存率試験（すなわち、生存可能な細胞は染色剤を排除する が、死んだ細胞はこれができず、従って青く染まる）から判断したところ、１０ ０個の細胞は全て生存可能である。播種された細胞のうちの一定の割合のものだ けが接着し伸展することになる。これら２つの現象、すなわち接着（ａｔｔａｃ ｈｍｅｎｔ）と伸展ｆｓｐｒｅａｄｉｎｇ）は、細胞分裂にとって必要条件であ る。接着は、懸濁液から細胞が定着し、支持体上に接着する現象である。細胞は 、この時点でなお丸い形状を維持している。次に、伸展が起こる：すなわち、丸 い細胞は扁平になり、次に支持上により大きい表面積にわたって接着することが できる。その後、細胞は分裂、つまり増殖できる。１つの母細胞が２つの娘細胞 を生じる。

このプロセスは、有糸分裂と呼ばれる。

増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ又はｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が進行 でき、支持体領域は細胞で充たされることになる。この時点で、培養は集密状態 （コンフルエント）と呼ばれる。

細胞増幅の速度とは、細胞集団の倍加時間を意味する。

細胞増幅を測定するための方法は、以下のとおりである：直径３５ｍｍの６個の 皿の中に、１　ｃｍ２につき５Ｘ１０’個のトリパンブルー排除細胞を播種する 。３日後（すなわち第３日）（このときには接着可能な全ての細胞は接着する機 会があった）、３つの培養皿を洗い、浮遊している非接着の細胞を除去する。こ の時点で、接着した細胞はまだ分裂しない。これらを、トリプシン−ＥＤＴＡ処 理により培養皿から除去しく継代培養の調製に関する場合と同様に）、光学顕微 鏡下で血球計数器で計数する。かくして、接着した細胞の総量がわかる。例えば 、３つの皿について、１皿あたり平均５０，０００の細胞を得られつる。その他 の３つの培養物が１３日後（すなわち第１３日）に集密状態に達した時点で、培 養物を洗い、最終的に浮遊している細胞を除去する。次に、接着した細胞をトリ プシン−ＥＤＴＡによって除去し、上述のとおり計数する。１皿あたり平均１． ２ＸｌＯ＠細胞が得られる。１つの細胞が２つの細胞に分裂することがわかって いる。従って、５０，０００−→１００，０００−→２００，０００−→４００ ，０００−→８００，０００、及び８００，０００から１／２分裂−−１．２０ ０，０００となる。かくして、集密状態（第１３日）から接着可能な全ての細胞 が接着してしまう日（第３日）までに４．５回の分裂、すなわち１０日間に４． ５回の分裂が起こり、これは２．２日につき１回の分裂に相当する。

密度がＩ　Ｘ　１０’細胞／ｃｍ”よりも低い場合、細胞の成長は、集密状態が 達成され得ないようなものであり得る。

密度が５Ｘ１０’細胞／ｃｍ”よりも高い場合、集密状態はより迅速に達成され る。

本発明の好ましい一実施態様においては、培養物は、星形の非ケラチンサイト細 胞のような自己由来の非ケラチンサイト細胞を、約１０％以下、好ましくは約７ ％以下しか含まず、かつ自己由来の線維芽細胞を、約１％以下、好ましくは約０ ．５％以下しか含んでい本発明の有利な実施態様に従うと、培養物は自己由来の 線維芽細胞及び自己由来の非ケラチンサイト細胞を全（含まず、特に、自己由来 のメラノサイトも自己由来のランゲルハンス細胞も全く含んでケラチノサイトの 増殖速度（すなわち細胞分裂速度）は、メラノサイト及び／又はランゲルハンス 細胞のような非ケラチンサイト細胞の存在下では減少する。これは濃度依存性の 効果である。接着した細胞集団は、１０％を超えないこれらの細胞で構成されて いる可能性がある。しかしながら、集密状態のケラチノサイト層は確実に得られ るであろう。これらの非ケラチンサイト細胞は星形細胞であり、本発明のシステ ムにおける継代後、はとんどが伸展しないため、ケラチノサイト縫代培養におい ては重要な役割を果たさなこの星形弁ケラチノサイト細胞は、例えばメラノサイ ト及びランゲルハンス細口包である。

培養物が約１０％を超える自己由来の非ケラチンサイト細胞を含んでいる場合、 培養の始めには（例えば最初の一週間）ケラチノサイト細胞分裂の見かけの阻害 が存在する。

播種の後、伸展した細胞の総量の約１％を超える自己由来の線維芽細胞が培養物 に含まれていてはならない。これは、それより多（の量の線維芽細胞が開始培養 に夾雑している場合、いかなる集密的ケラチノサイトシートも得られないからで ある。自己由来の線維芽細胞の量が約１％よりも高い場合、Ｉｇ養表面は、ケラ チノサイトの島と線維芽細胞の領域から成る単層で覆われ、非凝集性の細胞シー トが導き出されることになる。

本発明の別の好ましい実施態様に従うと、本発明の培養物は、ｌ　Ｘ　１０’細 ｔｌａ／ｃｍ２という低い密度で、但し好ましくは３〜５×１０’細胞／ｃｍ” 細胞種されたケラチノサイトの培養の開始から約１０日後に、ケラチノサイト細 胞が集密的で局所的に分化しているようなものである。

「集密的（集密状態）ｊという語は、培養容器の全表面が細胞で覆われているこ とを表わす。このような培養の中の細胞の大部分は、活発に増殖中である（すな わち分裂中である）。しかしながら本発明の培養中のケラチノサイトの場合、集 密状態の前でさえ、培養の一定の領域において細胞分化が起こることは否定でき ない。

「分化」に関して言うと、それはケラトビアリン顆粒を含むケラチノサイトが培 養物中に見い出される場合に認識される。ケラトビアリン顆粒は以下のように検 出される。ケラトビアリン顆粒は、培養された多層ケラチノサイトシートのへマ ドキシリン−エオシン染色された組織学的切片中に認識される。顆粒は、光学顕 微鏡下で褐色の斑点として見える。培養表面がひとたびケラチノサイトで満たさ れる、すなわち集密状態が達成されると、細胞はさらに増殖して、より厚く多層 のシートを結果としてもたらす。上部層の細胞は、か（して分化する。

「局所的に分化した」というのは、集密状態の前であっても、培養の一定の領域 で分化が起こっていたことを意味する。

本発明の好ましい一実施態様においては、細胞は過度に分化していてはならない 。これは、培養物が、１枚のシートとして支持体から分離し得るほど充分な強さ をもっていなくてはならず、このため多層凝集性培養物が必要となるからである 。このような多層凝集性培養物は、ケラトビアリン顆粒を有する数多くのケラチ ノサイト細胞を含み、従って、分化している。

［凝集性（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）　Ｊというのは、細胞が互いに接着した状態にと どまっていることを意味する。

「シート」という語は、新鮮又は低温保存の集密的ケラチノサイト培養物であっ て、培養皿から無傷（インタクトな）状態で又はＤｉｓｐａｓｅ処理により分離 され、新鮮ケラチノサイトシートの場合には直ちに、又は低温保存されたシート の場合には解凍の時点で、患者の創傷上に適用することができるものを意味する 。シートの好ましいタイプは、上述のように調製することができる低温保存され たケラナノサイ１〜移植片である。

シートを作るにあたり、「過度に分化した段階」の特徴である、至る所に泡を含 まず、かつ白色ではないケラチノサイト細胞培養物を使用することが適切である 。シートが過度に分化している場合、培養物にはほとんど全く増殖がない可能性 があり、その上、創傷治療特性がさほど最適でない可能性もある。シートが過度 に分化している場合、酵素無しで支持体から分離する可能性があり、一方、集密 的シートがさほど分化していない場合、Ｄｉｓｐａｓｅ（例えばＢｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手される）などの酵素を用いる必要がある。

本発明の好ましい一実施態様に従うと、ケラチノサイト細胞の培養物は、１／４ 〜１／２、好ましくは１／３の分割比で、分化の損失なく８継代、好ましくは６ 継代で継代培養されつる。

継代培養は、（支持体から細胞を除去し、互いに接着した細胞を分離して分離細 胞の懸濁液を得るための）トリプシン処理によって第１の派生培養が行なわれ、 この派生培養から、Ｘ個の皿（Ｘは後で規定）上に懸濁した細胞を播種して第２ の派生培養が行なわれる基となる母培養であり、派生培養の合計数が継代培養数 を表わす、という点を思い起こして頂きたい。

１／Ｘの「分割比」という表現は、母培養全部から、Ｘ個のベトリ皿上に播種し 、集密状態及び分化を得ることが可能であるということを意味している。

本発明は同様に、以下の工程ニ ー　非自己由来の線維芽細胞、及び器官抽出物、特に下垂体抽出物を含まず、以 下の添加剤：血清、表皮成長因子、ヒドロコルチゾン及び／又はコレラトキシン 、及び場合によってはインシュリンを含み、それ自体Ｍｅｄｉｕｍｌ　９９を含 む基本培地を含む培地中に、Ｉ　Ｘ　１０’細飽／ｃｍ２の低い密度で、好まし くは３〜５Ｘ１０’細胞／ｃｍ”で支持体上にケラチノサイト細胞を播種する工 程；及び −好ましくは約１％〜約ｌＯ％の範囲内、より好ましくは約２％〜約８％の範囲 内のＣＯ２を含む水飽和した大気中、３７℃の温度にてこのような細胞を成長さ せる工程を含むことを特徴とする方法によって得られるもののような、ケラチノ サイトの培養物にも関する。

本発明は同様に、凍結乾燥された形態での本発明に従ったケラチノサイトの培養 物にも関する。

本発明はさらに、場合によっては凍結乾燥品（ｌｙｏｐｈｉｓａｔｅ）の形態を した、本発明に従ったケラチノサイト培養物の抽出物に関する。

このような抽出物は、培養物から従来の要領で形成することができる。

［抽出物ｊという語は、集密状態に至るまでインビトロで成長させ、その創傷治 療活性を保持しているヒト又は動物のケラチノサイトから得られる、細胞産物を 意味する。細胞抽出物は、例えば、培養されたケラチノサイトの溶解及び／又は 破壊とそれに続く分画の後、調製することができ、−上述のように異なる分画を 凍結乾燥することが可能である。このような凍結乾燥品は、状況に応じて選ばれ 、最適な用量で投与される、乾燥粉末、軟こう、懸／ｉＪｌ液、溶液、ゲル、ク リーム、又は生体適合性がある合成もしくは天然の固体７１〜リツクスの形態で 適用することができる。

本発明はさらに、好ましくは凍結乾燥した形態であり、がっヒトの皮膚のような 皮膚などの表面創傷の治癒を促進するために使用できる、上述のような培養又は 抽出物を有効物質として含む医薬組成物にも関する。この医薬組成物は、好まし くは表面創傷上に適用するのに好適な製剤形態で凍結乾燥された培養又は抽出物 を含んでいる。このような製剤は、表面創傷に直接、乾燥粉末として、又はゲル 、クリーム、軟こう、懸濁液、溶液又は生体適合性がある合成もしくは天然の固 体マトリックスの形態で、適用することができ、これらのいずれもが、望まれる 場合には薬学的に許容可能な従来の目武形剤及び添加剤と共に、従来の要領で調 製することができる。

通常、凍結乾燥された培養又は抽出物は、治療すべき表面創傷のタイプ、及び組 成物が使用されるべき状況の関数である濃度で、このような組成物の中に取り込 まれる。例えば、本発明の凍結乾燥された培養物又は細胞抽出物は、］、ｃｍ” あたりの創傷治癒のための有効物質の量が、生きたケラチノサイト約１０３〜１ ０７個、好ましくは生きたケラナノサイト１０４〜１０’個、特に５Ｘ１０’〜 ５Ｘ１０５個の生きたケラナノサイト中に見い出される有効物質の量と等価であ るような濃度で適用されつる。（当然のことながら、生きた細胞の培養物の中に どれほどの有効物質が存在するかを直接測定することは不可能であるということ はわがるだろう；がくして、有効物質は、ある量のケラチノサイト細胞に存在す る有効物質の量を基準にして記載されてきた）。

本発明の医薬組成物で治療可能な表面創傷のタイプの例としては、以下のものが 挙げられるニ ー　熱による、化学的、電気による及び放射線に誘発された皮膚の火傷：網状皮 膚自己移植片で被覆された火傷も同様に、網状皮膚間隙の閉鎖を刺激するであろ う本発明のケラチノサイト調製物の恩恵を受ける； −切開創、擦過傷及び裂傷などの厚み全部（全層性）及び厚みの一部の機械的創 傷；これらのタイプの創傷には、皮膚の外科的及び切除創傷も含まれる； −皮膚のさまざまな潰瘍化、例えば褥癒、静脈及び動脈潰瘍、及び糖尿病や脈管 炎のような根底にある疾患によってひき起こされる潰瘍。

−角膜創傷； −鼓膜外傷；及び −水庖性類天庖癒、表皮水庖症及び紅斑性根１ｍ（エリテマトーデス）のような 、病理学的条件による外傷。

本発明はさらに、創傷の表面に本発明の医薬組成物を適用することにより、（例 えばヒトの皮膚などの皮膚の）表面創傷の治癒を促進するための方法に関する。

本発明は同様に、非自己由来の繊維芽細胞を含まず、器官抽出物、特に下垂体抽 出物を含まないケラチノサイト細胞の培養物を調製するための方法において、 −非自己由来の繊維芽細胞、及び器官抽出物、特に下垂体抽出物を含まず、以下 の添加剤：血清、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン及び／又はコレラ トキシン、及び場合によってはインシュリンを含み、それ自体Ｍｅｄｉｕｍ　１ ９９を含む基本培地を含む培地中にＩ　Ｘ　１０’細胞／ｃｍ”の低い密度、好 ましくは３〜５Ｘ１０’細胞／　ｃｍ２で支持体上にケラチノサイト細胞を播種 する工程；及び −　好ましくは約１％〜約１０％の範囲内、より好ましくは約２％〜約８％の範 囲内のＣＯ２を含む水飽和した大気中、３７℃の温度にてこのような細胞を成長 させる工程を含むことを特徴とする方法にも関する。

細胞シートを得るためには、ケラチノサイトを支持体上に播種することが必要で ある。この支持体は、細胞の成長を可能にするプラスチック製の、又はあらゆる 天然（例えばコラーゲン、又は上皮除去された真皮）、半合成（例えばフィブロ ネクチンコーティングされたプラスチック）又は合成の（例えばポリウレタン） 支持体であってよい。

例において、結果は、インビトロでの支持細胞層無しのケラチノサイトの成長に おけるＥＧＦ、コレラトキシン、ヒドロコルチゾン及びインシュリンの役目に関 して示されている。

この方法のＭｅｄｉｕｍ　１９９は、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｉｅｓのベルギーのカタログ（１９９１年）の４６ページに開示され ている。

Ｍｅｄｉｕｍｌ　９９は、ＣＭＲＬ１０６６培地（ベルギーのＧｉｂｃｏ　ＢＲ ＬＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ、３９ページ、１９９１年）又 はウィリアムＥ、培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｅ培地：ベルギーのＧｉｂｃｏ　Ｂ ＲＬ　ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ、６２ページ、１９９１年） 、あるいはその両方の組合せによって置換できる。

この方法の血清には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれるが、好ましくは 、培地中のＢＳＡの総濃度が約０．５ｇ／Ｒを下回らないように付加的なりＳＡ を添加する。ウシ胎児血清は１リツトルにつき１３〜２９ｇの血清アルブミンを 含んでいる。従って、１リツトルの培地中１０％のウシ胎児血清の濃度について は、１．３〜２．９ｇの血清アルブミンが存在することになり、１リツトルあた り１ｇのウシ血清アルブミンを添加する場合、１βの培地中には２．３ｇ〜３． ９ｇの血清アルブミンが存在することになる。１０％の血清を培地に添加する場 合、付加的なりＳＡはほとんど影響を及ぼさない。

本発明の別の実施態様に従うと、この方法のための培地は、この方法の間に変更 することができる。例えば、添加剤としてコレラトキシンを含む第１の培地を使 用し、ひき続いて表皮成長因子、ヒドラコルチゾン及びコレラトキシンを添加剤 として含む第２の培地を使用することが可能である。この方法の別の好ましい実 施態様に従うと、培地は、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９、血清及び以下の３つの成分、 すなわちヒドロコルチゾン、表皮成長因子及びコレラトキシンを含む。

本発明の方法及び本発明の培養物は、以下のような利点を有するコ −３Ｔ３支持細胞層系におけるものと同じ密度で細胞を播種することができる； −より容易である：すなわち、これは、成長を止められた状態になり、次にケラ チノサイトの前に又はケラチノサイトと共に播種されなくてはならない、３Ｔ３ 細胞を必要としない；〜　より廉価である：ケラチノサイト培養のために３Ｔ３ 細胞を利用できる状態とするためには、最適な培養密度での３Ｔ３細胞の絶え間 ない培養が必要であり、そのため付加的な作業、時間及び材料が要求される。そ の上、３Ｔ３支持細胞層細胞は、例えばマイトマイシンＣ処理又はγ照射により 成長停止させなくてはならない； −残留３Ｔ３細胞が無い：従来の３Ｔ３支持細胞層技術では、ケラチノサイトシ ートを創傷上に適用する前に、できるかぎり多くの残留３Ｔ３細胞を除去するた めにＥＤＴＡでの洗浄が行なわれる二ケラチノサイトシート内に残り、創傷床と 直接接触している３Ｔ３細飽が、例えば宿主において免疫学的反応を誘発しつる という可能性は否定できない； −より安全である＝３Ｔ３細胞は、無限に分裂する新生物性細胞である。細胞が γ照射を受けるか又はマイトマイシンＣ処理を受けても、この方法は、いかなる ３Ｔ３も全く添加されないことから明らかにより安全である； −実質的に純粋である；皮膚のトリプシン処理の後、表皮は真皮から除去され、 真皮部分は１回だけ穏やかに削り取られる；このようにすることにより、ケラチ ノサイト培養物は実質的に繊維芽細胞を含まない；実際、夾雑性繊維芽細胞はケ ラチノサイトがシートを形成するのを妨げる；ランゲルハンス細胞、メルケル細 胞及びメラノサイトのようなその他の表皮細胞は、本発明の培養条件下で分裂し ない； −短期間に集密的ケラチノサイト培養物を提供する：同量の分離されたケラチノ サイトから出発して、本発明の培養物は、３Ｔ３支持細胞層を用いる培養とほぼ 同じ時間内で集密状態に達する； −この支持細胞層無しの系は、新鮮な状態で使用してもよいし、又は必要となる まで液体窒素中に貯蔵されるケラチノサイトシートの調製を可能にする；シート は、凍結乾燥されたケラチノサイト、又はケラチノサイトの細胞抽出物の調製の ために使用してもよい。

本発明は同様に、培地が、 −基本培地が ・約２０％〜約１００％（ｗ／ｖ）のＭｅｄｉｕｍ　１９９を含み、ＭＥＭ培地 のような他の基本培地により、最高８０％、好ましくは７５％まで置換され得る ようなものであり、−培地中の血清が、約２％〜約２５％、特に約４％〜約１５ ％（ｖ／ｖ）、より特定的には１０％の濃度で含まれ、この血清が好ましくは胎 児血清、又は新生児血清、特にウシ胎児血清であり、 −培地中のヒドロコルチゾンが、Ｏ〜約４μｇ／ｄ、特に約０゜Ｏ１ｕｇ／−〜 約２ｕｇ／ｄ、好ましくは約０．１〜約０．８μｇ／Ｗ１１、より好ましくは約 ０．４日ｇ／ｄの濃度で含まれており、−培地中の表皮成長因子が、約１〜約１ １００ｎ／−１特に約１〜約５０ｎｇ／ｍ＆、好ましくは約３．３〜約２０ｎｇ ／ｄ、より好ましくは１０ｎｇ／−の濃度で含まれており、−培地中のコレラト キシンが、０〜約８０ｎｇ／ｍｌ’、特に約１〜約５０ｎｇ／ｄ、好ましくは約 ３〜約１８ｎｇ／＋Ｊ、より好ましくは９　ｎｇ／−の濃度で含まれており、 −培地中のインシュリンが、０〜約３０μｇ／ｄ、特に約１〜約Ｉ　Ｑ　ＩＪｇ 　／　ｙｎｌ、例えば５日ｇ／−の濃度で含まれているようなものである方法に も関する。培地中の基本培地の濃度は、約８０％〜約９８％である。

基本培地中で、Ｍｅｄｉｕｍ　ｌ　９９が２０％未満で存在する場合、成長はよ り緩慢である可能性があり、細胞は８回未満の継代を維持する。

本発明は同様に、培地が、ウシ脳抽出物、トリョードチロニン、トランスフェリ ン、ヒトコーン（Ｃ，ｏｈｎ）分画■、及びＭｅｄｉｕｍ　１９９中に含まれて いるアデニン以外のアデニンを含んでいない方法にも関する。

本発明は同様に、培地が、エタノールアミン、セレナイト、プトレッシン及びホ スホエタノールアミンを含まない方法にも関する。

本発明は同様に、本発明に基づく方法を用いて、集密的ケラチノサイト細胞の培 養物を調製するための方法であって、以下の工程ニ ー　少な（とも４日ごとに、好ましくは２日経過後に、細胞の培地を交換する工 程、及び −上述の添加剤を拒絶するのに充分な時間だけ生存培地中に細胞を置くことによ って、集密的な凝集性多層培養物を得るのに充分な時間の後に、培養物の成長を 停止させる工程であって、ここでこの生存培地は、細胞が生きた状態にとどまる ことはできるが、細胞の増殖及び分化のための刺激が全く無いものであり、この 培地は、例えば、好ましくはいかなる血清も、付加的なりＳＡも、表皮成長因子 も、ヒドロコルチゾンも、コレラトキシンも、インシュリンも含まない、本発明 に従った培地であるか、又はその他のいずれかの基本培地又はいずれかの基本培 地の混合物である工程； −例えばＰＢＳで、細胞を洗浄して前述の生存培地を除去する工程 を含むことを特徴とする方法にも関する。

増殖のための刺激が無いというのは、独自では増殖できるが、外部的に強制され ていないことを意味する。

生存培地として使用される基本培地の一例としては、ＤＭＥＭ−Ｆｌ２が考えら れる。

培地は、使用された栄養分を置換し、細胞の培養により産生された代謝産物を除 去するために、４日ごとに交換する。

培養物の成長は、集密的な凝集性多層培養物を得るためには、一般に約１０日後 、好ましくは１１日後に停止させる。

細胞は、一般に、上述の添加剤を除去するため、約１日又は２日間生存培地中に 置（。生存培地中に２日を超えて置かれると、栄養不足に苦しむ可能性がある。

細胞は、洗浄された時点で、創傷内での直接的使用又は凍結乾燥もしくは低温保 存ができる状態となる。

ＤＭＥＭ−Ｆｌ、２については、ベルギーのカタログＧｉｂｃｏ　ＢＲＬＬｉｆ ｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　（１９９１年）、４１ページに開示されている 。

ヒト由来でない物質が存在することによる免疫学的反応を避けるため、好ましく はいかなる血清も存在しない。

本発明は同様に、本発明に従った方法を用いて集密的及び分化したケラチノサイ ト細胞の培養物を調製するための方法であって、以下の工程ニ ー　少なくとも約４日ごとに細胞の培地を交換する工程、及び−細胞が生きた状 態にとどまることはできるが、細胞の増殖及び分化のための刺激が全く無い生存 培地の中に約１〜２日間細胞を置くことによって、約２１日後に培養物の成長を 停止させる工程であって、ここでこの培地は、例えば、好ましくはいかなる血清 も、付加的ＢＳＡも、表皮成長因子も、ヒドロコルチゾンも、コレラトキシンも 、インシュリンも含まない、本発明に従った培地、又はその他のいずれかの基本 培地又はいずれかの基本培地の混合物、又はＤＭＥＭ−Ｆｌ　２である工程、− 例えばＰＢＳで、細胞を洗浄して前述の培地を除去する工程を含むことを特徴と する方法にも関する。

本発明は同様に、上述の細胞を、例えばディスパーザを用いて、支持体から分離 させた後にシートの形態で回収する方法にも関する。

本発明は同様に、凍結乾燥された形態のケラチノサイト細胞を調製するための方 法であって、細胞を、上述のとおり本発明に従って得、その後（例えば低張液を 用いて）溶解させ、（例えば機械的手段により）支持体がら分離させ、収集し、 場合によっては音波処理した後、約−２０”Ｃ〜約−１９６℃、好ましくは約− ４０”Ｃの温度で凍結させ、次に真空下で凍結乾燥させて凍結乾燥品を構成する 乾燥物質を提供する方法にも関する。代替的には、細胞を、まず支持体から分離 させ（例えば機械的手段又はＤｉｓｐａｓｅでの処理により）、その後、溶解さ せ（例えば低張液又は音波処理により）、それから凍結乾燥させることが可能で ある。

低張液の一例としては、水で１０倍希釈されたＰＢＳが考えられる。

細胞は、例えばゴム（ラバー）ポリスマンを用いてかきとることにより支持体か ら分離させることができる。

音波処理の利点は、細胞を開裂させることにより細胞の中味を放出させるという 点にある。

本発明は同様に、ケラチノサイト培養物の抽出物を調製するための方法であって 、細胞を、本発明に従った方法によって得、これらの細胞を（例えば低張液を用 いて）溶解させ、（例えば機械的手段により）支持体から分離させ、収集した後 に、音波処理し、遠心分離して、 −音波処理により細胞膜から分離された物質を含む可能性がある、低張液中で可 溶性の分子を含む上清、及び−細胞膜及び核を含むベレット を得、 この上清及びぺｌノットを回収し、場合によっては凍結及び凍結乾燥する方法 にも関する。

ケラチノサイト培養物から凍結乾燥された材料を調製するための本発明の技術は 、基本的に以下の工程を含んでいるニー　供給源として支持細胞層無しで成長さ せた一次又は継代した、集密的〜分化したケラチノサイト培養物を使用する工程 ；−ＰＢＳで培養を洗浄し、ラバーポリスマンで培養表面から細胞をかき取る工 程； −低張性ショック及び／又は音波処理により細胞を溶解させる工程ニ ー　総凍結乾燥品を得るべく凍結乾燥するか、又は遠心分離により細胞分画を調 製し、次に上清及びベレット分画を凍結乾燥する工程。

無菌の抽出物を得るためには、この方法を無菌的条件下で実施することができる 。代替的には、例えば紫外線又はガンマ線の照射により、凍結乾燥後に抽出物を 滅菌することができる。必要とあらば、抽出物を、その後、例えば水混和性ゲル 又は塩溶液中に再度溶解させることによって、ゲル、クリーム、軟こうなどとし て製剤化し直す及び／又は再水和させることができる。

本発明は同様に、ケラチノサイトの低温保存された培養物を調製するための方法 であって、細胞を本発明に従って得、この細胞をＯ〜約１５℃の温度で、好まし くは緩衝化された等慢性の冷培地中に入れ、ここでこの培地には、細胞の凍結損 傷を防ぎ、場合によっては細胞の損傷を避けるべくこの冷培地にさらに添加され ている低温保護物質の毒性を防ぐ、血清が含まれており、細胞を一り０℃〜約− １９６℃、好ましくは一７０℃の温度で凍結させ、その後細胞を液体窒素中に置 （方法にも関する。

「冷培地」という表現の中の「冷」というのは、温度が３７℃より低く、好まし くば０〜１５℃であることを意味する。

このような培地の一例は、等慢性緩衝溶液であり、ＤＭＳＯもしくはグリセロー ル又はＤＭＳＯとグリセロールの混合物のような１０％の低温保護物質と、１０ ％の血清とが添加されているあらゆる基本培地により構成されている。

血清を含まない培地中での低温保存は、より多くの凍結損傷という結果をもたら す。血清が全（ない場合、わずかな生存可能細胞しか回収されず、細胞シートは 細片になる。

本発明は同様に、低温保存された培養物を調製するための方法であって、細胞を 本発明に従って得、以下の工程を含む方法にも関するニ ー　少なくとも約４日ごとに細胞の培地を交換する工程；−細胞が生きた状態に とどまることはできるが、細胞の増殖及び分化のための刺激が全く無い生存培地 の中に細胞を置くことによって、約２１日後に培養物の成長を停止させる工程で あって、ここでこの培地は、例えば、場合によっては血清ならびに付加的なりＳ Ａ及びインシュリンを含むが、いかなる表皮成長因子も、ヒドロコルチゾンも、 コレラトキシンも含んでいない、本発明に従った培地又はその他のいずれかの基 本培地であるか、又はＤＭＥＭ−Ｆ　１２である工程； −例えばＰＢＳで、細胞を洗浄して上述の生存培地を除去する工程、及び −培養支持体から分離させたシートの形態で細胞を回収する工程であって、ここ で、細胞のシートが、約り℃〜約１５℃の温度で、好ましくは緩衝化された等慢 性の冷培地の中に置かれ、この培地には、細胞の凍結損傷を防ぎ、場合によって はこの冷培地に対しさらに添加されている凍結保護物質の毒性による細胞及び細 胞シートの損傷を防ぐ、血清が含まれており、細胞シートを一２０°Ｃ〜約−１ ９６℃、好ましくは一７０℃の温度で凍結させる工程。

その後、細胞シートは液体窒素の中に置かれる。

本発明は同様に、非自己由来の線維芽細胞を含まず、器官抽出物、特に下垂体抽 出物を含まず、以下の添加剤：血清、表皮成長因子、コレラトキシン及び／又は ヒドロコルチゾン、及び場合によってはインシュリンを含み、それ自体Ｍｅｄｉ ｕｍ　１９９を含む基本培地を含む培地にも関する。

本発明は同様に、基本培地としてＭｅｄｉｕｍ　１９９を含み、添加剤として血 清、及びヒドロコルチゾン、表皮成長因子、コレラトキシンという３つの成分の うちの少なくとも２つ、及び場合によってはインシュリンを含む培地にも関する 。

本発明は同様に、それ自体Ｍｅｄｉｕｍ　１９９を含む基本培地、血清及び以下 の成分：ヒドロコルチゾン、表皮成長因子及びコレラトキシン、及び場合によっ てはインシュリンを含む培地にも関する。

本発明の好ましい培地は、 ・　約２０％〜約１００％（ｗ／ｖ）のＭｅｄｉｕｍ　１９９を含み、この培地 は、ＭＥＭ培地のような他のいずれかの基本培地により、最高８０％、好ましく は７５％まで置換され得、−培地中の血清は、約２％〜約２５％、特に約４％〜 約１５％（Ｖ／Ｖ）、より好ましくは約１０％の濃度で含まれ、この血清は好ま しくは胎児血清、又は新生児血清、特にウシ胎児血清であり、 −培地中のヒドロコルチゾンは、０〜約４　ｕｇ　／　ｄ、特に約０．０１〜約 ２　ｕｇ　／　Ｊ、好ましくは約０．１〜約０．８ｕｇ／ｄ、より好ましくは０ ．４νｇ／−の濃度で含まれており、−培地中の表皮成長因子は、約１〜約１０ ０　ｎｇ／ｌｎ！！、特に約１〜約５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３．３〜約２ ０ｎｇ／、４１、より好ましくはＬｏｎｇ／）Ｊの濃度で含まれており、−培地 中のコレラトキシンは、０〜約８０ｎｇ／、／、特に約１〜約５０ｎｇ／ｉ、好 ましくは約３〜約１８ｎｇ／ｄ、より好ましくは９　ｎｇ／−の濃度で含まれて おり、 −培地中のインシュリンは、０〜約３０μｇ／ｄ、特に約１〜約１０＋Ｊｇ／ｍ ／、例えば５μｇ／−の濃度で含まれている。

本発明のケラチノサイト培養は、創傷治療特性を示す。

インビトロでのケラチノサイト増殖の刺激は、ケラチノサイト由来の調製物の１ つの特性である。しかしながら、わずかな量の阻害物質が存在しつるということ も否定できない。

動物モデルについて研究が行なわれてきた。全層にわたる（ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃ ｋｎｅｓｓ）創傷を、復元された凍結乾燥ケラチノサイト物質（すなわち、完全 な凍結乾燥品及び細胞抽出物）、従来の創傷処置、及び培養ケラチノサイトによ り産生されつる既知の成長因子ＴＧＦ−αの適用によって治療した。皮下組織内 に延びている全層性創傷は、最も治癒の困難なものの中に入るものである。

上皮細胞の成長に対するケラチノサイト物質の刺激活性は、すでに知られている 。しかしながら、培養ケラチノサイトが、創傷治癒プロセスのある段階を阻害し つる物質を含んでいるか否かは、明白ではない。これは、全層性創傷において解 明することができる。

創傷治癒を臨床的に及び組織学的に記載するため、厳密に規定された基準が用い られた。１つの重要な基準は、創傷の閉鎖のために必要とされる時間である。さ らに、治癒した皮膚の質も非常に重要である。癖痕組織が、創傷を受けていない 皮膚に組織学的に類似していればいるほど、質が良い。本発明のケラチノサイト 由来の物質が創傷治療活性を含んでいるという結論を下すことができる。

完全凍結乾燥品は、結果として、対照、及び新鮮なもしくは低温保存されたケラ チノサイトシートの効果、ＴＧＦ−α及び従来のＤｕｏｄｅｒｍ■での処置に比 べて、質的に優れた層痕及び迅速な治癒をもたらした。

置皿９説用 図１は、創傷がないブタの皮膚を示している（倍率：９００Ｘ）。

この写真は、表皮内の異なる細胞層（基底層、有軒層、顆粒層、角質層）及び乳 頭間隆起の存在を明確に示している。

これは又、表皮と真皮の間にいかなる分離も無いことを示し、さらには真皮の網 状部（写真の下方部分）内のコラーゲン束の存在も示している。真皮内の毛細血 管は、群毎に並んでいる。

図２は、創傷後９１日目のブタの皮膚内の廠痕組織を表わしている。創傷閉鎖ま で、創傷は本発明の凍結乾燥された培養ケラチノサイトで処理された。この写真 は、乳頭間隆起の存在、表皮と真皮の間の接着、及びコラーゲン束の存在を示し ている。これは又、薄いコラーゲン束の存在も示している。表皮は異なる細胞層 を含んでいる。倍率：　９００Ｘ。

図３は、創傷を受けてから８４日目の、創傷閉鎖までＤｕｏｄｅｒｍ■で処理さ れたブタの皮膚を、比較的低い倍率（倍率：２００Ｘ）で表わしている。

この写真は、乳頭間隆起が全く存在しないこと、そして表皮と真皮の間には分離 が存在することを示している。コラーゲン束及び毛細血管は、この写真上では倍 率が低いために評価不可能である。

凱工 計、　、びケラチノサイトの ヒトケラチノサイトを、外科的皮膚標本（包皮、乳房整形術、腹部皮膚及び体の その他の場所）から、及び死体の皮膚から単離する。

皮膚を、最高１ｍｍの厚みで皮膚採取器を用いて除去する。時として皮下組織を 含むさらに厚い皮膚片も、同様に使用される。皮膚は、直ちにリン酸緩衝生理食 塩溶液（ＰＢＳ）、すなわち８ｇのＮａＣｊ２．０．２ｇのＫＣＪ２．３．１ｇ のＮａ２ＨＰＯ−・１２Ｈ２０，０，２ｇのＫＨｓＰＯ４をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で １尼にしたもの、ｐＨ７，４の中に入れ、４℃に保つ。次に、標本を４時間以内 に培養ラボへと移送する。１００Ｕ／Ｊのペニシリン及び１００ｍｇ／−のスト レプトマイシンを含むＰＢＳで皮膚を徹底的に洗う。必要とあらば、３０ｍＭの Ｈｅ　ｐ　ｅ　ｓ、１０ｍＭのグルコース、３ｍＭのＫＣｊ２．１３０ｍＭのＮ ａＣｊ２．１ｍＭのＮａ２８ＰＯ４’１２Ｈ２０及び３．３ｎＭのフェノールレ ッドを含む等張性緩衝溶液である溶液Ａ中で、皮膚の試料を４℃で貯蔵する。薄 い皮膚片は約１６時間貯蔵でき、より厚い皮膚片は約４日間貯蔵できる。

脂肪組織はできるかぎり除去する。皮膚を約０．５Ｘ０．５ｃｍのより小さい細 片に切断し、トリプシン溶？ｒＩｉ（溶液Ａ中、０．２５％のトリプシンＳ　ｉ 　ｇｍａ　）の中に／７遊させる。この手順は皮膚試料の厚みによって左右され る。薄い網状皮膚は、３７℃で約２０分間トリプシン処理するが、一方、厚い皮 膚は４℃で約１６時間トリプシン処理する。

鉗子を用いて真皮から表皮を除去する。次に、上下にピペッティングし、注射針 （２１Ｇ、０．８Ｘ５０）を通過させることにより、表皮を懸濁させる。代替的 な手順としては、基底細胞を収集するため、除去された表皮の基底側をかき取る 。残留する基底上表皮細胞は廃棄する。真皮の上部部分は、なおも数多くの基底 ケラチノサイトのみならず線維芽細胞も含んでおり、従って、一度だけ穏やかに かき取る。トリプシン処理は、１０％のウシ胎児血清を添加することによって停 止する。次いで、細胞懸濁液を無菌ガーゼ（ＰｅｒｌＯｎ　Ｐ６．６３　ｍｍ） を通してろ過し、低速で遠心分離する（１２０ｇ、８分間）。

樋肥肚量 ０．２−の細胞懸濁液を、０．１−のトリパンブルー溶液（０，８５％生理食塩 水中、０．４％：　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合する。約３分 後、血球計数器（Ｎｅｕｂａｕｅｒ　Ｃｈａｍｂｅｒ）内で細胞を計数する。青 色に染まった細胞は死んだ細胞であり、一方染まらなかった細胞は生存可能であ る。

ヒトケラチノサイトの１立 細胞を培地中に再懸濁させ、１　ｃｍ２につき生存細胞５Ｘ１０’個の密度でプ ラスチックのベトリ皿（直径１００　ｍｍ、　ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ 　）の中に播種する。空気中５％のＣＯ２を含む水飽和大気の中で、３７℃のイ ンキュベーター内で細胞を成長させる。

１リツトルの培地（ｐＨ＝６．９〜７．４、好ましくは＝７．１）は、２．７８ ｇのＭｅｄｉｕｍｌ　９９　（Ｇｉｂｃｏ　；ハンクス塩及びグルタミンを含み 、ＮａＨＣＯ３を含まないもの）、８．０３ｇの最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ　； ハンクス塩及びグルタミンを含み、Ｎ　ａ　ＨＣＯ−を含まないもの）、１．３ ｇのＮ　ａ　ＨＣＯ＊　ｆｓｉｇｍａｌ、Ｉｇのウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ） 、５ｍｇのウシ膵臓インシュリン（Ｓｉｇｍａ）、５０ｍｇのグルタミン（Ｓｉ ｇｍａ）、９ｕｇのコレラトキシン（Ｓｉｇｍａ）、１００ｍｇの硫酸ストレプ トマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１００，０ＯＯＵのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、１ ０μｇの表皮成長因子（Ｇｉｂｃｏ）、０．４ｍｇのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇ ｍａ）、１０％の熱非働化ウシ胎児血清（５６℃、３０９Ｊ）（ＧｉｂＣＯ）か らなる。培地は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｌ中に調製し、ろ過に より滅菌する（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。

３日後、そしてその後は２〜３日ごとに培地を交換する。培養物は１０〜１６日 後に集密状態になる。３〜５層の細胞層を含むより厚いシートは、分化している とみなされ、培養約２０日後に得られる。ブタのケラチノサイトは同じ技術によ り単離し培養する。

吐代瓜ヌ 亜集密的ケラチノサイト培養をＰＢＳで３回洗い、改変Ｐｕｃｋの生理食塩水（ Ｇｉｂｃｏ）中のトリプシン（０，０５％）及びＥＤＴＡ（００２％）で覆う。

分離した時点で細胞を収集し、１２０ｇで８分間遠心分離する。ベレット化した 細胞を培地中に再懸濁させる。分割比は１：３である。

光主速ｎ　丈０および　勺　」勿の二　・亜集密的、集密的及びいわゆる分化し た培養物を、供給源として使用する。培養を停止する２４時間前に、培養物をＰ ＢＳで３〜４回洗い、添加剤又はウシ胎児血清無しでＤＭＥＭ／Ｆ　１２　（Ｇ ｉｂｃｏ）を添加する。翌日、培養物をＰＢＳで２回洗い、皿を５−の無菌的１ ／ｌ０ＰＢＳ　（Ｍｉ　］　１　ｉ−Ｑ水で１０倍希釈したＰＢＳ）で覆う。５ 分後、細胞を、ラバーポリスマンでかき取り、５〇−入りＦａｌｃｏｎチューブ （Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の中に収集する。合計５−の１／１０Ｐ ＢＳで皿を２回洗う。この溶液をＦａｌｃｏｎデユープに加える。チューブを、 約５分間穏やかに振とうし、−３０℃で凍結させる。２４時間以内に試料を凍結 乾燥させる。凍結乾燥された物質は、−３０℃でＦａｌｃｏｎチューブ内で貯蔵 する。

培養ケラチノサイトの同じ供給源から細胞抽出物を調製する。

細胞を、ＰＢＳ又は低張ＰＢＳ　（Ｍｉ　１１　ｉ−Ｑ水中、１／１０のＰＢＳ ）の中で、ラバーポリスマンでかき取る。懸濁液を音波処理するか（１５秒間、 ３回）又はＵｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ処理しく１３．５０Ｏｒｐｍ　、水浴中で １５秒間、３回；　Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘＴ２５■Ｊａｎｋｅ　ｋＫｕｎｋ ｅｌ、　ＩＫＡ　Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）、その後、４℃で３０分 間、１０．０００ｇで遠心分離する。結果として得られた上清及びベレットを別 々に凍結乾燥し、−３０℃で貯蔵する。

Ｄｉｓｐａｓｅでの培養ケラチノサイトの処理（３７℃で約１５分間、直径１０ ｃｍのベトリ皿１つにつき１２　Ｕ　；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）とそれに続＜ 　ＰＢＳでの３回の洗浄は、細胞を皿からかき取る前に導入してもよいイ」加的 な工程である。このような処理は、ケラチノサイトの活性に影響を及ぼさない。

凍結乾燥品を、殺菌性紫外線下で滅菌する（１５分間、光源から約５０ｃｍの距 離にて）。

笠±凹訓１ １０−の０．９％Ｎａ（１２又はＭｉｌｌｉ−Ｑ水の中に、０．２ｇのＩｄｒｏ ｒａｍｎｏｓａｎ（Ｆｅｄｅｒａ、ブリュッセル）を溶解させる。１２０℃で４ ０分加圧滅菌（オートクレーブ）することによって、滅菌を行なう。

凍１．″−すした　の　゛″１ｒ 創傷上への適用に先立ち、凍結乾燥した物質を再水和させる及び／又は再溶解さ せる。１つのベトリ皿から得られた量の滅菌済みの培養ケラチノサイトを、創傷 への適用の前に１．Ｅ５＋ｎｉ’のゲルと無菌的に混合する。

田傷゛癒のための重　モデル インビボ実験の目的は、凍結乾燥したケラチノサイト由来の物質が創傷治療活性 を含むか否か、及び新鮮なケラチノサイトシート、低温保存されたケラチノサイ トシート、従来のＤｕｏｄｅｒｍ■（ＣｏｎｖａＴｅｃ　５ｑｕｉｂｂ）での創 傷処理、又は既知のケラチノサイト成長因子であるＴＧＦ−αを用いて得られる ものに比べてこの活性が優れたものであるか否かを見出すことである。凍結乾燥 されたケラチノサイト物質は、適用する前にゲル中で再水和させた。

その皮膚の組織学的特徴がヒトの皮膚のものに類似していることから、実験動物 として家畜ブタを選んだ：この特徴の一例としては、表皮と真皮の相対的厚さ、 毛の相対的疎らさ、又皮下脂肪組織の存在が挙げられる。

体重的６０ｋｇの若い成熟した雄と雌のブタを、５ｔｒｅｓｎｉｌ■（筋肉内、 ４０　ｍｇ／　２０　ｋｇ　；　Ｊａｎｓｓｅｎ）で前処理し、Ｉ（ｙｐｎｏｄ ｉｌ＠　（静脈内、７５　ｍｇ／　２０　ｋｇ　；　Ｊａｎｓｓｅｎ）で麻酔し 、Ｆｌｕｏｔｈａｎｅ■（ＩＣＩ）で麻酔状態に保つ。背中を剃ったｌ＆、　Ｈ ｉｂｉｓｃｒｕｂ■（ＩＣＩ）及びｌ５ｏｂｅｔ、ａｄｉｎｅ　ｄｅｒｍｉｃｕ ｍ（Ａｓｔａ　Ｍｅｄｉｃａ、ブリュッセル）を用いて皮膚を消毒する。背中の を椎に近いところに３Ｘ３ｃｍの外科的創傷を導入する。創傷の縁部間の距離は ５ｃｍである。６つの創傷の１列をを椎の左側に、又６つの創傷のもう１列をを 椎の右側に作る。創傷を以下に列挙する物質で処置し、閉鎖包帯（Ｔｅｇａｄｅ ｒｍ■３Ｍ又は０ｐｓｉｔｅ■、Ｓｍ１ｊ、ｈ　ａｎｄ　Ｎｅｐｈｅｗ）で覆い 、Ｆｉｘｏｍｕｌｌ■　（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ）包帯で固定する。最終的に、 弾性の非接着性包帯で躯幹を包む。ブタを豚小屋内で回復させる。４〜５日ごと に創傷を検査する。創傷が閉じるまで、新たに物質を適用し、包帯を交換する。

これには、約３週間かかる。動物には、通常の食糧ベレット及び水を任意に与え る。

４匹のブタについて実験を行なった。ケラチノサイト由来の物質の適用単位は、 直径１０ｃｍのベトリ皿１つから得られる量である。

創傷治療活性について、以下の物質を試験した：Ｄｕｏｄｅｒｍ■、これは最も 頻繁に用いられる創傷被覆物質の１つである（動物Ｎｏ、Ｉ、Ｈ１■及びＩＶに おいて検定）；−培養約２０日後に得られた新鮮な分化したケラチノサイトシー ト（Ｎｏ、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）。シートは、ケラチノサイトが創傷上で 下を向いた状態で適用するニ ー　低温保存された分化ケラチノサイトシートは、播種後約２０日目に分離し、 液体窒素中に貯蔵した培養である（Ｎｏ、１．ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ）。シー トは、基底ケラチンサイトが下向きになるように創傷上に置くニ ー　凍結乾燥ケラチノサイトは、１／１０ＰＢＳ中で収集され凍結乾燥されるケ ラチノサイトシートから出発して調製される（Ｎ［Ｌ■、■１、ＩＩＩ、及びＩ Ｖ）； −１０，０００ｇの上清は、１／１０ＰＢＳ中で溶解され、［Ｊｌｔｒａ−ｔｕ ｒｒａｘ＠Ｊａｎｋｅ　ｔｔ、Ｋｕｎｋｅｌ、ＩＫＡ、　Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎ ｉｋ、トイ）ソ）中でホモジナイズされ、ｔｏ、０００ｇで３０分間遠心分離さ れるケラチノサイト培養物から由来する（ｋＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ）。ｔ ｏ、０００ｇの上清は、３％濃縮力）ら１１５００希釈まで変化するさまざまな 濃度で適用する（Ｎｏ、Ｉ及びＩＴ）　；−１０，０００ｇのペレットは、記載 された手順の１０，０００ｇの沈渣である（Ｎｏ、Ｉ、■、■及びＩＶ）ニー　 ＴＧＦ−αは、創傷治癒においである役割を果たしつる因子の１つである。１． ５−のゲル中に溶解させた４００ｎｇを、倉ＩＨＪＦ、ｔつにつき適用した（Ｎ ｏ、Ｉ、■、■及びＴＶ）；−ゲルは、創傷上に適用する前に凍結乾燥ケラチノ サイト又番まＴＧＦ−αなどの乾燥物質を溶解させる１、５−のゲルである（Ｎ ｏ、　Ｉ　、　Ｈ、Ｉｎ及びＩＶ）；−対照創傷は、生理食塩水のみで処置する 。

冶癒しつつある創傷の肉眼及び顕微鏡による評価を可能にするし１くつかの基準 を規定した。ある時点で研究されるこれらの様十目Ｇよ、表１及び表２において 星印でマークされている。評価（よ３人の石升究者によって独立して行なわれる 。最終的結果は、３名全員の合意に基づいて得られる。

表１ 創傷を受けた後の異なる時点における治癒しつつある創傷の肉眼的評価のための 基準 顕微鏡による評価のためには、創傷閉鎖の時点及び創傷導入後約３カ月目、すな わち第２の動物においては１０５０５日目３及び第４の動物においてはそれぞれ ８４日目及び９１日目に、パンチ生検（直径３ｍｍ）を採取する。毎回２セツト のパンチ生検を、ホルモル中での固定用と凍結用に１セツトずつ採取する。ホル モル固定された生検からパラフィン切片を調製し、その後、ルーチンのヘマトキ シリン−エオシン又は特殊染色法によって染色する。特殊染色は、基底膜、メラ ノサイト、レチクリン及びエラスチンを明らかにするために用いる。凍結した試 料からクリオスタット（低温槽）切片を作り、ある種のケラチン、ランゲルハン ス細胞及び毛細血管の存在を調べる免疫細胞化学実験のために使用する。

創傷の閉鎖は、肉眼的に観察される上皮形成として定義する。

（１）第１の動物での実験を２３日目に停止しなければならなかった、及び（１ １）はとんどの創傷は２３日目に動物の体内で閉鎖した、という２つの理由で、 ２３日という時点を基準点として任意に選択する（以下参照）。

表２ 異なる時間的間隔での治癒しつつある創傷の顕微鏡レベルでの評価のための基準 ☆数字はサイトケラチンのタイプを意味する。

（１）閉鎖時点で収縮が小さく、（１）最大の収縮をもつ創傷が最初に閉鎖せず 、（ｉｌ）最初に閉じた創傷が大きな収縮を示さないことから、我々のモデルに おいては、閉鎖は創傷の収縮によるものではなく上皮形成によるものであると結 論づけられる。創傷の位置は、収縮の方向及び範囲に影響を及ぼす。一般に、全 ての痔痕は閉鎖後及び数週間後に鱗屑状になった。閉鎖後２．５力月目、すなわ ち実験の終りにおいて、過形成性痔痕は見られなかった。

顕微鏡的基準のためには、創傷のない皮膚の組織学が基準として用いられた。余 病組織の顕微鏡観察は、痔病の質に関する重要な情報を提供した。創傷の場所が 治癒しつつある創傷の組織学に影響を及ぼすという証拠は全（見い出されなかっ た。かくして、余病の質は、主として創傷の処置に用いられた物質によって影響 されていた。しかしながら、動物ごとに大きな組織学的差異が見られた。

これらの差異は、動物間差異によるものである可能性が高い。例えば、一定の質 をもつＤｕｏｄｅｒｍは、４匹の動物全ての首の創傷に適用され、結果として異 なる組織学がもたらされた。動物間差異は、ケラチノサイト由来物質を使用して も同様に観察された。例えば、ケラチノサイＩ・シート又は凍結乾燥されたケラ チノサイトの適用の後、動物Ｎｏ、　ＩＩＩ及びＩＶの場合よりも動物Ｎｏ、Ｉ 及びＩＩの場合の方に、創傷閉鎖時点でより著しい乳頭間隆起が見い出された。

このことは、一部には、第３及び第４の動物が最初の２匹のブタと異なる供給業 者に由来していたという事実によるものでありうる。

創傷閉鎖の時点で、不規則な過形成が通常観察された。すなわち、上皮は、創傷 を受けていない皮膚の場合よりも厚いものであった。一般に、表皮は約２カ月後 にはより薄いものであったが、それでもなお正常な上皮よりもわずかに厚いもの であった。

その後の時点における余病の質は非常に重要である。真皮に対する表皮の接着及 び真の乳頭間隆起の存在は、痔痕組織の質を評価するための重要な基準である。

時間の関数として乳頭間隆起のサイズ及び数が正規化される傾向が存在する。実 際、閉鎖時点で全（又はわずかじか隆起が存在しなかった場合、隆起は、３力月 目にはより数多く又より良く発達していた。一方、隆起が正常な皮膚においてよ りも閉鎖後にはるかに大きかった場合、これらの構造は３力月目にはより正常で ある傾向があった。

表３に、創傷閉鎖に必要な日数に関する結果を要約して示す。

数字１．２．３及び４は、４匹の異なるブタに対応する。第１欄は、創傷に適用 した製剤を示す。

この表中、 −「非処置」というのは、その創傷に生理食塩水のみを適用した動物に相当する ； −「ゲル単独」というのは、ゲルの形態で創傷に生理食塩水を適用したケースに 相当する； −「新鮮ＫＣＪは、本発明に従って培養した新鮮ケラチノサイト細胞に相当する ； −［低温ＫＣＪは、本発明に従って培養した低温保存ケラチノサイト細胞に相当 するニ ー　「凍結乾燥」は、本発明のケラナノサイ１−細胞の凍結乾燥品に相当する； −ｒｌ　０，０００ｐｅＩＪは、１．０．０００ｇで遠心分離した後に得られた ベレットに相当する； −ｒｌｏ、０ＯＯｓｕＪは、１０，０００ｇで遠心分離した後に得られた上清に 相当する。

表３ 分化した新鮮ケラチノサイトシートでの処置後、２匹の動物において創傷は２３ 日より早く閉鎖した。顕微鏡レベルでは、表皮は全ての標本において真皮に接着 していた。真の乳頭間隆起は、７つの痔痕のうち３つにおいて発生した。閉鎖後 ２力月目に、３つの慶痕全てにおいて表皮は真皮に接着していた。

低温保存された分化ケラチノサイトシートを用いた創傷の処置は、分化した新鮮 なシートを使用した場合はど満足のいく結果を示さなかった。動物Ｎｏ、　Ｔの 創傷は、肉眼的には閉鎖していると思われたものの上皮形成していないようであ った。創傷を受けてから約３カ月目に３匹の動物のうち２匹において上皮が分離 した。７つの痔病のうち３つに乳頭間隆起が存在した。閉鎖後早い時期に、３つ の余病のうちの２つに錯角化が発生した。

分化したケラチノサイトシートから得られた凍結乾燥したケラチノサイトで処置 された創傷は、４匹全てのブタにおいて創傷導入後２３日目より早く閉鎖した。

組織学的観察によると、生検の時点で全ての創傷が上皮形成されていた。表皮は 、上皮が部分的に分離していた１０５０５日目物Ｎａ　ＩＩの生検において以外 、全ての切片で真皮に接着していた。７つの痔病のうち４つが真の乳頭間隆起を 示した。創傷を受けた後３カ月目に、第２及び第３の動物においてわずかな顆粒 層肥厚が見られた。

Ｄｕｏｄｅｒｍでの被覆は、肉眼で判断されるように３匹の動物において２３日 より早い創傷閉鎖という結果をもたらした。動物Ｎｏ、ＩＩ及びＩＩＩにおいて は早い時点及びさらに遅い時点で、又動物Ｎｏ、ＩＶでは２７日目において、は とんど又は全く乳頭間隆起が見られなかった。かくして、１１の廠痕のうちわず か３つにおいて表皮拡張が存在しているにすぎなかった。Ｎｏ、　Ｉｌｌの４つ の醗痕全ての表皮は、完全に接着していなかった。創傷を受けてから３力月目に 、表皮は動物Ｎｏ、ｌＶのみにおいて、つまり５つのうち２つの余病において、 接着していた。

非処置の創傷は、動物Ｎｏ、　Ｈ及びＮｏ、ＩＶにおいて２３日目より早く閉鎖 した。乳頭間隆起は、７つの癖痕のうちわずか２つにおいてのみ見られた。ゲル 単独の適用の後にも、類似の結果が得られた。これらの癖痕は、ケラチノサイト 由来の物質による創傷処置の後の癖痕に比べ、低い質のものである。

溶解したケラチノサイトの１０．０００ｇの上清で処置すると、２匹の動物にお いて２３日より早く創傷閉鎖が見られた。表皮は、閉鎖後早い時期に４つの癖痕 のうち３つにおいて、又２．５力月後に３つの癖痕のうち２つにおいて、接着し た。６つの癖痕のうち４つにおいて乳頭間隆起が発生した。さまざまな濃度の上 清を用いた実験は、閉鎖時点で、使用された濃度の間、すなわち３倍濃縮から］ １５００希釈までの間に、明白な組織学的差異が全くなかったことを明らかにし た。

溶解したケラチノサイトの１０．０００ｇのペレットの適用は、４匹の動物のう ち２匹において２３日よりも早い創傷閉鎖という結果をもたらした。表皮は、７ つの癖痕のうち４つにおいて真皮に接着していた。真の乳頭間隆起は全く見られ なかった。閉鎖後早い時期に３つの痔病のうち２つにおいて錯角化が見られた。

従って、１０．０００ｇのベレット物質の使用は、１０，０００ｇの上清の適用 後に比べ、低い質の癖痕という結果をもたらした。恐らくは、有効物質の量は、 １０，０００ｇの上清の場合よりも低（、結果として比較的満足度の低い治癒が もたらされる。

動物Ｎα■及びＩＶのＴＧＦ−α創傷は、２３日より早く閉鎖した。

顕微鏡観察により、創傷閉鎖の時点の動物Ｎｏ、　Ｉにおいて以外、乳頭間隆起 が全（又はほとんど存在しないことが明らかになった。動物Ｎｏ、Ｉには、乾廁 状の過形成が見られた。創傷を受けてから３力月目に、３つの癖痕のうち２つに おいて表皮が真皮に接着していた。完全ケラチノサイト凍結乾燥品の適用後の治 癒が精製ＴＧＦ−α単独の適用後に比べて優れていたことから、凍結乾燥ケラナ ノサイト中の治療活性はＴＧＦ−αによるものでないか、又は少な（ともＴＧＦ −α単独によるものではないという結論が下される。

毛のり及び汗腺は、痔痕中に全く見い出されなかった。

メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、サイトケラチン、基底膜、 レチクリン及びエラスチンのような特異的な皮膚成分の存在については、全ての 癖痕を調べたわけではなかった。構造（物）は、最も代表的な癖痕においてのみ 、すなわち新鮮及び低温保存ケラチノサイトシート、凍結乾燥ケラチノサイトシ ート、Ｄｕｏｄｅｒｍ　、対照としてのゲル単独、及び当然のことながら創傷を 受けていない皮膚において研究した。従って、凍結乾燥ケラチノサイト抽出物で の創傷処置後に得られた痔病は、ここでは研究しなかった。

痔痕内のケラチンパターンは、創傷の無い皮膚のものと類似していた。ケラチン １０／１１に対する抗体は陽性反応を示し、一方ケラチン８／１８／１９は発見 されなかった。驚くべきことに、ケラチン１３／１６に対する抗体を使用して陽 性反応が見られた。これらのケラチンは、正常なヒトの皮膚内には発生しないが 、見かけ上（少な（とも両者のうち一方、おそら（はケラチン１６）は、創傷を 受けていないブタの皮膚及び痔病の中に存在する。

創傷を受けていない皮膚にも癖痕の上皮にもメラノサイト（フォンターナ技術に より染色される）は観察されなかった。これまでのところ、ランゲルハンス細胞 は、ペルオキシダーゼ酵素の細胞化学又は免疫化学（抗ヒトランゲルハンス抗体 ０ＫＴ６）を使用することにより、創傷の無い皮膚又は痔病のいずれにも検出さ れなかった。ブタの皮膚又は痛痕内に、メルケル細胞は発見されなかった（ケラ チン８．１８．１９に対する陽性度無し）。

基底膜（過ヨウ素酸シック染色により検出される）は、真皮の結合組織に対する 上皮の接着において重要な役割を果たす。基底膜は、培養ケラチノサイト（新鮮 シート、低温保存シート及び凍結乾燥ケラチノサイト）で処置された治癒した創 傷において充分に発達した。これは、Ｄｕｏｄｅｒｍの適用の後又は対照におい てはあてはまらなかったことである。

レチクリンパターン（銀含浸により明らかにされる）は、創傷を受けていない皮 膚に類似していた。エラスチンの薄い繊維（オルセイン染色により検出される） は、新鮮ケラチノサイトシート及び凍結乾燥ケラチノサイトの適用後の痔病にお いてのみ発見され、低温保存シート、Ｄｕｏｄｅｒｍ又はゲル単独での創傷処置 の後には見られなかった。

結論として、凍結乾燥された培養ケラチノサイトは、新鮮培養ケラチノサイトシ ー１〜を含むその他の被験物質のいずれのものよりも高い創傷治療活性を明らか に立証している。癖痕は、より迅速に閉鎖し、質はより優れたものである。

憇匪 インビトロで　させた　を　まないケラチノサイトにおＧるＥＧＦ、コレラトキ シン、ヒドロコルチゾン　びインシュ旦２四とえ削 −！わ ヒトケラチノサイトの迅速な増殖を誘発するためには、表皮成長因子（ＥＧＦ） が必要である。しかしながら、ＥＧＦが単独で培地中に存在する場合、接着した ケラチノサイトの収量が低いことがわかる。コレラトキシン（ＣＴ）は、高い収 量の接着した及び伸展したケラチノサイトを可能にする。一方、培地中にＣＴが 単独で存在している場合、成長停止が見られる。

ヒドロコルチゾンは、ケラチノサイト増殖を誘発するが、ＥＧＦはど強力ではな い。インシュリンは、ケラチノサイトに対し有益な効果をもたらすが、その効果 は、ＥＧＦ、コレラトキシン及びヒドロコルチゾンが、特に、好ましい濃度で存 在する場合に比べ、培地にＥＧＦとコレラトキシン又はＥＧＦとヒドロコルチゾ ンが含まれている場合の方がより大きいものである。

培地中のＥＧＦ、ヒドロコルチゾン及びコレラトキシンの最適な濃度は、それぞ れ１−あたり例えば１０ｎｇ、　０．　１３μｇ及び９ｎｇである。好ましくは ５νｇ／−の濃度で、インシュリンを加えることが可能である。

以下のことを調査する目的で試験を行なったニー　３つの添加剤の全てを含むが 又はいずれも含まない培地と比較しての、−次（ＰＯ）及び継代培養された（Ｐ ｌ）ヒトヶラチノサイトの成長及び接着と成長に対して、インシュリン存在下で 表皮成長因子（ＥＧＦ）、コレラトキシン及びヒドロコルチゾン（ＨＹ）が及ぼ す影響、 −同じ現象についてのＥＧＦ＋ＣＴ％ＥＧＦ＋ＨＹ及びＨＹ＋ＣＴの影響、 −他の２つが「標準的」濃度である状態で、１つの添加剤（ＥＧＦ、ＣＴ又はＨ Ｙ）の濃度を加減することの効果、−ヒト一部ケラチノサイトの接着と成長にお けるインシュリンの役割。

完全培地は、１−あたりＬｏｎｇのＥＧＦ、９ｎｇのコレラトキシン、０．４μ ｇのヒドロコルチゾン及び５１．Ｉｇのインシュリンを含んでいた。全ての実験 は６ウエルのプレート内で行なった。ドナー間の差異が生じる可能性があるので 、かつプレート間の変動を回避するために、各プレートは２つの内部標準を含ん でいた：その１つは、細胞を完全培地中で成長させたものであり、もう１つはあ らゆる添加剤を含まない培地中で成長させたものである。

細胞の成長に対する効果を調べるため、細胞を、完全培地中に播種した。２日後 、培養をＰＢＳで３回洗い、特殊培地で被覆した。

細胞の接着、伸展及び成長に対する添加剤の効果を検査するため、ケラチノサイ トを特殊培地中に播種した。継代培養された（Ｐｌ）ケラチノサイト（ＫＣ）を 使用した場合、細胞を、トリプシン処理及び継代の前に、完全培地中で成長させ た。

結論： Ａ、インシュリンを含む培養に対するＥＧＦ、ＣＴ及びＨＹの効果 Ａ、１．　ＥＧＦ： 培地中の単独のＥＧＦは、この特殊培地中に細胞を播種した場合、比較的緩慢で あるものの、集密状態を可能にした。これは、播種培地中にＥＧＦのみが存在す る場合、接着した細胞がより低い収量で見られるという事実によるものでありう る。

さらに、実験は、ＥＧＦ、ＨＹ、ＣＴ及びインシュリンの間でＥＧＦが最も強力 なケラチノサイト増殖刺激物質であることを明らかに示した。ＨＹ＋ＣＴの組合 せは、ＥＧＦ＋ＣＴ＋ＨＹ、ＥＧＦ＋ＣＴ、ＥＧＦ＋ＨＹ、及びＥＧＦ単独の場 合に比べて緩慢な成長を示し、迅速な成長にはＥＧＦが必要であることが証明さ れた。

ＣＴ＋ＨＹ＋１／３ＥＧＦ及びＣＴ＋ＨＹ＋２ＸＥＧＦが完全培地に比べてわず かに緩慢なＰＯ（−次）及びＰＬ（第一継代培養）ケラチノサイトの成長をもた らしたという事実は、添加剤のこの組合せについてのＥＧＦの最適濃度がｌＯｎ ｇ／ＷＩ！！前後であることを示唆しうるものである。接着−成長実験において は、ＣＴ＋ＨＹ＋１／３ＥＧＦ、ＣＴ＋ＨＹ＋２ＸＥＧＦ及び完全培地の効果は 類似していた。

ＣＴが無い状態で培地中にＥＧＦ　（ＨＹ有り又はＨＹ無し）が存在した場合、 大きい扁平な半透明の分裂するケラチノサイトが出現した。このような細胞は、 培養中にＣＴが存在した場合には見られなかった。しかしながら、培養物が集密 状態に達すると、このような細胞はもはや見られなかった（ＥＧＦ、場合によっ てはＨＹが存在し、ＣＴが全く存在しない場合）。

全ての細胞は、典型的なケラチノサイト形態学を示し、多層を形成した。

ＣＴが単独で培地中に存在した場合には、集密状態はめったに得られなかった。

見かけ上は、集密状態は、−次ケラチノサイトがこの特殊培地中に播種される場 合に時として達成しつる。ＣＴは、培地中の単独のＥＧＦ及びＨＹの場合に比べ てさらに高い収量の接着し伸展したケラチノサイトを可能にした。しかしながら 、わずかな日数の後に、成長停止が起こった。−次ケラチノサイトがＥＧＦ＋Ｈ Ｙ＋ＣＴ無しの培地中に播種された場合には集密状態が得られるが、ＣＴが単独 で存在する場合には得られないという事実は、ＣＴの増殖「阻害」効果を示して いる。Ｅ　Ｇ　Ｆ　＋　ＨＹの組合せは、ＥＧＦ＋ＨＹ＋１／３ＣＴの場合と比 べて、ケラチノサイトの成長について類似の結果を示し、ＥＧＦ＋ＨＹ＝２＋Ｃ Ｔよりも幾分か速い可能性がある。接着−成長実験によると、ＥＧＦ＋ＨＹは、 この組合せに１ｘ、１／３又は２×のＣＴが添加された場合よりも時として緩慢 であることが示された。ケラチノサイトの成長に関しては、１／３ＣＴ＋ＥＧＦ ＋ＨＹ及び完全培地（＝ＥＧＦ＋ＨＹ＋ＣＴ）は、２ｘＣＴ＋ＥＧＦ＋ＨＹより もわずかに迅速であり、ここでも又ＣＴがケラチノサイトの増殖を妨げることを 示唆している。従って、ＣＴの有益な効果には基本的に接着収量を改善すること が関与している。従って培地は好ましくはＣＴを含んでいる。接着−成長実験に おいては、ＥＧＦ＋ＣＴ＋ＨＹ、１／３ＣＴ＋ＨＹ＋ＥＧＦ及び２　Ｘ　ＣＴ　 ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　十ＨＹの間に差異は全く存在しなかった。従ってＣＴの最適濃 度は、ＥＧＦとＨＹとの組合せにおいて約９ｎｇ／ｍｌでありうる。

Ａ、３．ヒドロコルチゾン：添加剤としてＨＹを単独で含む培地は、ある種の培 養において集密状態を与えた。ＨＹが単独で存在したとき、接着した細胞がより 低い収量で見い出された。しかしながら、集密状態を得ることができるという事 実は、ＣＴの場合とは異なり、成長停止が全くないということを示している。培 養物がＣＴ＋ＨＹによって集密状態に達するが、ＣＴ単独では達しないというこ とから、おそら＜ＨＹはわずかな成長刺激を誘発する。

ＨＹ無しのＥＧＦ＋ＣＴを用いて集密状態が達成されるが、時として、ＨＹも存 在する場合に比べて遅い時点で達成される。さらに、１／３ＨＹ＋ＥＧＦ＋ＣＴ 及び２ＸＨＹ＋ＥＧＦ＋ＣＴは、全ての実験においてＨＹ　＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　＋ 　ＣＴが示したのと類似の結果を示した。従って、接着−成長及び成長のみに対 するマイナスの効果無しに、濃度を０．１３νｇ／−にまで下げてもよいが、培 地にＨＹを添加することが推奨される。

３つの添加剤ＥＧＦ、ＨＹ及びＣＴの組合せは、最高の結果をもたらす。しかし ながら、接着−成長実験は、他の２つの因子が標準的濃度であれば、１つの因子 の濃度を標準濃度の１／３〜２Ｘ（試験した範囲）の間で変動させうることを示 した。

Ｂ、インシュリンの効果： ＥＧＦ＋ＨＹ＋ＣＴが無い状態で培地中でケラチノサイトを成長させることは、 ＥＧＦ＋ＨＹ＋ＣＴが欠如したこの培地中に一次細胞を播種したいくつかのケー スを除いて、不成功である。その上、インシュリンも除かれると、この培地中に 播種した−次ケラチノサイトで集密状態に達することはできなかった（表８）。

従って、ケラチノサイトの接着−伸展−成長にとってインシュリンは有益である 。しかしながら、集密的−次培養を得るには、ＥＧＦ＋ＨＹ＋ＣＴの組合せで充 分である。

Ｆｉｇｕｒｅ　１ Ｆｉｇｕｒｃ　２ Ｆｉｇｕｒｅ　３ 、　、、、、、、−、、−、−ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０２６５７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．好ましくは１×１０４細胞／ｃｍ２、好ましくは３〜５×１０４細胞／ｃｍ ２の最小播種密度について、少なくとも２日に１回、特に少なくとも２．５日に １回の細胞分裂という細胞増幅速度を有する、非自己由来の線維芽細胞を含まず 、器官抽出物、特に下垂体抽出物を含まず、かつ大きい扁平な半透明のケラチノ サイトを含まない、ケラチノサイト細胞の培養物。 ２．星形非ケラチノサイト細胞のような自己由来の非ケラチノサイト細胞を、約 １０％以下、好ましくは約７％以下しか含まず、かつ自己由来の線維芽細胞を、 約１％以下、好ましくは約０．５％以下しか含まず、好ましくはいかなる自己由 来の線維芽細胞も、自己由来の非ケラチノサイトも含まず、特にいかなる自己由 来のメラノサイトも自己由来のランゲルハンス細胞も含まない、請求の範囲第１ 項に記載の培養物。 ３．１×１０４細胞／ｃｍ２までの低い密度で、好ましくは３〜５×１０４細胞 ／ｃｍ２で播種されたケラチノサイトの培養の開始から約１０日後に、局所的に 分化し、集密状態にある、請求の範囲第１項又は第２項に記載のケラチノサイト 細胞の培養物。 ４．１／４〜１／２、好ましくは１／３の分割比で、分化の喪失無しに８継代、 好ましくは６継代、継代培養されうる、請求の範囲第１項に記載のケラチノサイ ト細胞の培養物。 ５．以下の工程： −非自己由来の線維芽細胞、及び器官抽出物、特に下垂体抽出物を含まず、以下 の添加剤：血清、表皮成長因子、ヒドロコルチゾン及び／又はコレラトキシン、 及び場合によってはインシュリンを含み、それ自体Ｍｅｄｉｕｍ１９９を含む基 本培地を含む培地中に１×１０４細胞／ｃｍ２までの低い密度、好ましくは３〜 ５×１０４細胞／ｃｍ２で支持体上にケラチノサイト細胞を播種する工程、 −好ましくは約１％〜約１０％の範囲内、より好ましくは約２％〜約８％の範囲 内のＣＯ２を含む水飽和した大気中、３７℃の温度にて前記細胞を成長させる工 程を含むことを特徴とする方法に従って得られるもののようなケラチノサイトの 培養物。 ６．凍結乾燥された形態である、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記 載のケラチノサイトの培養物。 ７．場合によっては凍結乾燥品の形態である、請求の範囲第１項〜第５項のいず れか１項に記載のケラチノサイト培養物の抽出物。 ８．非自己由来の線維芽細胞を含まず、器官抽出物、特に下垂体抽出物を含まな いケラチノサイト細胞の培養物を調製するための方法において、 −非自己由来の線維芽細胞、及び器官抽出物、特に下垂体抽出物を含まず、以下 の添加剤：血清、表皮成長因子、ヒドロコルチゾン及び／又はコレラトキシン、 及び場合によってはインシュリンを含み、それ自体Ｍｅｄｉｕｍ１９９を含む基 本培地を含む培地中に１×１０４細胞／ｃｍ２までの低い密度、好ましくは３〜 ５×１０４細胞／ｃｍ２で支持体上にケラチノサイト細胞を播種する工程、 −好ましくは約１％〜約１０％の範囲内、より好ましくは約２％〜約８％の範囲 内のＣＯ２を含む水飽和した大気中、３７℃の温度にて前記細胞を成長させる工 程を含むことを特徴とする方法。 ９．培地に、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、血清、及びヒドロコルチゾン、表皮成長因子 及びコレラトキシンという３つの成分が含まれている、請求の範囲第８項に記載 の方法。 １０．培地が、 −基本培地が 約２０％〜約１００％（Ｗ／Ｖ）のＭｅｄｉｕｍ１９９を含み、ＭＥＭ培地のよ うな他のいずれかの基本培地により、最高８０％、好ましくは７５％まで置換さ れうるようなものであり、かつ −培地中の血清が、約２％〜約２５％、特に約４％〜約１５％（Ｖ／Ｖ）、特に １０％の濃度で含まれ、該血清は好ましくは胎児血清又は新生児血清、特にウシ 胎児血清であり、−培地中のヒドロコルチゾンが、０〜約４μｇ／ｍｌ、特に約 ０．０１〜約２μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約０．８μｇ／ｍｌ、より好 ましくは０．４μｇ／ｍｌの濃度で含まれており、−培地中の表皮成長因子が、 約１〜約１００ｎｇ／ｍｌ、特に約１〜約５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３．３ 〜約２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれており、− 培地中のコレラトキシンが、０〜約８０ｎｇ／ｍｌ、特に約１〜約５０ｎｇ／ｍ ｌ、好ましくは約３〜約１８ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは９ｎｇ／ｍｌの濃度で 含まれており、 −培地中のインシュリンが、０〜約２０μｇ／ｍｌ、特に約１〜約１０μｇ／ｍ ｌ、例えば５μｇ／ｍｌの濃度で含まれているようなものである、請求の範囲第 ８項及び第９項に記載の方法。 １１．培地が、ウシ脳抽出物、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ヒトコ ーン分画Ｖ、及びＭｅｄｉｕｍ１９９中に含まれているアデニン以外のアデニン を含んでいない、請求の範囲第８項〜第１０項のいずれか１項に記載の方法。 １２．培地が、エタノールアミン、セレナイト、プトレツシン及びホスホエタノ ールアミンを含まない、請求の範囲第８項〜第１１項のいずれか１項に記載の方 法。 １３．請求の範囲第８項〜第１２項のいずれか１項に記載の方法を用いて、集密 的ケラチノサイト細胞の培養物を調製するための方法であって、以下の工程： −少なくとも約４日に１回、好ましくは２日経過後に、細胞の培地を交換する工 程、及び −上述の添加剤を拒絶するのに充分な時間だけ生存培地中に細胞を置くことによ って、集密的な凝集性多層培養物を得るのに充分な時間の後に、培養物の成長を 停止させる工程であって、ここで該生存培地は、細胞が生きた状態にとどまるこ とはできるが、細胞の増殖及び分化のための刺激は全く無いようなものであり、 該培地は、例えば、好ましくはいかなる血清も、付加的なＢＳＡも、表皮成長因 子も、ヒドロコルチゾンも、コレラトキシンも、インシュリンも含まない請求の 範囲第８項〜第１２項のいずれか１項に言及されている培地であるか、又はその 他のいずれかの基本培地又はいずれかの基本培地の混合物である工程、一例えば ＰＢＳで、細胞を洗浄して前述の生存培地を除去する工程 を含むことを特徴とする、請求の範囲第８項〜第１２項のいずれか１項に記載の 方法。 １４．請求の範囲第８項〜第１２項のいずれか１項に記載の方法を用いて、集密 的で分化したケラチノサイト細胞の培養物を調製するための方法であって、以下 の工程： 一少なくとも約４日に１回細胞の培地を交換する工程、及び一細胞が生きた状態 にとどまることはできるが、細胞の増殖及び分化のための刺激が全く無い生存培 地の中に約１日〜２日間細胞を置くことによって、約２１日後に培養物の成長を 停止させる工程であって、ここで該培地は、例えば、好ましくはいかなる血清も 、表皮成長因子も、ヒドロコルチゾンも、コレラトキシンも含まない請求の範囲 第８項〜第１２項のいずれか１項に言及されている培地、又はその他のいずれか の基本培地又はＤＭＥＭ−Ｆ１２である工程、及び 一例えばＰＢＳで、細胞を洗浄して前述の培地を除去する工程を含むことを特徴 とする、請求の範囲第８項〜第１３項のいずれか１項に記載の方法。 １５．前記細胞を、例えばＤｉｓｐａｓｅを用いて、支持体から分離させた後、 シートの形態で回収する、請求の範囲第８項〜第１４項のいすれか１項に記載の 方法。 １６．凍結乾燥された形態のケラチノサイト細胞を調製するための方法であって 、請求の範囲第１５項に従って細胞を得、該細胞を、例えば低張液を用いて溶解 させ、例えば機械的手段により支持体から分離させ、収集し、場合によっては音 波処理した後、均−２０℃〜約−１９６℃、好ましくは約−４０℃の温度で凍結 させ、真空下で凍結乾燥し、凍結乾燥品を構成する乾燥物質を提供することを特 徴とする方法。 １７．ケラチノサイト培養物の抽出物を調製するための方法であって、細胞を請 求の範囲第８項〜第１４項のいずれか１項に従って得、該細胞を、例えば低張液 を用いて溶解させ、例えば機械的手段により支持体から分離させ、収集した後に 、音波処理し、遠心分離して、 一音波処理により細胞膜から分離された物質を含む可能性がある、前記低張液中 で可溶性の分子を含む上清、及び一細胞膜及び核を含むペレット を提供し、 該上清又はペレットを回収し、場合によっては凍結及び凍結乾燥することを特徴 とする方法。 １８．低温保存されたケラチノサイトの培養物を調製するための方法であって、 細胞を請求の範囲第８項〜第１４項のいずれか１項に従って得、該細胞を、０〜 約１５℃の温度の好ましくは緩衝化された等張性の冷培地の中に入れ、該培地に は、細胞の凍結損傷を防ぎ、場合によっては細胞の損傷を避けるべく該冷培地に さらに添加されている低温保護物質の毒性を防ぐ、血清が含まれており、細胞を −２０℃〜約−１９６℃、好ましくは−７０℃の温度で凍結させ、その後細胞を 液体窒素の中に置くことを特徴とする方法。 １９．細胞を請求の範囲第８項〜第１４項のいずれか１項に従って得る、低温保 存された培養物の調製方法であって、以下の工程：一少なくとも約４日に１回細 胞の培地を交換する工程、及び一細胞が生きた状態にとどまることはできるが、 細胞の増殖及び分化のための刺激が全く無い生存培地の中に細胞を置くことによ って約２１日後に培養物の成長を停止させる工程であって、ここで該培地は、例 えば、場合によっては血清、付加的なＢＳＡ及びインシュリンを含み、しかしい かなる表皮成長因子も、ヒドロコルチゾンも、コレラトキシンも含まない請求の 範囲第９項に記載の培地であるか、又はその他のいずれかの基本培地又はＤＭＥ Ｍ−Ｆ１２である工程、 −例えばＰＢＳで、細胞を洗浄して上述の生存培地を除去する工程、及び −培養支持体から分離されるシートの形態で細胞を回収する工程 を含み、 細胞シートを、０℃〜約１５℃の温度の好ましくは緩衝化された等張性の冷培地 の中に入れ、該培地には、細胞の凍結損傷を防ぎ、場合によっては該冷培地にさ らに添加されている低温保護物質の毒性が細胞を損傷するのを防ぐ血清が含まれ ており、細胞のシートを−２０℃〜約−１９６℃、好ましくは−７０℃の温度で 凍結させ、その後細胞シートを液体窒素の中に置くことを特徴とする方法。 ２０．非自己由来の線維芽細胞を含まず、器官抽出物、特に下垂体抽出物を含ま ず、以下の添加剤：血清、表皮成長因子、コレラトキシン及び／又はヒドロコル チゾン、及び場合によってはインシュリンを含み、それ自体Ｍｅｄｉｕｍ１９９ を含む基本培地を含む培地。 ２１．基本培地としてＭｅｄｉｕｍ１９９を含み、添加剤として血清、及びヒド ロコルチゾン、表皮成長因子、コレラトキシンという３つの成分のうちの少なく とも２つ、及び場合によってはインシュリンを含む培地。 ２２．−基本培地が、 約２０％〜約１００％（Ｗ／Ｖ）のＭｅｄｉｕｍ１９９を含み、該培地が、ＭＥ Ｍ培地のような他のいずれかの基本培地により、最高８０％、好ましくは７５％ まで、置換されうるようなものであり、かつ −培地中の血清が、約２％〜約２５％、特に約４％〜約１５％（Ｖ／Ｖ）、好ま しくは１０％の濃度で含まれ、該血清は好ましくは胎児血清又は新生児血清、特 にウシ胎児血清であり、−培地中のヒドロコルチゾンが、約０〜約４μｇ／ｍｌ 、特に約０．０１〜約２μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約０．８μｇ／ｍｌ 、より好ましくは０．４μｇ／ｍｌの濃度で含まれており、−培地中の表皮成長 因子が、約１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、特に約１〜約５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは 約３．３〜約２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれて おり、−培地中のコレラトキシンが、０〜約８０ｎｇ／ｍｌ、特に約１〜約５０ ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３〜約１８ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは９ｎｇ／ｍｌ の濃度で含まれており、 −培地中のインシュリンが、０〜約３０μｇ／ｍｌ、特に約１〜約１０μｇ／ｍ ｌ、例えば５μｇ／ｍｌの濃度で含まれているようなものである 培地。 ２３．創傷の治癒を促進するため表面創傷に適用することができる医薬組成物で あって、有効成分として、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のケ ラチノサイトの培養物、特に凍結乾燥された培養物、又は請求の範囲第７項に記 載のケラチノサイト培養物の抽出物、特に凍結乾燥された培養物の抽出物を含む 組成物。 ２４．請求の範囲第２３項に記載の組成物を創傷に適用する工程を含むことを特 徴とする、表面創傷の治癒を促進するための方法。