ES2212285T3

ES2212285T3 - Tejido de la vaina dermica en la curacion de heridas.

Info

Publication number: ES2212285T3
Application number: ES98917354T
Authority: ES
Inventors: Amanda J. The Dept. Of Bio. Sciences Jahoda; Colin A. B. The Dept. Of Bio. Sciences Jahoda
Original assignee: University of Durham
Current assignee: University of Durham
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2004-07-16
Anticipated expiration: 2018-04-14
Also published as: EP0980270A1; JP2002507132A; WO1998048860A1; DE69820254D1; JP4567105B2; DE69820254T2; BR9809351A; ATE255426T1; CA2287507A1; EP0980270B1; GB9708692D0; AU738028B2; AU7059898A

Abstract

La invención se refiere a la utilización en sistemas de cicatrización de tejido de vaina dérmica y/o de células derivadas de estos. Se ha explotado en particular las características apropiadas de este tipo de tejido para obtener un nuevo material de cicatrización que puede utilizarse en nuevas composiciones terapéuticas y nuevos apósitos quirúrgicos cuando se desea un cierre de las heridas y cicatrices mínimas.

Description

Tejido de la vaina dérmica en la curación de heridas.

La invención trata del uso de tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma y/o porciones de folículos pilosos que contengan estas y otras poblaciones celulares para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de heridas.

La piel es un órgano muy complejo que recubre la superficie externa del cuerpo y se funde, en varios orificios corporales, con las membranas mucosas del tracto digestivo y otros conductos. Tiene múltiples funciones como la prevención de la pérdida de agua corporal, pero actúa predominantemente como una barrera protectora frente a la acción de agentes físicos, químicos y bacterianos sobre tejidos más profundos. La piel es elástica y salvo en algunas áreas como las palmas, las plantas y las orejas, está unida con bastante flexibilidad al tejido subyacente. Su espesor varía entre 0,5 mm (0,02 pulgadas) en los párpados y 4 mm (0,17 pulgadas) o más en las palmas y las plantas.

La piel se compone de dos capas (rogamos que vea la Figura 1 que ilustra un corte anatómico transversal de un trozo de piel), la capa externa, que en comparación es fina (0,1 mm), se denomina epidermis, o cutícula; tiene un espesor de varias células y tiene una capa córnea externa de células muertas que se pierden constantemente de la superficie y son reemplazadas desde abajo a partir de una capa basal de células, denominada estrato germinal. La epidermis se compone predominantemente de queratinocitos que representan más de un 95% de la población celular, el resto incluye células dendríticas como las células de Langerhans y los melanocitos. Es esencialmente celular y avascular, con relativamente poca matriz extracelular salvo por la capa de colágeno y otras proteínas que se encuentra debajo de la capa basal de queratinocitos. Los queratinocitos de la capa basal se dividen constantemente y posteriormente las células hijas se mueven hacia fuera, donde experimentan un periodo de diferenciación y eventualmente se desprenden de la superficie. La capa interna de la piel se denomina dermis y se compone de una red de material extracelular colagenoso, fibras elásticas, vasos sanguíneos y nervios. En su interior se encuentran los folículos pilosos con glándulas sebáceas (conocidos en conjunto como unidad pilosebácea) y glándulas sudoríparas asociadas. La interfase entre la epidermis y la dermis es extremadamente irregular y consiste en una sucesión de papilas o proyecciones digitiformes. Debajo de las células epidérmicas basales a lo largo de esta interfase la matriz extracelular especializada está organizada en una estructura diferenciada denominada la membrana basal.

La fibra de pelo de los mamíferos es el producto de un pequeño cúmulo de tejido conocido como folículo piloso que está ubicado inmediatamente por debajo de la superficie de la piel. La parte distal de dicho folículo se continúa directamente hacia fuera con la epidermis cutánea. Aunque es pequeño, el folículo comprende un sistema altamente organizado de diferentes capas reconocibles dispuestas de forma concéntrica. Los folículos pilosos activos se extienden hacia abajo a través de la dermis, la hipodermis (una capa flexible de tejido conectivo), y la capa de tejido graso o adiposo.

En la base de cualquier folículo activo se encuentra el bulbo piloso, que consiste en un cuerpo de células dérmicas, conocido como papila dérmica, contenido en una copa invertida de células epidérmicas conocidas como matriz epidérmica (rogamos que vea la Figura 1). Sin tener en cuenta el tipo de folículo, la fibra de pelo, junto con varias capas epidérmicas de soporte, es producido por células epidérmicas germinales en la base de esta matriz epidérmica. La vaina dérmica más profunda es contigua a la base de la papila a partir de la cual realiza una curva externamente y alrededor de todas las capas epidérmicas de la matriz del pelo como un fino tejido de revestimiento, y continua entonces como un tubo o un manguito a lo largo de todo el folículo. La vaina dérmica se conoce también como vaina de tejido conectivo.

El desarrollo de apéndices de la piel como folículos de la barba y el pelo depende de la interacción entre las dos capas de la piel, la epidermis y la dermis. En el desarrollo embrionario, un intercambio secuencial de información entre estas dos capas respalda una compleja serie de procedimientos morfogenéticos que culminan con la formación de estructuras foliculares adultas. Sin embargo, tras la madurez, y a diferencia de las células dérmicas y epidérmicas de la piel en general, algunas poblaciones celulares del folículo piloso mantienen un comportamiento inductor, interactivo y biosintético de tipo embrionario. Es probable que estas propiedades deriven de la naturaleza muy dinámica del folículo que es cíclicamente productor, en el que la repetida remodelación tisular requiere un alto nivel de comunicación interactiva dermo-epidérmica, al igual que es vital para el desarrollo embrionario y, al igual que sería conveniente en cualquier forma de reconstrucción tisular.

La fibra de pelo se produce en la base de un folículo activo a un ritmo muy rápido (0,4 mm al día en los folículos del cuero cabelludo humano y hasta 1,5 mm al día en las vibrisas o bigote de las ratas), lo que significa que la proliferación celular en la epidermis folicular figura entre las más rápidas en tejidos adultos (1).

La región más dinámica del folículo piloso es la parte final del bulbo más profundamente incrustada, en la que las interacciones dermo-epidérmicas locales dirigen el crecimiento activo de la fibra. Esta misma región es fundamental para los cambios que se dan durante el desarrollo y la remodelación tisular implicados en la precisa alternancia existente entre fases de crecimiento y regresión de la fibra de pelo o los apéndices. Como un elemento clave en las actividades, la papila dérmica aparece para orquestar el complejo programa de diferenciación que caracteriza la formación de la fibra de pelo a partir de la fuente primitiva de células epidérmicas germinales (2-5). La vaina dérmica más profunda se inicia debajo de la base de la papila, a partir de ahí hace una curva hacia fuera y hacia arriba para cerrar por fuera todas las capas de la matriz epidérmica del pelo como una copa fina de tejido. (Rogamos que se vea la Figura 1). La vaina dérmica continúa con una disposición tubular a lo largo de todo el folículo, al igual que lo hace la vaina radicular externa epidérmica que está ubicada inmediatamente por dentro de ésta. Entre las dos capas existe una membrana basal especializada llamada membrana vítrea. La vaina radicular externa constituye poco más de una monocapa epidérmica en el folículo inferior, pero su grosor se va incrementando más superficialmente.

Estudios pioneros establecieron que los folículos de bigote de rata cuyos bulbos finales habían sido amputados, podían regenerar todos los elementos cruciales requeridos para restaurar el crecimiento de las fibras (6). También revelaron que las papilas dérmicas aisladas tenían una capacidad de interacción particularmente poderosa para poder inducir folículos pilosos completamente nuevos cuando se reimplantaban in vivo (2). Experimentos posteriores apoyaron aún más lo que se había visto en ratas (4, 7-9), y confirmaron que las papilas de otras especies, incluyendo ratones (10, 11) y ovejas (12) tenían aptitudes de interacción similares. También se ha informado que los folículos humanos faciales (13) y axilares (14) in situ, así como, los folículos humanos aislados trasplantados en huéspedes roedores (15), se regeneran tras su amputación. Estudios posteriores in vitro sugieren claramente que los tejidos y células foliculares humanos mostraron las propiedades de interacción altamente especializadas que se habían visto en sus equivalentes en roedores (16).

Mientras que los componentes anatómicos individuales y las subpoblaciones celulares de la piel están bien establecidos, sus interacciones bioquímicas intra/inter y sus mecanismos de control siguen siendo en gran medida una materia para la especulación y una intensa investigación.

Heridas, quemaduras, enfermedades y úlceras grandes originan la destrucción de extensas áreas de piel. La regeneración de la piel sobre áreas denudadas se hace de forma natural por proliferación celular a partir de los márgenes circundantes de piel sana no dañada y los apéndices de la piel subyacente cuando éstos permanecen. Un problema clínico específico que ocurre de forma natural como resultado de la curación de heridas es la cicatrización hipertrófica, en la que no existe un equilibrio entre la producción de colágeno nuevo y la destrucción de colágeno, y hay una sobreproducción de tejido cicatricial que puede inhibir el recubrimiento de la herida con epidermis nueva. Esto es bastante común, pero normalmente disminuye. Sin embargo, en algunos casos, esta situación puede empeorar y se pueden forman cicatrices queloides (masas de matriz extracelular que siguen creciendo). Se pueden tratar clínicamente con esteroides si son menores, pero casos más serios son extremadamente difíciles de tratar y terminan a menudo en cirugía. Sin embargo, si el área de piel denudada/dañada es grande y de todo su grosor entonces el recubrimiento completo del área dañada se ve facilitado por el uso de injertos de piel, secciones de piel de grosor completo o parcial se eliminan de una parte lejana del cuerpo (zona donante) y se aplican a la superficie en carne viva (zona receptora).

Debe observarse que generalmente los injertos son de piel trasplantada del cuerpo del propio individuo (trasplante autólogo). En un trasplante satisfactorio el injerto se alimenta al principio del suero que sale del área dañada y a continuación por invasión capilar del injerto a partir del tejido subyacente.

Se sabe desde hace tiempo que la supervivencia del injerto se ve afectada por su inmunogenicidad en relación con la zona en la que se trasplanta. Como un ejemplo extremo, las hembras presentan una gran intolerancia al tejido masculino - debido en gran medida a su reacción frente a los antígenos específicos del varón (H-Y). Es bien sabido que la piel, en este contexto, presenta un aguante o tolerancia de notoria pobreza (18, 19).

A lo largo de los años, se han seguido múltiples enfoques en un intento de crear un modelo viable con el que estudiar la fisiología y la morfología de la piel, y/o que pudiera ser usado para procedimientos médicos de injerto.

Existen cuatro o más tipos frecuentes de soporte dérmico en modelos de heridas de la piel:

a): Colágeno nativo (dermis tratada para eliminar los elementos celulares que se re-celulariza a continuación);

b): Geles o enrejados de colágeno (hechos a partir de colágeno extraído que se reconstituye a continuación) y,

c): Mezclas altamente complejas de colágeno reconstituido y una multitud de productos de la matriz extracelular (de fuentes tan diversas como tumores de ratón y aletas de tiburón).

d): Fibroblastos de la piel de donantes jóvenes o neonatos (de este modo menos inmunogénicos) crecidos sobre una matriz biológica, y a los que se les ha dejado adherirse y producir su propia matriz extracelular. Esto se trasplanta entonces en su forma celular como una "piel viva" o bien libre de células, empleando la matriz extracelular producida por las células.

Todas estas metodologías incorporan el uso de fibroblastos corrientes de la piel, y ninguna genera modelos o sustitutos que sean realmente representativos de la estructura de la piel normal. Además, representan a menudo un gran consumo de tiempo y son extremadamente caros de preparar.

La curación o la contracción de las heridas puede ser un procedimiento doloroso tanto fisiológica como psicológicamente. La cicatrización puede llevar a desfiguración y deformación; en algunos casos la tirantez y/o adhesiones, como resultado de las formaciones de tejido cicatricial, pueden originar un daño en los tejidos circundantes y/o subyacentes y/o la pérdida de elasticidad y/o sensibilidad regional. En humanos, gran parte del problema asociado a heridas de todo el grosor de la piel/quemaduras/lesiones/traumatismos es que no se restaura una dermis de grosor normal, lo que puede dar como resultado depresiones y/o indentaciones en la región cicatricial. Muchos animales poseen una piel "más flexible" que los humanos y tienen una mayor capacidad de contracción, tal como lo ilustra la escisión de un parche de piel de grosor completo de 2 cm del dorso de un conejo y la reducción del lugar a una cicatriz, que es una línea apenas visible en cuestión de dos semanas. En consecuencia, acelerar/potenciar la contracción podría reducir el tamaño de la región cicatrizada. Además, creemos que el fenómeno conocido de la rápida curación de las heridas del cuero cabelludo humano, comparado con los índices de curación de heridas en otras partes del cuerpo que tienen una menor densidad de folículos, o que tienen menos folículos activos grandes, se debe a la abundancia de células de la vaina dérmica disponibles que, al igual que los miofibroblastos, fomentan la contracción de las heridas. Esta idea va en contra de la tendencia predominante, por la que las propiedades de curación rápida de la piel del cuero cabelludo se atribuyen a una mayor vascularización de la región.

La contracción de las heridas es una parte muy importante del procedimiento por el que la piel cura, y se cree que una población transitoria de células llamadas miofibroblastos, efectúan el cierre de la zona dañada por contracción. No se ha identificado la fuente exacta de miofibroblastos, pero estas células se caracterizan por su expresión de alfa actina de músculo liso. Una invención para mejorar la curación de heridas tendría un beneficio inmediato y un gran número de aplicaciones ya que se estima que más de 2 millones de personas sufren quemaduras serias cada año solamente en los Estados Unidos, y muchos de ellos requieren injertos.

Se han intentado varios enfoques experimentales de injertos de piel artificial, por ejemplo se han hecho crecer en cultivo láminas epiteliales a partir de piel interfolicular y se han injertado en el donante más tarde; pero aunque preserva la vida, este procedimiento es con frecuencia insatisfactorio porque las láminas son delicadas y difíciles de transferir. También, ya que no hay una dermis de soporte implicada, quedan indentaciones dérmicas en el sitio del injerto porque no se restaura una dermis normal de grosor completo. Su simplicidad hace que no sean representativas de un modelo de piel para estudios in vitro, mientras que en relación con los injertos, en el mejor de los casos, solamente actúan como revestimiento mientras que se recupera la piel del propio paciente.

Se han intentado enfoques alternativos empleando células epidérmicas basales y de la vaina radicular externa cultivadas sobre geles de colágeno (con o sin fibroblastos de la piel), u otros sustitutos dérmicos naturales o sintéticos, con el mismo objeto final, pero otra vez muchos de estos enfoques tienen limitaciones específicas, generalmente relacionadas con la supervivencia o la incapacidad de parecerse a la piel normal. De los enfoques de técnicas anteriores se reivindica que las células de la vaina epidérmica radicular externa en combinación con un componente dérmico proporcionan los mejores resultados en los pacientes heridos. De este modo, a pesar de la demanda y el suministro de complejos constituyentes bioquímicos de soporte, los actuales modelos de piel in vitro son deficientes en
que:

1): Su componente epidérmico no experimenta una diferenciación normal;

2): No desarrollan la barrera dermo-epidérmica biosintética normal de la piel (una especie de filtro biológico y procesador de mensajes) denominada membrana basal;

3): Carecen de constituyentes como folículos pilosos y glándulas sudoríparas;

4): Son frágiles, difíciles de manipular y no se pueden mantener;

5): No pueden evitar la desfiguración porque no pueden rellenar espacios vacíos de tejido;

6): No previenen las infecciones ni restauran un tejido vivo/eficaz de forma que se pueden desarrollar cicatrices inflexibles y afuncionales.

Por lo tanto, en términos de sistemas in vitro fieles, y como material para la reposición de piel, los modelos/sustitutos actuales son deficientes.

En este ámbito, artículos recientes enfatizan la desesperada necesidad de más investigación para probar y encontrar un material de soporte adecuado para los injertos epidérmicos que promueva un alto nivel de "aceptación". Proponemos que el fracaso de las técnicas anteriores se debe en gran medida a la falta de un lecho dérmico en la herida favorable a que se unan a él las células epidérmicas, cuando se ha perdido todo el grosor de la piel - creemos que las células de la vaina dérmica son candidatos naturales para este papel, y que la producción satisfactoria de tejidos sólo puede ocurrir cuando se emplean las células apropiadas para ello.

Los tipos celulares más importantes de todos son aquellos que se encuentran en el origen de cada sistema biológico es decir las células madre, puesto que sostienen vitalmente y reponen la población descendiente más diferenciada y a medida que se especializan desarrollan funciones características. Estas células son aún las células menos comprendidas en términos de su distribución, comportamientos y los factores por los cuales pueden ser definidas. Es probable que la capacidad para proporcionar un número significativo de células madre primitivas puras, sin estimular, indiferenciadas tenga un amplio impacto sobre nuestra comprensión de la biología celular y ofrezca enfoques positivos y prometedores para futuros avances terapéuticos.

Fortuitamente, hemos estudiado los folículos pilosos e identificado una población celular específica con privilegios inmunes y potencial específico de célula madre que se puede usar de una forma de lo más ventajosa para acelerar y potenciar la curación de heridas.

Hemos encontrado que formas simples de célula(s) folicular(es) proporcionan una recombinación dermo-epidérmica (en condiciones de cultivo muy básicas) que da como resultado la formación de membrana basal y la diferenciación epidérmica específica de apéndices que no habían sido documentadas con anterioridad, y que estas células foliculares pueden mostrar fácilmente algunas características fundamentales que han faltado hasta la fecha en los sistemas de modelado de piel. Otros atributos naturales que predisponen a las células foliculares como candidatos para aplicaciones en la curación de heridas incluyen su similitud con los miofibroblastos de las heridas; la exhibición de propiedades de tipo célula madre; la producción de una matriz extracelular única de tipo embrionario y el hecho de que exhiban impresionantes aptitudes de regeneración e inducción.

De este modo, somos capaces de aportar mejoras inmediatas en al menos tres áreas clave (formación de membrana basal, diferenciación epidérmica normal sobre una dermis de soporte natural y la incorporación de apéndices de la piel) en relación con las alternativas actualmente disponibles de injertos de piel y modelos de piel in vitro. Por lo tanto, utilizando un tejido o un tipo celular específico y aislado es decir tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma e incorporándolos en un injerto reconstruido o un injerto compuesto, podemos producir un sustituto de la piel más apropiado que solventa muchos de los problemas asociados a las técnicas anteriores.

El documento EP 0236014 describe una población de células, aislada de papilas dérmicas, que tiene potencial de célula madre. Estas células, en asociación con células epidérmicas son capaces de estimular el crecimiento del pelo en el cuero cabelludo. Se conocen también procedimientos de aislamiento y cultivo de células madre foliculares a partir de una subpoblación de queratinocitos foliculares y están descritas en el documento WO 9501423. Sin embargo, ninguno de estos documentos describe el potencial de célula madre de las células de la vaina dérmica para proporcionar los distintos tejidos diferenciados que se encuentran en la piel y su utilidad para la estimulación de la curación de
heridas.

Es por lo tanto un objeto de la invención proporcionar un nuevo sistema de curación de heridas que emplea células/tejidos que derivan de uno mismo y/o sus atributos.

Otro objeto más de la invención es proporcionar un sistema de curación de heridas que emplea células/tejidos que no provienen de uno mismo y/o sus atributos.

Otro objeto más de la invención es proporcionar un sistema de curación de heridas de uso multipotencial, es decir para su uso en situaciones de curación de heridas agudas y/o crónicas y/o leves y/o graves.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma para el tratamiento de heridas.

En una forma de realización preferida de la invención dicho tejido de la vaina dérmica y/o dichas células deriva/derivan de una porción seleccionada de un folículo, de ser posible el tercio inferior del mismo y mejor aún derivan de un anillo de células alrededor de dicho folículo, de ser posible un anillo interno, y mejor aún dicho tejido/células es/son positivo(as) para la actina de músculo liso.

En una forma de realización preferida de la invención dicho tejido y dichas células derivadas de ahí se proporcionan o combinan con al menos otro tipo celular más de un folículo piloso, y mejor aún se combinan con tejido que comprenda la papila dérmica, o células que derivan de la misma. Se prefiere esta combinación porque nuestros experimentos han demostrado que el tejido de la papila dérmica, o células derivadas de la misma pueden fomentar el cierre de las heridas y la reducción del tejido cicatricial.

En otra forma de realización preferida de la invención se proporciona un sistema de curación de heridas que comprende un material matriz adecuado que tiene incorporado y/o embebido en su interior y/o asociado a él y/o unido al mismo tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma. De ser posible dicho material matriz comprende colágeno nativo o geles o enrejados colagenosos construidos a partir de colágeno reconstituido o mezclas altamente complejas de colágeno reconstruido y una multitud de productos de la matriz extracelular o cualquier otro material matriz adecuado conocido por los expertos en la materia, la selección del cual no pretende limitar el alcance de la invención.

En otra forma más de realización preferida de la invención se proporciona un vendaje quirúrgico que comprende un material enrejado y un material matriz adecuado, al menos uno de los cuales tiene incorporado y/o embebido en su interior y/o asociado a él y/o unido al mismo tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma. De ser posible dicho vendaje quirúrgico es convencional, la selección del cual no pretende limitar el alcance de la invención.

En otra forma más de realización preferida de la invención se proporciona una composición terapéutica que comprende un vehículo adecuado para tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma, de ser posible dicho vehículo puede ser formulado para que tenga propiedades antibacterianas y/o propiedades antisépticas y mejor aún incluye además aditivos promotores del crecimiento y/o anestésicos locales. De ser posible, dicha composición terapéutica se puede adaptar para ser aplicada tópicamente en forma de células de la vaina dérmica suspendidas en una solución/gel/crema/emoliente vehículo adecuado; de forma alternativa dicha composición se puede adaptar para ser administrada mediante una inyección y de esta forma comprender una solución vehículo; de forma alternativa, dicho vehículo se puede incorporar y/o embeber en y/o asociarlo a y/o unirlo a un apósito o una venda o similar.

En otra forma más de realización preferida de la invención se proporciona un material matriz adecuado que tiene incorporado y/o embebido en su interior y/o asociado a él y/o unido al él tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma para su implantación.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma para su uso en un injerto reconstruido para su uso en el tratamiento de las lesiones de la piel en las que se requiere una reposición dérmica.

En otra forma de realización preferida de la invención dicho tejido y/o células se proporcionan o combinan además con al menos otro tipo celular, dicho tipo celular deriva de un folículo piloso y de ser posible comprende tejido de la papila dérmica y/o células derivadas de la misma.

En otra forma más de realización preferida de la invención se proporciona tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma para su uso en modelos in vitro, de ser posible, y opcionalmente, en combinación con al menos otra población celular derivada de la piel.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención se proporciona un sistema de curación de heridas tal como se ha descrito en la presente invención para su uso en el tratamiento de curación de heridas agudas y/o crónicas y/o leves y/o graves, y/o la reparación de cartílago y/o la reparación ósea y/o la reparación muscular y/o la reparación de tejido conectivo y/o la reparación de vasos sanguíneos.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención se proporciona tejido de la vaina dérmica y/o células adaptados de forma que proporcionen una capa protectora de células/cápsula en la que dicha capa de células/cápsula está situada adecuadamente sobre o alrededor de un órgano que va a ser injertado en un paciente/receptor. En este aspecto de la invención se explota la propiedad inmunoprotectora del tejido de la vaina dérmica y/o de las células derivadas de la misma.

En cualquiera de los aspectos anteriores de la invención dicho tejido de la vaina dérmica puede derivar del propio paciente y más preferiblemente de un donante.

En resumen, creemos que el tejido de la vaina dérmica y/o las células derivadas de la misma juegan un importante papel en la curación de heridas y/o los modelos de heridas porque se ha demostrado este tejido y/o las células derivadas del mismo participan en la contracción de las heridas, la reposición de la dermis de heridas incluyendo la reposición de una variedad de tipos de dermis dependiendo de la zona de la herida, incrementando la fuerza y el estado de la herida, dando soporte al crecimiento epidérmico, en la reducción de la cicatrización en este tipo de tejido; y/o en combinación con células de la papila dérmica pueden llevar a una curación de las heridas sin cicatriz. Además, este tipo de tejido se puede almacenar durante mucho tiempo a bajas temperaturas y sigue conservando las propiedades anteriormente mencionadas, pudiendo de este modo fabricar de forma fiable tratamientos para la curación de heridas y modelos celulares de heridas que se pueden almacenar a continuación para un uso futuro. Además, este tejido y/o células derivadas del mismo pueden subsistir largo tiempo en cultivo en condiciones de estrés extremo, de este modo los tratamientos para la curación de heridas y/o los modelos celulares de heridas de este tipo son de naturaleza robusta, otra ventaja favorable en cuanto al almacenamiento, y la aplicación posterior.

Se describe a continuación una forma de realización de la invención solamente a modo de ejemplo haciendo referencia a las Figuras que se encuentran a continuación en las que:

La Figura 1 representa una ilustración esquemática de un corte anatómico transversal de un trozo de piel.

La Figura 2 es una representación esquemática de los procedimientos.

La Figura 3 representa una evidencia gráfica de tejido de papila (P) y vaina dérmica (S) aislado microdiseccionado de la parte final de un bulbo de un folículo piloso del cuerpo cabelludo de un varón; tal como se muestra en la Figura 2e, marcado con un asterisco (*).

La Figura 4 representa una evidencia gráfica de dos fibras de pelo que han sido producidos en la inmediata vecindad de la herida en la piel de una mujer con un implante de vaina dérmica de varón, protegida con un pequeño collar de goma de silicona.

La Figura 5 representa una evidencia gráfica de la Figura 4 después de retirar el collar de silicona (y el apósito).

La Figura 6 representa una evidencia gráfica de un corte histológico de la región final de un bulbo de una folículo inducido, que revela una papila (P) teñida positivamente con azul Alcian.

La Figura 7 representa una evidencia gráfica de la porción inferior de un folículo inducido, que se puede observar se tiñe positivamente tras hibridación in situ con una sonda de ADN específica para el cromosoma Y, realizada por medio de un marcaje con digoxigenina.

La Figura 8 representa una evidencia gráfica de un corte de tejido que actúa como control negativo de la Figura 7 y representa piel de una mujer que no se ha teñido en absoluto con la sonda para el cromosoma Y unida a digoxigenina.

La Figura 9 representa una evidencia gráfica de la porción inferior de un folículo inducido teñido positivamente tras hibridación in situ con una sonda de ADN específica para el cromosoma Y, realizada con un marcador fluoróforo verde.

La Figura 10 representa una evidencia gráfica de un corte de tejido que actúa como control positivo para la Figura 9.

La Figura 11 representa una evidencia gráfica del lateral de un injerto a largo plazo (24 días) visto a gran aumento.

La Figura 12 representa una evidencia gráfica de la capacidad de las células de la vaina dérmica para diferenciarse a distintas células mesenquimales.

(A): Células de vaina dérmica humana cultivadas a largo plazo (más de un año).

(B): Células de la vaina dérmica que parece que se fusionan en forma de mioblasto (tipo músculo).

(C): Estructuras de tipo miotubo en cultivos de células de vaina dérmica.

(D): Adipocitos (productores de grasa).

(E): Condrocitos (tipo cartílago).

(F): Células precursores óseas productoras de minerales - Tinción de Von Kossa.

(G): Células de la vaina dérmica marcadas por inmunohistoquímica para alfa-actina de músculo liso.

(H): Células de vaina dérmica humana teñidas positivamente para miosina de músculo liso.

(I): Células de vaina dérmica marcadas positivamente para desmina.

La Figura 13 representa una evidencia gráfica de piel del margen de una herida en la que las células de la vaina dérmica han rodeado un folículo aislado en el tejido no dañado, lejos del grupo principal de células marcadas.

Enfoque experimental Aislamiento de tejido

Se afeitó groseramente un pequeño parche de piel del cuero cabelludo de un varón (aproximadamente 1,5 cm^{2}), dejando aún alguna fibra expuesta para poder arrancarla posteriormente. El área se limpió con una solución antiséptica y anestesió localmente con una inyección de lignocaína más adrenalina, antes de tomar una biopsia con sacabocados de 6 mm de diámetro en una ángulo apropiado para la orientación del folículo. Los extremos más proximales (por debajo de 1/5 de largo) de los folículos expuestos se amputaron de la biopsia invertida con la ayuda de un microscopio de disección (Zeiss), y se transfirieron a gotas individuales de medio esencial mínimo (Gibco) a 4ºC. Tras arrancar las fibras de pelo de los folículos transectos, la biopsia se devolvió a su sitio original en la piel del cuero cabelludo y se dejó que curase. Este procedimiento inicial duró aproximadamente 20-25 min. Véase la Figura 2 (a, a1, b, b1 y c) que es una representación esquemática de los procedimientos.

Las capas dérmicas de la porción más externa de la parte final del bulbo se invirtieron para poder raspar y descartar la matriz epidérmica (incluido el tejido indiferenciado) (Fig. 2d). Las papilas dérmicas, aisladas por ruptura de la capa basal (Fig. 2e), se juntaron en medio fresco (Fig. 2h). La fina cobertura externa de tejido conectivo se separó de las piezas de dermis con vainas, antes de juntarlas de forma similar en medio fresco. (Fig. 2g e i). La Figura 3 representa una evidencia gráfica de tejido aislado de papila (P) y vaina (S) dérmica microdiseccionado de la parte final del bulbo de un folículo piloso del cuero cabelludo de una varón, tal como se muestra en la Figura 2e marcado con un

\hbox{asterisco (*).}

Implantaciones

Estas operaciones fueron mínimamente invasivas hasta el punto de ser prácticamente imperceptibles, por lo tanto no se consideró necesario ningún pretratamiento con anestesia local. Esto también evitó la posibilidad de que el anestésico pudiera afectar negativamente a las pequeñas cantidades de dermis vulnerable que se iban a implantar.

Se hizo una pequeña herida, superficial, en la parte interna del antebrazo de la mujer receptora con el extremo de una hoja de escalpelo, y se amplió ligeramente empleando los extremos de fórceps "relojeros" muy finos (Nº 5) (Fig. 2j). En los instantes siguientes, cuando exudaba una pequeña cantidad de sangre o fluido, se absorbía con pequeñas bolas de algodón estériles. Se realizaron dos grupos de operaciones.

En el primero, se implantó tejido de la vaina dérmica de doce folículos en dos heridas (seis en cada), aproximadamente 10 horas tras haber retirado la parte final de los bulbos de la biopsia. El segundo conllevó la implantación de 11 piezas de vaina dérmica en una herida, 9 papilas dérmicas en una segunda herida, y 2 papilas (que se pegaron a los fórceps y tuvieron que ser implantadas de nuevo, por separado) en una tercera herida, alrededor de 20 horas tras la biopsia. En todos los casos, el material se recolectó en la menor cantidad de fluido posible y se transfirió directamente a la zona de la herida, de forma que se pudiese insertar rápidamente en la piel desde el extremo de los fórceps. Al inicio las heridas se dejaron sin tratar y sin tapar. Cuando se vio que emergían fibras de pelo de los lugares de implantación (3-4 semanas más tarde), se colocaron sobre ellas anillos de silicona con borde y se aseguraron empleando cinta quirúrgica - como medida de precaución para proteger frente a la abrasión, rogamos que se vea la Figura 4, que representa una evidencia gráfica de dos fibras de pelo que se han producido en la vecindad inmediata de la herida en la piel de la mujer con un implante de vaina dérmica de varón protegida con un pequeño collar de goma de silicona y la Figura 5 que representa una evidencia gráfica de la Figura 4 tras la retirada del collar de silicona (y el apósito).

El primer grupo de dos heridas se biopsió de forma conjunta como una sola pieza elíptica de piel, 77 días tras la implantación de tejido de la vaina, y se fijó inmediatamente con paraformaldehído al 4% a pH 7,3 recién preparado. El segundo grupo de heridas (realizado 3 meses tras el primero) se trató de forma similar - siendo retirado 42 días tras la operación como dos pequeñas biopsias con sacabocados (4 mm) (localizados más precisamente por su posición cerca de lunares). Se realizaron, en intervalos regulares, observaciones externas detalladas y registros fotográficos de los lugares del cuero cabelludo del donante varón y de la piel del brazo de la mujer receptora.

Sonda para el cromosoma Y marcada con un fluoróforo (Imagenetics)

La sonda centroespecífica marcada con el fluoróforo Spectrum green (Imagenetics) consistía en secuencias cromosoma-específicas de ADN satélite humano altamente repetido. El ADN diana en las secciones de tejido se desnaturalizó con formamida al 70%/SSC 2x a 70ºC durante 10 minutos. Mientras tanto, se preparó la mezcla de la sonda para que contuviese: 7 \mul de tampón de hibridación SpectrumCEP (sulfato de dextrano, formamida, SSC, pH 7,0), 1 \mul de sonda SpectrumCEP (sonda centroespecífica marcada con un fluoróforo y ADN bloqueante en tampón Tris-EDTA) y 2 \mul de solución bloqueante 5x (tal como se ha detallado más arriba), todo ello se centrífugo (1-3 s), se calentó durante 5 min en un baño de agua a 75ºC y se puso en hielo. Los portaobjetos desnaturalizados se lavaron en etanol 70%, 85% y 100% (1 min cada uno) y se secaron al aire. Cada portaobjetos, calentado hasta 45ºC, recibió 10 \mul de mezcla de sonda y se colocó un cubreobjetos silanizado que se selló por los bordes antes de incubar los portaobjetos en una caja húmeda a 42ºC durante 18 horas. Tras la hibridación y la retirada del cubreobjetos, los portaobjetos se lavaron durante 3 x 10 min en formamida 50%/SSC 2x; 10 min en SSC 2x, y 5 min en SSC 2x/NP-40 0,1%, todos con solución de Denhardts, 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado, 1% de leche en polvo y 0,1% de Tween-20 y todo ello a 45ºC. Los portaobjetos se dejaron secar en la oscuridad y se realizó, en cada uno de ellos, una contratinción con 10 \mul de yoduro de propidio (Imagenetics) y se puso un cubreobjetos.

Sonda para el cromosoma Y marcada con digoxigenina (Boehringer Mannheim)

Cada portaobjetos recibió 20 \mul de la mezcla de hibridación, que consistía en 10 \mul de formamida (50% del volumen final); 5 \mul de la solución de hibridación 4x; 2,5 \mul de sonda (50 ng); 2,5 \mul de la solución de bloqueo 8x. La mezcla se cubrió con un cubreobjetos de cristal silanizado, se selló y se desnaturalizó a continuación durante 5->10 minutos a 72ºC sobre una plancha de cristal previamente templada en el horno, antes de incubarla en una cámara húmeda a 37ºC durante toda la noche. Los portaobjetos se lavaron 3 x 5 min en SSC 2x, antes de hacerlo durante 30 min en 50 ml de TBS con solución de bloqueo 1x (como arriba) y 1% de reactivo bloqueante del kit de Boehringer - ambos también a 37ºC. Para promover la detección, los portaobjetos se transfirieron a 50 ml de TBS y 50 \mul de conjugado con fosfatasa alcalina anti-digoxigenina (200 \mug/ml) que contenían 1% de reactivo bloqueante del kit, durante 30 min a 37ºC, y se lavaron 3 x 10 min en Tween-20 0,2% en TBS a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de su uso, se añadieron 4,5 \mul de NBT, 3,5 \mul de fosfato-X y 0,24 mg de levamisol (Sigma) a 1 ml de tampón Tris/NaCl/MgCl_{2}. Se añadieron volúmenes apropiados para el número y el tamaño de los cortes y los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente en una caja húmeda cubierta con papel de aluminio hasta que apareció el color azul oscuro/morado. Para parar la reacción, los portaobjetos se enjuagaron durante 5 min a temperatura ambiente en Tris-Cl 10 mM/Na2 EDTA 1 mM, pH 8,0.

Los portaobjetos que se contratiñeron con yoduro de propidio se incubaron 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad en 50 ml de TBS + 5 \mul de yoduro de propidio (1 mg/ml), o una concentración similar de amarillo de acriflavina, se lavaron durante 2-3 min bajo un chorro de agua corriente, y se dejaron secar en la oscuridad. Por último, los portaobjetos se montaron en 20 \mul de solución anti-apagamiento bajo un cubreobjetos de cristal, que se selló en los bordes con esmalte de uñas.

Experimentos de contracción de heridas y cierre de heridas Experimentos de contracción de gel de colágeno

Se aislaron poblaciones específicas de células humanas de un adulto por microdisección precisa de los tejidos apropiados (desperdicios de operaciones anteriores en varones y mujeres donantes de 25-45 años), que se usaron entonces para iniciar cultivos celulares a partir de un explante. También se empleó un enfoque similar para establecer las distintas edades de células de roedores (tal como se detalla más abajo). Los cultivos primarios (humano y de rata) se pasaron aproximadamente 2 a 3 semanas tras su inicio, y todos los experimentos se realizaron con células de segundo o tercer pase en las 2 a 4 semanas posteriores.

Se preparó una solución de colágeno tipo I a partir de tendones de cola de rata adulta (20, 21). En resumen, 1 g de tendón de cola U.V./esterilizado con etanol se agitó en 300 ml de ácido acético 0,5 M estéril durante 48 horas a 4ºC. La solución resultante se filtró a continuación a través de varias capas de gasa estéril, se centrifugó a 2500 g durante 3 horas, y se dializó durante 24 horas frente a agua destilada antes de someterlas a otra centrifugación. El gel de colágeno (que se solidifica a 37ºC) se preparó mezclando la solución de colágeno con una décima parte de su volumen de MEM concentrado 10x y aproximadamente la mitad de su volumen de NaHCO_{3} 4,4% para dar un pH final de 7,3. Cada población se sembró a la misma densidad de 10^{5} células por ml de gel de colágeno, del cual se pusieron 1,5 ml en cada placa petri de 35 mm a 37ºC (95% de aire/5% de CO_{2}) para que se solidificara y se cubrió entonces con 0,5 ml de MEM (tiempo considerado = 0). Se registró el diámetro de 20-24 distintos geles de colágeno para cada tipo celular, cada 4-6 horas durante un periodo de 5 días. Se añadió más medio en pequeños incrementos a medida que los geles se encogían.

Se llevaron a cabo más experimentos para investigar la "unión" de los bordes de cortes de piel. Se hicieron cortes estandarizados en pequeñas piezas rectangulares de piel humana, verticales a través de tres cuartas partes de su largo u horizontales justo a través de ellos, justo por debajo de la epidermis. Las superficies de los cortes se apretaron entre ellas junto con fibroblastos de la piel, células de papila dérmica, vaina dérmica o músculo liso (que habían sido acumuladas en montones "pegajosos" de células viables con un raspador de goma) y se intercalaron posteriormente entre ellas. Placas petri de células muy confluentes fueron fuentes muy superiores que aquellas que tenían un número bajo, puesto que produjeron acumulaciones más pegajosas de células. Todas las piezas de piel se cultivaron en un entorno no líquido, es decir que se encontraban en una superficie permanentemente húmeda en una atmósfera húmeda a 37ºC, pero nunca flotando ni sumergidas en medio.

Almacenamiento de tejido de la vaina dérmica Almacenamiento a baja temperatura de tejido/células de la vaina dérmica; además de su sometimiento a condiciones adversas para resaltar las características de tipo célula madre - incluida la capacidad de supervivencia preferente

Muestras de piel humana (tal como se ha detallado justo arriba) se limpiaron y se microdiseccionaron apropiadamente para proporcionar: (a) porciones de 3 mm^{2} de piel completa; (b) folículos pilosos aislados; (c) fragmentos de membrana vítrea intercalada entre finas capas de dermis de la vaina y epidermis de la ORS, y (d) cultivos primarios de células de la vaina dérmica (preparadas tal como se ha descrito más arriba). Cada uno de estos cuatro niveles de complejidad tisular se sometió entonces a seis formas de condiciones adversas (cada una repetida con o sin suero, y/o, glucosa y glicerol): (i) almacenamiento prolongado a baja temperatura de 4ºC; (ii) ciclos repetidos de congelación/descongelación a -20ºC; (iii) almacenamiento congelación/descongelación a -80ºC en DMSO.

Resultados Implantes de vaina

Todas las zonas en las que se había implantado tejido de la vaina dérmica curaron rápidamente y de una forma que parecía típica de cualquier lesión superficial de la piel. Se formaron finas y estrechas costras a medida que la zona se secaba, que se perdieron a continuación a lo largo de los días siguientes para dejar una herida muy tenue, que era casi imperceptible al cabo del décimo día aproximadamente. No había ningún signo externo de cualquier reacción inflamatoria en o alrededor de las heridas, ni ninguna percepción física de la zona. El extremo de una fibra más oscura y desproporcionadamente más robusta para su longitud que cualquiera de los pelos vellosos locales de la piel de los brazos, se observó por primera vez en el día 24 tras la introducción de la vaina dérmica. En el día 33 post-implantación, se vio que había emergido una segunda fibra mucho más delgada y sin pigmento justo al lado de la primera. También era visible una salpicadura muy ligera de material pigmentado debajo de la superficie de la piel, en la inmediata vecindad de las zonas curadas. Además, se podía ver una línea oscura de material por debajo de la piel directamente por detrás de la base de la fibra mayor (véanse las Figuras 4 y 5). Esto representaba casi con toda seguridad una continuación de la longitud del pelo expuesto, e indicó que el folículo productor del mismo estaba embebido superficialmente y en un ángulo y orientación inusuales en relación con los folículos locales. Ambas fibras se incrementaron en masa y longitud a lo largo de las semanas siguientes, pero esto fue más pronunciado en la fibra pigmentada que se hizo más obviamente robusta y de este modo morfológicamente diferente del pelo local (véanse las Figuras 4 y 5). La fibra blanca más delgada estaba cubierta por una fina capa (o saco) de células secas, pero por el contrario, era similar en tamaño y apariencia general a los pelos vecinos no inducidos. Veintiún días tras el segundo grupo de operaciones (iniciado tres meses tras el primero) una fibra (otra vez más oscura y más fuerte que el pelo local) se vio en la zona de implantación de la vaina. Tras un espacio de tiempo similar más, de tres semanas, este pelo fuertemente pigmentado creció más grueso y se volvió más curvo. Esta zona se biopsió el día 42.

El examen histológico de las zonas en las que se había implantado vaina confirmó que los dos grandes folículos que habían producido externamente fibras de tipo terminal, tenían todos los componentes característicos. Por ejemplo, las papilas dérmicas grandes y ovaladas (positivas para azul Alcian) (Fig. 6, leyenda P) que tenían una matriz epidérmica pigmentada superpuesta, y se podían ver claramente, en cortes transversales, capas concéntricas de tejido típicas de los folículos. Sin embargo, estos folículos eran algo diferentes de la población vellosa local en cuanto a su: gran tamaño; profundidad de crecimiento superficial en el interior de la piel, y un ángulo de orientación inusual paralelo a la superficie de la piel. Estas características independientes y opuestas sugieren claramente que los apéndices mayores fueron inducidos.

Notablemente, ninguno de los materiales trasplantados se trasplantó en una zona inmunoprotegida.

También se observaron más folículos pequeños en posiciones aleatorias y dispuestos en y alrededor de las zonas post-experimentales de las heridas, y mientras que se podían haber formado de novo también, su situación no puedo ser interpretada basándose en criterios morfológicos solamente.

Evidencia que apoya el inmunoprivilegio tal como se ilustra por hibridación in situ

Ambos controles tanto positivo (véase la Figura 7 que representa una evidencia gráfica de la porción inferior de un folículo inducido que se puede ver se tiñe positivamente tras hibridación in situ con una sonda de ADN específica para el cromosoma Y, realizada con un marcaje con digoxigenina) como negativo (véase la Figura 8 que representa una evidencia gráfica de un corte de tejido que actúa como control negativo de la Figura 7, y representa la piel de una mujer que no se tiñe en absoluto con la sonda para el cromosoma Y unida a digoxigenina) tiñeron de forma apropiada para confirmar la validez de la metodología básica de los protocolos.

En el primer grupo de cortes experimentales de tejido, ambas sondas de ADN específicas para el cromosoma Y reconocieron algunos de los folículos más pequeños en las zonas de herida, así como los grandes inducidos más predecibles. Solamente las regiones más inferiores de los folículos más pequeños, de hecho, poco más que las regiones finales de los bulbos, se tiñeron repetidamente de forma positiva con las sondas (comparen las Figuras 7 y 8), que se visualizan con digoxigenina o fluoróforo Spectrum green para indicar las células de origen masculino. Desgraciadamente, la resolución morfológica del tejido no era adecuada para interpretar la distribución de las sondas al nivel de las células individuales, o incluso las capas de tejido. Sin embargo, se consideró que el hecho de que la sonda marcada tanto con el fluoróforo (véase la Figura 9 comparado con la Figura 10) como con digoxigenina (Figura 7 comparado con la 8) reconociese regiones prácticamente idénticas del tejido de folículos como positivas, reforzaba los resultados.

Evidencia experimental que apoya la capacidad de las células de la vaina dérmica para proporcionar una reposición a largo plazo de la dermis de la piel

Las células de la vaina dérmica se combinaron con células provenientes de folículos pilosos y se injertaron, en el interior de una cámara que separaba el injerto de las células de la piel circundante, en un animal.

Las células de la vaina dérmica formaron una dermis muy buena con una densidad celular uniforme y ningún signo de formación anormal de colágeno. También interaccionaron con la epidermis para producir una cubierta gruesa de epidermis. Se formó una membrana basal completa y normal entre la vaina dérmica y la epidermis. Donde la cámara que rodeaba al injerto había sido eliminada, el infiltrado de células blancas sanguíneas que se había formado en el exterior del injerto no parece que entre en la zona con piel nueva. Véase la Figura 11 que representa una visión a gran aumento del lateral de un injerto a largo plazo (24 días). La línea de infiltrado de células blancas sanguíneas de mayor densidad, a la izquierda, no ha invadido el injerto. En la dermis, los haces de colágeno están estructurados, las células dérmicas están distribuidas de forma regular y se evidencia una membrana basal completa y normal.

Evidencia experimental que apoya el potencial de célula madre de las células de la vaina dérmica

La Figura 12 (A-I) representa una evidencia gráfica de la capacidad de las células de la vaina dérmica para diferenciarse a distintas células mesenquimales y, por lo tanto, de su potencial de célula madre. Se puede observar que estas células se pueden diferenciar a miotubos, adipocitos, condrocitos y células óseas productoras de minerales. Una evidencia más sorprendente es que se vio que el tejido de folículo piloso, obtenido de individuos situados dentro del intervalo de edad de 95-105 años, era viable y capaz de actuar como una fuente productora para el inicio de un cultivo celular. Este dato apoya la hipótesis de que la capacidad de las células madre para diferenciarse y reproducirse permanece constante durante toda la vida (22). Además, la congelación y descongelación repetidas de células primarias de la vaina dérmica y la clonación posterior no alteraron su potencial para exhibir al menos cuatro fenotipos distintos a pesar de su exposición previa a condiciones adversas.

Evidencia experimental que apoya el potencial para contribuir a cualquier linaje de la vaina dérmica de los folículos Miotubos musculares

Se observaron subpoblaciones de pequeñas células en forma de huso, tanto individualmente como en distintos estados de fusión (al igual que se puede observar con frecuencia en cultivos preparados de forma rutinaria), algunas formando largas ramificaciones, estructuras multinucleadas de tipo miotubo.

Una proporción de estas células se tiñó positivamente con anticuerpos monoclonales frente a miosina, desmina y/o alfa actina de músculo liso. (Hubo incluso una ocasión curiosa en el pasado cuando observamos latidos rítmicos espontáneos, es decir contracciones, de largas agregaciones de estas células de tipo precursor de músculo en nuestras placas petri).

Adipocitos

Estas células se identificaron por su apariencia multivesicular característica y el hecho de que el material contenido en las vesículas se tiñera de rojo con Sudan IV, y mostrando, de este modo, que eran lípidos neutros saturados.

Condrocitos

Se ven como acumulaciones de células redondeadas con un material pericelular positivo con azul Alcian pH 1,0 que serían proteoglicanos condroitin y queratán sulfato, y lagunas entre muchas de las células - (de forma interesante se observa un comportamiento celular similar cuando células de la vaina dérmica de rata se mezclan con cartílago microdiseccionado de oreja in vitro). Esto también parece estar relacionado con nuestras observaciones in vivo, cuando las células de vaina dérmica implantadas parecen inducir hiperplasia en el cartílago de la oreja normalmente inactivo.

Células óseas productoras de minerales

Estas células se identificaron por su formación de agregados en los que la matriz aparecía mineralizada y se teñía positivamente para fosfatos de calcio, tras tratarlas por el procedimiento de von Kossa.

Se observaron otros tipos característicos de células en nuestros cultivos celulares de vaina dérmica (incluyendo interesantes poblaciones dendríticas) pero hasta ahora éstas permanecen sin definir con exactitud.

Evidencia experimental que apoya a las células de la vaina dérmica como sustitutos de fibroblastos en las lesiones de la piel

Se implantaron células de la vaina dérmica y fibroblastos marcados con un colorante fluorescente (DiI) en heridas de la piel en un gel de colágeno, las células de la vaina dérmica sobrevivieron en comparación con las células de la piel más de 10 días y se observó que penetraban más lejos en la piel del huésped. Las células de la vaina dérmica también demostraron ser capaces de migrar y de incorporarse a la piel normal en zonas alejadas de la herida en sí (véase la Fig. 13 que representa una evidencia gráfica de piel en el margen de una herida y en la que las células de la vaina dérmica han rodeado un folículo aislado alejado en el tejido no dañado).

Evidencia que apoya la contracción de las heridas

La contracción de la herida es una parte muy importante del procedimiento por el cual la piel cura, y se cree que una población transitoria de células llamadas miofibroblastos, efectúan este cierre de la zona dañada por contracción. La fuente exacta de los miofibroblastos no ha sido identificada hasta la fecha, pero se caracterizan por su expresión de alfa actina de músculo liso.

Llevamos a cabo estudios que comparaban las aptitudes de células dérmicas foliculares y no foliculares de ratas de tres edades diferentes, y de distintas zonas de piel en humanos adultos, para contraer geles enrejados de colágeno. Los tipos celulares de humano adulto implicados eran derivados de fibroblastos de la piel de cuatro zonas diferentes del cuerpo; concretamente células de músculo liso, papila dérmica de folículos del cuero cabelludo y, células de la vaina dérmica de folículo inferior, medio y superior. Las células de roedor derivaban de fibroblastos de la piel de animales recién nacidos, de 14 días, y adultos de cuatro zonas diferentes del cuerpo, (oreja, hocico, dorsal, cojinete plantar); células de músculo liso aórtico, y células de la papila y la vaina dérmicas de folículos de las vibrisas.

Los resultados mostraron que todos los tipos de células dérmicas derivadas de folículos eran capaces de contraer geles en mucho mayor medida (aproximadamente el doble) que las células de músculo liso, o los fibroblastos de la piel de cualquiera de las regiones del cuerpo. La capacidad contráctil de las células dérmicas derivadas de vibrisas de rata adulta, fue similar a la de fibroblastos de la piel y células de músculo liso de rata recién nacida. Si bien, en cualquiera de los grupos de edad, las células derivadas de folículos siempre fueron más contráctiles que tanto los fibroblastos de la piel como las células de músculo liso (que se comportaron de forma similar).

De los cuatro tipos celulares estudiados, las células de la vaina dérmica fueron de lejos los promotores más capaces del procedimiento de "unión". Ellas solas formaron uniones estables entre dos bordes dañados de una porción de piel, tanto si el corte se había hecho vertical u horizontalmente. Ocasionalmente, parecía que habían sellado realmente entre ellas las superficies del corte, ya que no se evidenciaban espacios externamente por ser la epidermis suprayacente continua. Las células de la papila dérmica, mientras que fueron mucho menos eficaces que la vaina dérmica (tal vez una tercera parte igual de buenas), fueron mejores que los controles sin células. La capacidad de las células de músculo liso para efectuar la reasociación del tejido pareció igual que si no se hubieran introducido células en las heridas, pero los fibroblastos de la piel parecieron realmente obstaculizar cualquier "cierre" posible.

Aunque se llevó a cabo in vitro, este trabajo apoya la proposición de que las células dérmicas derivadas del folículo pueden promover los procedimientos de curación de heridas in vivo.

Almacenamiento de tejido de la vaina dérmica

Nuestras investigaciones ha demostrado que el tejido de la vaina dérmica y/o células derivadas de la misma se pueden almacenar a largo plazo a bajas temperaturas y aún pueden crecer, cuando se someten a las condiciones adecuadas. Esto tiene, claramente, implicaciones importantes en el almacenamiento de tratamientos para la curación de heridas, y concretamente, el almacenamiento de injertos o "piel viva" hechas de los mismos.

Además, nuestras investigaciones han demostrado también que las células de la vaina dérmica pueden persistir durante largo tiempo en cultivo bajo un estrés extremo. Esto también tiene importantes implicaciones para los tratamientos para la curación de heridas derivados de este tipo de tejido e implica que el tipo de tejido es adecuadamente robusto y exhibe las características de célula madre de durabilidad y viabilidad.

En resumen, no sólo el tejido de la vaina dérmica y/o las células derivadas de la misma tienen todas las propiedades ventajosas que uno esperaría encontrar en un tipo de tejido para la curación de heridas sino que también tienen propiedades que facilitan el uso del tejido en cuanto a fabricación y almacenamiento a largo plazo.

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Claims

1. El uso de células/tejido de la vaina dérmica para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
heridas.

2. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1 en el que dicha(s) célula(s) de la vaina dérmica se deriva(n) de una porción seleccionada de un folículo piloso.

3. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2 en el que dicha porción seleccionada es el tercio inferior de un folículo piloso.

4. Un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dicha(s) célula(s) de la vaina dérmica deriva(n) de un anillo de células en torno a un folículo piloso.

5. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 4 en el que dicho anillo de células es un anillo interno de células respecto a la región dérmica o mesenquimal del folículo piloso.

6. Un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicha(s) célula(s) de la vaina dérmica se tiñe(n) positivamente para la alfa actina de músculo liso.

7. Un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que dicha(s) célula(s) de la vaina dérmica se proporciona(n), o se combina(n), con al menos otro tejido o tipo celular, proveniente de un folículo piloso.

8. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 7 en el que dicho otro tejido o tipo celular comprende papilas dérmicas o células derivadas de la misma.

9. Un uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8 en el que dicho medicamento comprende un material matriz adecuado.

10. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 9 en el que dicho material comprende colágeno nativo, o geles o enrejados colagenosos construidos a partir de colágeno reconstituido o mezclas altamente complejas de colágeno reconstituido.

11. Un uso de acuerdo con las Reivindicaciones 9 ó 10 en el que dicho medicamento comprende además una red de material sobre la que se aplica dicha matriz, de forma que dicha matriz que incluye dicha(s) células(s) de la vaina dérmica se incorpora o embebe en el mismo, o se asocia a o se une a dicha red.

12. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 11 en el que dicho sistema comprende un vendaje quirúrgico.

13. Un uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12 en el que dicho medicamento comprende además al menos un agente terapéutico seleccionado.

14. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 13 en el que dicho agente terapéutico seleccionado tiene propiedades anti-bacterianas o propiedades anti-sépticas.

15. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 13 en el que dicho agente terapéutico tiene propiedades anestésicas.

16. Un uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 15 en el que dicho medicamento está adaptado para su aplicación tópica.

17. Un uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 en el que dicho medicamento está adaptado para su administración por inyección.

18. Un uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 en el que dicha composición terapéutica está incorporada o embebida en, asociada a, o unida a, un apósito o venda.

19. Un vendaje quirúrgico que comprende un material matriz adecuado que tiene incorporado y/o embebido en su interior, y/o asociado al mismo, y/o unido al mismo, un medicamento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 18.

20. Un sistema de modelado in vitro de heridas que comprende el medicamento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

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21. Un medicamento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en el que dicha(s) célula(s) de la vaina dérmica deriva(n) de un donante.