DE102010009572A1

DE102010009572A1 - Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden unter Verwendung der Zellen der Haarwurzelscheide, Präparat und Herstellverfahren

Info

Publication number: DE102010009572A1
Application number: DE102010009572A
Authority: DE
Inventors: Sabine Krüger; Dr. Richter Wolfgang
Original assignee: EURODERM GmbH
Current assignee: EURODERM GmbH
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2011-09-01
Also published as: WO2011104030A1; US20110217269A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs mit dem Schritt: Aufbringen von Zellen, welche aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen wurden, auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers. Sie betrifft ferner Zellen, ein Präparat, das Verwenden von Zellen sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Sie betrifft ferner Zellen, insbesondere Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, gemäß Anspruch 12, ein Präparat gemäß Anspruch 15, das Verwenden von Zellen gemäß Anspruch 16 sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats gemäß Anspruch 19.
Die Verwendung von Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen zur Erhöhung oder Verstärkung einer Pigmentierung bestimmter Hautbereiche ist bekannt, u. a. aus der PCT/EP 2008/007684 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist es, weitere Verwendungen von Zellen des Körpers anzugeben.
Diese Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Daneben werden Zellen gemäß Anspruch 12, ein Präparat mit Zellen gemäß Anspruch 15, das Verwenden von Zellen gemäß Anspruch 16 sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats gemäß Anspruch 19 vorgeschlagen.
Gemäß Anspruch 1 wird ein Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden eines zweiten Hautbereichs und/oder zum Begünstigen der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst ein Aufbringen von Zellen, welche aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen wurden, auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers.
Gemäß Anspruch 12 werden Zellen aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders vorgeschlagen, welche zu ihrem Einsatz in oder auf einem zweiten Hautbereich zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge des zweiten Hautbereichs eines Empfängers gewonnen sind bzw. wurden.
Gemäß Anspruch 15 wird ein Präparat mit den erfindungsgemäß vorgeschlagenen Zellen vorgeschlagen.
Gemäß Anspruch 16 wird das Verwenden von Zellen vorgeschlagen, welche aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen sind bzw. wurden, zum Erzeugen eines Präparats zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfängers.
Gemäß Anspruch 19 wird ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, mit Zellen, insbesondere mit Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen, vorgeschlagen.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche und Ausführungsformen. Bei allen folgenden Ausführungen ist der Gebrauch des Ausdrucks „kann sein” bzw. „kann haben” usw. synonym zu „ist vorzugsweise” bzw. „hat vorzugsweise” usw. zu verstehen und soll eine erfindungsgemäße Ausführungsform erläutern.
Das erfindungsgemäße Verfahren des Anspruchs 1 dient in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen allein einem kosmetischen Zweck, etwa bei der Erhöhung der Pigmentierung oder bei der Vermeidung von hypertrophem Narbengewebe des zweiten Hautbereichs. In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen dient das erfindungsgemäße Verfahren dem Erfüllen ästhetischer Ansprüche der mit dem Verfahren behandelten Personen. Das erfindungsgemäße Verfahren des Anspruchs 1 dient in manchen Ausführungsformen einem nicht-therapeutischen und einem nicht-chirurgischen Zweck.
Erfindungsgemäße Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere der folgenden Merkmale aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die verwendeten Zellen Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen (im Folgenden auch kurz: „Vorläuferzellen”) oder weisen solche im Verband oder in einer Gruppe oder Mischung auf. In manchen Ausführungsformen liegen derartige Zellen auch in einer Zellmischung vor, die man erhält, wenn man die von der Haarwurzelscheide gewonnenen Zellen nicht nach ihrer Herkunft, Funktion oder Beschaffenheit trennt. Trennt man die gewonnen Zellen jedoch nach Erhalt, so kann man durch Verwenden von vornehmlich Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen eine höhere Wirkung nach ihrem Auftragen im Sinne der vorliegenden Erfindung erzielen.
Wenn im Folgenden auf Melanozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen Bezug genommen wird, so gilt dies uneingeschränkt auch für mesenchymale Vorläuferzellen und Stammzellen, selbst wenn dies nicht ausdrücklich erwähnt ist.
Die Keratinozytenvorläuferzellen können alternativ oder ergänzend zu den Melanozytenvorläuferzellen aufgebracht werden.
Das Aufbringen der Keratinozytenvorläuferzellen kann gleichzeitig mit dem Schritt des Aufbringens der Melanozytenvorläuferzellen erfolgen. Die Keratinozyten- und die Melanozytenvorläuferzellen können jedoch auch zeitlich versetzt aufgebracht werden.
Eine gemeinsame und ggf. auch gleichzeitige Verwendung von Melanozytenvorläuferzellen und Keratinozytenvorläuferzellen kann vorteilhaft zu einem begünstigten Wachstum der Melanozytenvorläuferzellen und der Keratinozytenvorläuferzellen nach ihrem gemeinsamen Aufbringen auf den zweiten Hautbereich führen.
Die Anmelderin des vorliegenden Verfahrens führt dies auf Interaktionen chemischer, biochemischer und/oder biologischer Art zwischen den genannten Vorläuferzellen-Typen zurück. Sie konnte beobachten, dass dieser Vorteil bereits dann auftritt, wenn das natürliche Mischungsverhältnis von Keratinozytenvorläuferzellen zu Melanozytenvorläuferzellen, wie es bspw. in den Haarwurzelscheiden des ersten Hautbereichs vorliegt, auch in der auf den zweiten Hautbereich aufgebrachten Mischung dieser Zellen beibehalten wird.
Das Aufbringen von Zellen – beispielsweise von Melanozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen – aus Haarwurzelscheiden, insbesondere aus epithelialen Haarwurzelscheiden, eines ersten Hautbereichs auf einen zweiten Hautbereich dient dem Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge des zweiten Hautbereichs bzw. hat diesen Zweck. Das Aufbringen der Zellen kann dabei vorteilhaft dazu beitragen, das Wachstum, die Differenzierung und/oder die Funktion der (Haut-)Zellen sowie von Hautanhangsgebilden wie Haaren und Zellen, welche in Hautschichten vorliegen, anzuregen.
Das Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfängers im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Begünstigen oder Fördern der primären oder sekundären Heilung von Wunden des zweiten Hautbereichs bzw. hat diesen Zweck. Dies kann das (Re-)Epithelisieren der Wunde umfassen.
Das Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfängers im Sinne der vorlegenden Erfindung umfasst in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Vermindern oder Verhindern des Entstehens von hypertrophem Narbengewebe oder von Keloid, z. B. bei der Wundheilung von Haut eines zweiten Hautbereichs der Körperoberfläche bzw. hat diesen Zweck.
Das Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfängers im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Erhöhen oder Begünstigen der Behaarung einer Narbe oder von Haut des zweiten Hautbereichs bzw. hat diesen Zweck.
Das Aufbringen von Zellen der Haarwurzelscheide bringt im Gegensatz zum Aufbringen von bspw. interfollikulären Melanozyten den Vorteil einer vergleichsweise unbegrenzten Verfügbarkeit mit sich. Während die Gewinnung von Melanozyten i. d. R. mit einer Entnahme von Haut einhergeht und damit nur zur Erhöhung der Wundheilung oder Funktionsherstellung eines begrenzten Hautareals in Frage kommt – und zudem mit einem chirurgischen Eingriff in die Integrität der Haut an der Entnahmestelle einhergeht – können Zellen der Haarwurzelscheide wie z. B. Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen vergleichsweise einfach und in hoher Stückzahl aus Haarwurzelscheiden gewonnen werden. Das Aufbringen solcher Zellen impliziert somit deren vorteilhaft hohe Verfügbarkeit.
Die Zellen, welche gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, liegen in bestimmten Ausführungsformen dieser Verfahren in einer Suspension oder in einem Sediment vor.
Das Aufbringen der Zellen erfolgt in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung durch einfaches Aufpinseln, Aufsprühen, Auftupfen oder dergleichen. Das Aufbringen erfolgt in manchen Ausführungsformen nicht-invasiv. Es erfolgt in bestimmten Ausführungsformen nicht-chirurgisch. Es kann in manchen oder in allen Ausführungsformen ohne ärztliches oder medizinisches Fachwissen erfolgen.
Das Aufbringen der Zellen oder Vorläuferzellen kann bspw. mittels einer Suspension mit 10²–10⁹ Zellen/ml. insbesondere mit 10⁵–10⁷ Zellen/ml, bspw. mittels Spritze oder Spray oder in einem biokompatiblen Vlies erfolgen.
Das Aufbringen kann in einer biokompatiblen Lösung (z. B. PBS) oder mittels eines biokompatiblen Trägers (z. B. Hyaluronan, Kollagen) erfolgen. Die Zellen können dabei als vitale oder z. B. mittels Mitomycin C oder durch Bestrahlung wachstumsarretierte Zellen oder auch als Zellextrakte (wie z. B. Lyophilisate, Sonicate) eingesetzt werden. Auch von diesen Zellen konditionierte Medien können zu diesem Zweck eingesetzt werden.
Das Aufbringen der Zellen oder Vorläuferzellen kann durch einfaches Auftragen auf die Haut erfolgen. Die Zellen können mittels z. B. Fibrinkleber auf dem zweiten Hautbereich fixiert und mit einem Okklusiv- oder Okklusionsverband geschützt werden. Aber auch jede andere geeignete Form des Aufbringens z. B. durch Integration der Zellen in biologische oder synthetische Matrices ist erfindungsgemäß möglich.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die Zellen aus Haarwurzelscheiden des ersten Hautbereichs mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen. Das Zupfen der Haare ist in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen die einzige Art der Trennung und/oder der Gewinnung der Zellen aus dem ersten Hautbereich. Es wird in diesen Ausführungsformen somit ausschließlich gezupft. Insbesondere wird nicht geschnitten, gestanzt oder dergleichen.
Die o. g. Zellen können vorteilhaft auf einfache und somit wiederholt durchführbare Weise gewonnen werden. Der Vorgang ihres Gewinnens vor ihrer Aufbringung kann vergleichsweise einfach und schmerzfrei durchgeführt werden. Dieser Vorgang birgt ferner kein Komplikationsrisiko, insbesondere kein oder kein nennenswertes Infektionsrisiko. Insbesondere werden bei alleinigem Auszupfen der Haare bzw. ihrer Haarwurzelscheiden keine Erreger übertragen, die typischerweise bei Blutkontakt übertragen werden.
Bei der Verwendung von Zellen der Haarwurzelscheide können die Zellen bspw. durch ein Auszupfen von Kopfhaaren, insbesondere von Anagenhaaren, insbesondere vom Capillitium gewonnen sein, was, wie oben angesprochen, einen weiteren Vorteil gegenüber der Verwendung von Zellen anderer Herkunft, insbesondere von interfollikulären Melanozyten bedeutet.
Ein „Gewinnen” im Sinne der Anmeldung bedeutet in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Trennen oder Lösen der Zellen, beispielsweise der Melanozytenvorläuferzellen und/oder der Keratinozytenvorläuferzellen. vom ersten Hautbereich. Es kann erfindungsgemäß auch ein Lösen der Zellen vom ersten Hautbereich umfassen. Dieses Lösen kann bspw. ein einfaches Auszupfen von Haaren, insbesondere Anagenhaaren aus der Kopfhaut, umfassen. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfasst das Gewinnen das Trennen der Zellen vom ersten Hautbereich ausdrücklich nicht.
Das Gewinnen im Sinne der Anmeldung bedeutet in manchen Ausführungsformen das Trennen der Zellen, ggf. auch der Aufbereitung, z. B. mittels Trypsin, oder umfasst ein solches Trennen und/oder Aufbereiten.
Zum „Gewinnen” von Zellen aus Haarwurzelscheiden kann erfindungsgemäß neben dem Trennen der Zellen vom ersten Bereich – oder alternativ hierzu – auch das Isolieren der Zellen aus den Haarwurzelscheiden, insbesondere aus epithelialen Haarwurzelscheiden, zählen.
Zum Schritt des „Gewinnens” kann auch ein Schritt oder eine Mehrzahl von Schritten zählen, mittels welcher die gewonnenen Zellen zu ihrem Aufbringen vorbereitet werden. Dies kann mittels Herstellen einer Zellsuspension geschehen.
Die Zellsuspension, insbesondere eine Melanozytenvorläuferzellen-Suspension und/oder Keratinozytenvor-läuferzellen-Suspension kann nach einer in vitro-Vermehrung der hierin enthaltenen Zellen hergestellt werden. In manchen Ausführungsformen ist ein Anzüchten umfasst. In anderen nicht.
Die Zellen und/oder die Zellsuspension kann jedoch auch direkt hergestellt werden, d. h. ohne vorherige Anzucht der Zellen und/oder ohne deren Verbringen in eine Kultur mit dem Ziel des Anzüchtens, Ausdifferenzierens oder Ausreifens dort.
In manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen, ohne diese zuvor zur Aufzucht der Zellen in Kultur verbracht zu haben, aufgebracht.
Das Gewinnen umfasst in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Lösen der Zellen von der Haut oder Kopfhaut, gleich ob es vitale Haut oder biopsierte Haut ist, nicht.
Die Suspension kann biokompatible Substanzen wie PBS und/oder einen biokompatiblen Träger wie bspw. Hyaluronan oder Kollagen umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der zweite Hautbereich zur Aufnahme der Zellen vorbereitet. Diese Vorbereitung erlaubt besonders wirksam ein Anwachsen der aufgebrachten Zellen auf dem zweiten Hautbereich.
Das Vorbereiten des zweiten Hautbereichs kann bspw. ein Entfernen der Epidermis, oder von Teilen hiervon, des zweiten Hautbereichs umfassen. Letzteres ist bspw. mittels Dermabrasio oder oberflächlicher Laserapplikation mit den hiermit verbundenen, dem Fachmann bekannten Vorteilen möglich.
Das Vorbereiten umfasst in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Aufbringen einer geeigneten Lösung. Als Beispiel sei hier eine Fibrinogen-Lösung genannt, welche den zweiten Hautbereich zur späteren Aufnahme der Zellen und zu deren besserem Anhaften und vor allem Anwachsen am zweiten Hautbereich vorbereitet.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der zweite Hautbereich zur Aufnahme der Zellen nicht und/oder nicht im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens vorbereitet. Letzteres ist z. B. dann der Fall, wenn die Zellen oder die Vorläuferzellen auf eine bestehende Wunde aufgebracht werden.
In manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen des Verfahrens werden die auf den zweiten Hautbereich aufgebrachten Zellen, z. B. zum beschleunigten Aufbau von Pigmenten oder zum beschleunigten Reifen oder Ausdifferenzieren, stimuliert.
Eine solche Stimulierung kann mittels UV-Belichtung erfolgen. Diese aktiviert die transferierten Zellen und kann z. B. mittels Breitband-UV, Schmalband-UVB, PUVA oder Excimer-Laser-Bestrahlung erfolgen.
Das Stimulieren kann vorteilhaft zu einer Pigmentierung sowie dem Aufbau der epidermalen Pigmenteinheit führen. Es kann zum beschleunigten Aufbau von Pigmenten führen.
Eine Stimulierung bspw. mittels Ultraviolett-Belichtung kann einmalig oder wiederholt erfolgen. Die Bestrahlung sollte dabei vorteilhaft jeweils unterhalb der Erythem-Schwelle liegen. Zum Beispiel kann eine zweimalige Bestrahlung pro Woche zur Erzielung einer gewünschten Pigmentierung des zweiten Hautbereichs führen. Eine häufigere oder weniger häufige Bestrahlung ist ebenfalls möglich.
Untersuchungen der Anmelderin haben gezeigt, dass ein Stimulieren mittels Bestrahlung auch die Wundheilung weiter begünstigen kann. Dies konnte bereits mit einer UV-Stimulierung gezeigt werden.
Die Zellen können von einem Spender stammen und bei diesem auch wieder aufgebracht werden.
In manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Spender und Empfänger identisch. Der erste Hautbereich und der zweite Hautbereich sind somit Hautbereiche ein und desselben Lebewesens. In einem solchen Fall können vorteilhaft Bemühungen, welche ein Typisieren oder Matchen aufgrund von genetischen Unterschieden zwischen Spender und Empfänger betreffen, entfallen oder sich verringern. Zudem entfallen Risiken der Übertragung – bspw. von Infektionen – vom Spender auf den Empfänger.
Die Zellen können jedoch auch von einem Spender stammen und bei einem von diesem verschiedenen Empfänger aufgebracht werden. Dabei ist es unerheblich, ob Spender und Empfänger Mensch oder Tier sind. Auch eine Übertragung von Tier auf Mensch und umgekehrt ist von der Erfindung umfasst.
Unter „Melanozytenvorläuferzellen” werden erfindungsgemäß sowohl autologe als auch allogene und xenogene Melanozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen verstanden, unter „Keratinozytenvorläuferzellen” sowohl autologe als auch allogene und xenogene Keratinozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen, unter „mesenchymalen Vorläuferzellen” sowohl autologe als auch allogene und xenogene mesenchymale Vorläuferzellen bzw. Stammzellen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ferner gelöst durch Zellen, insbesondere durch Melanoytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen, gemäß den Merkmalen des Anspruchs 12. Vorteilhafte Weiterbildungen sind auch hierbei wiederum Gegenstand jeweils der Unteransprüche.
Da mit den erfindungsgemäßen Zellen dieselben Vorteile wie mit dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erzielbar sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen an dieser Stelle explizit auf deren obenstehende Diskussion verwiesen.
Die erfindungsgemäßen Zellen sind aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs gewonnen. Die erfindungsgemäßen Zellen liegen somit außerhalb des Körpers vor.
Die erfindungsgemäßen Zellen sind in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen zu ihrem Einsatz in oder auf einem zweiten Hautbereich zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge des zweiten Hautbereichs geeignet und vorgesehen.
In bestimmten Ausführungsformen wurden die erfindungsgemäßen Zellen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen.
In manchen Ausführungsformen sind die Zellen zur Verwendung gewonnen und vorgesehen ohne zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
In bestimmten Ausführungsformen sind oder werden die Zellen nicht verändert, insbesondere nicht genetisch verändert.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Präparat mit den Merkmalen des Anspruchs 15.
Da mit dem erfindungsgemäßen Präparat dieselben Vorteile wie mit dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erzielbar sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen an dieser Stelle explizit auf deren obenstehende Diskussion verwiesen.
Das erfindungsgemäße Präparat weist erfindungsgemäße Zellen, beispielsweise Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, auf.
Ferner wird die erfindungsgemäße Aufgabe auch gelöst durch Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 16 oder des Anspruchs 19. Die mit diesen Verfahren erzielbaren Vorteile sind dieselben, die mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren erzielbar sind, weshalb zur Vermeidung von Wiederholungen auf deren diesbezügliche Diskussion verwiesen wird.
Die Zellen können dabei mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen sein.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Zellen zur Verwendung gewonnen und vorgesehen, ohne zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
Gemäß Anspruch 19 wird ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats vorgeschlagen. In manchen Ausführungsformen hiervon ist das Präparat eine Suspension. In bestimmten Ausführungsformen ist das Präparat zur Verwendung in irgendeinem der vorstehend beschriebenen Verfahren vorgesehen und geeignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, umfasst in manchen Ausführungsformen wenigstens das enzymatische Ablösen der Zellen – oder Vorläuferzellen, – seien es die Melanozytenvorläuferzellen und/oder die Keratinozytenvorläuferzellen und/oder die mesenchymalen Vorläuferzellen- von der Haarwurzelscheide eines entnommenen Haars. Die enzymatische Ablösung kann bspw. mittels einer Trypsin/EDTA-Lösung erfolgen.
Das EDTA kann als Flüssigkeit in Form einer klaren, farblosen, geruchlosen Lösung, hergestellt nach Ph. Eur (europäisches Arzneibuch in der aktuellen Version), mit einem pH von 5,42 bis 6,04 und einer Osmolarität von 331–368 mOsm/kg vorliegen, wie es beispielsweise von der Firma Biochrom AG, Deutschland unter der Artikelnummer L2113 in einer 100 ml Glasflasche erhältlich ist.
Die Trypsin/EDTA-Lösung kann 0,8%-ig vorliegen. Die Lösung bewirkt insbesondere eine Ablösung der epithelialen Zellen vom Haarschaft. Die Ablösung erfolgt vorzugsweise bei 37°C. Jedoch sind auch höhere Temperaturen möglich, bei denen die Viabilität der Zellen noch gewährleistet ist, oder niedrigere, bei denen noch eine Aktivität von Trypsin gewährleistet ist.
Zur enzymatischen Ablösung kann eine Inkubation in Trypsin, 0,1% bis 10%, besonders zwischen 0,5% bis 4%, in PBS über 1–50, insbesondere über 15–30 min, erfolgen.
PBS kann von der Firma BioConcept, Schweiz in einer 500 ml-Flasche in flüssiger Form mit einem pH von 7,3 ± 0,2 und einer Osmolarität von 285 ± 10 als PBS ohne Ca/Mg mit der Artikelnr. 3-05F29 (PBS1) oder als PBS mit Ca/Mg unter der Artikelnr. 8-05F00 (PBS2) als sterile, farblose und klare Flüssigkeit, die bei Raumtemperatur gelagert werden kann, bezogen werden. Dieses PBS kann zur Herstellung von M-Lösung geeignet sein.
Vorteilhaft an dem Vorgehen des enzymatischen Ablösens ist insbesondere, dass durch die mögliche Verwendung von Enzymen eine nachteilige Auswirkung auf die behandelten Zellen und/oder deren Veränderung, u. a. genetische Veränderung, vermieden werden kann. Die enzymatische Ablösung ist daher besonders schonend für die zu gewinnenden Zellen.
Daneben umfasst das Verfahren zum Herstellen der Suspension in einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen alternativ oder ergänzend – jeweils unabhängig voneinander – die folgenden Schritte: a) Stoppen des enzymatischen Ablösens, z. B. durch die Zugabe von Humanserum, b) Zentrifugieren der Suspension zum Erhalten eines Sediments, c) erneutes Suspendieren des zellhaltigen Sediments in einer Thrombin-Lösung, welche eine sofortige Fixierung der aufgebrachten Zellen in dünner Schicht bei der Applikation auf vorangehend aufgebrachtes Fibrinogen erlaubt und somit eine homogene, nicht zu okklusive Applikation in jeder Körperregion ermöglicht.
Als Kleberproteinlösung kann TissuCol-DuoS 2 ml Immun, welches zum Beispiel mit der Artikelnr. B1332020110614 von der Firma Baxter AG, Österreich hergestellt und von der Firma Baxter Deutschland GmbH, Hyland Immuno Division, Deutschland lieferbar ist, eingesetzt werden. Ein solcher biologischer Zweikomponentenkleber besteht aus 2 Fertigspritzen zu 2 ml Kleberproteinlösung mit Fibrinogen und 2 ml Thrombinlösung, nach Vermischen der Komponenten kann eine Verfestigung des Klebers in Sekunden bis Minuten erfolgen.
Das Verfahren umfasst in manchen Ausführungsformen – jeweils unabhängig voneinander – die folgenden Schritte: Überführen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments in eine biokompatible Lösung, Einbringen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments in einen biokompatiblen Träger und/oder Herstellen eines Zellextraktes.
Im Folgenden werden exemplarische Ausführungsbeispiele detailliert beschrieben.
So wurde in einem ersten exemplarischen Ausführungsbeispiel ein Präparat vorbereitet. Hierzu wurden verschiedene Lösungen hergestellt, welche theoretisch für vier Patienten reichen und im Einzellfall variabel anpassbar sind.
Eine Dispase-Lösung wurde aus 20 ml Dispase und 40 ml PBS1 zubereitet und in 250 ml-Nährmedienflaschen resuspendiert. Anschließend wurden 4 × je 15 ml zum Haarezupfen in 50 ml Röhrchen aliquotiert.
PBS1 wurde 4 × zu je 8 ml zum Überfuhren der Haarfollikel in 50 ml-Röhrchen aliquotiert.
Für die Trypsin-Lösung wurden 4 ml Trypsin-Lösung (z. B. TS-Lösung von Sigma), 2 ml EDTA (1,0% von Biochrom) und 4 ml PBS1 gemischt und zu je 2 ml in 15 ml-Röhrchen aliquotiert.
Die Lösung zum Abstoppen wurde durch Mischen von 135 ml PBS2 mit 15 ml Humanserum und Resuspendieren der Mischung in 250 ml-Nährmedienflaschen hergestellt. Anschließend wurde die Lösung zu je 30 ml in 50 ml-Röhrchen aliquotiert.
Für die Thrombin-Lösung wurden 2 ml Thrombin (TissueCol-DuoS) mit 11,3 ml PBS2 (mit Ca/Mg) gemischt und in 15 ml-Röhrchen resuspendiert. Zum Versand wurden je 2 ml in 2 ml-Spritzen mit steriler Kanüle (Gr. 1) aufgezogen, die Luftblasen entfernt, die Kanüle wieder mit einer Schutzhülle versehen, die Spritzen in Klebebeutel verpackt und in nicht-gefrorenem Zustand mit Kühlakku verschickt.
Die Fibrinogen-Lösung wurde durch Mischen von 2 ml Fibrinogen (TissueCol-DuoS) mit 6 ml PBS1 hergestellt. Zum Versand wurden je 2 ml in 2 ml-Spritzen mit steriler Kanüle (Gr. 1) aufgezogen, die Luftblasen entfernt, die Kanüle wieder mit einer Schutzhülle versehen, die Spritzen in Klebebeutel verpackt und in gefrorenem Zustand mit Trockeneis verschickt.
Je Patient und/oder je nach Behandlung können folgende Geräte und/oder Verbrauchsmaterialien eingesetzt und ggf. in einem Behandlungsset mitverschickt werden bzw. zur Behandlung bereitliegen: Pipettierhilfe und Ladekabel, eine sterile Metall-Pinzette, eine 90 ml Petrischale, Pipetten (10 Stück 10 ml/5 Stück 2 ml), ein Zellsieb, 1–2 Kryoröhrchen; ein 50 ml-Röhrchen mit 15 ml Dispase-Lösung, ein 50 ml-Röhrchen mit 8 ml PBS1, ein 15 ml-Röhrchen mit 2 ml Trypsin-Lösung, ein 50 ml-Röhrchen mit 30 ml PBS2/Humanserum, ein 50 ml-Röhrchen (für Zellsieb), vier 15 ml-Röhrchen (für Zentrifugation); eine Spritze (mit Kanüle) mit 2 ml Fibrinogen-Lösung, eine Spritze (mit Kanüle) mit 2 ml Thrombin-Lösung.
Zunächst wurde eine Zellsuspension hergestellt. Dazu ließ man eine Fibrinogen-Lösung (Spritze) bei Raumtemperatur auftauen. Eine Dispase-Lösung zum Haarezupfen (15 ml) wurde in eine 90 ml-Petrischale überführt. Danach wurden an etwa 250 bereits ausgezupft vorliegenden Haarfollikeln (ausreichend zur Behandlung einer Fläche von ca. 20 bis 30 cm²) der Großteil des Haares (totes Haarmaterial) abgeschnitten. Die Haarfollikel wurden in die 90 ml-Petrischale überführt.
Die geschnittenen Haarfollikel wurden mittels einer sterilen Pinzette in ein 50 ml-Röhrchen, welches 8 ml PBS1 enthielt, überführt. Anschließend wurden 2 ml Trypsin-Lösung zugegeben. Es sollte darauf geachtet werden, dass alle Haarfollikel in die Lösung eintauchen.
Das Röhrchen wurde (z. B. mit Hilfe eines Wärmeblocks/Wasserbades) auf ca. 37°C aufgewärmt. Die Trypsin-Behandlung erfolgte für ca. 25–30 min unter gelegentlichem Schütteln/Resuspendieren. Durch Zugabe von 30 ml PBS2/Serum wurde das Trypsin inaktiviert.
Ein mechaniches Ablösen der ORS-Zellen (Zellen der äußeren Haarwurzelscheide; ORS = outer root sheath) wurde durch gründliches Auf- und Abpipettieren (mind. 30-mal) z. B. mittels einer 10 ml-Pipette erreicht.
Anschließend wurde die Suspension über ein Zellsieb (Porengröße 70 μm) in cm 50 ml-Röhrchen transferiert, um totes Zellmaterial/Zellklumpen zu entfernen.
Die Suspension (40 ml) wurde auf vier 15 ml-Röhrchen verteilt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und der Überstand abgegossen oder abpipettiert. Zum Zellpellet wurde die Thrombinlösung (2 ml) aus der Spritze zugegeben und die Zellen mit einer 2 ml-Pipette resuspendiert. Dabei wurden Zellen aus den vier Röhrchen gesammelt.
Es wird darauf hingewiesen, dass in manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Zentrifugieren nicht vorgesehen ist. Das Verfahren kann in solchen Ausführungsformen somit ohne Zentrifugieren ablaufen. Dies kann den apparativen Aufwand, welcher zur Durchführung des Verfahrens erforderlich ist, vorteilhaft gering halten.
Anschließend wurde die Zellsuspension in ein Kryoröhrchen überführt und daraus wieder in die Thrombin-Spritze mit Kanüle aufgezogen.
Zur Behandlung von Hautwunden wurde den Patienten 2 ml Fibrinogen-Lösung auf die Wundfläche aufgebracht. Anschließend wurde die Thrombin-Zell-Lösung aufgebracht. Die Wunde wurde auf übliche Weise verbunden. Der erste Verbandswechsel fand jeweils nach 5 Tagen statt.
Zur Behandlung von Narbengewebe wie hypertrophen Narben sowie Keloidbildung waren die behandelten Patienten wie folgt vorbereitet gewesen. Nach örtlicher Betäubung des Wundbereichs wurde das Narbengewebe mittels Dermabrasio oder unter Verwendung eines Erbium-YAG-Lasers abgetragen. Anschließend begann das erfindungsgemäße Verfahren mit dem Aufbringen der Zellsuspension und des Fibrinklebers (optional) mittels einer Spritze oder einer Spray-Vorrichtung. Die behandelten Areale wurden mit Folienverband abgedeckt. Ein erster Verbandswechsel erfolgte nach 5 bis 7 Tagen.
Im Folgenden wird das Beispiel der Behandlung eines Patienten, bei dem sowohl eine Begünstigung der Wundheilung, des Haarwachstums die Vermeidung von Keloidbildung im Bereich des behandelten zweiten Hautbereichs beobachtet werden konnte, beschrieben:
Der Patient, männlich, 29 Jahre, wurde 1991 an der Bauchmuskulatur operiert. In Folge der Operation entstand Keloid im Narbenbereich. Dieses wurde über Jahre mit verschiedenen üblichen Cremes ohne kosmetische Verbesserung behandelt.
Bereits eine einmalige Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren im Jahr 2009 führte zu einer kompletten Epithelisierung der vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Dermabrasio geschaffenen akuten Wunde innerhalb von nur 4 Tagen. Eine Keloidbildung konnte im Verlauf der folgenden Monate bis heute nicht beobachtet werden; es kam zu keiner Keloidbildung. Hingegen konnte eine der umgebenden Hautareale angepasste Pigmentierung beobachtet werden; ferner ein Wachsen von Haaren auf der behandelten akuten Wunde. Dabei wurden bei dem Patienten zumindest auch Melanoyzten-Vorläuferzellen aufgetragen.
Ein Haarwachstum wurde bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auch bei Patienten in Bereichen ohne Narbengewebe, also in narbenfreiem Gewebe, beobachtet. Dies war insbesondere an Stellen erstaunlich, an welchen vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens keine Haare (mehr) gewachsen waren.
Bei der Behandlung akuter oder chronischer Wunden wurde wie folgt vorgegangen: An eine vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens gesäuberte Wunde, wobei z. B. mit einem scharfen Löffel Fibrinbeläge oder nekrotisches Gewebe abgetragen wurden, wurde das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt: Zunächst wurden die Zellsuspension und der Fibrinkleber (optional) mittels einer Spritze oder einer Spray-Vorrichtung aufgebracht und die behandelten Areale mit Folienverband abgedeckt. Ein erster Verbandswechsel erfolgte nach ca. 3 bis 5 Tagen.
In einem weiteren exemplarischen Ausführungsbeispiel wurden bei einer weiteren Person mit einem seit Jahren unverändert bestehenden Vitiligoherd von rund zehn Quadratzentimetern Fläche am Handrücken 50 Anagenhaare aus der Kopfhaut gezupft. Die abgetrennten Haarwurzeln wurden für 25 min in Trypsin/EDTA-Lösung, 0,8%-ig, bei 37°C inkubiert. Hierbei lösten sich epitheliale Zellen vom Haarschaft. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Humanserum beendet. Die mit der Trypanblau-Exklusion gemessene Vitalität der Zellen lag dabei bei über 50%. Die Zellsuspension wurde bei 500 × g zentrifugiert, und das zellhaltige Sediment wurde in 2 ml einer Thrombin-Lösung suspendiert. Die zur Heilung der Hautwunden vorgesehene Fläche am Handrücken wurde nach eingehender Desinfektion mittels Dermabrasio de-epidermisiert. Nach Aufbringen von 2 ml einer Fibrin-Lösung auf die Wundfläche wurde die Zellsuspension aufgetragen. Das Behandlungsareal wurde anschließend mit einem herkömmlichen Wundverband okklusiv abgedeckt. Ein Verbandswechsel erfolgte alle drei Tage. Nach einer innerhalb von zwei Wochen abgeschlossenen Reepithelisierung wurde das Behandlungsareal zwei Mal wöchentlich mit Breitspektrum-Ultraviolett unterhalb der Erythem-Schwelle belichtet. Eine vollständige Angleichung der Pigmentierung des behandelten Hautbereichs an eine diesen umgebende Haut konnte auf diese Weise im Verlauf von acht Wochen erzielt werden.
Zum Unterdrücken einer Autoimmunreaktion können im Falle einer Vitiligo zeitlich begrenzt geeignete Wirkstoffe wie topische oder systemische Kortikosteroide oder topische Calcineurin-Inhibitoren eingesetzt werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 2008/007684 [0002]

Claims

Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs, gekennzeichnet durch den Schritt: Aufbringen von Zellen, welche aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen wurden, auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen (kurz: Vorläuferzellen) sind oder solche umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellen oder Vorläuferzellen jeweils aus Haarwurzelscheiden des ersten Hautbereichs mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut oder einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders oder anderweitig aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen wurden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs ein Fördern der primären oder sekundären Heilung von Wunden ist oder dieses umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs ein Vermindern oder Verhindern des Entstehens von hypertrophem Narbengewebe oder von Keloid ist oder dieses umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs ein Erhöhen oder Begünstigen der Behaarung einer Narbe oder von Haut des zweiten Hautbereichs ist oder dieses umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt Vorbereiten der gewonnenen Zellen oder Vorläuferzellen vor dem Aufbringen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt Aufbringen der gewonnenen Zellen oder Vorläuferzellen ohne jeweils diese zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu haben.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den Schritt Vorbereiten des zweiten Hautbereichs zur Aufnahme der gewonnenen Zellen oder Vorläuferzellen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den Schritt Stimulieren der Zellen oder Vorläuferzellen nach ihrem Aufbringen auf den zweiten Hautbereich.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Spender und Empfänger identisch sind.
Zellen, insbesondere Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders, gewonnen zu ihrem Einsatz in oder auf einem zweiten Hautbereich zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge des zweiten Hautbereichs eines Empfängers.
Zellen nach Anspruch 12, gewonnen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut oder einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders oder anderweitig aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders.
Zellen nach Anspruch 12 oder 13, gewonnen und vorgesehen zu ihrem Aufbringen auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers oder zum Herstellen eines Präparats, ohne vor ihrem Aufbringen oder vor dem Herstellen zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
Präparat mit Zellen gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14.
Verwenden von Zellen, insbesondere Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen, gewonnen aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders zum Erzeugen eines Präparats zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfängers.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Zellen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut oder einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders oder anderweitig aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen sind.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17. wobei die Zellen gewonnen und vorgesehen sind zu ihrem Aufbringen auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers oder zum Herstellen eines Präparats, ohne vor ihrem Aufbringen oder vor dem Herstellen zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, welche Zellen der Haarwurzelscheide, insbesondere Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, aufweist, insbesondere zur Verwendung in einem der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 sowie 16 bis 18, mit wenigstens einem oder mehreren der folgenden Schritte: – Enzymatisches Ablösen von Zellen von der Haarwurzelscheide; – Stoppen des enzymatischen Ablösens, insbesondere durch die Zugabe von Humanserum; – Zentrifugieren oder Filtrieren der Suspension zum Erhalten eines Sediments oder Zellkonzentrats; – Suspendieren des zellhaltigen Sediments Konzentrats, insbesondere in einer Thrombin-Lösung; – Überführen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments oder des Konzentrats in eine biokompatible Lösung; – Einbringen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments oder des Konzentrats in einen biokompatiblen Träger; und/oder – Herstellen eines Zellextraktes.
Verfahren nach Anspruch 16 bis 19, wobei das Verfahren ein Kultivieren der Zellen der Haarwurzelscheide nicht umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20 wobei das Verfahren den Schritt eines Zentrifugierens und/oder Filtrierens, insbesondere des Zentrifugierens und/oder Filtrierens der Suspension zum Erhalten eines Sediments, nicht umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei das Verfahren den Schritt eines Stoppens des enzymatischen Ablösens nicht umfasst.