ES2252893T3

ES2252893T3 - Granulos derivados de queratinocitos para el uso como sustancias para la curacion de heridas.

Info

Publication number: ES2252893T3
Application number: ES99114054T
Authority: ES
Inventors: Hans Van Bossuyt
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1991-11-20
Filing date: 1992-11-19
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2012-11-19
Also published as: EP0615545B1; ATE193057T1; DE69233558D1; JPH07501214A; ATE307599T1; EP0970701A2; GR3034195T3; DK0970701T3; EP0970701B1; US6126935A; EP0970701A3; DE69231063T2; EP0615545A1; DE69233558T2; HK1027022A1; CA2123683C; DE69231063D1; DK0615545T3; JP3311351B2; WO1993010217A1

Abstract

La invención se refiere a fracciones granuladas de queratinocitos para uso como sustancias para curar heridas. Las fracciones de gr nulos de la presente invención se pueden obtener por un procedimiento que comprende las etapas de: desarrollar cultivos de queratinocitos, separar los queratinocitos y lisarlos completamente, fraccionar dichas células lisadas para producir una fracción granulada, y recoger dicha fracción granulada.

Description

Gránulos derivados de queratinocitos para el uso como sustancias para la curación de heridas.

La invención se refiere al uso de gránulos de queratinocitos como sustancias para la curación de heridas.

La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que contienen como sustancias activas, dichos gránulos de queratinocitos.

La invención también se refiere a las composiciones cosméticas, que contienen como sustancias activas, gránulos de queratinocitos.

La piel es presumiblemente el órgano más sometido a daños. La reparación de la piel es un proceso complejo que puede ser dividido en 4 fases usualmente descrito como inflamación, formación de tejido de granulación, epitelización y remodelación de la matriz del tejido conectivo. Cada una de estas fases es compleja en sí misma, y es claro que para una buena curación de las heridas, los procesos deben ocurrir sucesivamente y en coordinación. Una buena curación de las heridas puede ser definida como la restitución de la piel, incluyendo la parte dérmica y epidérmica, de tal manera que el tejido cicatrizado resultante semeje a lo máximo la piel sana estructuralmente, histológicamente, funcionalmente, y estéticamente. Obviamente, tal tejido cicatrizado es diferente de uno cicatrizado hipertrófico o queloide.

Para propósitos de claridad una descripción simplificada de la composición de la piel humana es dada a continuación. La parte superior está compuesta de la epidermis, que contiene mayormente células epiteliales o queratinocitos, algunas células de Langerhans y melanocitos, y varias células de Merkel. Cinco capas diferentes se encuentran en la epidermis, reflejando el estado de queratinización. Los queratinocitos que proliferan en la base de la epidermis, es decir, en la capa basal, están unidos a la dermis por medio de la membrana de basamento. La dermis está compuesta de tejido conectivo, incluyendo fibroblastos y otras células de tejido conectivo, y sustancias de la matriz del tejido conectivo. Los vasos sanguíneos, los nervios, los órganos sensoriales, las glándulas sudoríparas, las glándulas sebáceas, y los folículos pilosos están presentes en la dermis.

Experimentos clínicos y con animales han demostrado que la aplicación de queratinocitos (humanos) cultivados in vitro, por ejemplo como láminas, induce la curación de heridas en heridas crónicas tales como úlceras y en quemaduras, que pueden ser tratadas concomitantemente con auto-injertos de piel en malla. Además, existen indicaciones de que la aplicación de injertos de queratinocitos cultivados suprime la formación de la cicatriz hipertrófica y la formación del queloide. Inicialmente, los auto-injertos fueron usados, los cuales fueron preparados por crecimiento de los queratinocitos aislados a partir de la propia piel del paciente. Los cultivos de queratinocitos confluentes (diferenciados) son entonces desprendidos de las placas de cultivo y aplicados como una lámina, con las células basales en dirección hacia abajo sobre la herida. Alrededor de 3 semanas son necesarias antes de que una cantidad razonable de queratinocitos pueda ser cultivada para su aplicación como un auto-injerto. Incluso entonces, la cantidad puede no ser suficiente para cubrir toda la superficie de la herida. Sin embargo, este período de tiempo puede ser crítico para el paciente, especialmente en el caso de las quemaduras extensivas de tercer grado.

Por lo tanto, fueron acometidos experimentos para aplicar los homo-injertos de queratinocitos. Los queratinocitos fueron aislados de la piel de una persona, cultivados para obtener láminas de queratinocitos confluentes, y luego aplicados sobre la herida de un paciente. Ninguna diferencia en la actividad de curación de la herida fue observada entre los auto- y homo-injertos. Una desventaja principal de los homo-injertos cultivados es el riesgo de transferir agentes patógenos tales como el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis B, y el citomegalovirus, de la piel donante al paciente aceptor.

Estas técnicas para el tratamiento de heridas hacen uso de injertos de queratinocitos frescos, que contienen queratinocitos proliferantes. Las láminas de queratinocitos son desprendidas del recipiente de cultivo por tratamiento con Dispasa e inmediatamente aplicadas sobre la herida. La capacidad de estas láminas en términos de tiempo y cantidad es un gran inconveniente de los injertos de queratinocitos frescos. Se asume que la proliferación de los cultivos de queratinocitos contienen una mayor actividad de curación de las heridas que los cultivos más diferenciados. Además, solamente un cultivo multi-capa puede ser desprendido como una lámina del recipiente de cultivo, y puede ser esparcida sobre la herida. Por lo tanto, los queratinocitos cultivados tienen que ser tomados en una fase de crecimiento óptima. Sin embargo, es imposible predecir cuando un paciente entrará al hospital y cuantos injertos de queratinocitos serán necesarios entonces. Otro inconveniente de usar las láminas de queratinocitos frescas (autólogas) es que es requerido aún un cierto período de tiempo antes de que una cantidad suficiente de láminas de queratinocitos puedan ser cultivadas y entonces aplicadas.

Los homo-injertos crio-preservados eluden parcialmente estos inconvenientes. Los injertos de queratinocitos crio-preservados pueden ser preparados como sigue: los cultivos de queratinocitos confluentes (diferenciados) son enjuagados con fosfato buffer salino (PBS), cultivados 1 día sin aditivos (factor de crecimiento epidérmico, insulina, toxina del cólera, triiodotironina, transferina, hidrocortisona), desprendidos de la placa por tratamiento con Dispasa y adheridos a un sustrato de transferencia (por ejemplo, Interface® Wuhrlin-Soplamed). Estas láminas son impregnadas en el medio de cultivo suplementado con 10% de DMSO como crioprotector, y almacenadas congeladas en nitrógeno líquido o por un período más corto de tiempo a -80°C. Antes de la aplicación, la muestra es descongelada y enjuagada con PBS para eliminar el DMSO y las proteínas del suero bovino. Estas láminas son aplicadas con las células basales en dirección hacia abajo como para las láminas frescas. Después de la descongelación, alrededor del 60% de las células son viables como fue apreciado a partir del teñido vital.

Inicialmente, fue asumido que los queratinocitos de los homo-injertos cultivados permanecen y crecen sobre las heridas, un evento que es clínicamente conocido como "take". Sin embargo, varios reportes demostraron recientemente que el cierre de las heridas es debido al crecimiento del epitelio hospedero.

Así, la curación es inducida sin la toma permanente de injertos de queratinocitos, sugiriendo que la actividad de curación de las heridas puede ser debida a una(s) sustancia(s) (química(s)) asociada(s) con los queratinocitos cultivados, que estimula el crecimiento exterior del queratinocito. Como consecuencia, no sería necesario aplicar láminas de queratinocitos viables. Por lo tanto, las láminas de queratinocitos cultivados fueron liofilizadas y la actividad de curación de las heridas fue comparada con las láminas criopreservadas y frescas.

Por lo tanto, el efecto beneficioso de las láminas de queratinocitos cultivadas en la curación de heridas puede ser probablemente atribuido a una(s) sustancia(s) presente(s) en el queratinocito cultivado o inducido por una(s)
molécula(s) presente(s) en los queratinocitos cultivados. Hasta la fecha el(los) factor(es) y su concentración en los queratinocitos cultivados son desconocidos. No puede ser excluido que ciertas citoquinas conocidas y factores de crecimiento estén presentes. Muchos factores de crecimiento conocidos, por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de transformación alfa (TGF-\alpha), el factor de crecimiento de transformación beta (TGF-\beta) influencian los queratinocitos y los fibroblastos de la piel. Por ejemplo, el TGF-\alpha, el EGF, y el FGF inducen la proliferación de queratinocitos. El TGF-\beta y el PDGF estimulan la síntesis de colágeno y otros componentes del tejido conectivo. La neovascularización puede estar influenciada por el TGF-\alpha y el FGF básico. Debido a estas propiedades, tales factores de crecimiento pueden jugar un papel en la curación de las heridas.

Los resultados clínicos mostraron que las láminas de queratinocitos cultivadas crio-preservadas y frescas estimulan la re-epitelización, resultando en una curación más rápida comparada con el tratamiento de heridas clásico o la aplicación de auto-injertos de piel en malla solamente. De acuerdo a los resultados de nuestro modelo animal para la curación de heridas, los queratinocitos cultivados liofilizados dieron mejores resultados que las láminas de queratinocitos.

El término "queratinocitos liofilizados" denota el producto obtenido a partir de queratinocitos humanos o animales, que han crecido in vitro al estado diferenciado, confluente, o sub-confluente, y luego un liofilizado de estas células es preparado de manera que no ocurra o que sea mínima la degradación de las sustancias asociadas a la célula. Tal liofilizado contiene actividad de curación de las heridas. Los extractos de células de estos queratinocitos cultivados también contienen actividad de curación de las heridas. Un extracto de célula puede ser preparado, por ejemplo, después de la lisis y/o disrupción de los queratinocitos cultivados y el fraccionamiento subsiguiente. El material total o las fracciones separadas pueden ser liofilizadas. La liofilización no es necesaria, pero es ventajosa ya que la sustancia resultante es más fácil para almacenar, puede ser mantenida en un lugar pequeño, es más fácil de manipular, puede ser aplicada en una formulación (por ejemplo, en un polvo seco, una pomada, una suspensión, una solución, un gel, una crema o una matriz sólida, natural o sintética, biocompatible) seleccionada de acuerdo a las circunstancias, puede ser administrada en una dosis óptima, normalmente tiene una vida media más larga, y puede ser fácilmente tamizada para la preparación más activa.

Una ventaja de los queratinocitos cultivados liofilizados es que el material está rápidamente disponible exactamente en el momento que es necesitado, en contraste con las láminas de queratinocitos cultivadas frescas. Antes de la aplicación sobre una herida, las láminas de queratinocitos frescas tienen que ser cultivadas durante un día sin suero fetal de ternero y aditivos tales como factor de crecimiento epidérmico, toxina del cólera, triiodotironina, transferina, etc. Subsiguientemente, las láminas tienen que ser eliminadas de las placas de cultivo con Dispasa, enjuagadas y transferidas a una habitación de operación de manera estéril. En el caso de las láminas crio-preservadas, el medio de almacenamiento, que contiene 10% de DMSO como crio-protector, es descongelado tan rápido como sea posible a 37°C y cuidadosamente enjuagado con PBS antes de que éste sea transferido a la habitación de operación. Los injertos de queratinocitos crio-preservados descongelados tienen que ser manipulados cuidadosamente ya que las láminas son extremadamente frágiles. Además de la necesidad de ajustes especializados, toma al menos 1 día para los injertos de queratinocitos frescos y alrededor de 1 h en el caso de los injertos de queratinocitos crio-preservados, antes de que ellos puedan ser aplicados sobre la herida. En contraste, el material de queratinocito liofilizado está instantáneamente disponible y puede ser aplicado como tal, o rehidratado en una solución de sal o gel estéril preparada previamente. Las sustancias derivadas de los queratinocitos liofilizados pueden ser aplicadas en la dosis óptima. En el caso de las láminas de queratinocitos, la herida es cubierta con una lámina y se asume que es inútil poner otra lámina encima.

Las diferencias entre los donantes juegan un papel en la actividad de los queratinocitos cultivados. La actividad de estimulación de la proliferación de los queratinocitos de las sustancias derivadas de los queratinocitos liofilizados es fácilmente probada in vitro. Los lotes más activos pueden ser seleccionados para el tratamiento al paciente. Los injertos de queratinocitos frescos no pueden ser probados y, en el caso de las láminas de queratinocitos crio-preservadas, la preparación del material requiere trabajo adicional.

Los extractos o fracciones de queratinocitos cultivados liofilizados son fáciles de almacenar. Una gran cantidad puede ser preparada de ante mano. Otra ventaja es que la actividad de estimulación del crecimiento de los queratinocitos puede ser probada in vitro para seleccionar las preparaciones más activas. Esto es obviamente imposible cuando son usadas las láminas de queratinocitos frescas. Además, las láminas frescas deben ser usadas en un momento óptimo y no pueden ser almacenadas para nada. Si no hay pacientes para tratar en ese momento óptimo del cultivo, las células pierden valor para ese propósito. Por otro lado, las láminas de queratinocitos crio-preservadas deben ser almacenadas en un recipiente de almacenamiento crio-biológico que contiene nitrógeno líquido. La provisión de los queratinocitos liofilizados puede ser mantenida a -20°C como polvo seco.

Los queratinocitos liofilizados no requieren medios de transportación especiales. Por el contrario cuando son desprendidos de la superficie de cultivo, los injertos de queratinocitos frescos y crio-preservados tienen que ser transportados en un medio buffer estéril, isotónico para prevenir el secado de los queratinocitos. Además, estos injertos de queratinocitos pueden ser desprendidos de la gasa soporte, y comenzar a flotar o encogerse, entorpeciendo el método exacto de aplicación, es decir, los queratinocitos basales en dirección hacia abajo. El material de queratinocito liofilizado es un polvo de peso ligero, simplemente mantenido en un frasco estéril. Es aconsejable re-hidratar y/o re-disolver el polvo en gel o en solución salina antes del uso. La preparación puede entonces ser mantenida por al menos 1 semana a 4°C sin pérdida de la actividad de estimulación de la proliferación de los queratinocitos. La sustancia re-hidratada puede tener mejor contacto con el tejido herido, favoreciendo de esta forma el proceso de curación.

Ya que la sustancia está completamente seca durante el almacenamiento, las proteinazas no están activas, por lo tanto se incrementa la vida media.

El propósito de la invención es proporcionar fracciones de células derivadas de cultivos de queratinocitos.

Otro propósito de la invención es proporcionar una sustancia para la curación de las heridas derivada de los queratinocitos humanos cultivados.

Otro propósito de la invención es proporcionar una sustancia derivada de los queratinocitos humanos cultivados que pueda tener aplicaciones cosméticas.

La invención se refiere a los cultivos de células de queratinocitos que están libres de fibroblastos no autólogos, libres de extractos de órganos, particularmente extractos pituitarios, y libres de células de queratinocitos translúcidas grandes planas, que tienen una velocidad de amplificación celular de al menos 1 división celular cada 2 días, particularmente de al menos 1 división cada 2.5 días, preferiblemente para una densidad de siembra mínima de 1 x 10^{4} células/cm^{2}, preferiblemente de 3 a 5 x 10^{4} células/cm^{2}.

"Extractos de órganos" designa extractos de cerebro bovino, y más particularmente extractos pituitarios.

Las células de queratinocitos translúcidas grandes son células epiteliales atípicas planas caracterizadas por citoplasmas filamentosos.

"Grandes" en la expresión "las células de queratinocitos translúcidas grandes planas" significa que a partir de las observaciones hechas en el microscopio de luz invertida, las células ocupan alrededor de 3-6 veces el área de superficie más grande en el cultivo que el tamaño normal de los queratinocitos en el medio de cultivo de la invención o que la mayoría de los queratinocitos en el factor de crecimiento epidérmico que contienen el cultivo libre de la toxina del cólera.

"Plana" en la expresión "las células de queratinocitos translúcidas grandes planas" significa que las células pueden ser reconocidas como menos gruesas que los queratinocitos normales obtenidos en el cultivo de la invención. Grosor significa grosor focal en el microscopio.

"Translúcida" en la expresión "las células de queratinocitos translúcidas grandes planas" significa que el citoplasma es menos denso bajo el microscopio de luz que los queratinocitos obtenidos en el medio de cultivo de la invención. En otras palabras, cuando más de alrededor del 75% de la luz pasa a través de la célula, ésta es una célula translúcida. Cuando menos de alrededor del 50% de la luz pasa a través de la célula, ésta es una célula de queratinocito normal.

El método para determinar la velocidad de amplificación celular es dado a continuación.

Por ejemplo, 100 células son sembradas en un medio de cultivo de la invención, como es definido a continuación. Las 100 son viables como se juzgó a partir de la prueba de viabilidad con azul tripán (es decir, las células viables excluyen el teñido, pero las células muertas son incapaces de hacer eso y son por lo tanto teñidas de azul). Solamente un cierto porcentaje de las células sembradas se unirán y propagarán. Estos dos últimos fenómenos, la unión y la propagación, son pre-requisitos para la división celular. La unión es el fenómeno donde las células se asientan a partir de una suspensión, y se unen al soporte. Las células mantienen aún una forma redonda en este momento. La propagación ocurre entonces: las células redondas pueden aplastarse y luego unirse a lo largo de una superficie grande sobre el soporte. Subsiguientemente, las células pueden dividirse, es decir, multiplicarse. Una célula madre da origen a 2 células hijas. Este proceso es llamado mitosis

La proliferación o multiplicación puede proceder, y el área de soporte se llenará con células. En ese momento, el cultivo es llamado confluente.

La velocidad de amplificación celular significa el tiempo de duplicación de la población celular.

El método para medir la amplificación celular es como sigue:

Cinco x 10^{4} células de exclusión con azul tripán son sembradas por cm^{2} en 6 placas de 35 mm de diámetro. Después de 3 días (es decir, el día 3) (todas las células que eran capaces de unirse han tenido entonces la oportunidad de unirse), tres placas de cultivo son enjuagadas para eliminar las células no unidas, que flotan. Las células unidas no se dividen todavía en este momento. Las mismas son eliminadas de la placa de cultivo por tratamiento con tripsina-EDTA (como para la preparación de sub-cultivos) y contadas en un hemocitómetro bajo el microscopio de luz. Por lo tanto, la cantidad total de células unidas es conocido. Por ejemplo, para las tres placas, un promedio de 50,000 células por placa pudieran ser obtenidas. Cuando los otros 3 cultivos alcanzan la confluencia después de 13 días (es decir, el día 13), los cultivos son enjuagados para eliminar eventualmente las células que flotan. Las células unidas son entonces eliminadas con tripsina-EDTA y contadas como anteriormente. Un promedio de 1.2 x 10^{6} células por placa es obtenido. Es conocido que 1 célula se divide en 2 células, Eso da: 50,000- ->100,000- -> 200,000- ->400,000
- ->800,000 y 1/2 división de 800,000- ->1,200,000. Así, ocurren 4.5 divisiones desde la confluencia (día 13) hasta el día en el que todas las células que eran capaces de unirse, se han unido (día 3), es decir, 4.5 divisiones en 10 días, lo que corresponde a una división cada 2.2 días.

Si la densidad es menor que 1 x 10^{4} células/cm^{2}, el crecimiento de las células puede ser tal que la confluencia pudiera no ser alcanzada.

Si la densidad es mayor que 5 x 10^{4} células/cm^{2}, la confluencia es alcanzada más rápidamente.

En una realización preferida de la invención, el cultivo contiene no más que alrededor de 10%, preferiblemente no más que alrededor de 7% de células de no-queratinocito autólogas tales como células de no-queratinocito, en forma de estrella, y contiene no más que alrededor de 1%, y preferiblemente no más que alrededor de 0.5% de fibroblastos autólogos.

De acuerdo a una realización ventajosa de la invención, el cultivo contiene células de no-queratinocitos no autólogas y fibroblastos no autólogos, y particularmente células de Langerhans no autólogas y melanocitos no autólogos.

El rango de proliferación (es decir el rango de división celular) de los queratinocitos es reducido en presencia de células de no-queratinocitos tal como células de Langerhans y/o melanocitos. Este es un efecto dependiente de la concentración. La población de las células unidas puede consistir de no más del 10% de estas células. Sin embargo, una capa de queratinocito confluente será indudablemente obtenida. Estas células de no-queratinocitos son células en forma de estrellas y juegan un papel inferior en los sub-cultivos de queratinocitos, ya que la mayoría no se propaga después de su transición por el sistema de la invención.

Las células de no-queratinocitos en forma de estrellas son, por ejemplo, células de Langerhans y melanocitos.

Si el cultivo contiene más que alrededor de 10% de células de no-queratinocitos autólogas, hay una inhibición aparente de la división celular de los queratinocitos al principio del cultivo (por ejemplo, durante la primera semana).

Después de la siembra, los cultivos no deben contener más que alrededor de 1% de fibroblastos autólogos de la cantidad total de células propagadas, debido a que ninguna lámina de queratinocitos confluente es obtenida si una gran cantidad de fibroblastos contamina el cultivo iniciado. Si la cantidad de los fibroblastos autólogos es mayor que alrededor de 1%, la superficie de cultivo es cubierta con una mono-capa que consiste de áreas de fibroblastos e islas de queratinocitos, que conduce a láminas de células no-cohesivas.

De acuerdo a otra realización preferida de la invención, el cultivo de la invención es tal que las células de queratinocitos son confluentes y localmente diferenciadas alrededor de 10 días después del inicio del cultivo de queratinocitos sembrados a una densidad tan baja como 1 x 10^{4} células/cm^{2}, pero preferiblemente de 3 a 5 x 10^{4} células/cm^{2}.

La expresión "confluente" indica que toda la superficie del recipiente de cultivo está cubierta de células. La mayoría de las células en tal cultivo han sido activamente proliferadas (es decir divididas). Sin embargo, en el caso de los queratinocitos en el cultivo de la invención, no está excluido que la diferenciación celular ocurra en ciertas áreas del cultivo, incluso antes de la confluencia.

Como "diferenciación", es reconocido cuando los queratinocitos que contienen gránulos de queratohialina son encontrados en el cultivo. Los gránulos de queratohialina son detectados como sigue. Los gránulos de queratohialina son reconocidos en secciones histológicas teñidas con hematoxilina-eosina de las láminas multi-capas de queratinocitos cultivadas. Los gránulos son vistos como manchas carmelitas en el microscopio de luz. Una vez que la superficie de cultivo es llenada con queratinocitos, es decir, es alcanzada la confluencia, las células proliferan adicionalmente resultando en láminas multi-capas, más gruesas. Las células en las capas superiores son así diferenciadas.

"Localmente diferenciadas" significa que la diferenciación ha ocurrido en ciertas áreas del cultivo, incluso antes de la confluencia.

En una realización preferida de la invención, las células no deben ser demasiado diferenciadas. Esto se debe a que el cultivo debe ser lo suficientemente fuerte para ser capaz de ser desprendido del soporte como una lámina, y esto requiere de un cultivo cohesivo multi-capas. Tal cultivo cohesivo multi-capas contiene muchas células de queratinocitos con gránulos de queratohialina y es, por lo tanto, diferenciado.

"Cohesivo" significa que las células permanecen unidas.

El término "lámina" se refiere a un cultivo de queratinocitos confluente, fresco o crio-preservado, que es desprendido intacto de la placa de cultivo o por tratamiento con Dispasa y que puede ser aplicado sobre la herida de un paciente, tanto inmediatamente en el caso de la lámina de queratinocitos fresca o después de la descongelación en el caso de la lámina crio-preservada. Un tipo de lámina preferida es un injerto de queratinocito crio-preservado que puede ser preparado como se describió anteriormente.

Es apropiado para hacer una lámina usar cultivos de células de queratinocitos que no son blancos y que no contienen burbujas en ninguna parte, lo cual es característico de una "etapa demasiado diferenciada". Cuando las láminas son demasiado diferenciadas, pudiera no haber casi proliferación en el cultivo, y además, las propiedades de curación de las heridas pudieran ser menos óptimas. Cuando las láminas son demasiado diferenciadas, ellas pueden ser desprendidas del soporte sin enzima, mientras que cuando las láminas confluentes son menos diferenciadas, es necesario usar una enzima tal como la Dispasa (obtenida, por ejemplo, de Boehringer Mannheim).

De acuerdo a una realización preferida de la invención, el cultivo de las células de queratinocitos puede ser sub-cultivado en 8 pasos, y preferiblemente en 6 pasos, sin pérdida de diferenciación, con una proporción de división de 1/4 a 1/2, preferiblemente de 1/3.

Debe ser recalcado que un sub-cultivo es un cultivo madre a partir del cual un primer cultivo derivado es llevado a cabo por tripsinización (eliminar células del soporte y separar células que están unidas para obtener una suspensión de células separadas), y sembrando las células suspendidas en X placas (X definido después), de dicho cultivo derivado, un segundo cultivo derivado es llevado a cabo, con el número total de cultivos derivados que representa el número de sub-cultivos.

La expresión "proporción de división" de 1/X se refiere al hecho de que, del total de un cultivo madre, es posible sembrar y obtener confluencia y diferenciación en X placas Petri.

La invención también se refiere al cultivo de queratinocitos tal como aquel obtenido por un proceso que comprende los siguientes pasos:

-: sembrar las células de queratinocitos sobre un soporte a una densidad tan baja como 1 x 10^{4} células/cm^{2}, preferiblemente de 3 a 5 x 10^{4} células/cm^{2} en un medio de cultivo que contiene un medio basal, el mismo conteniendo Medium 199, con los siguientes aditivos: suero, factor de crecimiento epidérmico, hidrocortisona y/o toxina del cólera, y posiblemente insulina, libre de fibroblastos no autólogos, y libre de extractos de órganos, particularmente extractos pituitarios; y

-: cultivar tales células a una temperatura de 37°C en una atmósfera saturada de agua que contiene CO_{2}, preferiblemente en el rango de alrededor de 1% a alrededor de 10%, más particularmente en el rango de alrededor de 2% a alrededor de 8%.

La invención además se refiere a los extractos de cultivos de queratinocitos de acuerdo a la invención, posiblemente en forma liofilizada. Tales extractos pueden ser formados de una manera convencional a partir de los cultivos.

El término "extracto" se refiere a un producto celular obtenido a partir de los queratinocitos humanos o animales que han crecido in vitro hasta la confluencia y que han mantenido su actividad de curación de las heridas. Un extracto celular puede ser preparado, por ejemplo, después de la lisis y/o disrupción de los queratinocitos cultivados y el subsiguiente fraccionamiento, y las fracciones diferentes pueden ser liofilizadas como se describió anteriormente. Tales liofilizados pueden ser aplicados como un polvo seco, en una pomada, en una suspensión, en una solución, en un gel, en una crema o en una matriz sólida, natural o sintética, biocompatible, seleccionada de acuerdo a las circunstancias y administradas en una dosis óptima.

La invención además se refiere a una composición farmacéutica que contiene, como una sustancia activa, un extracto como se definió anteriormente, que está preferiblemente en forma liofilizada y que puede ser usado para promover la curación de las heridas superficiales, por ejemplo de la piel, tal como la piel humana. La preparación farmacéutica preferiblemente comprende el extracto liofilizado en una formulación apropiada para la aplicación en heridas superficiales. Tal formulación puede ser aplicada directamente a una herida superficial tanto como un polvo seco o en forma de un gel, una crema, una pomada, una suspensión, una solución, o una matriz sólida, natural o sintética, biocompatible, cualquiera de las cuales puede ser preparada de una manera convencional, si se desea con aditivos y excipientes farmacéuticamente aceptables, convencionales. Normalmente, el extracto liofilizado está incorporado en tal composición en una concentración que es una función del tipo de la herida superficial a ser curada y las circunstancias, bajo las cuales la composición es usada. Por ejemplo, un extracto celular liofilizado de esta invención puede ser aplicado a una concentración, tal que la cantidad de sustancia activa para curar la herida, por cm^{2}, sea equivalente a la cantidad de Sustancia activa encontrada en alrededor de 10^{3} - 10^{7} de queratinocitos vivos, preferiblemente en 10^{4} - 10^{6} de queratinocitos vivos, especialmente en 5 x 10^{4} - 5 x 10^{5} de queratinocitos vivos. (debe ser entendido, por supuesto, que uno no puede medir directamente cuanta sustancia activa está presente en un cultivo de células vivas; así, la sustancia activa ha sido descrita con referencia a la cantidad de sustancia activa presente en una cantidad de células de queratinocitos).

Ejemplos de tipos de heridas superficiales que pueden ser tratadas con la composición farmacéutica de esta invención incluyen:

-: heridas de la piel por quemaduras inducidas por radiación y electricidad, químicas, térmicas; las heridas por quemaduras cubiertas con auto-injertos de piel en malla se beneficiarían también con las preparaciones de queratinocitos de esta invención, las que estimulan el cierre de los intersticios de la piel en malla;

-: heridas mecánicas de grosor total o grosor parcial tales como incisiones, abrasiones y laceraciones; estos tipos de heridas incluyen también heridas en la piel por escisión y quirúrgicas;

-: ulceraciones varias de la piel, tal como úlceras arteriales o venosas, decúbito, y úlceras causadas por enfermedades implícitas como diabetes y vasculitis;

-: heridas de la córnea;

-: lesiones de la membrana timpánica; y

-: lesiones debidas a condiciones patológicas tales como pemphigoid bullar, epidermolisis bullosa y lupus eritematoso.

Esta invención además se refiere a un proceso para promover la curación de una herida superficial (por ejemplo en la piel, por ejemplo piel humana), aplicando la composición farmacéutica de esta invención a la superficie de la herida.

La invención también se refiere a un proceso para preparar un cultivo de células de queratinocitos libre de fibroblastos no autólogos y libre de extractos de órganos, particularmente extractos pituitarios que comprende:

-: células de queratinocitos sembradas en un soporte a una densidad tan baja como 1 x 10^{4} células/cm^{2}, preferiblemente de 3 a 5 x 10^{4} células/cm^{2} en un medio de cultivo que contiene un medio basal, el mismo conteniendo Medium 199, con los siguientes aditivos: suero, factor de crecimiento epidérmico (EGF), hidrocortisona y/o toxina del cólera, y posiblemente insulina, libre de fibroblastos no autólogos, y libre de extractos de órganos, particularmente extractos pituitarios; y

Para obtener una lámina de células, es necesario sembrar los queratinocitos en un soporte. El soporte puede ser plástico o cualquier soporte natural (por ejemplo, colágeno o dermis des-epitelizada), semi-sintético (por ejemplo, plástico recubierto con fibronectina) o sintético (por ejemplo, poliuretano), que permita el crecimiento celular.

En los ejemplos, los resultados son dados en relación al papel del EGF, la toxina del cólera, la hidrocortisona, y la insulina en el crecimiento in vitro de los queratinocitos libres de capa alimentadora.

El Medium 199 de este proceso es descrito en el catálogo Belga de Gibco BRL Life Technologies (1991) en la página 46. El Medium 199 puede ser reemplazado por el medio CMRL 1066 (catálogo Belga de Gibco BRL Life Technologies, página 39, 1991) o por el medio Williams E. (Medio William E: catálogo Belga de Gibco BRL Life Technologies, página 62, 1991) o una combinación de ambos.

El suero de este proceso contiene albúmina de suero bovino (BSA), pero preferiblemente, BSA adicional es adicionada de manera que la concentración total de BSA en el medio de cultivo no sea menor que alrededor de 0.5 g/l. El suero fetal bovino contiene 13-29 g de albúmina de suero por litro; por lo tanto, para una concentración de 10% de suero fetal bovino en 1 litro del medio de cultivo, habrán 1.3-2.9 g de albúmina de suero, y en el caso que 1 g de albúmina de suero bovino sea adicionado por litro, habrá 2.3 g - 3.9 g de albúmina de suero en 1 l del medio de cultivo. En caso que el 10% de suero sea adicionado al medio, la BSA adicional tiene poca influencia.

De acuerdo a otra realización de la invención, el medio de cultivo para el proceso puede ser modificado durante el proceso. Por ejemplo, es posible usar un primer medio de cultivo que contiene la toxina del cólera como aditivo y subsiguientemente usar un segundo medio de cultivo que contiene factor de crecimiento epidérmico, hidrocortisona, y toxina del cólera como aditivos. De acuerdo a otra realización preferida del proceso, el medio de cultivo contiene Medium 199, suero y los tres componentes siguientes: hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico, y toxina del cólera.

La invención también se refiere a un proceso donde el medio de cultivo es tal que

-: el medio basal contiene:

\bullet: alrededor de 20% a alrededor de 100% (p/v) de Medium 199, con dicho medio estando expuesto a ser reemplazado hasta el 80%, preferiblemente hasta el 75%, por otro medio de cultivo basal tal como el medio MEM,

-: el suero en el medio de cultivo está contenido a una concentración de alrededor de 2% a alrededor de 25%, particularmente de alrededor de 4% a alrededor de 15% (v/v), más particularmente 10%, con dicho suero siendo preferiblemente suero fetal, o suero de recién nacido, particularmente suero fetal de ternero;

-: la hidrocortisona en el medio de cultivo está contenida a una concentración de 0 a alrededor de 4 \mug/ml, particularmente de alrededor de 0.01 \mug/ml a alrededor de 2 \mug/ml, preferiblemente de alrededor de 0.1 a alrededor de 0.8 \mug/ml, más preferiblemente 0.4 \mug/ml,

-: el factor de crecimiento epidérmico en el medio de cultivo está contenido a una concentración de alrededor de 1 a alrededor de 100 ng/ml, particularmente de alrededor de 1 a alrededor de 50 ng/ml, preferiblemente de alrededor de 3.3 a alrededor de 20 ng/ml, más preferiblemente 10 ng/ml,

-: la toxina del cólera en el medio de cultivo está contenida a una concentración de 0 a alrededor de 80 ng/ml, particularmente de alrededor de 1 a alrededor de 50 ng/ml, preferiblemente de alrededor de 3 a alrededor de 18 ng/ml, más preferiblemente 9 ng/ml,

-: la insulina en el medio de cultivo está contenida a una concentración de 0 a alrededor de 30 \mug/ml, particularmente de alrededor de 1 a alrededor de 10 \mug/ml, por ejemplo 5 \mug/ml. La concentración del medio basal en el medio de cultivo es de alrededor de 80% a alrededor de 98%.

En el medio basal, si hay menos que 20% de Medium 199, es posible que el crecimiento sea más lento y las células soportan menos de 8 pasos.

La invención también se refiere a un proceso donde el medio de cultivo está libre de extracto de cerebro bovino, triiodotionina, transferina, fracción de Cohn humana V, y adenina excepto de la adenina contenida en el Medium 199.

La invención también se refiere a un proceso donde el medio de cultivo está libre de etanolamina, selenita, putrescina, y fosfoetanolamina.

La invención también se refiere a un proceso para preparar un cultivo de células de queratinocitos confluente donde el proceso usado es de acuerdo a la invención y que comprende los siguientes pasos:

-: cambiar el medio de cultivo de las células al menos alrededor de cada 4 días, preferiblemente después de dos días, y

-: detener el crecimiento del cultivo después de un tiempo suficiente para obtener un cultivo multi-capas cohesivo confluente colocando las células en un medio de supervivencia durante un tiempo suficiente para que ellas rechacen los aditivos antes mencionados, con dicho medio de supervivencia siendo tal que las células puedan mantenerse vivas, pero donde no exista estimulación para la profileración y diferenciación de las células, con dicho medio siendo, por ejemplo, el medio de cultivo de acuerdo a la invención preferiblemente sin contener suero, y preferiblemente sin BSA adicional, sin factor de crecimiento epidérmico, sin hidrocortisona, sin toxina del cólera y sin insulina, o siendo cualquier otro medio basal o una mezcla de cualquier medio basal,

-: lavar las células para eliminar el medio de supervivencia antes mencionado, por ejemplo con PBS.

Ninguna estimulación para la proliferación significa que ellas pueden proliferar por sí mismas pero que no son externamente forzadas.

Un ejemplo de un medio basal que es usado como un medio de supervivencia puede ser DMEM-F12.

El medio de cultivo es cambiado cada 4 días para reemplazar los nutrientes que han sido usados y eliminar los metabolitos producidos por el cultivo de las células.

El crecimiento del cultivo es detenido generalmente después de alrededor de 10 días, preferiblemente 11 días, para obtener un cultivo multi-capas cohesivo confluente.

Las células son generalmente colocadas en un medio de supervivencia durante alrededor de 1 o 2 días, para liberarse de los aditivos antes mencionados. Ellas son colocadas por más de 2 días en un medio de supervivencia, ellas pueden sufrir de una pérdida de nutrientes.

Cuando las células son lavadas, ellas están listas para su uso directo en las heridas o para la liofilización o crio-preservación.

El DMEM-F12 es descrito en el catálogo Belga Gibco BRL Life Technologies (1991) en la página 41.

Preferiblemente no hay suero para evitar las reacciones inmunológicas debidas a la presencia de sustancias no humanas.

La invención también se refiere a un proceso para preparar un cultivo de células de queratinocitos diferenciadas y confluente donde el proceso usado está de acuerdo a la invención y comprende los siguientes pasos:

-: cambiar el medio de cultivo de las células al menos alrededor de cada 4 días, y

-: detener el crecimiento del cultivo después de alrededor de 21 días colocando las células en un medio de supervivencia durante alrededor de 1 a 2 días donde las células pueden mantenerse vivas, pero donde no exista estimulación para la profileración y diferenciación de las células, con dicho medio siendo, por ejemplo, el medio de cultivo de acuerdo a la invención preferiblemente sin contener suero ni BSA adicional, y sin factor de crecimiento epidérmico, sin hidrocortisona, sin toxina del cólera y sin insulina, o siendo cualquier otro medio basal o una mezcla de cualquier medio basal o siendo DMEM-F12,

-: lavar las células eliminadas del medio antes mencionado, por ejemplo con PBS.

La invención también se refiere a un proceso donde dichas células son recubiertas en forma de láminas después de ser desprendidas del soporte, por ejemplo por medio de Dispasa.

La invención también se refiere a un proceso para preparar células de queratinocitos en una forma liofilizada, donde las células, después de ser obtenidas de acuerdo a esta invención como se describió anteriormente y entonces lisiadas (por ejemplo por medio de una solución hipotónica), desprendidas del soporte (por ejemplo por medios mecánicos), recogidas, y posiblemente sonicadas, son congeladas a una temperatura de alrededor de -20°C a alrededor de -196°C, preferiblemente a alrededor de -40°C, y son luego liofilizadas al vacío para dar una sustancia seca que constituye el liofilizado. Alternativamente, las células pueden ser primero desprendidas del soporte (por ejemplo por medios mecánicos o por tratamiento con Dispasa), subsiguientemente lisiadas (por ejemplo por medio de una solución hipotónica o por sonicación) y luego liofilizadas.

Un ejemplo de una solución hipotónica puede ser PBS diluido diez veces con agua.

Las células pueden ser desprendidas del soporte por ejemplo raspando, por ejemplo con un rubber policeman.

Las ventajas de la sonicación es que por rompimiento las células se abren, el contenido de la célula es liberado.

La invención también se refiere a un proceso para preparar extractos de cultivos de queratinocitos, donde las células son obtenidas de acuerdo a la invención, donde las células, después de ser lisiadas (por ejemplo por medio de la solución hipotónica), desprendidas del soporte (por ejemplo por medios mecánicos) y recogidas, son sonicadas y centrifugadas para dar:

-: un sobre-nadante que contiene moléculas que son solubles en la solución hipotónica, posiblemente conteniendo sustancias que han sido desprendidas de la membrana celular por sonicación y

-: un gránulo que contiene la membrana celular y nucleica,

: y donde el sobre-nadante o el gránulo es recuperado y posiblemente congelado y liofilizado.

La técnica de la invención para preparar el material liofilizado a partir de los cultivos de queratinocitos esencialmente comprende los pasos de:

-: usar cultivos de queratinocitos confluentes a diferenciados, primarios o de transición, creciendo libres, de capa alimentadora, como fuente,

-: enjuagar los cultivos con PBS, raspar las células de la superficie de cultivo con un rubber policeman,

-: lisis de las células por shock hipotónico y/o sonicación,

-: liofilización para obtener el liofilizado total, o preparación de las fracciones de células por centrifugación, y la subsiguiente liofilización de las fracciones de gránulos y del sobre-nadante.

Para obtener extractos estériles, el proceso puede ser llevado a cabo bajo condiciones estériles. Alternativamente, los extractos pueden ser esterilizados después de la liofilización, por ejemplo por luz ultravioleta o irradiación de rayos gamma. Si es necesario, los extractos pueden subsiguientemente ser rehidratados y/o reformulados como un gel, crema, pomada, etc, por ejemplo re-disolviendo los extractos en un gel miscible en agua o una solución salina.

La invención también se refiere a un proceso para preparar cultivos crio-preservados de queratinocitos donde las células son obtenidas de acuerdo a la invención, y donde las células son colocadas en un medio frío, preferiblemente isotónico y buffer, a una temperatura de alrededor de 0 a alrededor de 15°C, con dicho medio conteniendo suero impidiendo que las células sean dañadas por congelación y posiblemente evitando la toxicidad del crio-protector que es posteriormente adicionado a dicho medio frío para evitar dañar las células, y donde las células son congeladas a una temperatura de -20°C a alrededor de -196°C, preferiblemente a -70°C, después de lo cual las células son colocadas en nitrógeno líquido.

En la expresión "medio frío", "frío" significa que la temperatura debe ser menor que 37°C y preferiblemente entre 0 y 15°C.

Un ejemplo de tal medio es una solución buffer isotónica y está constituida por cualquier medio basal al cual 10% de suero y 10% de crio-protector son adicionados tal como DMSO o glicerol o una mezcla de DMSO y glicerol.

La crio-preservación en el medio sin suero da como resultado más daño por congelación. Si no hay suero, sólo pocas células viables son recubiertas y las láminas de células caerán en pedazos.

La invención también se refiere a un proceso para preparar cultivos crio-preservados donde las células son obtenidas de acuerdo a la invención, y comprende los siguientes pasos:

-: cambiar el medio de cultivo de las células al menos alrededor de cada 4 días y

-: detener el crecimiento del cultivo después de alrededor de 21 días colocando las células en un medios de supervivencia donde las células pueden mantenerse vivas, pero donde no existe estimulación para la profileración y diferenciación de las células, con dicho medio siendo, por ejemplo, el medio de cultivo de acuerdo a la invención conteniendo posiblemente suero, y posiblemente BSA adicional e insulina, pero sin factor de crecimiento epidérmico, sin hidrocortisona y sin toxina del cólera, o cualquier otro medio basal o siendo DMEM-F12,

-: lavar las células para eliminar el medio antes mencionado, por ejemplo con PBS, y

-: recuperar las células en forma de láminas las cuales son desprendidas del soporte de cultivo y donde las láminas de células son colocadas en un medio frío, preferiblemente isotónico y buffer, a una temperatura de alrededor de 0°C a alrededor de 15°C, con dicho medio conteniendo suero impidiendo que las células sean dañadas por congelación y posiblemente evitando la toxicidad del crio-protector que es posteriormente adicionado a dicho medio frío de dañar las células y las láminas de células, y donde las láminas de células son congeladas a una temperatura de -20°C a alrededor de -196°C, preferiblemente a -70°C.

Las láminas de células son luego colocadas en nitrógeno líquido.

La invención también se refiere a un medio de cultivo que contiene un medio basal, el mismo conteniendo Medium 199, con los siguientes aditivos: suero, factor de crecimiento epidérmico, toxina del cólera y/o hidrocortisona, y posiblemente insulina, y libre de fibroblastos no autólogos y libre de extractos de órganos, particularmente extractos pituitarios.

La invención también se refiere a un medio de cultivo que contiene Medium 199 como un medio basal y como aditivos: suero, y al menos dos de los siguientes tres componentes hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico, toxina del cólera y posiblemente insulina.

La invención también se refiere a un medio de cultivo que contiene un medio basal, el mismo conteniendo Medium 199, suero y los siguientes componentes: hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico, y toxina del cólera, y posiblemente insulina.

Un medio preferido de la invención contiene:

\bullet: alrededor de 20% a alrededor de 100% (w/v) de Medium 199, con dicho medio siendo expuesto a ser reemplazado hasta el 80%, y preferiblemente hasta el 75%, por cualquier otro medio de cultivo basal tal como medio MEM,

-: el suero en el medio de cultivo está contenido a una concentración de alrededor de 2% a alrededor de 25%, particularmente de alrededor de 4% a alrededor de 15% (v/v), más preferiblemente 10%, con dicho suero siendo preferiblemente suero fetal, o suero de recién nacido, particularmente suero fetal de ternero,

\newpage

-: la hidrocortisona en el medio de cultivo está contenida a una concentración de 0 a alrededor de 4 \mug/ml, particularmente de alrededor de 0.01 a alrededor de 2 \mug/ml, preferiblemente de alrededor de 0.1 a alrededor de 0.8 \mug/ml, más preferiblemente 0.4 \mug/ml,

-: la insulina en el medio de cultivo está contenida a una concentración de 0 a alrededor de 30 \mug/ml, particularmente de alrededor de 1 a alrededor de 10 \mug/ml, por ejemplo 5 \mug/ml.

Los cultivos de queratinocitos de la invención presentan propiedades de curación de las heridas.

La estimulación de la proliferación de queratinocitos in vitro es una propiedad de la preparación derivada de queratinocitos. Sin embargo, no está excluido que una menor cantidad de inhibidores pueda estar presente.

Las investigaciones han sido llevadas a cabo en un modelo animal. Las heridas de grosor total fueron tratadas con sustancias de queratinocitos liofilizadas re-naturalizadas (es decir, extractos de células y liofilizado total), tratamiento clásico de heridas, y aplicación del conocido factor de crecimiento TGF-\alpha, el cual puede ser producido por queratinocitos cultivados. Las heridas de grosor total, que se extienden hacia la hipodermis, están entre las más difíciles de curar.

La actividad de estimulación del material de queratinocitos sobre el crecimiento de las células epiteliales es conocido. Sin embargo, no está claro si los queratinocitos cultivados contienen sustancias que pueden inhibir ciertas fases del proceso de curación de heridas. Esto puede ser dilucidado en heridas de grosor total.

Criterios rigurosamente definidos fueron usados para describir la curación de heridas clínicamente e histológicamente. Un criterio importante es el tiempo requerido para el cierre de la herida. Además, la calidad de la piel curada es de suma importancia. Mientras más el tejido la de la cicatriz se semeje a la piel sana histológicamente, la calidad es mejor. Puede ser concluido que las sustancias derivadas de queratinocitos de la invención contienen actividad de curación de las heridas. El liofilizado total dio como resultado una curación rápida y una cicatriz cualitativamente mejor, comparada con los controles y con el efecto de las láminas de queratinocitos frescas o crio-preservadas, el TGF-\alpha, y el tratamiento clásico con Duoderm®.

Leyenda de las figuras

La figura 1 representa la piel sana de un cerdo (amplificación: 900 x).

Esta figura muestra claramente la presencia de puentes intercelulares y de diferentes capas de células en la epidermis (estrato basal, estrato espinoso, estrato granuloso, estrato córneo).

También muestra que no hay desprendimiento entre la epidermis y la dermis y también muestra la presencia de haces de colágeno en los pars reticulata de la dermis (parte inferior de la figura). Los capilares sanguíneos en la dermis están ordenados en grupos.

La figura 2 representa un tejido cicatrizado en la piel de cerdo 91 días después de la herida. Hasta el cierre de la herida, la herida fue tratada con los queratinocitos cultivados liofilizados de la invención. La figura muestra la presencia de puentes intercelulares, la unión entre la epidermis y la dermis y la presencia de haces de colágeno. También muestra la presencia de delgados haces de colágeno. La epidermis contiene las diferentes capas de células. Amplificación: 900 x.

La figura 3 representa una amplificación inferior (amplificación: 200 x) de la piel de cerdo, 84 días después de la herida y tratada con Duoderm® hasta el cierre de la herida.

Esta figura muestra que no hay puentes intercelulares y que hay desprendimiento entre la epidermis y la dermis. Los haces de colágeno y los capilares sanguíneos no pueden ser evaluados en esta figura debido a la baja amplificación.

Ejemplo 1 Fuente de piel y aislamiento de los queratinocitos

Los queratinocitos humanos son aislados de muestras de piel quirúrgica (prepucio, mamoplastias, piel abdominal, y otras localizaciones en el cuerpo), y de la piel del cadáver.

La piel es eliminada con un dermatomo a un grosor de hasta 1 mm. Los pedazos más gruesos de piel, algunas veces conteniendo hipodermis, son usados también. La piel es inmediatamente colocada en una solución de fosfato de buffer salino (PBS): 8g de NaCl, 0.2 g de KCl, 3.1 g de Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}O, 0.2 g de KH_{2}PO_{4} en agua Milli-Q a 1 L; pH 7.4) y mantenida a 4°C. Las muestras son luego transferidas al laboratorio de cultivo dentro de 4 h. La piel es enjuagada extensivamente con PBS conteniendo 100 U/ml de penicilina, y 100 mg/ml de estreptomicina. Si es necesario, las muestras de piel son almacenadas a 4°C en solución A, la cual es una solución buffer isotónica que contiene 30 mM de Hepes, 10 mM de glucosa, 3mM de KCl, 130 mM de NaCl, 1 mM de Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}O y 3.3 mM de rojo de fenol. Los pedazos delgados de piel pueden ser almacenados durante alrededor de 16 h, los pedazos más gruesos durante alrededor de 4 días.

El tejido graso es eliminado lo más posible. La piel es cortada en pedazos pequeños de aproximadamente 0.5 x 0.5 cm y flotados en solución de tripsina (0.25% de tripsina Sigma en Solución A). El procedimiento depende del grosor de la muestra de piel. La piel en malla es tripsinizada durante alrededor de 20 min a 37°C, mientras que la piel gruesa es tripsinizada durante alrededor de 16 h a 4°C.

La epidermis es eliminada de la dermis usando fórceps. La epidermis es luego suspendida pipeteando hacia arriba y hacia abajo y pasando a través de una aguja de inyección (21 G, 0.8 x 50). Un procedimiento alternativo es raspar el lado basal de la epidermis eliminada para recoger las células basales. El tejido edipérmico suprabasal remanente es desechado. La parte superior de la dermis contiene aún numerosos queratinocitos basales pero también fibroblastos y es por lo tanto raspada suavemente, pero sólo una vez. La triptinisación es detenida mediante la adición de 10% de suero fetal de ternero. La suspensión de células es luego filtrada a través de una gasa estéril (Perlon P6, 63 mm) y centrifugada a una baja velocidad (120 g por 8 min).

Conteo de células

Los 0.2 ml de la suspensión de células son mezclados con 0.1 ml de solución azul tripán (0.4% en 0.85% solución salina; Flow Laboratories). Alrededor de 3 min después las células son contadas en un hemocitómetro (cámara Neubauer). Las células teñidas de azul están muertas, mientras que las no teñidas son viables.

Cultivo de queratinocitos humanos

Las células son resuspendidas en el medio de cultivo y sembradas en una placa petri plástica (100 mm diámetro, Becton Dickinson) a una densidad de 5 x 10^{4} células viables/cm^{2}. Las células son cultivadas en una incubadora a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO_{2} en aire.

Un litro del medio de cultivo (pH = 6.9-7.4, preferiblemente = 7.1) consiste de 2.78 g de Medium 199 (Gibco; con sales de Hank, con glutamina, sin NaHCO_{3}), 8.03 g de Medio Esencial Mínimo (Gibco; con sales de Hank, con glutamina, sin NaHCO_{3}), 1.3 g de NaHCO_{3} (Sigma), 1 g de albúmina bovina (Sigma), 5 mg de insulina de páncreas bovino (Sigma), 50 mg de glutamina (Sigma), 9 \mug de toxina del cólera (Sigma), 100 mg de estreptomicina sulfato (Gibco), 100,000 U de penicilina (Gibco), 10 \mug de factor de crecimiento epidérmico (Gibco), 0.4 mg de hidrocortisona (Sigma), 10% de suero fetal de ternero inactivado con calor (56°C, 30 min) (Gibco). El medio es preparado en agua Milli-Q (Millipore) y esterilizado por filtración (Millipore).

El medio de cultivo es cambiado 3 días después y subsiguientemente cada 2 a 3 días. El cultivo es confluente después de 10 - 16 días. Las láminas más gruesas, conteniendo 3-5 capas de células, son consideradas diferenciadas y son obtenidas después de alrededor de 20 días de cultivo. Los queratinocitos de cerdo son aislados y cultivados por la misma técnica.

Sub-cultivo

El cultivo de queratinocitos sub-confluente es enjuagado tres veces con PBS y cubierto con tripsina (0.05%) y EDTA (0.02%) en solución salina de Puck modificada (Gibco). Cuando las células son desprendidas, ellas son recogidas y centrifugadas a 120 g por 8 min. Las células granuladas son resuspendidas en el medio de cultivo. La proporción de división es 1:3.

Preparación del liofilizado total y de los extractos de células

Los cultivos sub-confluentes, confluentes, y los llamados diferenciados son usados como fuente. Veinticuatro horas antes de que el cultivo sea detenido, el cultivo es enjuagado 3-4 veces con PBS, y DMEM/F12 (Gibco) es adicionado sin aditivos o suero fetal de ternero. Al día siguiente, los cultivos son lavados dos veces con PBS y la placa es recubierta con 5 ml de PBS 1/10 estéril (PBS diluido 10 veces con agua Milli-Q). Cinco minutos más tarde, las células son raspadas con un rubber policeman y recogidas en un tubo Falcon de 50 ml (Becton Dickinson). La placa es enjuagada dos veces con 5 ml de PBS 1/10 en total. Esta solución es adicionada al tubo Falcon. El tubo es suavemente agitado durante 5 minutos y congelado a -30°C. Las muestras son liofilizadas dentro de 24 h. El material liofilizado es almacenado en el tubo Falcon a -30°C.

El extracto de células es preparado de la misma fuente de queratinocitos cultivados. Las células son raspadas con un rubber policeman en PBS o PBS hipotónico (PBS 1/10 en agua Milli-Q). La suspensión es sonicada (15 seg, 3 veces) o ultra homogenizada (13500 rpm, 3 veces 15 seg en baño de hielo); Ultra-turrax T25® Janke & Kunkel, IKA, Labortechnick, Alemania) y subsiguientemente centrifugada a 10000 g durante 30 min a 4°C. El gránulo y el sobre-nadante resultante son liofilizados de manera separada y almacenados a -30°C.

El tratamiento de los queratinocitos cultivados con Dispasa (12 U por placa petri de 10 cm de diámetro durante alrededor de 15 min a 37°C; Boehringer) seguido de 3 lavados con PBS es un paso adicional el cual puede ser introducido antes de que las células sean raspadas de la placa. Tal tratamiento no influye en la actividad de los queratinocitos.

El liofilizado es esterilizado bajo luz ultravioleta bactericida (15 min, a una distancia de alrededor de 50 cm de la fuente de luz).

Preparación del gel

0.2 g de Idroramnosan (Federa, Bruselas) son disueltos en 10 ml de NaCl al 0.9% o en agua Milli-Q. La esterilización es llevada a cabo por en un autoclave 40 min a 120°C.

Redisolución de la sustancia liofilizada

Antes de la aplicación sobre una herida la sustancia liofilizada es re-hidratada y/o re-disuelta. La cantidad de queratinocitos cultivados esterilizados obtenidos de una placa petri es mezclada de manera estéril con 1.5 ml del gel, antes de la aplicación sobre la herida.

Modelo animal para la curación de las heridas

El objetivo de los experimentos in vivo es averiguar si el material derivado de los queratinocitos liofilizados contiene actividad de curación de las heridas y si esta actividad es mejor o no que la obtenida con las láminas de queratinocitos frescas, las láminas de queratinocitos crio-preservadas, el tratamiento clásico de heridas con Duoderm® (ConvaTec Squibb) o TGF-\alpha, que es un factor de crecimiento de queratinocitos conocido. El material de queratinocitos liofilizado fue re-hidratado en gel antes de la aplicación.

El cerdo doméstico fue seleccionado como animal experimental ya que las características histológicas de su piel son similares a aquellas de la piel humana: ejemplos de esto incluyen el grosor relativo de la epidermis y la dermis, el esparcido relativo del vello, y la presencia de tejido adiposo subcutáneo.

Los cerdos hembra y macho adultos jóvenes, que pesan alrededor de 60 kg, son pre-tratados con Stresnil® (intramuscular, 40 mg/20 kg; Janssen), anestesiados con Hypnodil® (intravenosa, 75 mg/20 kg; Janssen) y mantenidos bajo anestesia con Fluothane® (ICI). Después de afeitar el lomo, la piel es desinfectada con Hibiscrub® (ICI) e Isobetadina dérmica (Asta Medica, Bruselas). Heridas quirúrgicas, 3 x 3 cm, son inducidas en el lomo cerca de la espina dorsal. La distancia entre los bordes de las heridas es de 5 cm. Una hilera de 6 heridas es hecha en la parte izquierda, y una hilera de 6 a la derecha de la espina dorsal. Las heridas son tratadas con las sustancias listadas abajo, cubiertas con un vendaje oclusivo (Tegaderm® 3M u Opsite® Smith and Nephew), y fijadas mediante el vendaje Fixomull® (Beiersdof). Finalmente, el tronco es envuelto con un vendaje elástico no adhesivo. Al cerdo se le permite recuperarse en su cochiquera. Las heridas son inspeccionadas cada 4 o 5 días. Es aplicado material nuevo y los vendajes son cambiados hasta que las heridas se cierran, lo cual toma alrededor de tres semanas. Los animales reciben gránulos de alimentos normales y agua a discreción.

Se llevaron a cabo experimentos en 4 animales. La unidad de aplicación del material derivado de queratinocitos es la cantidad obtenida de 1 placa petri de 10 cm de diámetro.

Las siguientes sustancias son probadas para la actividad de curación de las heridas:

-: Duoderm®, que es una de las sustancias para cubrir heridas más frecuentemente usada (ensayada en los animales No. I, II, III, y IV);

-: láminas de queratinocitos diferenciadas, frescas, obtenidas alrededor de 20 días después del cultivo (No. I, II, III, y IV). Las láminas son aplicadas con los queratinocitos en dirección hacia debajo sobre la herida;

-: láminas de queratinocitos diferenciadas crio-preservadas son cultivos desprendidos aproximadamente 20 días después de la siembra y almacenados en nitrógeno líquido (No. I, II, III, y IV). Las láminas son puestas sobre la herida con los queratinocitos basales en dirección hacia abajo;

-: los queratinocitos liofilizados son preparados comenzando a partir de las láminas de queratinocitos las cuales son recogidas en PBS 1/10 y liofilizadas (No. I, II, III, y IV);

-: 10000 g de sobre-nadante son derivados de los cultivos de queratinocitos, los cuales son lisiados en PBS 1/10, homogenizados en un Ultra-turrax® (Janke & Kunkel, IKA, Labortechnik, Alemania) y centrifugados a 10000 g durante 30 min (No. I, II, III, y IV). Los 10000 g de sobre-nadante fueron aplicados a diferentes concentraciones variando entre 3% concentrado a 1/500 diluido (No. I y II);

-: los 10000 g de gránulos son los 10000 g de sedimentos del procedimiento descrito (No. I, II, III, y IV);

-: el TGF-\alpha es uno de los factores que puede jugar un papel en la curación de las heridas. Cuatrocientos ng, disueltos en 1.5 ml de gel, fueron aplicados por herida (No. I, II, III, y IV);

-: el gel es 1.5 ml de gel en el cual sustancias secas, tales como queratinocitos liofilizados o TGF-\alpha, son disueltos antes de la aplicación sobre la herida (No. I, II, III, y IV);

-: la herida control es tratada con solución salina solamente.

Varios criterios fueron definidos, permitiendo la evaluación macroscópica y microscópica de las heridas en curación. Estos aspectos, los cuales son estudiados a un cierto punto tiempo, son marcados con un asterisco en las Tablas 1 y 2. La evaluación es realizada independientemente por 3 investigadores. El resultado final es obtenido por acuerdo de los 3.

TABLA 1

Criterio para la evaluación macroscópica de las heridas en curación a diferentes puntos de tiempos
después de la herida.
	antes del cierre	al cierre	\pm 2.5 meses después del cierre
profundidad de la herida (profunda,	*
superficial, igual)
tejido de granulación	*
efecto borde	*
formación de la costra cutánea	*	*
presencia de la membrana tipo fibrina	*
regularidad de la cicatriz		*	*
contracción (una/dos direcciones,	*	*	*
ninguna)
formación de escama		*	*
epitelización/cierre		*
peor apariencia de la herida		*
Aspecto (opaco, claro, eritema)		*	*

Para la evaluación microscópica, biopsias por punción (3 mm de diámetro) son tomadas en el momento del cierre de la herida y alrededor de 3 meses después de la inducción de la herida, es decir a los 105 días en el segundo animal, 84 y 91 días en el tercero y cuarto animal, respectivamente. Cada vez 2 juegos de biopsias por punción (3 mm de diámetro) son tomadas, una para fijación en formol y una para congelar. Secciones de parafina son preparadas a partir de las biopsias fijadas en formol y subsiguientemente teñidas con hematoxilina-eosina de rutina o teñidos específicos. Los teñidos específicos son usados para revelar la membrana de basamento, los melanocitos, la reticulina, y la elastina. Secciones de crióstato son hechas a partir de muestras congeladas y usadas para experimentos inmunocitoquímicos, investigando la presencia de ciertas queratinas, células de Langerhans, y capilares sanguíneos.

El cierre de la herida es definido como la epitelización observada macroscópicamente. El punto de tiempo de 23 días (ver abajo) es seleccionado arbitrariamente como un punto de referencia por 2 razones: (i) el experimento con el primer animal tuvo que ser detenido a los 23 días, y (ii) la mayoría de las heridas cerraron en los animales a los 23 días.

TABLA 2

Criterio para la evaluación a nivel microscópico de las heridas en curación a diferentes intervalos de tiempo.
Epidermis	al cierre	\pm 2.5 meses después del cierre
epidermis unida/desprendida	*	*
puentes intercelulares (número, penetración,	*	*
tamaño)
grosor (basal + espinoso + granuloso)	*	*
posición del núcleo en el basal	*	*
número de capas de células en el granuloso	*	*
paraqueratosis	*	*
aspecto de la córnea	*	*
presencia de melanocitos (teñido de Fontana)		*
presencia de células de Langerhans (enzima
citoquímica, inmunocitoquímica)		*
citoqueratina (8,18,19; 10,11; 13,16*)		*
Dermis
vasos sanguíneos (número, tamaño,	*	*
abierto/cerrado, orientación)
capilares en el papilar (cantidad, organización)
(factor 8 inmunocitoquímica)		*
presencia de folículos pilosos y glándulas	*	*
sudoríparas
fibras/haces de colágeno (Orientación, tamaño,
cantidad, localización)	*	*
membrana de basamento (teñido PAS)		*
elastina (teñido orceína)		*
reticulina (impregnación de plata)		*
(*) los números se refieren a los tipos de citoqueratina

Como (i) la contracción es pequeña en el momento del cierre (ii) las heridas con la contracción más grande no cierran primero, y (iii) las heridas que son cerradas primero no muestran gran contracción, se concluye que, en nuestro modelo, el cierre no es debido a la contracción de la herida sino a la epitelización. La posición de la herida afecta la dirección y la extensión de la contracción. En general, todas las cicatrices fueron escamosas después de cierre y varias semanas después. Las cicatrices hipertróficas no fueron observadas a los 2.5 meses después del cierre, es decir, al final de los experimentos.

Para el criterio microscópico la histología de la piel sana sirvió como referencia. La observación microscópica del tejido de la cicatriz proporcionó una información importante sobre la calidad de la cicatriz. No se encontró ninguna evidencia de que la localización de la herida influyó en la histología de la herida en curación. Así, la calidad de la cicatriz fue principalmente influenciada por la sustancia usada para el tratamiento de la herida. Sin embargo, grandes diferencias histológicas entre los animales fueron observadas. Probablemente estas diferencias son debidas a las diferencias entre los animales. Por ejemplo, Duoderm, que tiene una calidad constante, fue aplicada a la herida en el cuello de 4 animales, y dio como resultado una histología diferente. Diferencias entre los animales fueron observadas también usando sustancias derivadas de queratinocitos. Por ejemplo, a continuación de la aplicación de las láminas de queratinocitos o queratinocitos liofilizados, más puentes intercelulares pronunciados fueron encontrados al tiempo que las heridas cerraron en los animales No. I y II que en los No. III y IV. Esto puede en parte ser debido al hecho de que el tercer y cuarto animales eran originarios de un suministrador diferente al de los primeros dos cerdos.

Al tiempo de cierre de la herida, una hiperplasia irregular fue usualmente observada, es decir, el epitelio fue más grueso que en la piel sana. Generalmente, la epidermis fue más delgada alrededor de 2 meses después, pero aún ligeramente más gruesa que el epitelio normal.

La calidad de la cicatriz en un tiempo posterior es de gran importancia. La unión de la epidermis a la dermis y la presencia de verdaderos puentes intercelulares son un criterio importante para la evaluación de la calidad del tejido de la cicatriz. Existe una tendencia a normalizar el tamaño y el número de puentes intercelulares como una función del tiempo. De hecho, cuando no hubo o hubo pocos puentes al cierre, los puentes fueron más numerosos y mejor desarrollados a los 3 meses. Por otra parte, cuando los puentes fueron mucho más grandes después del cierre que en la piel normal, estas estructuras tendieron a ser más normales a los 3 meses.

La Tabla 3 resume los resultados relativos al número de días necesarios para el cierre de la herida.

Los números 1, 2, 3, y 4 corresponden a 4 cerdos diferentes. En la primera columna, el producto que ha sido aplicado sobre la herida es indicado.

En esta tabla,

-: "no tratado" corresponde a los animales sobre cuyas heridas solamente fue aplicada solución salina;

-: "gel solo" corresponde al caso donde la solución salina fisiológica fue aplicada sobre la herida en forma de un gel;

-: "KC fresco" corresponde a células de queratinocitos frescas cultivadas de acuerdo a la invención;

-: "KC crio" corresponde a las células de queratinocitos crio-preservados cultivadas de acuerdo a la invención;

-: "liofil" corresponde al liofilizado de las células de queratinocitos de la invención;

-: "10000 pel" corresponde a los gránulos obtenidos después de la centrifugación a 10000 g;

-: "10000 su" corresponde al sobre-nadante obtenido después de la centrifugación a 10000 g;

TABLA 3

	número del animal
	I	II	III	IV
no tratado	después 23	22	después 25	17
gel solo	después 23	después 25	22	22
duoderm	18	después 25	18, desp.25	17,22
KC fresco	después 23	después 25	22	17
KC crio	23	después 25	22	17
liofil	23	18	18	17
10000 pel	después 23	después 25	18	17
10000 su	después 23	22	18	17
TGF-\alpha	después 23	18	25	17

Después del tratamiento con láminas de queratinocitos frescas diferenciadas, las heridas cerraron antes de los 23 días en 2 animales. A nivel microscópico, la epidermis se unió a la dermis en todas las muestras. Verdaderos puentes intercelulares ocurrieron en 3 de las 7 cicatrices. Dos meses después del cierre, la epidermis se unió a la dermis en las 3 cicatrices.

El tratamiento de las heridas con láminas de queratinocitos diferenciadas crio-preservadas dio resultados menos satisfactorios que con el uso de láminas frescas diferenciadas. La herida en el animal No. 1 pareció no ser epitelizada, aunque macroscópicamente parecía cerrada. El epitelio se desprendió en 2 de los 3 animales a alrededor de los 3 meses después de la herida. Puentes intercelulares estuvieron presentes en 3 de las 7 cicatrices. Ocurrió paraqueratosis en 2 de las 3 cicatrices rápidamente después del cierre.

Las heridas tratadas con queratinocitos liofilizados obtenidos de las láminas de queratinocitos diferenciadas cerraron en los 4 cerdos antes de los 23 días después de la inducción de la herida. La observación histológica mostró que en el momento de la biopsia, todas las heridas fueron epitelizadas. La epidermis se unió a la dermis en todas las secciones, excepto en la biopsia del animal No. II a los 105 días, donde el epitelio fue parcialmente desprendido. Cuatro de las 7 cicatrices mostraron puentes intercelulares verdaderos. Una ligera hipergranulosis fue observada en el segundo y tercer animales a los 3 meses después de la herida.

Cubrir con Duoderm dio como resultado el cierre de la herida en 3 animales antes de los 23 días como se juzgó macroscópicamente. Pocos o ningún puente intercelular fueron observados en los animales No. II y III antes o después de los puntos de tiempos, y en el No. IV a los 27 días. De esta forma, se presentaron extensiones epidérmicas en sólo 3 de las 11 cicatrices. La epidermis de las cuatro cicatrices del No. III no se unió completamente. A los 3 meses después de la herida, la epidermis se unió en el animal No. IV solamente, es decir 2 cicatrices de 5.

Las heridas no tratadas se cerraron antes de los 23 días en los animales No. II y IV. Puentes intercelulares fueron encontrados en solamente 2 de 7 cicatrices. Resultados similares fueron obtenidos después de la aplicación del gel solo. Estas cicatrices son de menor calidad que las cicatrices a continuación de un tratamiento de heridas con sustancias derivadas de queratinocitos.

Después del tratamiento con 10000 g de sobre-nadante de queratinocitos lisiados, el cierre de las heridas antes de los 23 días fue observado en 2 animales. La epidermis se unió en 3 de las 4 cicatrices rápidamente después del cierre, y en 2 de las 3 cicatrices 2.5 meses después. Puentes intercelulares ocurrieron en 4 de 6 cicatrices. Los experimentos usando diferentes concentraciones del sobre-nadante revelaron que, al cierre, no hubo diferencia histológica obvia entre las concentraciones usadas, es decir, 3 veces concentrada a 1/500 diluida.

La aplicación de 10000 g de gránulos de queratinocitos lisiados dio como resultado el cierre de la herida antes de los 23 días en 2 de los 4 animales. La epidermis se unió a la dermis en 4 de las 7 cicatrices. No se encontraron puentes intercelulares verdaderos. Se observó paraqueratosis en 2 de las 3 cicatrices rápidamente después del cierre. De esta forma, el uso de 10000 g de material granulado dio como resultado cicatrices de menor calidad que después de la aplicación de los 10000 g de sobre-nadante. Presumiblemente, la cantidad de sustancia activa es menor que en los 10000 g de sobre-nadante, dando como resultado una curación menos satisfactoria.

Las heridas con TGF-\alpha en los animales No. II y IV cerraron en menos de 23 días. La observación microscópica reveló que pocos o ningún puente intercelular estuvo presente, excepto en el animal No. I al tiempo del cierre de la herida. Se encontró hiperplasia psoriasiforme en el último animal. A los 3 meses después de la herida, la epidermis se unió a la dermis en 2 de las 3 cicatrices. Ya que la curación después de la aplicación del liofilizado de queratinocitos total es mejor que después de la aplicación de TGF-\alpha solo purificado, se concluyó que la actividad de curación en el queratinocito liofilizado no se debe al TGF-\alpha o al menos no al TGF-\alpha solo.

Los folículos pilosos y las glándulas sudoríparas no fueron nunca encontrados en las cicatrices.

No todas las cicatrices fueron investigadas para determinar la presencia de componentes específicos de la piel tales como melanocitos, células de Langerhans, células de Merkel, citoqueratina, membrana de basamento, reticulina, y elastina. Las estructuras fueron estudiadas en la mayoría de las cicatrices representativas solamente, es decir, las láminas de queratinocitos crio-preservadas y frescas, los queratinocitos liofilizados, el Duoderm, el gel solo como control, y evidentemente, la piel sana. De esta forma, las cicatrices obtenidas después del tratamiento de la herida con extractos de queratinocitos liofilizados no fueron estudiadas aquí.

El patrón de queratina en las cicatrices fue similar a aquel en la piel sana. El anticuerpo para las queratinas 10/11 dio una reacción positiva, mientras que las queratinas 8/18/19 no fueron encontradas. Sorprendentemente, una reacción positiva fue observada usando el anticuerpo para las queratinas 13/16. Estas queratinas no están presentes en la piel humana normal, pero aparentemente (al menos una de ambas, presumiblemente la queratina 16) están presentes en la piel de cerdo sana y en las cicatrices.

No se observaron melanocitos (teñido por la técnica de Fontana) ni en la piel sana, ni en el epitelio de las cicatrices. Hasta el momento, las células de Langerhans no han sido detectadas, ni en la piel sana ni en las cicatrices mediante el uso de la enzima peroxidasa citoquímica o inmunoquímica (anticuerpo OKT6 de anti-Langerhans humano). Las células de Merkel no se encontraron en la piel del cerdo o en las cicatrices (no positivo para queratinas 8, 18, 19).

La membrana de basamento (revelada mediante teñido de Schiff periódico con ácido) juega un papel importante en la unión del epitelio al tejido conectivo de la dermis. La membrana de basamento fue bien desarrollada en las heridas curadas tratadas con queratinocitos cultivados (láminas frescas, láminas crio-preservadas y queratinocitos liofilizados). Este no fue el caso a continuación de la aplicación de Duoderm o en los controles.

El patrón de reticulina (demostrado por impregnación de plata) fue similar al de la piel sana. Fibras delgadas de elastina (reveladas por teñido con orceína) fueron solamente encontradas en las cicatrices después de la aplicación de las láminas de queratinocitos frescas y queratinocitos liofilizados, pero no seguido del tratamiento de la herida con láminas crio-preservadas, Duoderm, o gel solo.

En conclusión, los queratinocitos cultivados liofilizados demostraron claramente más actividad de curación de las heridas que cualquier otra de las sustancias probadas incluyendo las láminas de queratinocitos cultivadas frescas. La cicatriz se cierra más rápidamente y la calidad es mejor.

Ejemplo II Papel del EGF, la toxina del cólera, la hidrocortisona, y la insulina en los queratinocitos libres de capa alimentadora cultivados in vitro - Sumario

El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es necesario para inducir la rápida proliferación de los queratinocitos humanos. Sin embargo, un bajo rendimiento de queratinocitos unidos es observado cuando el EGF solo está presente en el medio. La toxina del cólera (CT) permite un alto rendimiento de los queratinocitos unidos y propagados. Por otra parte, un detenimiento del crecimiento es observado cuando la CT sola está presente en el medio de
cultivo.

La hidrocortisona induce la proliferación del queratinocito pero es menos potente que el EGF. La insulina tiene un efecto beneficioso sobre los queratinocitos, aunque su efecto es más importante cuando el medio contiene EGF y toxina del cólera, o EGF e hidrocortisona, que cuando el EGF, la toxina del cólera, y la hidrocortisona están presentes, particularmente a concentraciones preferidas.

Las concentraciones óptimas de EGF, hidrocortisona, y toxina del cólera en el medio de cultivo son respectivamente por ejemplo 10 ng, 0.13 \mug y 9 ng por ml. La insulina puede ser adicionada, preferiblemente a una concentración de 5 \mug/ml.

Pruebas han sido llevadas a cabo para investigar

-: la influencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF), la toxina del cólera, y la hidrocortisona (HY) en presencia de insulina en el crecimiento, y en la unión y crecimiento de los queratinocitos humanos primarios (PO) y sub-cultivados (P1) en comparación con el medio que contiene los 3 o ninguno de los 3 aditivos

-: la influencia de EGF + CT, EGF + HY y HY + CT para el mismo fenómeno

-: el efecto de disminuir e incrementar la concentración de un aditivo (EGF, CT o HY), con los otros 2 a una concentración "estándar"

-: el papel de la insulina en la unión y crecimiento de los queratinocitos primarios humanos.

El medio de cultivo completo contenía 10 ng de EGF, 9 ng de la toxina del cólera, 0.4 \mug de hidrocortisona, y 5 \mug de insulina por ml. Todos los experimentos fueron llevados a cabo en placas de 6 cavidades. Como puede haber diferencias entre los donantes, y para evitar la variación entre las placas, cada placa contenía 2 estándares internos: una donde las células fueron cultivadas en el medio completo, otra en el medio sin ningún aditivo.

Para investigar el efecto sobre el crecimiento de la célula, las células fueron sembradas en el medio completo. Dos días después, los cultivos fueron enjuagados 3 veces con PBS y cubiertos con el medio específico.

Los queratinocitos fueron sembrados en el medio específico para el examen del efecto de los aditivos en la unión, propagación y crecimiento de la célula. En el caso que los queratinocitos (KC) sub-cultivados (P1) fueron usados, las células fueron cultivadas en el medio completo antes de la tripsinización y la transición.

\newpage

Conclusiones A. Efecto de EGF, CT y HY sobre los cultivos que contienen insulina A.1. EGF

El EGF solo en el medio permitió la confluencia, aunque más lenta cuando las células fueron sembradas en este medio específico. Esto puede ser debido al hecho de que un rendimiento inferior de las células unidas es encontrado cuando solamente el EGF está presente en el medio de siembra.

Además, los experimentos mostraron claramente que, entre el EGF, la HY, la CT y la insulina, el EGF es el más potente estimulante de la proliferación de los queratinocitos. La combinación de HY + CT dio un crecimiento más lento que EGF + CT + HY, EGF + CT, EGF + HY y que el EGF solo, probando que el EGF es necesario para el crecimiento rápido. El hecho de que la CT + HY + 1/3 EGF y CT + HY + 2x EGF dio como resultado un crecimiento ligeramente más lento de queratinocitos PO (primarios) y P1 (primer sub-cultivo) que el medio completo puede sugerir que la concentración óptima de EGF para esta combinación de aditivos es de alrededor de 10 ng/ml. En los experimentos de crecimiento-unión, el efecto de CT + HY + 1/3 EGF, CT + HY + 2x EGF, y el medio completo fueron similares.

Cuando el EGF (con o sin HY) estaba presente en el medio en ausencia de la CT, aparecieron queratinocitos de división translúcidos grandes, planos. Tales células no fueron observadas cuando la CT estaba presente en el cultivo. Sin embargo, cuando el cultivo alcanzó la confluencia, tales células no fueron más observadas (cuando está EGF, posiblemente HY y no CT).

Todas las células presentaron la morfología típica del queratinocito y formaron multi-capas.

A.2 Toxina del Cólera

La confluencia fue raramente obtenida cuando la CT sola estaba presente en el medio. Aparentemente la confluencia puede algunas veces ser lograda cuando los queratinocitos primarios son sembrados en este medio específico. La CT permitió un rendimiento superior de los queratinocitos unidos y propagados, comparado con la HY y el EGF solo en el medio. Sin embargo, después de pocos días el crecimiento se detuvo. El hecho de que la confluencia pueda ser obtenida cuando los queratinocitos primarios fueran sembrados en el medio sin EGF + HY + CT, pero no cuando la CT sola está presente, indica el efecto "inhibidor" de la proliferación de la CT. La combinación de EGF + HY dio resultados similares para el crecimiento de los queratinocitos, comparado con EGF + HY + 1/3 CT y puede ser algo más rápido que EGF + HY = 2 + CT. Los experimentos unión-crecimiento mostraron que EGF + HY fue algunas veces más lento que cuando fue adicionada 1x, 1/3 o 2x de CT a esa combinación. Con relación al crecimiento de los queratinocitos, 1/3CT + EGF + HY y el medio completo (= EGF + HY + CT) fueron ligeramente más rápidos que 2x CT + EGF + HY, sugiriendo otra vez que la CT puede obstaculizar la proliferación de los queratinocitos. De esta forma, el efecto beneficioso de la CT esencialmente incluye mejorar el rendimiento de la unión. Por lo tanto, el medio de cultivo preferiblemente contiene CT. No hubo diferencia entre EGF + CT + HY, 1/3 CT + HY + EGF y 2x CT + EGF + HY en los experimentos de unión-crecimiento. La concentración óptima de CT puede así ser de alrededor de 9 ng/ml en combinación con EGF y HY.

A.3. Hidrocortisona

El medio conteniendo HY sola como aditivo dio confluencia en ciertos cultivos. Un rendimiento más bajo de las células unidas se encontró cuando la HY sola estaba presente. Sin embargo, el hecho de que la confluencia pueda ser obtenida muestra que, a diferencia del caso de la CT, el crecimiento no se detuvo. Presumiblemente la HY induce una ligera estimulación para el crecimiento, ya que los cultivos alcanzan la confluencia por CT + HY, pero no con CT sola. La confluencia es lograda con EGF + CT sin HY, pero algunas veces en un punto de tiempo posterior que cuando la HY está también presente. Además, 1/3 HY + EGF + CT y 2x HY + EGF + CT dio resultados similares que los que dio HY + EGF + CT en todos los experimentos. De esta forma, es aconsejable adicionar HY al medio, aunque la concentración puede ser disminuida a 0.13 \mug/ml sin un efecto negativo en la unión-crecimiento y el crecimiento solamente.

La combinación de los tres aditivos EGF, HY y CT da los mejores resultados. Sin embargo, los experimentos de unión-crecimiento mostraron que la concentración de un factor puede variar entre 1/3 a 2x (rango probado) la concentración estándar, a condición de que dos u otros factores tengan la concentración estándar.

B. Efecto de la insulina

Cultivar los queratinocitos en el medio en ausencia de EGF + HY + CT no es exitoso, excepto en ciertos casos donde las células primarias fueron sembradas en este medio careciendo de EGF + HY + CT. Además, cuando la insulina es también omitida, no podría ser lograda ninguna confluencia con los queratinocitos primarios sembrados en ese medio (tabla 8). Así, la insulina es beneficiosa para la unión-propagación-crecimiento de los queratinocitos. Sin embargo, la combinación de EGF + HY + CT es suficiente para obtener cultivos primarios confluentes.

Claims

1. Una fracción de gránulos para uso como un medicamento donde dicha fracción de gránulos es obtenida por un proceso que comprende los pasos de:

a): cultivar los cultivos de células de queratinocitos sobre un soporte,

b): desprender dichas células de queratinocitos del soporte,

c): lisiar las células,

d): fraccionar dichas células lisiadas por centrifugación para producir una fracción de gránulos y un sobre-nadante,

e): recoger dicha fracción de gránulos.

2. Una fracción de gránulos para uso como un medicamento de acuerdo a la reivindicación 1 adicionalmente caracterizada porque dicha fracción de gránulos es adicionalmente tratada por:

f): congelar dicha fracción de gránulos obtenida en el paso (e) a una temperatura de alrededor de -20°C a alrededor de -196°C,

g): liofilizar dicha fracción de gránulos congelada al vacío para dar una sustancia seca que constituye la fracción de gránulos.

3. Una fracción de gránulos para uso como un medicamento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde el paso (c) es llevado a cabo por medio de un shock hipotónico o sonicación.

4. Una fracción de gránulos liofilizada para uso como un medicamento de acuerdo a la reivindicación 2 donde el paso (f) es llevado a cabo a -40°C.

5. Composición farmacéutica para promover la curación de una herida superficial, donde dicha composición comprende, como ingrediente activo, una fracción de gránulos de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 5 donde dicha composición comprende el ingrediente activo formulado en un gel, una crema, una pomada, un polvo seco, una suspensión, una solución, o una matriz sólida biocompatible.

7. Una fracción de gránulos obtenida por un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para promover la curación de una herida superficial.

8. Una fracción de gránulos de acuerdo a la reivindicación 7 donde dicha herida superficial es una herida por quemadura de la piel, una herida mecánica de la piel, una ulceración de la piel, una herida de la córnea, una herida de la membrana timpánica, o una lesión debida a una condición patológica.

9. Una fracción de gránulos de acuerdo a la reivindicación 8 donde dicha quemadura comprende una quemadura térmica, una quemadura química, una quemadura eléctrica o una quemadura por radiación y donde dicha condición patológica comprende pemphigoid bullar, epidermolisis bullosa, o lupus eritematoso.

10. Uso de una fracción de gránulos de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un medicamento para promover la curación de heridas superficiales.