DE69820254T2

DE69820254T2 - Dermales hüllgewebe in der wundheilung

Info

Publication number: DE69820254T2
Application number: DE69820254T
Authority: DE
Inventors: J. Amanda JAHODA; A. B. Colin JAHODA
Original assignee: University of Durham
Current assignee: Jahoda Colin Albert Buchanan Durham Gb; University of Durham; Centre of Excellence for Life Sciences Ltd
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2018-04-15
Also published as: WO1998048860A1; ES2212285T3; ATE255426T1; JP4567105B2; EP0980270B1; EP0980270A1; JP2002507132A; GB9708692D0; DE69820254D1; CA2287507A1; BR9809351A; AU7059898A; AU738028B2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von dermalem Hüllgewebe, und/oder von aus ihm stammenden Hüllzellen, und/oder Abschnitten von Haarfollikeln, die diese oder andere Zellpopulationen umfassen, für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Wunden.
Die Haut ist ein hochkomplexes Organ, das die äußere Oberfläche des Körpers bedeckt und sich an verschiedenen Körperöffnungen mit den Schleimhäuten der Verdauungs- sowie anderer Kanäle verbindet. Sie hat vielfältige Funktionen wie die Verhinderung des Wasserverlustes des Körpers, agiert jedoch in erster Linie als Schutzschild gegen die Wirkung von physischen, chemischen und bakteriologischen Mitteln auf tiefer liegendes Gewebe. Die Haut ist elastisch und sie ist, mit Ausnahme einiger weniger Stellen wie den Handflächen, Fußsohlen und Ohren, locker an das darunterliegende Gewebe angehaftet. Ihre Dicke variiert von 0,5 mm (0,02 Inch) auf den Augenlidern bis 4 mm (0,17 Inch) oder mehr an den Handflächen und Fußsohlen.
Die Haut besteht aus zwei Schichten (vgl. bitte 1, die eine anatomische Querschnittsansicht durch einen Hautabschnitt darstellt), die äußere Schicht, die vergleichsweise dünn ist (0,1 mm) wird Epidermis oder Cuticula genannt, sie ist mehrere Zellen dick und weist eine äußere, hornige Schicht aus toten Zellen auf, die andauernd von der Oberfläche abgestoßen werden Band von unten durch eine Basalzellschicht ersetzt werden, die Stratum Germinativum genannt wird. Die Epidermis besteht überwiegend aus Keratinozyten, die über 95% der Zellpopulation ausmachen, der Rest umfasst dentritische Zellen wie zum Beispiel Langerhans- Zellen und Melanozyten. Sie ist im Wesentlichen zellulär und nicht-vaskulär, wobei es eine relativ kleine extrazelluläre Matrix gibt, außer der Kollagenschicht und anderen Proteinen unter der Basalschicht der Keratinozyten. Die Keratinozyten der Basalschicht teilen sich ständig und die Tochterzellen bewegen sich danach nach außen, wo sie eine Phase der Differenzierung erleben und schließlich von der Oberfläche abgelöst werden. Die innere Hautschicht wird Dermis genannt und besteht aus einem Netz aus kollagenem extrazellulärem Material, elastischen Fasern, Blutgefäßen und Nerven. In ihr sind Haarfollikel mit anhängenden Talgdrüsen (gemeinhin bekannt als die Haarfollikel-Talgdrüsen-Einheit) und Schweißdrüsen enthalten. Die Schnittstelle zwischen der Epidermis und der Dermis ist extrem unregelmäßig und besteht aus einer Reihe aus Papillen oder fingerähnlichen Vorsprüngen. Unter den basalen Epidermiszellen entlang dieser Schnittstelle ist die spezialisierte extrazelluläre Matrix in eine deutliche Struktur gegliedert, die die Basalmembran genannt wird.
Die Haarfaser von Säugetieren ist das Produkt eines kleinen Gewebsstiftes, der als Haarfollikel bekannt ist, der direkt unter der Oberfläche der Haut liegt. Der distale Teil dieses Follikels setzt sich direkt außen mit der kutanen Epidermis fort. Obwohl der Follikel klein ist, weist er ein hochorganisiertes System von erkennbar verschiedenen Schichten auf, die in konzentrischen Serien angeordnet sind. Aktive Haarfollikel erstrecken sich nach unten durch die Dermis, die Hypodermis (eine lockere Schicht von verbindendem Gewebe) und durch die Fettschicht oder die adipöse Schicht.
Am untersten Ende eines jeden aktiven Follikels befindet sich der Haarbulbus, der aus einem Körper aus dermalen Zel len besteht, die als Hautpapille bekannt sind, die in einer invertierten Schale aus epidermalen Zellen, die als die epidermale Matrix bekannt sind (siehe bitte 1), enthalten sind. Unabhängig von der Art des Follikels wird die Haarfaser, zusammen mit mehreren unterstützenden Epidermalschichten, durch keimentwicklungsfähige Epidermiszellen am unteren Ende dieser epidermalen Matrix hergestellt. Die unterste dermale Hülle ist mit den Papilla-Basal-Stielen verbunden, von wo sie sich als eine dünne Gewebshülle außen um alle epidermalen Schichten der Haarmatrix legt und sich dann als ein Schlauch oder eine Hülle über die Länge des Follikels ausdehnt. Die dermale Hülle ist ansonsten als Bindegewebshülle bekannt.
Die Entwicklung von Hautfortsätzen wie Federn und Haarfollikel beruht auf der Interaktion zwischen den zwei Schichten der Haut, der Epidermis und der Dermis. Bei der embryonalen Entwicklung untermauert ein sequentieller Informationsaustausch zwischen diesen Schichten eine komplexe Serie von morphogenen Prozessen, die in der Bildung der adulten Follikelstrukturen ihren Höhepunkt erreicht. Nach der Reife und im Gegensatz zu allgemeinen dermalen und epidermalen Hautzellen, behalten bestimmte Haarfollikelzellpopulationen embryonenartige induktive, interaktive und biosynthetische Verhaltsweisen bei. Diese Eigenschaften stammen wahrscheinlich aus der sehr dynamischen Natur der zyklisch produktiven Follikel, bei der die wiederholte Umgestaltung des Gewebes ein hohes Niveau an interaktiver Kommunikation zwischen der Dermis und der Epidermis benötigt, wie es für die embryonale Entwicklung lebensnotwendig ist und wie es für jede Form der Gewebsneubildung wünschenswert wäre.
Die Haarfaser wird ganz unten an einem aktiven Follikel mit einer sehr großen Geschwindigkeit hergestellt (0,4 mm pro Tag bei den Follikeln in der menschlichen Kopfhaut und bis zu 1,5 mm pro Tag bei den Vibrissen oder Tasthaaren der Ratte), was bedeutet, dass die Zellvermehrung in der Follikelepidermis zu den schnellsten unter den adulten Geweben (1) zählt.
Der dynamischste Bereich des Haarfollikels ist der tief eingebettete Endbulbus, wo lokale Dermale-Epidermale Interaktionen aktives Faserwachstum antreiben. Derselbe Bereich spielt ebenfalls eine Schlüsselrolle bei den entwicklungsbedingten Veränderungen sowie bei Neubildung des Gewebes, die bei dem präzisen Wechsel zwischen Wachstums- und Regressionsphasen der Haarfasern oder deren Fortsätzen eine Rolle spielen. Als Schlüsselfigur bei diesen Aktivitäten scheint die Hautpapille das komplexe Programm der Differenzierung zu steuern, das die Haarfaserbildung aus der einfachen keimfähigen Epidermiszellquelle (2–5) kennzeichnet.
Die niedrigste dermale Hülle beginnt unter dem basalen Papilla-Stiel, von wo es sich hinaus und hoch schlängelt, um äußerlich alle der Schichten der epidermischen Haarmatrix als eine dünne Gewebshülle einzuschließen. (Siehe bitte 1). Die dermale Ummantelung setzt sich als eine tubulusförmige Anordnung über die Länge des Follikels fort, ebenso wie die epidermische äußere Wurzelhülle, die direkt innerhalb von ihr liegt; zwischen den zwei Schichten liegt eine spezialisierte Grundmembran, die als glasige Membranbezeichnet wird. Die äußere Wurzelhülle stellt nur etwas mehr als eine epidermische Monoschicht in dem untern Follikel dar, je näher sie an der Oberfläche liegt, wird sie zunehmend dicker.
Pionierstudien stellten fest, dass Follikel der Tasthaare von Ratten, deren Endbulbus abgenommen worden war, alle der entscheidenden Elemente, die zur Wiederherstellung des Faserwachstums (6) benötigt wurden, regenerieren konnten. Sie fanden zudem heraus, dass die isolierte Hautpapille besonders kräftige interaktive Fähigkeiten aufwies, da sie in der Lage waren, komplett neue Haarfollikel zu induzieren, wenn sie in vivo (2) wieder eingepflanzt wurden. Nachfolgende Experimente erbrachten weitere stützende Erkenntnisse, zusätzlich zu dem, was bei den Ratten herausgefunden wurde (4, 7–9), und bestätigten, dass Papillen von anderen Arten, einschließlich Mäusen, (10, 11) und Schafen (12) ähnliche interaktive Fähigkeiten aufwiesen. Es wurde ebenfalls berichtet, dass menschliche Gesichts- (13) und Achsel- (14) Follikel in situ, ebenso wie isolierte menschliche Follikel, die Nagetierwirten (15) transplantiert wurden, sich folgend auf die Amputation wieder regenerieren konnten. Weitere Studien in vitro legten ausdrücklich nahe, dass menschliche Follikelgewebe und Zellen die hochspezialisierten interaktiven Eigenschaften zeigten, die bei ihren Nagetier-Gegenstücken (16) zu sehen waren.
Während die individuellen anatomischen Komponenten und die Unterpopulationen der Hautzellpopulationen gut untersucht sind, bleiben ihre intra/inter-biochemischen Interaktionen und Kontrollmechanismen größtenteils ein Fall für Spekulationen und eingehende Untersuchung.
Die Zerstörung von großen Bereichen der Haut wird durch Verletzung, Verbrennungen, Krankheit oder durch große Geschwüre hervorgerufen. Die Regeneration der Haut über abgeschürften Bereichen findet natürlicherweise durch Zellvermehrung aus den umgebenden Rändern der gesunden, unbeschädigten Haut und den darunterliegenden Hautfortsätzen statt, wenn diese noch vorhanden sind. Ein besonderes klinisches Problem, das natürlich als ein Ergebnis von Wundheilung auftritt, ist hypertrophe Vernarbung, bei der das Gleichgewicht zwischen der neuen Kollagenherstellung und dem Kollagenabbau nicht im Gleichgewicht ist, und eine Überproduktion von Narbengewebe vorherrscht, die die Bedeckung der Wunde mit neuer Epidermis hemmen kann. Dies tritt ziemlich häufig auf, doch für gewöhnlich lässt es nach. In einigen Fällen kann sich jedoch der Zustand verschlimmern und Keloidnarben (Massen von extrazellulärer Matrix, die nicht aufhören zu wachsen) können entstehen. Leichte Fälle davon können klinisch durch Steroide behandelt werden, ernstere Fälle sind jedoch extrem schwierig zu behandeln und ziehen häufig eine Operation nach sich. Ist jedoch der Bereich der abgeschürften/beschädigten Haut groß und in ihrer vollen Dicke beschädigt, wird eine vollständige Bedeckung des beschädigten Bereiches durch die Verwendung von Hauttransplantaten vereinfacht, Abschnitte der Haut werden entweder in ihrer vollen Dicke oder einer teilweisen Dicke von einem anderen Teil des Körpers (Spenderstelle) entfernt und auf der rohen Oberfläche (Empfängerstelle) angewendet.
Es sollte bemerkt werden, dass im Allgemeinen Hauttransplantate verwendet werden, die aus dem Körper desselben Individuums transplantiert sind (Autographen). Bei einer erfolgreichen Transplantation wird das Transplantat zuerst durch das Serum genährt, das aus dem beschädigten Bereich sickert und nachfolgend durch die Kapillarinvasion des darunterliegenden Gewebes in das Transplantat.
Es wurde vor langem anerkannt, dass das Überleben des Transplantates durch dessen immunogene Aktivität im Verhältnis zu der Stelle, an die es transplantiert wurde, beeinflusst wird. Ein extremes Beispiel ist, dass Frauen männliches Gewebe nicht vertragen – aufgrund ihrer Reaktion gegen männerspezifische (H–Y) Antigene (17). Die Haut ist für ihre notorisch schlechte Unterstützung oder Toleranz in diesem Zusammenhang (18, 19) bekannt.
Über die Jahre wurde eine Vielzahl von Verfahren bei dem Versuch verfolgt, ein lebensfähiges Modell zu bilden, mit dem die kutane Physiologie und Morphologie untersucht werden kann, und/oder das für medizinische Transplantationsverfahren verwendet werden kann.
Es gibt vier oder mehr übliche Arten der dermalen Unterstützung bei Hautwundmodellierungen:

a) natives Kollagen (Dermis behandelt, um zelluläre Elemente zu entfernen, die nachfolgend wieder zellularisiert werden);
b) kollagene Gele oder Gitter (hergestellt aus extrahiertem Kollagen, das dann wiederhergestellt wird) und,
c) hochkomplexe Mischungen aus wiederhergestelltem Kollagen und einer Vielzahl an extrazellulären Matrixprodukten (aus so verschiedenen Quellen wie Mäusetumoren und Haifischflossen).
d) Neonatale Fibroblasten oder Fibroblasten von jungen Spendern (und daher weniger immunogen) werden auf eine Biomatrix gezogen, und es wird ihnen gestattet, ihre eigene extrazelluläre Matrix anzuhaften und herzustellen. Diese wird dann entweder in der zellulären Form als eine "lebende Haut" oder zellfrei transplantiert, unter Verwendung der extrazellulären Matrix, die durch die Zellen hergestellt wurde.

Alle dieser Methodologien beinhalten die Verwendung von gewöhnlichen Hautfibroblasten, und keine von ihnen stellt Modelle oder Substituenten her, die für eine normale Hautstruktur wirklich repräsentativ sind. Überdies sind sie häufig sehr zeitaufwendig und extrem teuer in der Herstellung.
Wundheilung oder Wundkontraktion können ein schmerzhafter Prozess sein, sowohl physiologisch als auch psychologisch. Vernarbung kann zur Entstellung und Verunstaltung führen, und in einigen Fällen kann auch zu Gespanntheit (taughtness) und/oder Anwachsungen, als ein Ergebnis der Narbengewebsbildungen, dem umliegenden und/oder darunter liegenden Gewebe Schaden zufügen und/oder zu dem Verlust der lokalen Elastizität und/oder des lokalen Gefühls führen. Beim Menschen, liegt ein großer Teil des Problems, das mit Wunden/Verbrennungen/Verletzung/Trauma über die gesamte Dicke in Verbindung steht darin, dass die Dermis nicht wiederhergestellt wird, was zu Vertiefungen und/oder Einkerbungen in dem Narbenbereich führen kann. Viele Tiere haben eine "lockerere" Haut als Menschen und weisen eine größere Kontraktionsfähigkeit auf, was zum Beispiel dadurch gezeigt wird, dass das Entfernen eines Stückes Haut von einem Hasenrücken mit einer großen Fläche von 2 cm in seiner vollen Dicke in der Reduktion der Stelle zu einer Narbe innerhalb von zwei Wochen resultiert, so dass sie nur noch als kaum sichtbare Linie zu sehen ist. Demzufolge kann eine Unterstützung/Verbesserung der Kontraktion die Größe des vernarbten Bereiches reduzieren. Des Weiteren sind wir der Ansicht, dass das bekannte Phänomen der schnellen Wundheilung der menschlichen Kopfhaut im Vergleich zu den Wundheilungsgeschwindigkeiten der anderen Teile des Körpers, die eine niedrigere Follikeldichte aufweisen, oder weniger große aktive Follikel aufweisen, auf die Fülle von verfügbaren der malen Hüllzellen zurückzuführen ist, die, wie Myofibroblasten, bei der Wundkontraktion helfen. Diese Idee widerspricht der vorherrschenden Weisheit, dass die schnellen Heilungseigenschaften der Kopfhaut der höheren Gefäßverteilung in diesem Bereich zuzuschreiben seien.
Die Wundkontraktion ist ein sehr wichtiger Bestandteil der Prozesse, durch die die Haut heilt, und es wird angenommen, dass eine unbeständige Zellpopulation, die Myofibroblasten genannt wird, dieses Schließen der beschädigten Stelle durch Kontraktion durchführt. Die genaue Quelle der Myofibroblasten wurde noch nicht herausgefunden, aber diese Zellen sind durch ihr Ausscheiden von alpha-Glattmuskelaktin gekennzeichnet. Eine Erfindung zur Verbesserung der Wundheilung würde unmittelbaren Nutzen sowie eine weite Anwendung finden, da schätzungsweise mehr als 2 Millionen Menschen allein in den USA jedes Jahr schwere Verbrennungen erleiden und viele von ihnen Transplantationen benötigen.
Es wurden bereits mehrere experimentelle Methoden für künstliche Hauttransplantate versucht, zum Beispiel wurden Epithelschichten in Kulturen aus interfollikulärer Haut gezüchtet und später auf den Spender zurücktransplantiert – doch obwohl dieses Verfahren lebensrettend ist, ist es häufig nicht zufrieden stellend, da die Schichten sehr empfindlich sind und schwierig zu übertragen sind. Da keine stützende Dermis beteiligt ist, bleiben zudem dermale Vertiefungen an der Stelle des Transplantats zurück, da keine Dermis mit einer normalen vollen Dicke wiederhergestellt wird. Für Untersuchungen in vitro sind sie aufgrund ihrer Einfachheit nicht repräsentativ für ein Hautmodel, während sie im Bezug auf Transplantation bestenfalls nur als Bede ckung dienen können, während die eigene Haut des Patienten sich erholen kann.
Alternative Herangehensweisen wurden versucht, unter Verwendung von Basalhautzellen und von äußeren Wurzelumhüllenden Epidermiszellen, die auf Kollagengelen (mit oder ohne Hautfibroblasten), oder anderen natürlichen oder synthetischen dermalen Ersatzstoffen mit dem selben Endziel kultiviert wurden, aber wiederum weisen viele dieser Verfahren bestimmte Einschränkungen auf, die für gewöhnlich mit dem Überleben zusammenhängen oder mit der Unfähigkeit, der normalen Haut zu ähneln. Bei den Verfahren des Standes der Technik wird beansprucht, dass die äußere Wurzelumhüllenden Epidermiszellen in Verbindung mit einer dermalen Komponente zu den besten Ergebnissen bei Patienten mit Wunden führen. Daher sind, trotz der Nachfrage und der Bereitstellung von komplexen unterstützenden biochemischen Bestandteilen, die gegenwärtigen in vitro Hautmodelle dahingehend mangelhaft dass:

1) ihr epidermischer Bestandteil keiner normalen Differenzierung unterzogen wird;
2) sie nicht die normale biosynthetische Grenze der Haut zwischen Dermis und Epidermis entwickeln (sie ist eine Art biologischer Filter und dient der Verarbeitung von Nachrichten), die Basalmembran genannt wird;
3) ihnen Bestandteile fehlen, wie zum Beispiel Haarfollikel und Schweißdrüsen;
4) sie sind zerbrechlich, schwer zu handhaben sind und nicht aufbewahrt werden können;
5) sie können Entstellungen nicht verhindern, da sie keine Hohlräume im Gewebe ausfüllen können;
6) sie verhindern keine Infektion oder stellen lebendes/wirksames Gewebe wieder her, daher können sich unflexible Narben entwickeln, die keine Funktion haben.

Daher sind die gegenwärtigen Modelle/Ersatzstoffe im Sinne von genauen in vitro Systemen und als Material für Hautersatz unzureichend.
Neue Veröffentlichungen in diesem Bereich betonen den dringenden Bedarf an weiterer Forschung, um zu versuchen, ein geeignetes Unterstützungsmaterial für epidermische Transplantationen zu finden, das ein hohes Niveau an „Annahme" begünstigen wird. Wir nehmen an, dass die Schwächen des Standes der Technik größtenteils auf das Fehlen einer günstigen Wundbettdermis zurückzuführen sind, an die die Epidermiszellen anhaften können, wenn die gesamte Dicke der Haut verloren wurde – wir glauben, dass die dermalen Hüllzellen die natürlichen Kandidaten für diese Rolle sind, und dass erfolgreiche Gewebezüchtung nur stattfinden kann, wenn die geeigneten Zellen für diese Aufgabe verwendet werden.
Die wichtigsten aller Zellarten sind diejenigen an der Quelle eines jeden biologischen Systems, d. h. die Stammzellen, da diese die differenziertere abstammende Population wesentlich erhalten und regenerieren und da diese eine charakteristische Funktion entwickeln, wenn sie sich spezialisieren. Dies sind jedoch die Zellen, die hinsichtlich ihrer Verteilung, ihres Verhaltens und hinsichtlich der Faktoren, durch die sie definiert werden können, am wenigsten verstanden sind. Die Fähigkeit, eine erhebliche Anzahl an reinen, nicht-angeregten, nicht-differenzierten, primitiven Stammzellen aus einem adulten Organ zu bilden, würde vermutlich große Auswirkungen auf unser grundlegendes Verständnis der Zellbiologie haben und positive und viel versprechende Verfahren für zukünftige therapeutische Fortschritte erbringen.
Glücklicherweise haben wir Haarfollikel untersucht und eine bestimmte Zellpopulation mit Immunvorzügen und stammzellspezifischem Zellpotential ermittelt, das höchst vorteilhaft verwendet werden kann, um die Wundheilung zu unterstützen und verbessern.
Wir fanden heraus, dass einfache Formen von einer oder von mehreren Follikelzelle(n) eine dermale-epidermale Neukombination zur Verfügung stellen (unter sehr einfachen Kultivierungsbedingungen), die in vorher nicht dokumentierter Basalmembranbildung und Anhang-spezifischer epidermischer Differenzierung resultiert, und dass diese Follikelzellen leicht bestimmte Hauptcharakteristika aufweisen können, die bisher bei den Hautmodellsystemen fehlten. Weitere natürliche Eigenschaften, die die Follikelzellen als Kandidaten für die Anwendungen bei Wundheilung prädestinieren, beinhalten ihre Ähnlichkeit mit Wundmyofibroblasten; ihr Aufweisen von stammzellartigen Qualitäten; die Herstellung einer einmaligen embryoartigen extrazellulären Matrix, und die Tatsache, dass sie eindrucksvolle regenerative und induktive Fähigkeiten aufweisen.
Daher waren wir in mindestens drei Schlüsselgebieten (Basalmembranbildung, normale epidermale Differenzierung über eine natürlich unterstützende Dermis und die Eingliederung von Hautfortsätzen) in der Lage, Verbesserungen zu den gegenwärtig erhältlichen Hauttransplantationsalternativen und den in vitro Hautmodellen zu liefern. Daher waren wir durch die Verwendung eines bestimmten und isolierten Gewebes oder einer Zellart, d. h. des dermalen Hüllgewebes und/oder daraus stammender Zellen und durch ihr Einbringen in ein neugebildetes Transplantat oder in ein Transplantatkomposit, in der Lage, einen geeigneteren Hautersatz herzustellen, der viele der Probleme, die bei dem Stand der Technik vorhanden waren, löst.
EP0236014 offenbart eine Zellpopulation, die aus dermalen Papillen mit Stammzellpotential isoliert wurden. Diese Zellen sind, in Verbindung mit Epidermiszellen, in der Lage, das Haarwachstum in der Kopfhaut zu stimulieren. In WO9501423 sind zudem Verfahren zur Isolation und Kultivierung von follikulären Stammzellen aus einer Unterpopulation von follikulären Keratinozyten bekannt und offenbart. Keine dieser Schriften offenbart jedoch das Stammzellpotential von dermalen Hüllzellen zur Bereitstellung der verschiedenen differenzierten Gewebe, die in der Haut gefunden wurden, und deren Nutzen bei der Stimulierung der Wundheilung.
Aus diesem Grund ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Wundheilungssystem zur Verfügung zu stellen, das Zellen/Gewebe und/oder deren Attribute, die von der zu behandelnden Person selbst abgeleitet sind/ist, verwendet.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Wundheilungssystem zur Verfügung zu stellen, das Zellgewebe und/oder dessen Attribute verwendet, die nicht von der zu behandelnden Person selbst abgeleitet ist/sind.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, ein Wundheilungssystem zur Verfügung zu stellen, das vielfältig verwendet werden kann, d. h. zur Verwendung bei akuten und/oder chronischen und/oder geringeren und/oder schweren Wundheilungssituationen.
Gemäß eines ersten Aspektes der Erfindung wird ein dermales Hüllgewebe und/oder davon abstammende Zellen für die Behandlung von Wunden zur Verfügung gestellt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammen das dermale Hüllgewebe und/oder die Zellen von einem ausgewählten Abschnitt eines Follikels ab, bevorzugt von dessen unteren Drittel, und noch mehr bevorzugt stammen sie aus einem Zellring bei oder um den besagten Follikel, bevorzugt aus einem inneren Ring, und am meisten bevorzugt ist/sind das Gewebe/die Zellen, das/die positiv für alpha-Glattmuskelaktin ist/sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden das Gewebe und die daraus stammenden Zellen mit mindestens einem anderen Zelltyp aus einem Haarfollikel zur Verfügung gestellt oder kombiniert, und am idealsten werden sie mit Gewebe kombiniert, das die Hautpapille, oder daraus stammende Zellen, umfasst. Diese Kombination ist bevorzugt, da unsere Experimente gezeigt haben, dass dermales Papillagewebe, oder daraus stammende Zellen, beim Schließen der Wunde und bei der Reduzierung des Narbengewebes helfen kann.
Bei einer noch bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Wundheilungssystem zur Verfügung gestellt, das ein geeignetes Matrixmaterial umfasst, das dermales Hüllgewebe und/oder daraus abstammende Zellen in sich beinhaltet und/oder darin eingebettet ist und/oder damit in Verbindung steht und/oder daran angehaftet ist. Idealerweise umfasst das Matrixmaterial natives Kollagen oder kollagene Gele oder Gitter, die aus neu gebildetem Kollagen gebildet sind, oder hochkomplexe Mischungen aus wiederhergestelltem Kollagen und einer Vielzahl von extrazellulären Matrixprodukten oder irgendein anderes dem Fachmann bekanntes geeignetes Matrixmaterial, dessen Auswahl jedoch den Umfang der Erfindung nicht beschränken soll.
Bei einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein chirurgischer Verband zur Verfügung gestellt, der ein Netzmaterial sowie ein geeignetes Matrixmaterial umfasst, wobei mindestens eines dieser Materialien dermales Hüllgewebe und/oder daraus abstammende Zellen in sich beinhaltet und/oder darin eingebettet hat und/oder damit in Verbindung steht und/oder daran angeheftet ist. Idealerweise handelt es sich um einen herkömmlichen chirurgischen Verband, wobei dessen Auswahl jedoch den Umfang der Erfindung nicht beschränken soll.
Bei einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine therapeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die einen geeigneten Träger für dermales Hüllgewebe und/oder für davon abstammende Zellen umfasst, Idealerweise kann der Träger so formuliert werden, dass er antibakterielle Eigenschaften und/oder antiseptische Eigenschaften aufweist und mehr bevorzugt kann er wachstumsförderne Additive und/oder lokale Anästhetika aufweisen. Bevorzugt kann die therapeutische Zusammensetzung so angepasst werden, dass sie topisch in Form von dermalen Hüllzellen angewendet wird, die in einer/einem geeigneten Trägerlösung/Gel/Creme/Weichmacher Suspendiert wurde; alternativ kann die Zusammensetzung so angepasst werden, dass sie durch Injektion verabreicht wird und somit eine Trägerlösung umfassr; des Weiteren alternativ kann der besagte Träger in einem Pflaster oder einer Bandage oder ähnlichem eingearbeitet sein und/oder darin eingebettet sein und/oder damit in Verbindung stehen und/oder daran angehaftet sein.
Bei noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein geeignetes Matrixmaterial zur Verfügung gestellt, das zur Implantation ein dermales Hüllgewebe und/oder davon abstammende Zellen in sich eingearbeitet hat und/oder darin eingebettet hat und/oder damit in Verbindung steht und/oder daran angeheftet hat.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein dermales Hüllgewebe und/oder davon abstammende Zellen zur Verwendung in einem neu gebildeten Transplantat zur Verwendung bei der Behandlung von Hautverletzungen, bei denen ein dermaler Ersatz benötigt wird, zur Verfügung stellt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Gewebe und/oder Zellen ferner zur Verfügung gestellt oder mit mindestens einem weiteren Zelltyp kombiniert, wobei der Zelltyp aus einem Haarfollikel stammt und bevorzugt dermales Papillagewebe und/oder davon abstammende Zellen umfasst.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dermales Hüllgewebe und/oder davon abstammende Zellen für die Verwendung bei einer in vitro Modellierung zur Verfügung gestellt, bevorzugt, und wahlweise, in Kombination mit mindestens einer anderen von der Haut abstammenden Zellpopulation.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Wundheilungssystem wie bevorstehend beschrieben für die Verwendung bei der Behandlung von akuter und/oder chronischer und/oder geringerer und/oder schwerer Wundheilung; und/oder Wieder herstellung von Knorpel und/oder Knochenheilung und/oder Muskelheilung und/oder Heilung von Bindegewebe und/oder Heilung von Blutgefäßen zur Verfügung gestellt.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird dermales Hüllgewebe und/oder Zellen zur Verfügung gestellt, die so angepasst sind, dass sie eine Schutzschicht aus Zellen/Kapseln bereitstellen, wobei die Schicht aus Zellen/Kapseln geeigneterweise auf oder um ein Organ positioniert ist, das einem Patienten/Empfänger als alogenes Transplantat transplantiert wird. Bei diesem Aspekt der Erfindung wird die immunoprotektive Qualität des dermalen Hüllgewebes und/oder der davon abstammenden Zellen ausgenutzt.
Bei jedem der oben genannten Aspekte der Erfindung kann das dermale Hüllgewebe von dem Patienten selbst stammen oder, besonders bevorzugt, nicht von ihm selbst stammen.
Zusammenfassend sind wir der Ansicht, dass das dermale Hüllgewebe und/oder die davon abstammenden Zellen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und/oder bei der Wundmodellierung spielen, da gezeigt wurde, dass dieses Gewebe und/oder die davon abstammenden Zellen an der Wundkontraktion beteiligt sind, ebenso wie an dem Austausch der Wunddermis – einschließlich des Austausches von einer Vielzahl von Dermisarten, je nach Stelle der Wunde, an der Erhöhung der Wundfestigkeit und des Zustandes, an der Unterstützung des Wachstums der Epidermis, an einer Veringerung der Narbenbildung in dieser Gewebeart, und/oder in Verbindung mit dermalen Papillazellen, kann tatsächlich zu einer narbenlosen Wundheilung führen und überdies kann dieses Gewebe lange Zeit bei niedrigen Temperaturen gelagert werden und dennoch die vorstehend genannten Eigenschaften beibehalten, daher können Wundheilungstherapeutika und Wundzellenmodelle zuverlässig hergestellt werden und dann für eine zukünftige Verwendung gelagert werden. Zudem können dieses Gewebe und/oder die aus ihm stammenden Zellen eine lange Zeit in Kulturen unter extremer Belastung existieren, daher sind Wundheilungstherapeutika und/oder Wundzellmodelle dieser Art naturgemäß robust, was einen weiteren Vorteil hinsichtlich der Lagerung und der nachfolgenden Anwendung darstellt.
Eine Ausführungsform der Erfindung wird nun exemplarisch beschrieben, nur unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren, wobei:
1 eine schematische Darstellung einer anatomischen Querschnittsansicht durch ein Hautstück darstellt.
2 eine schematische Darstellung der Verfahren darstellt.
3 einen bildhaften Nachweis von isolierter dermaler Papilla (P) und von Hüllgewebe (S) darstellt, die von Haarfollikelendzwiebeln einer männlichen Kopfhaut mikropräpariert wurden: wie in 2e dargestellt, gekennzeichnet durch einen Stern (*).
4 einen bildhaften Nachweis von zwei Haarfasern darstellt, die in der unmittelbaren Nachbarschaft der männlichen dermalen Hülle, die in die Wunde der weiblichen Haut implantiert wurde, die durch einen kleinen Silikongummikragen geschützt ist, hergestellt wurden.
5 einen bildhaften Nachweis von 4 darstellt, nachdem der Silikonkragen (und die Pflasteranbringung) entfernt worden war.
6 einen bildhaften Nachweis eines histologischen Schnittes durch einen Zwiebelendbereich eines induzierten Follikels darstellt, der eine Alcianblau positiv kontrastierte Papilla (P) enthüllte.
7 einen bildhaften Nachweis eines unteren Bereiches eines induzierten Follikels darstellt, der sich nach einer in situ Hybridisierung mit einer Y-Chromosomenspezifischen DNA Sonde, die durch eine Digoxygeninmarkierung durchgeführt wurde, positiv färbt.
8 einen bildhaften Nachweis eines Gewebeschnittes darstellt, der als negative Kontrolle für 7 dient und weibliche Haut darstellt, die durch den Digoxygeninverbundene Y- Chromosomensonde überhaupt nicht eingefärbt wurde.
9 einen bildhaften Nachweis eines unteren Abschnitts eines induzierten Follikels darstellt, der als Folge der in situ Hybridisierung mit einer Y- Chromosomenspezifischen DNA Sonde positiv eingefärbt wurde, durchgeführt mit einem grünen Fluorophormarker.
10 einen bildhaften Nachweis eines Gewebeschnittes darstellt, der als positive Kontrolle für 9 dient.
11 einen bildhaften Nachweis einer starken Vergrößerungsansicht der Seite eines Langzeit[24 Tage]transplantats darstellt.
12 einen bildhaften Nachweis einer Fähigkeit der dermalen Hüllzellen, in unterschiedliche Mesenchymalzellen zu differenzieren, darstellt.
(A) Langzeitkultivierte (über ein Jahr) menschliche dermale Hüllzellen.
(B) Dermale Hüllzellen, die myoblastartig (muskelartig) zu verschmelzen scheinen.
(C) Myo-Röhrchen-artige Strukturen in dermalen Hüllzellkulturen
(D) Adipocytzellen (Fett-herstellende Zellen).
(E) Chondrocytzellen (knorpelartige Zellen).
(F) Mineral-herstellende Knochenvorläuferzellen – gefärbt nach dem Von-Kossa-Verfahren.
(G) Dermale Hüllzellen, die immunohistochemisch für alpha-Glattmuskelaktin markiert wurden.
(H) Menschliche dermale Hüllzellen, die positiv für Glattmuskelmyosin gefärbt wurden.
(I) Dermale Hüllzellen, die positiv für Desmin markiert wurden.
13 stellt bildlichen Nachweis der Haut am Rand einer Wunde dar und wobei dermale Hüllzellen ein isoliertes Follikel in dem unbeschädigten Gewebe außerhalb der Hauptgruppe der markierten Zellen fern in unbeschädigtem Gewebe umgeben.
EXPERIMENTELLES VERFAHREN
Isolation von Gewebe
Ein kleines Stück männlicher Kopfhaut (about 1,5 cm²) wurde grob rasiert, wobei einige Fasern noch immer exponiert blieben, um nachfolgendes Auszupfen zu ermöglichen. Bevor eine Stanzbiopsie mit 6 mm Durchmesser in einem Winkel durchgeführt wurde, der der Ausrichtung der Follikels entspricht, wird die Fläche mit einer antiseptischen Lösung abgewischt und lokal mit Lignocain und mit einem Adrenalinanästhetikum injiziert. Die proximalsten Spitzen (weniger als ein fünftel der Länge) der exponierten Follikel wurden unter einem Präparationsmikroskop (Zeiss) von der umgekehrten Biopsie amputiert, und in einzelne Tropfen eines minimalen essenziellen Mediums (Gibco) bei 4°C transferiert. Nach dem Zupfen der Haarfasern aus den durchgeschnittenen Follikeln, wurde die Biopsie wieder zu ihrer originalen Kopfhautstelle zurückgebracht und dort zur Heilung belassen. Dieser erste Arbeitsschritt dauerte ca. 20–25 Minuten. Vgl. 2 (a, al, b, bl und c), die eine diagrammatische Darstellung des Verfahrens darstellt.
Die äußersten dermalen Schichten des Endes der Haarzwiebel wurden umgedreht, um zu ermöglichen, dass die epidermische Matrix (einschließlich des undifferenzierten Gewebes) weggekratzt und weggeworfen werden kann (2d). Hautpapillen, die durch eine Basalstumpf-Abtrennung isoliert wurden (2e), wurden in einem neuen Medium angesammelt ( 2h). Die dünne äußere Bedeckung des Bindegewebes wurde dann aus den Stücken der Hülldermis gezupft, bevor sie in ähnlicher Weise in neuem Medium angesammelt wurden (2g und i). 3 stellt einen bildhaften Nachweis von isoliertem dermalen Papilla- (P) und Hüll- (S) Gewebe dar, das von dem Endbulbus eines Haarfollikels einer männlichen Kopfhaut zellselektiert wird, wie in 2e mit einem Stern (*) markiert dargestellt.
Implantationen
Da diese Operationen so minimal angreifend waren, dass sie praktisch nicht wahrnehmbar waren, wurde keine Art einer lokal anästhesierenden Vorbehandlung als notwendig erachtet. Dies vermied ebenfalls die Möglichkeit, dass das Anästhetikum die winzigen Mengen an verletzbarer Dermis, die implantiert werden sollte, negativ beeinflussen könnte.
Eine kleine, nicht tiefe Wunde wurde dem inneren Unterarm einer weiblichen Spenderin mit der Spitze eines Skalpellmessers zugefügt, und; leicht mit den Spitzen einer sehr feinen Uhrmacherpinzette (No. 5) (2j) geweitet. In den wenigen Momenten, in denen eine winzige Menge an Blut oder Flüssigkeit abgesondert wurde, wurde diese unter Verwendung von winziger steriler Baumwolltupfer absorbiert. Es wurden zwei Operationsreihen durchgeführt.
Bei der ersten wurde dermales Hüllgewebe aus zwölf Follikeln in zwei Wundstellen (in jede sechs) implantiert, ca. 10 Stunden nachdem die Endbulben aus der Biopsie entfernt worden waren. Bei der zweiten wurden 11 Stück dermale Hüllen in eine Wundstelle implantiert, 9 Hautpapillen in eine zweite, und 2 Papillen (die an der Pinzette klebten und separat wieder eingepflanzt werden mussten) in eine dritte, ca. 20 Stunden nach der Biopsie. In allen Fällen wurde das Material in so wenig Fluid wie möglich gesammelt und dann direkt auf die Wundstelle transferiert, so dass es schnell am Ende der Pinzette in die Haut eingesetzt werden konnte.
Die Wunden wurden anfangs unbehandelt und unbedeckt belassen. Als zu beobachten war, dass Haarfasern aus den implantierten Stellen erschienen (3–4 Wochen später), wurden über ihnen kleine Silikonringe mit Einfassungen platziert und unter Verwendung eines Operationsbandes gesichert – als Vorsichtsmaßnahme zum Schutz vor Abrieb, vgl. Sie bitte 4, die bildlichen Nachweis von zwei Haarfasern darstellt, die in der unmittelbaren Umgebung der männliche Hüllzell-implantierten weiblichen Hautwunde, die durch einen kleinen Silikongummikragen geschützt wird und 5, die einen bildlichen Nachweis der 4 darstellt, nachdem der Silikonkragen (und der Pflasteranhang) entfernt wurden.
Die erste Reihe der zwei Wundstellen wurde 77 Tage nach der Hüllgewebeimplantation zusammen als ein einziges Stück elliptischer Haut biopsiert und wurde unmittelbar in frisch vorbereiteten 4% Paraformeldehyd bei PH 7,3 fixiert. Die zweite Wundreihe (3 Monate nach der ersten gemacht) wurde ähnlich behandelt – wobei sie 42 Tage postoperativ als zwei kleine (4 mm) Stanzbiopsien (genauer lokalisiert durch ihre Positionierung neben Muttermalen) entfernt wurden. Detaillierte äußere Beobachtungen und photographische Aufzeichnungen der männlichen Spenderkopfhaut und der Hautstellen an dem Unterarm der weiblichen Empfängerin wurden in regelmäßigen Intervallen durchgeführt.
Fuorophor-markierter Y-Chromosomenfühler [Imagenetics]
Das Spektrum einer mit einem grünen Fluorophor markierten Zählerprobe (Imagenetics), bestand aus chromosomenspezifischen Sequenzen aus häufig wiederholten menschlichen Satelliten-DNAs. Die Ziel-DNA in den Gewebeschnitten wurde in 70% Formamid/2 × SSC bei 70°C 10 Minuten lang denatu riert. In der Zwischenzeit wurde die Probenmischung so vorbereitet, dass sie enthielt: 7 μl Spektrum-CEP-Hybridisationspuffer (Dextransulphat, Formamid, SSC, pH 7,0), 1 μl Spektrum-CEP-Sonde (Fluorophor-markierte Zählersonde und blockieren der DNA in einem Tris-EDTA-Puffer) und 2 μl von 5 × Blockierungslösung (wie obenstehend detailliert beschrieben) wurden zentrifugiert (1–3 Sekunden), 5 Minuten lang in einem Wasserbad bei 75°C erhitzt und dann auf Eis angeordnet. Die denaturierten Scheiben wurden in 70%, 85% und 100% Ethanol gewaschen (in jedem einem Minute lang) und dann luftgetrocknet. Jede Scheibe, auf 45°C erhitzt, erhielt 10 μl der Probenmischung und danach eine silanisierte Überstülphaube, die vor der Scheibeninkubation in einem feuchten Behälter bei 42°C über 18 Stunden an den Rändern versiegelt wurde. Nach der Hybridisation und der Entfernung der Überstülphaube wurden die Scheiben gewaschen: 3 × 10 Minuten in 50% Formamid/2 × SSC; 10 Minuten in 2 × SSC, und 5 Minuten in 2 × SSC/0,1% NP-40, wobei alle eine Denhardt-Lösung enthielten, 50 μg/ml sonifizierte Lachssperma-DNA, 1% Milchpulver und 0,1% Tween-20 und alles bei 45°C. Die Scheiben wurden im Dunkeln luftgetrocknet, und danach wurden jeder Scheibe 10 μl Propidium-Iodid Kontrastfärbung (Imagenetics) sowie eine Überstülphaube hinzugefügt.
Digoxigenin-markierte Y-Chromosomensonde [Boehringer Mannheim]
Jede Scheibe erhielt 20 μl der Hybridisationsmischung, bestehend aus: 10 μl Formamid [50% des Endvolumens]; 5 μl 4 × Hybridisationslösung; 2,5 μl Sonde [50 ng]; 2,5 μl 8 × Blockierungslösungen. Die Mischung wurde durch eine silanisierte Glas-Überstülphaube bedeckt, versiegelt und dann vor der Übernachtinkubation in einer Feuchtkammer bei 37°C 5 -> 10 Minuten bei 72°C auf einer vorgewärmten Glasplatte in dem Ofen denaturiert. Die Scheiben wurden 3 × 5 Minuten in 2 × SSC gewaschen, bevor sie 30 Minuten in 50 ml TBS gewaschen wurden, das 1 × Blockierungslösung (wie oben) und 1% Boehringer Kit-Blockierungsmittel aufwies- beides ebenfalls bei 37°C. Um die Detektion zu fördern wurden die Scheiben in 50 ml TBS und 50 μl Antidigoxigeninalkalinphosphatasekonjugat [200 ug/ml], das 1% Kit-Blockierungsmittel enthielt, 30 Minuten bei 37°C gewaschen, und dann wurden sie 3 × 10 Minuten in 0,2% Tween 20 in TBS bei Raumtemperatur gewaschen. Unmittelbar vor der Verwendung wurde 4,5 μl NBT, 3,5 μl X-phosphate und 0,24 mg Levamisol (Sigma) 1 ml Tris/NaCl/MgCl2 Puffer hinzugefügt. Adäquate Mengen für die Anzahl und Größe der Abschnitte wurden hinzugefügt und die Scheiben inkubierten bei Raumtemperatur in einem befeuchteten Behälter, bedeckt mit Folie, bis sich die dunkelblau/purpurfarbene Farbe entwickelte. Um die Reaktion zu beenden, wurde die Scheiben 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 10 mM Tris-Cl/1 mM Na₂ ED-TA, pH 8,0 abgespült.
Abschnitte, die mit Propidiumiodid gegengefärbt werden sollten, wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln in 50 ml TBS + 5 μl Propidiumiodid [1 mg/ml], oder in einer ähnlichen Konzentration von Acriflavingelb, inkubiert, 2–3 Minuten unter fließendem Wasser gespült und dann im Dunkeln lufttrocknen gelassen. Schließlich wurden die Bereiche in 20 μl Anti-Bleichlösung unter einer Glasüberzugshaube angeordnet, die an den Rändern mit einem Nagellack versiegelt wurde.
Experimente bezüglich der Wundkontraktion und des Schließens der Wunde
Kollagengel Kontraktionsexpermimente
Bestimmte Populationen adulter menschlicher Zellen wurden durch exakte Zellsektion der geeigneten Gewebe (Abfall von früheren Operationen von männlichen und weiblichen Spendern im Alter von 25 bis 45 Jahren) isoliert, die dann verwendet wurden, um Zellkulturen durch überwachsende Explantate anzulegen. Ein ähnliches Verfahren wurde ebenfalls angewendet, um die verschiedenen Alter der Nagetierzellen herzustellen (wie untenstehend beschrieben). Primärkulturen (von Menschen und Ratten) wurden 2 bis 3 Wochen nach ihrer Initiierung subpassiert, und alle Experimente wurden ca. 2 bis 4 Wochen danach entweder mit Zellen aus der zweiten oder dritten Passage durchgeführt.
Eine Typ 1-Kollagenlösung wurde aus adulten Rattenschwanzsehnen (20, 21) hergestellt. Kurz gesagt wurde 1% U. V./Ethanol-sterilisierte Schwanzsehne wurde in 300 ml steriler 0,5 M Essigsäure 48 Stunden lang bei 4°C gerührt. Danach wurde die resultierende Lösung durch mehrere Schichten steriler Gaze gefiltert, bei 2500 g 3 Stunden lang zentrifugiert, und 24 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert, bevor es einer weiteren Zentrifugierung unterzogen wurde. Das Kollagengel (das bei 37°C aushärtet) wurde durch Mischen der Kollagenlösung mit einem Zehntel seines Volumens an 10 × konzentriertem MEM und ca. der Hälfte Seines Volumens an 4,4% NaHCO₃ hergestellt, um einen End-PH-Wert von 7,3 zu ergeben. Jede Population wurde mit derselben Dichte von 10⁵ Zellen pro ml Kollagengel ausgesäht, von denen 1,5 ml in je 35 mm Petrischalen bei 37°C angeordnet wur den, um fest zu werden (95% Luft/5% CO₂) und wurden dann mit ca. 0,5 ml MEM bedeckt (wurde als Zeit = 0 festgelegt). Der Durchmesser von 20–24 separaten Kollagengelen wurde für jeden Zelltyp aufgezeichnet, alle 4–6 Stunden über einen Zeitraum von 5 Tagen. Weiteres Medium wurde in kleinen Inkrementen hinzugefügt, da die Gele sich verkleinerten.
Wir führten weitere Experimente durch, um das "zusammenstricken" der Schnittränder der Haut zu untersuchen. Standartisierte Schnitte wurden in kleinen länglichen Stücken menschlicher Haut hergestellt, entweder vertikal über drei Viertel ihrer Länge, oder horizontal genau durch sie hindurch, genau unter der Epidermis. Die geschnittenen Oberflächen wurden dann mit entweder Hautfibroblasten, dermaler Papilla, dermaler Hüll- oder Glattmuskelzellen (die zu "klebrigen" Klumpen von lebensfähigen Zellen mit einem Gummischaber angehäuft worden waren) wieder zusammengepresst und nachfolgend zwischen ihnen angeordnet. Sehr konfluente Petrischalen mit Zellen waren weit bessere Quellen als diejenigen, die eine geringere Anzahl aufwiesen, da sie klebrigere Zellanhäufungen lieferten. Alle diese Hautstücke wurden in einer nicht-flüssigen Umgebung kultiviert, d. h. auf einer andauernd feuchten Oberfläche bei einem feuchten Klima bei 37°C, jedoch nie auf dem Medium schwimmend, oder in ihm eingetaucht.
Lagerung des dermalen Hüllgewebes
Lagerung des dermalen Hüllgewebes/der dermalen Hüllzellen bei niedriger Temperatur; zusätzlich wurden sie widriger Umständen ausgesetzt, um die stammzelltypischen Charakteristika hervorzuheben – einschließlich der Fähigkeit zum bevorzugten Überleben
Menschliche Hautproben (wie direkt obenstehend beschrieben) wurden gesäubert und angemessen einer Zellsektion unterzogen zur Verfügungstellung von: (a) 3 mm² Abschnitten der ganzen Haut; (b) isolierten Haarfollikeln; (c) Fragmenten der glasigen Membran, die zwischen dünnen Schichten der Hülldermis und ORS Epidermis eingepresst ist, und (d) Primärkulturen von dermalen Hüllzellen (wie obenstehend hergestellt). Jede dieser vier Stufen der Gewebekomplexität wurde widrigen Umständen unterzogen (jede wiederholt mit und ohne Serum, und/oder, Glucose und Glycerin): (i) längere Lagerung bei kalter Temperatur bei 4°C; (ii) wiederholte Frier/Tau-Zyklen bei –20°C; (iii) wiederholte Frier/Tau-Lagerung bei –80°C in DMSO;
ERGEBNISSE
Implantationen von Hüllen
Alle Stellen, in die dermales Hüllgewebe implantiert worden war, heilten schnell und auf eine Weise, die für jede oberflächliche Hautverletzung typisch schien. Als die Stelle trocknete bildet sich feiner, enger Schorf und dieser löste sich in wenigen darauf folgenden Tagen, um eine überaus leichte Wunde zurückzulassen, die bis zum ca. 10. Tag kaum mehr wahrnehmbar war. Es trat kein äußeres Zeichen irgendeiner entzündlichen Reaktion in den Wunden oder um diese herum auf, ebenso wie es keine physische Wahrnehmung der Stelle gab. Die Spitze einer Faser, die dunkler war und unverhältnismäßig fester für ihre Länge als jedes andere der lokalen Vellushaare der Armhaut war, wurde zuerst am 24. Tag nach der Einführung der dermalen Hülle beobachtet. Am 33. Tag nach der Implantation, konnte eine zweite, viel feinere und nicht-pigmentierte Faser gesehen werden, die gerade an der Stelle der ersten Faser hervorgekommen war.
Eine sehr leichte Pünktchenbildung des pigmentierten Materials war ebenfalls unter der Oberfläche der Haut sichtbar, in der unmittelbaren Umgebung der geheilten Stellen. Zudem war eine dunkle Linie des Materials unter der Haut zu sehen, direkt hinter der Basis der größeren Faser (vgl. 4 und 5). Dies stellte fast sicher eine Verlängerung der exponierten Haarlänge dar, und zeigte an, dass der Follikel, der das Haar herstellt, oberflächlich und in einem ungewöhnlichen Winkel und mit einer ungewöhnlichen Ausrichtung bezüglich der lokalen Follikel eingebettet war. Beide Fasern wuchsen in den nächsten Wochen in Masse und Länge, doch das wurde durch die pigmentierte Faser mehr hervorgehoben, die offensichtlich stärker wurde und sich daher morphologisch von den lokalen Haaren unterschied (vgl. 4 und 5). Die feinere weiße Faser wurde durch eine dünne Schicht (oder Sack) getrockneter Zellen bedeckt, war aber ansonsten in Gestalt und allgemeinem Erscheinungsbild den umliegenden, nicht induzierten Haaren ziemlich ähnlich. 21 Tage nach der zweiten Operationsreihe (begonnen drei Monate nach der ersten) war eine Faser (wieder dunkler und fester als die lokalen Haare) an der Hüll-implantierten Stelle zu sehen. Über eine ähnliche Zeitspanne von drei Woche, wurde dieses solide pigmentierte Haar dicker und war mehr gelockt. Die Stelle wurde am 42. Tag biopsiert.
Die histologische Untersuchung der Hüll-implantierten Stellen bestätigte, dass die zwei größeren Follikel, die äußerlich Fasern des vollentwickelten Typs hergestellt hatten, alle der charakteristischen Komponenten aufwiesen. Zum Beispiel war eine große ovale (Alcianblau-positive) Hautpapille (6, Beschriftung P) durch eine pigmentierte epidermische Matrix überzogen, und follikeltypische konzentrische Gewebeschichten waren in querverlaufenden Abschnitten ebenfalls deutlich zu sehen. Diese Follikel waren jedoch ziem lich unterschieldich von der lokalen Velluspopulation hinsichtlich ihrer: größeren Größe; geringen Wachstumstiefe in der Haut, und dem ungewöhnlichen Winkel der Orientierung parallel zur Hautoberfläche. Derartige unabhängige und widersprüchliche Merkmale legen deutlich nahe, dass die größeren Anhängsel induziert waren.
Bemerkenswert ist, dass keines der transplantierten Materialien in eine immunogeschützte Stelle transplantiert wurde.
Weitere kleinere Follikel wurden ebenfalls an zufälligen Positionen bemerkt und in zufälligen Anordnungen in und um die post-experimentellen Wundstellen, und während sie ebenfalls neu gebildet sein können, konnte ihre Lage nicht nur auf der Basis von morphologischen Kriterien interpretiert werden.
Unterstützender Nachweis des Immunoprovilegs wie durch in situ Hybridisation illustriert
Sowohl positive (vgl. 7, die einen bildhaften Nachweis eines unteren Bereiches eines induzierten Follikels darstellt, der sich nach einer in situ Hybridisierung mit einer Y-Chromosomenspezifischen DNA Sonde, die durch eine Digoxygeninmarkierung durchgeführt wurde, positiv färbt) als auch negative (vgl. 8, die einen bildhaften Nachweis eines Gewebeschnittes darstellt, der als negative Kontrolle für 7 dient und weibliche Haut darstellt, die durch die Y- Chromosomenspezifische DNA Sonde überhaupt nicht eingefärbt wurde) Kontrollen färbten sich entsprechend, um die Validität der grundsätzlichen Verfahrensweise der Protokolle zu bestätigen.
Bei der ersten Reihe der experimentellen Gewebesektionen erkannten beide der Y-Chromosomespezifischen DNA-Sonden einige der kleineren Follikel in den Wundbereichen, ebenso wie die leichter voraussagbaren induzierten größeren Follikel. Nur die niedrigsten Bereiche der kleineren Follikel, tatsächlich nur etwas größer als die Endbulbusbereiche, färbten sich wiederholt durch die Sonde positiv (vgl. 7 und 8), wie entweder durch das Digoxygenin oder durch das grüne Spectrumfluorophor, um die Zellen männlichen Ursprungs anzuzeigen. Unglücklicherweise war die morphologische Auflösung des Gewebes nicht ausreichend, um die Probenverteilung auf dem Niveau der einzelnen Zellen oder sogar Gewebeschichten zu interpretieren. Nichtsdestotrotz, dass sowohl die Fluorophor-, (vgl. 9 im Vergleich zu 10) und Digoxygenin- (7 im Vergleich zu 8) markierte Fühler fast identische Bereiche des Follikelgewebes als positiv erkannten, wurde als Verstärkung der Ergebnisse angesehen.
Unterstützender experimenteller Nachweis der Fähigkeit von dermalen Hüllzellen, Hautdermis als Langzeitersatz zur Verfügung zur stellen
Dermale Hüllzellen wurden mit epidermalen Zellen aus Haarfollikeln neu kombiniert und, innerhalb einer Kammer, die das Transplantat von den umliegenden Hautzellen trennte, auf ein Tier transplantiert.
Die dermalen Hüllzellen bildeten eine sehr gute Dermis mit einer gleichmäßigen Zelldichte und ohne Anzeichen einer abnormalen Kollagenbildung. Sie interagierten auch mit der Epidermis, um eine dicke epidermale Decke zu bilden. Eine vollständige und normale Basalmembran wurde zwischen der dermalen Hülle und der Epidermis gebildet. Wird die Kammer, die das Transplantat umgab, entfernt, scheint das weiße Blockzelleninfiltrat, das sich außerhalb des Transplantats gebildet hatte, die neue Hautstelle nicht zu betreten. Vgl. 11, die eine starke Vergrößerungsansicht der Stelle eines Langzeittransplantats (24 Tage) darstellt. Die Linie des dunklen, dichten weißen Blutzelleninfiltrats links, ist nicht in den Transplantatbereich eingedrungen. In der Dermis sind Kollagenbündel strukturiert, dermale Zellen sind gleichmäßig verteilt und eine vollständige und normale Basalmembran ist ersichtlich.
Unterstützender experimenteller Nachweis des Stammzellenpotentiales der dermalen Hüllzelle
12(A–I) stellt einen bildhaften Nachweis der Fähigkeit der dermalen Hüllzellen dar, sich in verschiedene mesenchymale Zellen zu differenzieren, und somit wird ihr Stammzellpotential dargestellt. Es ist ersichtlich, dass diese Zellen in verschiedene Myoröhrchen, Adipocyten, Chondrozyten und Mineral-herstellende Knochenzellen differenzieren können. Ein weiterer überraschender Nachweis beinhaltet, dass herausgefunden wurde, dass Haarfollikelgewebe, das von Personen in der Altersspanne von 95–105 Jahren erhalten wurde, lebensfähig ist und in der Lage ist, als eine produktive Quelle für eine Initiierung von Zellkulturen zu dienen. Diese Daten unterstützen die Hypothese der Fähigkeit von Stammzellen zur ständigen Differenzierung und Reproduktion von Überbleibseln während ihrer Lebenszeit (22). Zusätzlich änderte wiederholtes Einfrieren und Auftauen von primären dermalen Hüllzellen und nachfolgendes Klonen ihr Potential, mindestens vier verschiedene Phänotypen aufzuweisen, nicht, obwohl sie vorher widrigen Umständen ausgesetzt worden waren.
Unterstützender experimenteller Nachweis des Abstammungspotentiales der Follikel der dermalen Hülle
Muskelmyoröhrchen (muscle myotubes)
Subpopulationen aus kleinen Spindel-förmigen Zellen wurden sowohl einzeln als auch in verschiedenen Stadien der Fusion beobachtet (wie sie üblicherweise in routinemäßig hergestellten Kulturen zu sehen sind), wobei einige langzweigige multinukleäre myotubartige Strukturen bildeten.
Ein Teil dieser Zellen färbte sich mit Myosin, Desmin und/oder alpha-Glattmuskelaktin monoklonalen Antikörpern positiv. [In der Vergangenheit gab es sogar ein seltsames Ereignis, wenn wir in unseren Petrischalen von langen Zusammenballungen solcher Muskel-Vorläuferzellen spontanes rhythmisches Schlagen, d. h. Kontraktionen, beobachteten].
Adipocyten
Diese Zellen wurden aufgrund ihrer unverkennbaren multivesikularen Erscheinung und der Tatsache bestimmt, dass das in ihren Vesikel enthaltene Material durch Sudan IV rot gefärbt wurde, und daher als gesättigtes neutrales Lipid bestimmt.
Chondrocyten
Zu sehen als Akkumulationen von gerundeten Zellen mit perizellulärem PH 1,0 Alcianblau positivem Material, das Chondriotin und Keratansulphatproteoglykan sein könnte, und Lacunae zwischen vielen der Zellen – {interessanterweise wird ein ähnliches Zellverhalten beobachtet, wenn dermale Rattenhüllzelllen in vitro mit zellselektierten Ohrknorpel gemischt werden}. Dies scheint auch wahrscheinlich mit unseren in vivo Beobachtungen in Verbindung zu stehen, wenn implantierte dermale Hüllzellen Hyperplasie in dem normalerweise inaktiven Ohrknorpel zu stimulieren scheinen.
Mineral-herstellende Knochenzellen
Diese Zellen wurden durch ihre Bildung von Aggregaten bestimmt, in denen die Matrix mineralisiert erschien und sich positiv auf Calciumphosphate färbten, nachdem sie durch das Von-Kossa-Verfahren behandelt wurden.
Weitere unverwechselbare Zellarten wurden ebenfalls in unseren dermalen Hüllzellkulturen beobachtet (einschließlich interessanter dentritischer Populationen) doch bisher sind sie nicht genau definiert.
Unterstützender experimenteller Nachweis von dermalen Hüllzellen als Ersatzstoffe für Fibroblasten bei Hautverletzungen
Mit fluoreszierendem Farbstoff (DiI) markierte dermale Hüllzellen und Fibroblasten wurden in einem Kollagengel in Hautwunden implantiert, dermale Hüllzellen überlebten im Vergleich zu Hautzellen über 10 Tage und es wurde beobachtet, dass sie weiter in die Haut des Wirts eindrangen. Es wurde auch gezeigt, dass dermale Hüllzellen zur Migration fähig sind und sich selbst in die normale Haut außerhalb der eigentlichen Wunde eingliedern (vgl. 13, die einen bildhaften Nachweis der Haut am Rande einer Wunde darstellt, und wobei dermale Hüllzellen ein isoliertes Follikel fern in unbeschädigtem Gewebe umringt haben).
Unterstützender Nachweis der Wundkontraktion
Wundkontraktion ist ein sehr wichtiger Bestandteil des Prozesses, in dem Haut heilt, und es wird angenommen, dass eine kurzlebige Zellpopulation, die Myofibroblasten genannt wird, dieses Schließen der unbeschädigten Stelle durch Kontraktion vollzieht. Die genaue Quelle der Myofibroblasten wurde bis heute nicht gefunden, doch sie sind durch ihre Expression von alpha-Glattmuskelaktin gekennzeichnet.
Wir führten Studien durch, die die Fähigkeiten von follikulären und nicht-follikulären Dermalzellen aus drei verschiedenen Altersklassen von Ratten sowie aus verschiedenen Hautstellen erwachsener Menschen verglichen, ein Kollagengitter zu kontrahieren. Die involvierten adulten menschlichen Zelltypen stammten von Hautfibroblasten aus vier verschiedenen Körperstellen; besonders Glattmuskelzellen; Hautpapille aus Kopfhautpartikeln und dermale Hüllzellen aus unteren, mittleren und oberen Follikeln. Die Nagetierzellen stammten von Neugeborenen, 14 Tage alten und erwachsenen Hautfibroblasten von Tieren aus vier verschiedenen Körperstellen [Ohr, Schnauze (mystacial), Rücken (dorsal), Pfotenballen]; aortische Glattmuskelzellen, und dermale Papilla und Hüllzellen aus Vibrissenfollikeln.
Die Ergebnisse zeigten, dass alle der aus dem Follikel abstammenden dermalen Zellarten fähig waren, Gele in einem viel größeren Maße zu kontrahieren (fast doppelt) als entweder die Glattmuskelzellen oder irgendeine andere der Hautfibroblasten der Körperbereiche. Die Kontraktionsfähigkeiten der von adulten Rattenvibrissen abstammenden dermalen Zellen ähnelte derjenigen der Hautfibroblasten und Glattmuskelzellen einer neugeborenen Ratte. Auch wenn in jeder Altersgruppe die aus dem Follikel abstammenden Zellen immer kontraktionsfähiger als entweder die Hautfibroblasten oder die Glattmuskelzellen (die sich ziemlich ähnlich verhielten) waren.
Von den vier untersuchten Zelltypen waren die dermalen Hüllzellen bei weitem dem fähigsten Förderer des Prozesses des "Zusammenstrickens". Nur sie bildeten stabile Verbindungen zwischen den zwei beschädigten Rändern des Hautabschnittes, egal, ob der Schnitt vertikal oder horizontal durchgeführt worden war. Gelegentlich schien es, als hätten sie die zwei Schnittoberflächen tatsächlich zusammengeschweißt, da äußerlich keine Lücken sichtbar waren, da die darüberliegende Epidermis durchgehend war. Die dermalen Papillazellen, die ja viel weniger effizient sind als die dermalen Hüllen (vielleicht ein drittel so gut), waren besser als die Kontrollen, die gar keine Zellen aufwiesen. Die Fähigkeiten der Glattmuskelzellen eine Neubindung des Gewebes durchzuführen schien auf einer Ebene zu liegen, als ob man gar keine Zellen in die Wunden eingeführt hätte, aber die Hautfibroblasten schienen tatsächlich jedes "Kleben" völlig zu verhindern.
Obwohl diese Arbeit in vitro durchgeführt wurde, unterstützt sie die Behauptung, dass von Follikeln abstammende dermale Zellen den Wundheilungsprozess in vivo fördern können.
Lagerung des dermalen Hüllgewebes
Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass dermales Hüllgewebe und/davon abstammende Zellen eine lange Zeit bei niedrigen Temperaturen gelagert werden können und dennoch immer noch wachsen, wenn sie den geeigneten Umständen aus gesetzt werden. Dies hat eindeutig wichtige Auswirkungen auf die Lagerung von Wundheilungstherapeutika, und insbesondere auf die Lagerung der daraus hergestellten Transplantate oder "lebenden Haut".
Überdies haben unsere Untersuchungen außerdem gezeigt, dass die dermalen Hüllzellen eine lange Zeit unter extremer Belastung in Kulturen bestehen können. Dies hat ebenfalls wichtige Auswirkungen für Wundheilungstherapeutika, die aus diesem Gewebetyp hergestellt sind und ziehlt darauf ab, zu implizieren, dass diese Gewebeart entsprechend robust ist, und spiegelt die für Stammzellen charakterisierende Dauerhaftigkeit und Lebensfähigkeit wider.
Kurz gesagt, weist dermales Hüllgewebe und/oder davon abstammende Zellen all die vorteilhaften Eigenschaften auf, die man sich bei einer Wundheilungsgewebeart erhofft, es weist zudem auch Eigenschaften auf, die die Verwendung des Gewebes hinsichtlich der Herstellung und der Langzeitlagerung erleichtern.
LITERATURNACHWEIS

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Claims

Die Verwendung von dermalen Hüllzellen/dermalem Hüllgewebe für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Wunden.
Eine Verwendung nach Anspruch 1, wobei die dermale Hüllzelle(n) abgeleitet ist/sind von einem ausgewählten Teil eines Haarfollikels.
Eine Verwendung nach Anspruch 2, wobei der ausgewählte Teil das untere Drittel eines Haarfollikels ist.
Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die dermale Hüllzelle(n) abgeleitet ist/sind aus einem Zellring um ein Haarfollikel.
Eine Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Zellring ein innerer Ring von Zellen bezüglich der dermalen oder mesenchymalen Region des Haarfollikels ist.
Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die dermale Hüllzelle(n) sich positiv für alpha-Glattmuskelaktin färbt/färben.
Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1–6, wobei die dermale Hüllzelle(n) zur Verfügung gestellt wird/werden oder mit wenigstens einem anderen Gewebe oder Zelltyp aus einem Haarfollikel kombiniert wird/werden.
Eine Verwendung nach Anspruch 7, wobei das andere Gewebe oder der andere Zelltyp dermale Papilla oder Zellen, die davon abgeleitet sind, umfaßt.
Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das Medikament ein geeignetes Matrixmaterial umfaßt.
Eine Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Material natives Kollagen oder kollagene Gele oder Gitter, die aus rekonstituiertem Kollagen aufgebaut sind, oder hochkomplexe Mischungen aus rekonstituiertem Kollagen umfaßt.
Eine Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Medikament weiterhin ein Materialnetz umfaßt, auf welches die Matrix angewendet wird, so daß die Matrix, die die dermale Hüllzelle(n) enthält, in dem Netz beinhaltet oder darin eingebettet ist oder damit in Verbindung steht oder daran angehaftet ist.
Eine Verwendung nach Anspruch 11, wobei das System einen chirurgischen Verband umfaßt.
Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1–12, wobei das Medikament weiterhin wenigstens ein ausgewähltes therapeutisches Mittel umfaßt.
Eine Verwendung nach Anspruch 13, wobei das ausgewählte therapeutische Mittel antibakterielle Eigenschaften oder antiseptische Eigenschaften hat.
Eine Verwendung nach Anspruch 13, wobei das therapeutische Mittel anästhetische Eigenschaften hat.
Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1–15, wobei das Medikament daran angepaßt ist, topisch angewendet zu werden.
Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1–16, wobei das Medikament daran angepaßt ist, durch Injektion verabreicht zu werden.
Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1–16, wobei die therapeutische Zusammensetzung in einem Pflaster oder in einer Bandage beinhaltet ist oder darin eingebettet ist, damit in Verbindung steht oder daran angehaftet ist.
Ein chirurgischer Verband, der ein geeignetes Matrixmaterial umfaßt, das ein Medikament gemäß einem der Ansprüche 1–18 beinhaltet und/oder ein Medikament gemäß einem der Ansprüche 1–18 darin eingebettet ist und/oder damit in Verbindung steht und/oder daran angehaftet ist.
Ein in vitro-Wundenmodellierungssystem, das ein Medikament gemäß einem der Ansprüche 1–19 umfaßt.
Ein Medikament nach einem der Ansprüche 1–19, wobei die dermale Hüllzelle(n) nicht von der zu behandelnden Person selbst abgeleitet ist/sind.