WO2011104030A1 - Verfahren zum begünstigen der heilung von hautwunden unter verwendung von zellen der haarwurzelscheide, präparat und herstellverfahren - Google Patents

Verfahren zum begünstigen der heilung von hautwunden unter verwendung von zellen der haarwurzelscheide, präparat und herstellverfahren Download PDF

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WO2011104030A1
WO2011104030A1 PCT/EP2011/000925 EP2011000925W WO2011104030A1 WO 2011104030 A1 WO2011104030 A1 WO 2011104030A1 EP 2011000925 W EP2011000925 W EP 2011000925W WO 2011104030 A1 WO2011104030 A1 WO 2011104030A1
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WO
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cells
skin
skin area
progenitor cells
donor
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PCT/EP2011/000925
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Inventor
Wolfgang Richter
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Euroderm Gmbh
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Publication date
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting the healing of skin wounds and / or the restoration of the function of the skin and / or its skin appendages. It further relates to cells, in particular melanocyte precursor cells and / or keratinocyte progenitor cells and / or mesenchymal progenitor cells. according to claim 12, a preparation according to claim 15, the use of cells according to claim 16 and a method for producing a preparation according to claim 19.
  • melanocyte precursor cells and / or keratinocyte progenitor cells to increase or enhance pigmentation of certain areas of the skin is known, i.a. from PCT / EP 2008/007684 assigned to the assignee of the present invention.
  • An object of the invention is to specify further uses of cells of the body. This object of the present invention is achieved by a method according to
  • Claim 1 solved.
  • cells according to claim 12 a preparation with cells according to claim 15, the use of cells according to claim 16 and a method for producing a preparation according to claim 19 are proposed.
  • CONFIRMATION COPY Restoration of the function of the skin and / or its skin appendages proposed.
  • the method comprises applying cells obtained from hair root sheaths of a first skin area of a donor to a second skin area of a recipient.
  • cells are proposed from hair root sheaths of a first skin area of a donor, which for their use in or on a second skin area for promoting the healing of wounds and / or restore the function of the skin and / or their skin appendages of the second skin area of a recipient won are or have been.
  • a preparation with the cells proposed according to the invention is proposed.
  • a method for producing a preparation, in particular a suspension, with cells, in particular with melanocyte precursor cells and / or keratinocyte precursor cells and / or mesenchymal progenitor cells, is proposed.
  • inventive method of claim 1 is used in some embodiments of the invention solely for a cosmetic purpose, such as in the increase of pigmentation or in the prevention of hypertrophic scar tissue of the second skin area.
  • the method of the invention serves to meet aesthetic demands of the persons treated with the method.
  • the method according to the invention of claim 1 serves in some embodiments a non-therapeutic and a non-surgical purpose.
  • Embodiments of the present invention may include one or more of the following features.
  • the cells used are melanocyte progenitor cells and / or keratinocyte progenitor cells and / or mesenchymal progenitor cells (hereinafter also referred to as "progenitor cells" for short) or in association or in a group or mixture in a cell mixture which is obtained by not separating the cells obtained from the hair root sheath by their origin, function or constitution, but separating the cells obtained on receipt can be carried out by using predominantly melanocyte progenitor cells and / or keratinocyte precursor cells and / or or mesenchymal progenitor cells achieve a higher effect after their application in the context of the present invention.
  • progenitor cells melanocyte progenitor cells and / or keratinocyte progenitor cells and / or mesenchymal progenitor cells
  • melanocyte progenitor cells and / or keratinocyte progenitor cells or stem cells this also applies without restriction to mesenchymal progenitor cells and stem cells, even if this is not expressly mentioned.
  • the keratinocyte precursor cells can be applied alternatively or in addition to the melanocyte progenitor cells.
  • the application of the keratinocyte progenitor cells may occur simultaneously with the step of applying the melanocyte precursor cells.
  • the keratinocyte and the melanocyte progenitor cells can also be applied offset in time.
  • a common and possibly simultaneous use of melanocyte precursor cells and keratinocyte progenitor cells can advantageously lead to a favored growth of the melanocyte progenitor cells and the keratinocyte precursor cells after their joint application to the second skin area.
  • the assignee of the present process attributes this to chemical, biochemical and / or biological interactions between said progenitor cell types. It could be observed that this advantage already occurs when the natural mixing ratio of keratinocyte progenitor cells to melanocyte progenitor cells, as it is present for example in the hair root sheaths of the first skin area, is also maintained in the mixture of these cells applied to the second skin area.
  • the application of cells - for example, melanocyte progenitor cells and / or keratinocyte progenitor cells - from hair root sheaths, in particular from epithelial hair root sheaths, of a first skin area to a second skin area, serves to promote healing of skin wounds and / or restoration of function the skin and / or its skin appendages of the second skin area or has this purpose.
  • the application of the cells can advantageously contribute to the growth, differentiation and / or function of (skin) cells and of Skin appendages such as hair and cells, which are present in skin layers, to stimulate.
  • promoting the healing of wounds and / or restoring the function of the skin and / or its dermal appendages of a second skin area of a recipient comprises promoting or promoting the primary or secondary healing of wounds of the second skin area or regions has this purpose. This may include (re) epithelializing the wound.
  • Promoting the healing of wounds and / or the restoration of the function of the skin and / or its dermal appendages of a second skin area of a recipient within the meaning of the present invention comprises reducing or preventing the emergence of hypertrophic scar tissue or keloid, e.g. in the wound healing of skin of a second skin area of the body surface or has this purpose.
  • promoting the healing of wounds and / or restoring the function of the skin and / or its dermal appendages of a second skin area of a recipient comprises increasing or promoting the hairiness of a scar or skin of the second skin area or skin has this purpose.
  • the application of cells of the hair root sheath in contrast to the application of, for example, interfollicular melanocytes, has the advantage of a comparatively unlimited availability. While the extraction of melanocytes usually associated with a removal of skin and thus only to increase the wound healing or functional production of a limited skin area in question - and also with a surgical intervention in the Skin integrity at the donor site is accompanied - cells of the hair root sheath such as melanocyte progenitor cells and / or keratinocyte precursor cells can be obtained comparatively easily and in large numbers from hair root sheaths. The application of such cells thus implies their advantageous high availability.
  • the cells used in accordance with the methods of the invention are in suspension or sediment in certain embodiments of these methods.
  • the application of the cells in certain embodiments of the present invention by simply brushing, spraying, dabbing or the like.
  • the application is noninvasive in some embodiments. It is non-surgical in certain embodiments. It may occur in some or all embodiments without medical or medical knowledge.
  • the application of the cells or progenitor cells can be carried out, for example, by means of a suspension having 10 -10 cells / ml, in particular 10 -10 cells / ml, for example by means of a syringe or spray, or in a biocompatible fleece.
  • the application may be carried out in a biocompatible solution (eg PBS) or by means of a biocompatible carrier (eg hyaluronan, collagen).
  • a biocompatible carrier eg hyaluronan, collagen.
  • the cells can be considered vital or z.
  • B. by mitomycin C or by irradiation growth-arrested cells or as cell extracts (such as, for example, lyophilisates, sonicates) can be used. Media conditioned by these cells can also be used for this purpose.
  • the application of the cells or progenitor cells can be done by simply applying to the skin.
  • the cells can by means of z. B. Fibrin glue fixed on the second skin area and with an occlusive or Be protected occlusion dressing. But also any other suitable form of applying z. B. by integration of the cells in biological or synthetic matrices is possible according to the invention. In one embodiment of the method according to the invention were
  • Cells from hair root sheaths of the first skin area obtained by plucking hair from the vital skin of the donor or by plucking or otherwise obtaining hair from a present skin biopsy of the donor.
  • the plucking of the hair is in certain embodiments of the invention the only way of separating and / or recovering the cells from the first skin area. It is thus plucked exclusively in these embodiments. In particular, it does not cut, stamp or the like.
  • the o.g. Cells can be advantageously obtained in a simple and thus repeatedly feasible manner. The process of obtaining them before applying them can be done relatively easily and painlessly. This process also carries no risk of complications, in particular no or no significant risk of infection. In particular, no pathogens that are typically transmitted in the event of blood contact are transmitted when plucking the hair or its hair root sheaths alone.
  • the cells can be obtained, for example, by picking hair from the head, in particular from anagen hair, in particular from the capillium, which, as mentioned above, means a further advantage over the use of cells of other origin, in particular interfollicular melanocytes ,
  • a "winning" within the meaning of the application means in certain embodiments of the invention the separation or release of the cells, for example the melanocyte precursor cells and / or the Keratinocyte precursor cells, from the first skin area.
  • it can also comprise a detachment of the cells from the first skin area.
  • This release can, for example, a simple plucking of hair, especially anagen hairs from the scalp include.
  • harvesting expressly does not involve separating the cells from the first skin area.
  • the winning in the sense of the application means in some embodiments the separation of the cells, possibly also of the processing, e.g. by trypsin, or includes such separation and / or processing.
  • the step of "winning” can also include a step or a plurality of steps by means of which the cells obtained are prepared for application, which can be done by producing a cell suspension.
  • Suspension and / or keratinocyte precursor cell suspension may be prepared after in vitro propagation of the cells contained therein. In some embodiments, breeding is included. Not in others. However, the cells and / or the cell suspension can also be prepared directly, ie without prior culture of the cells and / or without their introduction into a culture with the aim of cultivating, differentiating or maturing there. In some embodiments of the method according to the invention, the cells are applied without having previously spent them in order to grow the cells in culture. The winning comprises in certain inventive
  • Embodiments do not dissolve the cells of the skin or scalp, whether it be vital skin or biopsied skin.
  • the suspension may comprise biocompatible substances such as PBS and / or a biocompatible carrier such as hyaluronan or collagen.
  • the second skin area is prepared for receiving the cells. This preparation allows particularly effective growth of the applied cells on the second skin area.
  • Preparing the second skin area may include, for example, removing the epidermis, or portions thereof, of the second skin area.
  • the latter is possible, for example, by means of dermabrasion or superficial laser application with the associated advantages known to those skilled in the art.
  • the preparation includes, in certain embodiments of the invention, the application of a suitable solution.
  • a suitable solution is a fibrinogen solution which prepares the second area of the skin for the later uptake of the cells and for their better adhesion and, above all, growth on the second area of the skin.
  • the second skin area for receiving the cells is not and / or not prepared in the course of the method according to the invention.
  • the latter is the case, for example. when the cells or progenitor cells are applied to an existing wound.
  • the cells applied to the second skin area e.g. for accelerated building of pigments or accelerated maturation or differentiation.
  • Such stimulation can be done by means of UV exposure.
  • the stimulation can advantageously lead to pigmentation and the structure of the epidermal pigment unit. It can lead to the accelerated build-up of pigments.
  • a stimulation for example, by means of ultraviolet exposure can take place once or repeatedly.
  • the irradiation should advantageously be below the erythema threshold. For example, twice weekly irradiation may result in achieving a desired pigmentation of the second skin area. More frequent or less frequent irradiation is also possible.
  • the cells can come from a donor and be applied to this again.
  • the method according to the invention are
  • the first skin area and the second Skin area are thus skin areas of one and the same animal.
  • efforts involving typing or matching due to genetic differences between donor and recipient may be eliminated or reduced.
  • the cells may also be derived from a donor and applied to a different recipient. It does not matter if the donor and the recipient are human or animal. A transmission from animal to human and vice versa is included in the invention.
  • melanocyte progenitor cells is understood to mean both autologous and allogeneic and xenogeneic melanocyte precursor cells or stem cells, "autogenous and allogeneic and xenogenic keratinocyte progenitor cells or stem cells under" keratinocyte progenitor cells ", and” autosomal as well as allogeneic and xenogeneic mesenchymal cells under “mesenchymal progenitor cells” Progenitor cells or stem cells.
  • the object according to the invention is furthermore achieved by cells, in particular by melanocyte precursor cells and / or
  • Keratinocyte progenitor cells and / or mesenchymal precursor cells according to the features of claim 12.
  • Advantageous developments are again in each case the subject of the dependent claims. Since the same advantages can be achieved with the cells according to the invention as with the method according to the invention described above, reference is explicitly made to their discussion above to avoid repetitions at this point.
  • the cells according to the invention are obtained from hair root sheaths of a first skin area. The cells of the invention are thus outside the body.
  • the cells of the invention are in some of the invention
  • the cells of the present invention have been obtained by plucking hair from the vital skin of the donor or plucking or otherwise harvesting hair from a present skin biopsy of the donor.
  • the cells are recovered for use and provided without first being spent or spent in a culture to grow cells. In certain embodiments, the cells are not or will not be altered, particularly not genetically altered.
  • the object according to the invention is furthermore achieved by a preparation having the features of claim 15.
  • the preparation according to the invention comprises cells according to the invention, for example melanocyte precursor cells and / or keratinocyte precursor cells and / or mesenchymal progenitor cells.
  • the object according to the invention is also achieved by methods having the features of claim 16 or claim 19. The advantages which can be achieved with these methods are the same which can be achieved with the method described above, and reference is therefore made to their discussion in order to avoid repetition.
  • the cells can thereby be obtained by plucking hair from the vital skin of the donor or by plucking or otherwise obtaining hair from a present skin biopsy of the donor.
  • the method according to the invention are
  • Cells are obtained and intended for use without first being spent or spent in a culture to grow cells.
  • a method for producing a preparation is proposed.
  • the preparation is a suspension.
  • the preparation is intended and suitable for use in any of the methods described above.
  • the method according to the invention for producing a preparation, in particular a suspension comprises in some embodiments at least the enzymatic detachment of the cell or precursor cells, be it the melanocyte progenitor cells and / or the keratinocyte progenitor cells and / or the mesenchymal progenitor cells, from the hair root sheath of an extracted hair.
  • the enzymatic detachment can be carried out, for example, by means of a trypsin / EDTA solution.
  • the EDTA can be used as a liquid in the form of a clear, colorless, odorless solution prepared according to Ph. Eur.
  • the trypsin / EDTA solution may be 0.8%.
  • the solution causes a detachment of the epithelial cells from the hair shaft.
  • the detachment is preferably carried out at 37 ° C. However, higher temperatures are possible in which the viability of the cells is still guaranteed, or lower, in which an activity of trypsin is still guaranteed.
  • PBS can be obtained from the company BioConcept, Switzerland in a 500 ml bottle in liquid form with a pH of 7.3 ⁇ 0.2 and an osmolarity of 285 ⁇ 10 as PBS without Ca / Mg with the article no. 3-05F29 (PBS1) or as PBS with Ca / Mg under the article no. 8-05F00 (PBS2) as a sterile, colorless and clear liquid which can be stored at room temperature.
  • This PBS may be suitable for the preparation of M solution.
  • the method for producing the suspension in some embodiments according to the invention comprises, alternatively or additionally, each independently of one another, the following steps: a) stopping the enzymatic detachment, eg by adding human serum, b) centrifuging the suspension to obtain a sediment, c) resuspending the cell-containing sediment in a thrombin solution, which allows immediate fixation of the applied cells in a thin layer when applied to previously applied fibrinogen and thus allows a homogeneous, non-occlusive application in each body region.
  • Such a biological two-component adhesive consists of 2 pre-filled syringes to 2 ml of adhesive protein solution with fibrinogen and 2 ml of thrombin solution, after mixing the components, a solidification of the adhesive can be done in seconds to minutes.
  • the method in some embodiments, independently of each other, comprises the steps of: transferring the cells or suspension or sediment into a biocompatible solution, introducing the cells or suspension or sediment into a biocompatible carrier, and / or preparing a cell extract.
  • a preparation was prepared.
  • Various solutions were produced for this purpose, which theoretically suffice for four patients and can be variably adjusted in a single case.
  • a dispase solution was prepared from 20 ml dispase and 40 ml PBS1 and resuspended in 250 ml nutrient media bottles. Then 4 x per 15 ml for hair plucking in 50 ml tubes were aliquoted.
  • PBS1 was aliquoted 4 x 8 ml each to transfer the hair follicles into 50 ml tubes.
  • trypsin solution 4 ml of trypsin solution (e.g., TS solution from Sigma), 2 ml of EDTA (1.0% of Biochrom) and 4 ml of PBS1 were mixed and aliquoted into 2 ml each into 15 ml tubes.
  • trypsin solution e.g., TS solution from Sigma
  • EDTA 1.0% of Biochrom
  • PBS1 4 ml of PBS1
  • the stop-off solution was prepared by mixing 135 ml PBS2 with 15 ml human serum and resuspending the mixture in 250 ml nutrient media bottles. The solution was then aliquoted into 50 ml tubes of 30 ml each.
  • thrombin solution 2 ml of thrombin (TissueCol-DuoS) was mixed with 1.3 ml of PBS2 (with Ca / Mg) and resuspended in 15 ml tubes.
  • PBS2 with Ca / Mg
  • sterile cannula size 1
  • the fibrinogen solution was prepared by mixing 2 ml of fibrinogen
  • tissueCol-DuoS tissueCol-DuoS prepared with 6 ml of PBS1.
  • 2 ml each were drawn up in 2 ml syringes with sterile cannula (size 1), the air bubbles removed, the cannula again provided with a protective cover, the syringes packed in adhesive bags and shipped frozen with dry ice.
  • the following devices and / or consumables may be used for each patient and / or depending on the treatment and may be included in a treatment set or ready for treatment: pipetting aid and charging cable, a sterile metal tweezers, a 90 ml Petri dish, pipettes (10 pieces 10 ml / 5 pieces 2 ml), a cell strainer, 1-2 cryotubes; a 50 ml tube with 15 ml dispase solution, a 50 ml tube with 8 ml PBS1, a 15 ml tube with 2 ml trypsin solution, a 50 ml tube with 30 ml PBS2 / human serum, a 50 ml tube Tube (for cell strainer), four 15 ml tubes (for centrifugation); one syringe (with cannula) with 2 ml fibrinogen solution, one syringe (with cannula) with 2 ml thrombin solution.
  • a cell suspension was prepared. This was allowed to thaw a fibrinogen solution (syringe) at room temperature. A hair pluck dispensing solution (15 ml) was transferred to a 90 ml Petri dish. Thereafter, about 250 hair follicles already plucked (sufficient to treat an area of about 20 to 30 cm), the majority of the hair (dead hair material) were cut off. The hair follicles were transferred to the 90 ml Petri dish. The cut hair follicles were inserted by means of sterile tweezers
  • the suspension (40 ml) was distributed to four 15 ml tubes.
  • the cells were centrifuged off and the supernatant poured off or pipetted off.
  • the thrombin solution (2 ml) from the syringe was added and the cells were resuspended with a 2 ml pipette. Cells were collected from the four tubes. It should be noted that centrifugation is not provided in some embodiments of the method according to the invention. The method can thus proceed in such embodiments without centrifuging. This can keep the apparatus required, which is necessary for carrying out the method, advantageously low.
  • the cell suspension was transferred to a cryotube and reared therefrom in the thrombin syringe with cannula.
  • the treated patients had been prepared as follows. After local anesthesia of the wound area, the scar tissue was Dermabrasio or eroded using an Erbium YAG laser. Subsequently, the method according to the invention began with the application of the cell suspension and the fibrin glue (optional) by means of a syringe or a spray device. The treated areas were covered with foil dressing. A first dressing change took place after 5 to 7 days.
  • pigmentation adapted to the surrounding skin areas could be observed; further, hair growing on the treated acute wound.
  • At least melanocyte precursor cells were also applied to the patient.
  • anagen hairs were plucked from the scalp in another person with a vitiligo focus of about ten square centimeters on the back of the hand unchanged for years.
  • the separated hair roots were incubated for 25 min in trypsin / EDTA solution, 0.8%, at 37 ° C.
  • epithelial cells detached from the hair shaft.
  • the reaction was stopped by addition of human serum.
  • the vitality of the cells measured with the trypan blue exclusion was more than 50%.
  • the cell suspension was centrifuged at 500 xg and the cell-containing sediment was suspended in 2 ml of a thrombin solution.
  • the surface of the back of the hand intended for the healing of the skin wounds was de-epidermised after thorough disinfection by dermabrasion. After applying 2 ml of a fibrin solution to the wound surface, the cell suspension was applied. The treatment area was then covered occlusively with a conventional wound dressing. A dressing change took place every three days. Following reepithelialization completed within two weeks, the treatment area was exposed twice weekly to broad spectrum ultraviolet below the erythema threshold. A complete alignment of the pigmentation of the treated skin area with surrounding skin could thus be achieved over eight weeks.
  • suitable active ingredients such as topical or systemic corticosteroids or topical calcineurin inhibitors may be used for a limited period of time.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs mit dem Schritt: Aufbringen von Zellen, welche aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen wurden, auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers. Sie betrifft ferner Zellen, ein Präparat, das Verwenden von Zellen sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats.

Description

Beschreibung
Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden unter Verwendung von Zellen der Haarwurzelscheide, Präparat und
Herstellverfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Sie betrifft ferner Zellen, insbesondere Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, gemäß Anspruch 12, ein Präparat gemäß Anspruch 15, das Verwenden von Zellen gemäß Anspruch 16 sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats gemäß Anspruch 19.
Die Verwendung von Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen zur Erhöhung oder Verstärkung einer Pigmentierung bestimmter Hautbereiche ist bekannt, u.a. aus der PCT/EP 2008/007684 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist es, weitere Verwendungen von Zellen des Körpers anzugeben. Diese Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren gemäß
Anspruch 1 gelöst. Daneben werden Zellen gemäß Anspruch 12, ein Präparat mit Zellen gemäß Anspruch 15, das Verwenden von Zellen gemäß Anspruch 16 sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats gemäß Anspruch 19 vorgeschlagen. Gemäß Anspruch 1 wird ein Verfahren zum Begünstigen der Heilung von
Hautwunden eines zweiten Hautbereichs und/oder zum Begünstigen der
BESTÄTIGUNGSKOPIE Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst ein Aufbringen von Zellen, welche aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen wurden, auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers.
Gemäß Anspruch 12 werden Zellen aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders vorgeschlagen, welche zu ihrem Einsatz in oder auf einem zweiten Hautbereich zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge des zweiten Hautbereichs eines Empfängers gewonnen sind bzw. wurden.
Gemäß Anspruch 15 wird ein Präparat mit den erfindungsgemäß vorgeschlagenen Zellen vorgeschlagen. Gemäß Anspruch 16 wird das Verwenden von Zellen vorgeschlagen, welche aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen sind bzw. wurden, zum Erzeugen eines Präparats zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfängers.
Gemäß Anspruch 19 wird ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, mit Zellen, insbesondere mit Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen, vorgeschlagen.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche und Ausfuhrungsformen. Bei allen folgenden Ausführungen ist der Gebrauch des Ausdrucks„kann sein" bzw.„kann haben" usw. synonym zu„ist vorzugsweise" bzw. „hat vorzugsweise" usw. zu verstehen und soll eine erfindungsgemäße Ausfuhrungsform erläutern. Das erfindungsgemäße Verfahren des Anspruchs 1 dient in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen allein einem kosmetischen Zweck, etwa bei der Erhöhung der Pigmentierung oder bei der Vermeidung von hypertrophem Narbengewebe des zweiten Hautbereichs. In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen dient das erfindungsgemäße Verfahren dem Erfüllen ästhetischer Ansprüche der mit dem Verfahren behandelten Personen. Das erfindungsgemäße Verfahren des Anspruchs 1 dient in manchen Ausführungsformen einem nicht-therapeutischen und einem nicht-chirurgischen Zweck.
Erfindungsgemäße Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere der folgenden Merkmale aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die verwendeten Zellen Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen (im Folgenden auch kurz:„Vorläuferzellen") oder weisen solche im Verband oder in einer Gruppe oder Mischung auf. In manchen Ausführungsformen liegen derartige Zellen auch in einer Zellmischung vor, die man erhält, wenn man die von der Haarwurzelscheide gewonnenen Zellen nicht nach ihrer Herkunft, Funktion oder Beschaffenheit trennt. Trennt man die gewonnen Zellen jedoch nach Erhalt, so kann man durch Verwenden von vornehmlich Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen eine höhere Wirkung nach ihrem Auftragen im Sinne der vorliegenden Erfindung erzielen.
Wenn im Folgenden auf Melanozytenvorläuferzellen bzw. -Stammzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen Bezug genommen wird, so gilt dies uneingeschränkt auch für mesenchymale Vorläuferzellen und Stammzellen, selbst wenn dies nicht ausdrücklich erwähnt ist. Die Keratinozytenvorläuferzellen können alternativ oder ergänzend zu den Melanozytenvorläuferzellen aufgebracht werden.
Das Aufbringen der Keratinozytenvorläuferzellen kann gleichzeitig mit dem Schritt des Aufbringens der Melanozytenvorläuferzellen erfolgen. Die Keratinozyten- und die Melanozytenvorläuferzellen können jedoch auch zeitlich versetzt aufgebracht werden.
Eine gemeinsame und ggf. auch gleichzeitige Verwendung von Melanozytenvorläuferzellen und Keratinozytenvorläuferzellen kann vorteilhaft zu einem begünstigten Wachstum der Melanozytenvorläuferzellen und der Keratinozytenvorläuferzellen nach ihrem gemeinsamen Aufbringen auf den zweiten Hautbereich führen. Die Anmelderin des vorliegenden Verfahrens führt dies auf Interaktionen chemischer, biochemischer und/ oder biologischer Art zwischen den genannten Vorläuferzellen-Typen zurück. Sie konnte beobachten, dass dieser Vorteil bereits dann auftritt, wenn das natürliche Mischungsverhältnis von Keratinozytenvorläuferzellen zu Melanozytenvorläuferzellen, wie es bspw. in den Haarwurzelscheiden des ersten Hautbereichs vorliegt, auch in der auf den zweiten Hautbereich aufgebrachten Mischung dieser Zellen beibehalten wird.
Das Aufbringen von Zellen - beispielsweise von Melanozytenvorläuferzellen bzw. -Stammzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen bzw. -Stammzellen - aus Haarwurzelscheiden, insbesondere aus epithelialen Haarwurzelscheiden, eines ersten Hautbereichs auf einen zweiten Hautbereich dient dem Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge des zweiten Hautbereichs bzw. hat diesen Zweck. Das Aufbringen der Zellen kann dabei vorteilhaft dazu beitragen, das Wachstum, die Differenzierung und/oder die Funktion der (Haut-)Zellen sowie von Hautanhangsgebilden wie Haaren und Zellen, welche in Hautschichten vorliegen, anzuregen.
Das Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfängers im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Begünstigen oder Fördern der primären oder sekundären Heilung von Wunden des zweiten Hautbereichs bzw. hat diesen Zweck. Dies kann das (Re-)Epithelisieren der Wunde umfassen.
Das Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfangers im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Vermindern oder Verhindern des Entstehens von hypertrophem Narbengewebe oder von Keloid, z.B. bei der Wundheilung von Haut eines zweiten Hautbereichs der Körperoberfläche bzw. hat diesen Zweck.
Das Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfangers im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Erhöhen oder Begünstigen der Behaarung einer Narbe oder von Haut des zweiten Hautbereichs bzw. hat diesen Zweck.
Das Aufbringen von Zellen der Haarwurzelscheide bringt im Gegensatz zum Aufbringen von bspw. interfollikulären Melanozyten den Vorteil einer vergleichsweise unbegrenzten Verfügbarkeit mit sich. Während die Gewinnung von Melanozyten i.d.R. mit einer Entnahme von Haut einhergeht und damit nur zur Erhöhung der Wundheilung oder Funktionsherstellung eines begrenzten Hautareals in Frage kommt - und zudem mit einem chirurgischen Eingriff in die Integrität der Haut an der Entnahmestelle einhergeht - können Zellen der Haarwurzelscheide wie z.B. Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen vergleichsweise einfach und in hoher Stückzahl aus Haarwurzelscheiden gewonnen werden. Das Aufbringen solcher Zellen impliziert somit deren vorteilhaft hohe Verfügbarkeit.
Die Zellen, welche gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, liegen in bestimmten Ausführungsformen dieser Verfahren in einer Suspension oder in einem Sediment vor.
Das Aufbringen der Zellen erfolgt in bestimmten Ausfuhrungsformen der vorliegenden Erfindung durch einfaches Aufpinseln, Aufsprühen, Auftupfen oder dergleichen. Das Aufbringen erfolgt in manchen Ausführungsformen nichtinvasiv. Es erfolgt in bestimmten Ausführungsformen nicht-chirurgisch. Es kann in manchen oder in allen Ausführungsformen ohne ärztliches oder medizinisches Fachwissen erfolgen.
Das Aufbringen der Zellen oder Vorläuferzellen kann bspw. mittels einer Suspension mit 10 -10 Zellen/ml, insbesondere mit 10 -10 Zellen/ml, bspw. mittels Spritze oder Spray oder in einem biokompatiblen Vlies erfolgen.
Das Aufbringen kann in einer biokompatiblen Lösung (z. B. PBS) oder mittels eines biokompatiblen Trägers (z. B. Hyaluronan, Kollagen) erfolgen. Die Zellen können dabei als vitale oder z. B. mittels Mitomycin C oder durch Bestrahlung wachstumsarretierte Zellen oder auch als Zellextrakte (wie z. B. Lyophilisate, Sonicate) eingesetzt werden. Auch von diesen Zellen konditionierte Medien können zu diesem Zweck eingesetzt werden.
Das Aufbringen der Zellen oder Vorläuferzellen kann durch einfaches Auftragen auf die Haut erfolgen. Die Zellen können mittels z. B. Fibrinkleber auf dem zweiten Hautbereich fixiert und mit einem Okklusiv- oder Okklusionsverband geschützt werden. Aber auch jede andere geeignete Form des Aufbringens z. B. durch Integration der Zellen in biologische oder synthetische Matrices ist erfindungsgemäß möglich. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die
Zellen aus Haarwurzelscheiden des ersten Hautbereichs mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen. Das Zupfen der Haare ist in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen die einzige Art der Trennung und/oder der Gewinnung der Zellen aus dem ersten Hautbereich. Es wird in diesen Ausführungsformen somit ausschließlich gezupft. Insbesondere wird nicht geschnitten, gestanzt oder dergleichen. Die o.g. Zellen können vorteilhaft auf einfache und somit wiederholt durchführbare Weise gewonnen werden. Der Vorgang ihres Gewinnens vor ihrer Aufbringung kann vergleichsweise einfach und schmerzfrei durchgeführt werden. Dieser Vorgang birgt ferner kein Komplikationsrisiko, insbesondere kein oder kein nennenswertes Infektionsrisiko. Insbesondere werden bei alleinigem Auszupfen der Haare bzw. ihrer Haarwurzelscheiden keine Erreger übertragen, die typischerweise bei Blutkontakt übertragen werden.
Bei der Verwendung von Zellen der Haarwurzelscheide können die Zellen bspw. durch ein Auszupfen von Kopfhaaren, insbesondere von Anagenhaaren, insbesondere vom Capillitium gewonnen sein, was, wie oben angesprochen, einen weiteren Vorteil gegenüber der Verwendung von Zellen anderer Herkunft, insbesondere von interfollikulären Melanozyten bedeutet.
Ein „Gewinnen" im Sinne der Anmeldung bedeutet in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Trennen oder Lösen der Zellen, beispielsweise der Melanozytenvorläuferzellen und/oder der Keratinozytenvorläuferzellen, vom ersten Hautbereich. Es kann erfindungsgemäß auch ein Lösen der Zellen vom ersten Hautbereich umfassen. Dieses Lösen kann bspw. ein einfaches Auszupfen von Haaren, insbesondere Anagenhaaren aus der Kopfhaut, umfassen. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfasst das Gewinnen das Trennen der Zellen vom ersten Hautbereich ausdrücklich nicht.
Das Gewinnen im Sinne der Anmeldung bedeutet in manchen Ausführungsformen das Trennen der Zellen, ggf. auch der Aufbereitung, z.B. mittels Trypsin, oder umfasst ein solches Trennen und/oder Aufbereiten.
Zum „Gewinnen" von Zellen aus Haarwurzelscheiden kann erfindungsgemäß neben dem Trennen der Zellen vom ersten Bereich - oder alternativ hierzu - auch das Isolieren der Zellen aus den Haarwurzelscheiden, insbesondere aus epithelialen Haarwurzelscheiden, zählen.
Zum Schritt des„Gewinnens" kann auch ein Schritt oder eine Mehrzahl von Schritten zählen, mittels welcher die gewonnenen Zellen zu ihrem Aufbringen vorbereitet werden. Dies kann mittels Herstellen einer Zellsuspension geschehen. Die Zellsuspension, insbesondere eine Melanozytenvorläuferzellen-
Suspension und/oder Keratinozytenvor-läuferzellen-Suspension kann nach einer in vitro-Vermehrung der hierin enthaltenen Zellen hergestellt werden. In manchen Ausführungsformen ist ein Anzüchten umfasst. In anderen nicht. Die Zellen und/oder die Zellsuspension kann jedoch auch direkt hergestellt werden, d.h. ohne vorherige Anzucht der Zellen und/oder ohne deren Verbringen in eine Kultur mit dem Ziel des Anzüchtens, Ausdifferenzierens oder Ausreifens dort. In manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen, ohne diese zuvor zur Aufzucht der Zellen in Kultur verbracht zu haben, aufgebracht. Das Gewinnen umfasst in bestimmten erfindungsgemäßen
Ausführungsformen das Lösen der Zellen von der Haut oder Kopfhaut, gleich ob es vitale Haut oder biopsierte Haut ist, nicht.
Die Suspension kann biokompatible Substanzen wie PBS und/ oder einen biokompatiblen Träger wie bspw. Hyaluronan oder Kollagen umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfmdungsgemäßen Verfahrens wird der zweite Hautbereich zur Aufnahme der Zellen vorbereitet. Diese Vorbereitung erlaubt besonders wirksam ein Anwachsen der aufgebrachten Zellen auf dem zweiten Hautbereich.
Das Vorbereiten des zweiten Hautbereichs kann bspw. ein Entfernen der Epidermis, oder von Teilen hiervon, des zweiten Hautbereichs umfassen. Letzteres ist bspw. mittels Dermabrasio oder oberflächlicher Laserapplikation mit den hiermit verbundenen, dem Fachmann bekannten Vorteilen möglich.
Das Vorbereiten umfasst in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Aufbringen einer geeigneten Lösung. Als Beispiel sei hier eine Fibrinogen-Lösung genannt, welche den zweiten Hautbereich zur späteren Aufnahme der Zellen und zu deren besserem Anhaften und vor allem Anwachsen am zweiten Hautbereich vorbereitet.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der zweite Hautbereich zur Aufhahme der Zellen nicht und/oder nicht im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens vorbereitet. Letzteres ist z.B. dann der Fall, wenn die Zellen oder die Vorläuferzellen auf eine bestehende Wunde aufgebracht werden.
In manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen des Verfahrens werden die auf den zweiten Hautbereich aufgebrachten Zellen, z.B. zum beschleunigten Aufbau von Pigmenten oder zum beschleunigten Reifen oder Ausdifferenzieren, stimuliert.
Eine solche Stimulierung kann mittels UV-Belichtung erfolgen. Diese aktiviert die transferierten Zellen und kann z. B. mittels Breitband-UV, Schmalband-UVB, PUVA oder Excimer-Laser-Bestrahlung erfolgen.
Das Stimulieren kann vorteilhaft zu einer Pigmentierung sowie dem Aufbau der epidermalen Pigmenteinheit führen. Es kann zum beschleunigten Aufbau von Pigmenten führen.
Eine Stimulierung bspw. mittels Ultraviolett-Belichtung kann einmalig oder wiederholt erfolgen. Die Bestrahlung sollte dabei vorteilhaft jeweils unterhalb der Erythem-Schwelle liegen. Zum Beispiel kann eine zweimalige Bestrahlung pro Woche zur Erzielung einer gewünschten Pigmentierung des zweiten Hautbereichs führen. Eine häufigere oder weniger häufige Bestrahlung ist ebenfalls möglich.
Untersuchungen der Anmelderin haben gezeigt, dass ein Stimulieren mittels Bestrahlung auch die Wundheilung weiter begünstigen kann. Dies konnte bereits mit einer UV-Stimulierung gezeigt werden.
Die Zellen können von einem Spender stammen und bei diesem auch wieder aufgebracht werden. In manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind
Spender und Empfänger identisch. Der erste Hautbereich und der zweite Hautbereich sind somit Hautbereiche ein und desselben Lebewesens. In einem solchen Fall können vorteilhaft Bemühungen, welche ein Typisieren oder Matchen aufgrund von genetischen Unterschieden zwischen Spender und Empfänger betreffen, entfallen oder sich verringern. Zudem entfallen Risiken der Übertragung - bspw. von Infektionen - vom Spender auf den Empfänger.
Die Zellen können jedoch auch von einem Spender stammen und bei einem von diesem verschiedenen Empfänger aufgebracht werden. Dabei ist es unerheblich, ob Spender und Empfänger Mensch oder Tier sind. Auch eine Übertragung von Tier auf Mensch und umgekehrt ist von der Erfindung umfasst.
Unter „Melanozytenvorläuferzellen" werden erfindungsgemäß sowohl autologe als auch allogene und xenogene Melanozytenvorläuferzellen bzw. - Stammzellen verstanden, unter„Keratinozytenvorläuferzellen" sowohl autologe als auch allogene und xenogene Keratinozytenvorläuferzellen bzw. -Stammzellen, unter„mesenchymalen Vorläuferzellen" sowohl autologe als auch allogene und xenogene mesenchymale Vorläuferzellen bzw. Stammzellen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ferner gelöst durch Zellen, insbesondere durch Melanoytenvorläuferzellen und/oder
Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen, gemäß den Merkmalen des Anspruchs 12. Vorteilhafte Weiterbildungen sind auch hierbei wiederum Gegenstand jeweils der Unteransprüche. Da mit den erfindungsgemäßen Zellen dieselben Vorteile wie mit dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erzielbar sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen an dieser Stelle explizit auf deren obenstehende Diskussion verwiesen. Die erfindungsgemäßen Zellen sind aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs gewonnen. Die erfindungsgemäßen Zellen liegen somit außerhalb des Körpers vor. Die erfindungsgemäßen Zellen sind in manchen erfindungsgemäßen
Ausfuhrungsformen zu ihrem Einsatz in oder auf einem zweiten Hautbereich zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge des zweiten Hautbereichs geeignet und vorgesehen.
In bestimmten Ausführungsformen wurden die erfindungsgemäßen Zellen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen.
In manchen Ausführungsformen sind die Zellen zur Verwendung gewonnen und vorgesehen ohne zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein. In bestimmten Ausführungsformen sind oder werden die Zellen nicht verändert, insbesondere nicht genetisch verändert.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Präparat mit den Merkmalen des Anspruchs 15.
Da mit dem erfindungsgemäßen Präparat dieselben Vorteile wie mit dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erzielbar sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen an dieser Stelle explizit auf deren obenstehende Diskussion verwiesen. Das erfindungsgemäße Präparat weist erfindungsgemäße Zellen, beispielsweise Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, auf. Ferner wird die erfindungsgemäße Aufgabe auch gelöst durch Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 16 oder des Anspruchs 19. Die mit diesen Verfahren erzielbaren Vorteile sind dieselben, die mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren erzielbar sind, weshalb zur Vermeidung von Wiederholungen auf deren diesbezügliche Diskussion verwiesen wird.
Die Zellen können dabei mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen sein. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die
Zellen zur Verwendung gewonnen und vorgesehen, ohne zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
Gemäß Anspruch 19 wird ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats vorgeschlagen. In manchen Ausführungsformen hiervon ist das Präparat eine Suspension. In bestimmten Ausfuhrungsformen ist das Präparat zur Verwendung in irgendeinem der vorstehend beschriebenen Verfahren vorgesehen und geeignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, umfasst in manchen Ausführungsformen wenigstens das enzymatische Ablösen der Zellen - oder Vorläuferzellen, - seien es die Melanozytenvorläuferzellen und/oder die Keratinozytenvorläuferzellen und/oder die mesenchymalen Vorläuferzellen- von der Haarwurzelscheide eines entnommenen Haars. Die enzymatische Ablösung kann bspw. mittels einer Trypsin/EDTA- Lösung erfolgen. Das EDTA kann als Flüssigkeit in Form einer klaren, farblosen, geruchlosen Lösung, hergestellt nach Ph. Eur (europäisches Arzneibuch in der aktuellen Version), mit einem pH von 5,42 bis 6,04 und einer Osmolarität von 331- 368 mOsm/kg vorliegen, wie es beispielsweise von der Firma Biochrom AG, Deutschland unter der Artikelnummer L2113 in einer 100 ml Glasflasche erhältlich ist.
Die Trypsin/EDTA-Lösung kann 0,8 %-ig vorliegen. Die Lösung bewirkt insbesondere eine Ablösung der epithelialen Zellen vom Haarschaft. Die Ablösung erfolgt vorzugsweise bei 37°C. Jedoch sind auch höhere Temperaturen möglich, bei denen die Viabilität der Zellen noch gewährleistet ist, oder niedrigere, bei denen noch eine Aktivität von Trypsin gewährleistet ist.
Zur enzymatischen Ablösung kann eine Inkubation in Trypsin, 0,1 % bis 10 %, besonders zwischen 0,5 % bis 4 %, in PBS über 1 - 50, insbesondere über 15 - 30 min, erfolgen.
PBS kann von der Firma BioConcept, Schweiz in einer 500 ml-Flasche in flüssiger Form mit einem pH von 7,3 ± 0,2 und einer Osmolarität von 285 ± 10 als PBS ohne Ca/Mg mit der Artikelnr. 3-05F29 (PBS1) oder als PBS mit Ca/Mg unter der Artikelnr. 8-05F00 (PBS2) als sterile, farblose und klare Flüssigkeit, die bei Raumtemperatur gelagert werden kann, bezogen werden. Dieses PBS kann zur Herstellung von M-Lösung geeignet sein. Vorteilhaft an dem Vorgehen des enzymatischen Ablösens ist insbesondere, dass durch die mögliche Verwendung von Enzymen eine nachteilige Auswirkung auf die behandelten Zellen und/oder deren Veränderung, u.a. genetische Veränderung, vermieden werden kann. Die enzymatische Ablösung ist daher besonders schonend für die zu gewinnenden Zellen. Daneben umfasst das Verfahren zum Herstellen der Suspension in einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen alternativ oder ergänzend - jeweils unabhängig voneinander - die folgenden Schritte: a) Stoppen des enzymatischen Ablösens, z.B. durch die Zugabe von Humanserum, b) Zentrifugieren der Suspension zum Erhalten eines Sediments, c) erneutes Suspendieren des zellhaltigen Sediments in einer Thrombin-Lösung, welche eine sofortige Fixierung der aufgebrachten Zellen in dünner Schicht bei der Applikation auf vorangehend aufgebrachtes Fibrinogen erlaubt und somit eine homogene, nicht zu okklusive Applikation in jeder Körperregion ermöglicht.
Als Kleberproteinlösung kann TissuCol-DuoS 2ml Immuno, welches zum Beispiel mit der Artikelnr. B1332020110614 von der Firma Baxter AG, Österreich hergestellt und von der Firma Baxter Deutschland GmbH, Hyland Immuno Division, Deutschland lieferbar ist, eingesetzt werden. Ein solcher biologischer Zweikomponentenkleber besteht aus 2 Fertigspritzen zu 2 ml Kleberproteinlösung mit Fibrinogen und 2 ml Thrombinlösung, nach Vermischen der Komponenten kann eine Verfestigung des Klebers in Sekunden bis Minuten erfolgen. Das Verfahren umfasst in manchen Ausführungsformen -jeweils unabhängig voneinander - die folgenden Schritte: Überführen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments in eine biokompatible Lösung, Einbringen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments in einen biokompatiblen Träger und/oder Herstellen eines Zellextraktes.
Im Folgenden werden exemplarische Ausfuhrungsbeispiele detailliert beschrieben.
So wurde in einem ersten exemplarischen Ausführungsbeispiel ein Präparat vorbereitet. Hierzu wurden verschiedene Lösungen hergestellt, welche theoretisch für vier Patienten reichen und im Einzellfall variabel anpassbar sind. Eine Dispase-Lösung wurde aus 20 ml Dispase und 40 ml PBS1 zubereitet und in 250 ml-Nährmedienflaschen resuspendiert. Anschließend wurden 4 x je 15 ml zum Haarezupfen in 50 ml Röhrchen aliquotiert.
PBS1 wurde 4 x zu je 8 ml zum Überführen der Haarfollikel in 50 ml- Röhrchen aliquotiert.
Für die Trypsin-Lösung wurden 4 ml Trypsin-Lösung (z.B. TS-Lösung von Sigma), 2 ml EDTA (1,0 % von Biochrom) und 4 ml PBS1 gemischt und zu je 2 ml in 15 ml-Röhrchen aliquotiert.
Die Lösung zum Abstoppen wurde durch Mischen von 135 ml PBS2 mit 15 ml Humanserum und Resuspendieren der Mischung in 250 ml- Nährmedienflaschen hergestellt. Anschließend wurde die Lösung zu je 30 ml in 50 ml-Röhrchen aliquotiert.
Für die Thrombin-Lösung wurden 2 ml Thrombin (TissueCol-DuoS) mit 1 1,3 ml PBS2 (mit Ca/Mg) gemischt und in 15 ml-Röhrchen resuspendiert. Zum Versand wurden je 2 ml in 2 ml-Spritzen mit steriler Kanüle (Gr. 1) aufgezogen, die Luftblasen entfernt, die Kanüle wieder mit einer Schutzhülle versehen, die Spritzen in Klebebeutel verpackt und in nicht-gefrorenem Zustand mit Kühlakku verschickt. Die Fibrinogen-Lösung wurde durch Mischen von 2 ml Fibrinogen
(TissueCol-DuoS) mit 6 ml PBS1 hergestellt. Zum Versand wurden je 2 ml in 2 ml-Spritzen mit steriler Kanüle (Gr. 1) aufgezogen, die Luftblasen entfernt, die Kanüle wieder mit einer Schutzhülle versehen, die Spritzen in Klebebeutel verpackt und in gefrorenem Zustand mit Trockeneis verschickt. Je Patient und/oder je nach Behandlung können folgende Geräte und/oder Verbrauchsmaterialien eingesetzt und ggf. in einem Behandlungsset mitverschickt werden bzw. zur Behandlung bereitliegen: Pipettierhilfe und Ladekabel, eine sterile Metall-Pinzette, eine 90 ml Petrischale, Pipetten (10 Stück 10 ml / 5 Stück 2 ml), ein Zellsieb, 1-2 Kryoröhrchen; ein 50 ml-Röhrchen mit 15 ml Dispase- Lösung, ein 50 ml-Röhrchen mit 8 ml PBS1, ein 15 ml-Röhrchen mit 2 ml Trypsin-Lösung, ein 50 ml-Röhrchen mit 30 ml PBS2/Humanserum, ein 50 ml- Röhrchen (für Zellsieb), vier 15 ml-Röhrchen (für Zentrifugation); eine Spritze (mit Kanüle) mit 2 ml Fibrinogen-Lösung, eine Spritze (mit Kanüle) mit 2 ml Thrombin- Lösung.
Zunächst wurde eine Zellsuspension hergestellt. Dazu ließ man eine Fibrinogen-Lösung (Spritze) bei Raumtemperatur auftauen. Eine Dispase-Lösung zum Haarezupfen (15 ml) wurde in eine 90 ml-Petrischale überführt. Danach wurden an etwa 250 bereits ausgezupft vorliegenden Haarfollikeln (ausreichend zur Behandlung einer Fläche von ca. 20 bis 30 cm ) der Großteil des Haares (totes Haarmaterial) abgeschnitten. Die Haarfollikel wurden in die 90 ml-Petrischale überführt. Die geschnittenen Haarfollikel wurden mittels einer sterilen Pinzette in ein
50 ml-Röhrchen, welches 8 ml PBS1 enthielt, überführt. Anschließend wurden 2 ml Trypsin-Lösung zugegeben. Es sollte darauf geachtet werden, dass alle Haarfollikel in die Lösung eintauchen. Das Röhrchen wurde (z.B. mit Hilfe eines Wärmeblocks/Wasserbades) auf ca. 37 °C aufgewärmt. Die Trypsin-Behandlung erfolgte für ca. 25-30 min unter gelegentlichem Schütteln/Resuspendieren. Durch Zugabe von 30 ml PBS2/Serum wurde das Trypsin inaktiviert. Ein mechaniches Ablösen der ORS-Zellen (Zellen der äußeren Haarwurzelscheide; ORS=outer root sheath) wurde durch gründliches Auf- und Abpipettieren (mind. 30-mal) z.B. mittels einer 10 ml-Pipette erreicht. Anschließend wurde die Suspension über ein Zellsieb (Porengröße 70 μπι) in ein 50 ml-Röhrchen transferiert, um totes Zellmaterial/Zellklumpen zu entfernen.
Die Suspension (40 ml) wurde auf vier 15 ml-Röhrchen verteilt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und der Überstand abgegossen oder abpipettiert. Zum Zellpellet wurde die Thrombinlösung (2 ml) aus der Spritze zugegeben und die Zellen mit einer 2 ml-Pipette resuspendiert. Dabei wurden Zellen aus den vier Röhrchen gesammelt. Es wird darauf hingewiesen, dass in manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Zentrifugieren nicht vorgesehen ist. Das Verfahren kann in solchen Ausführungsformen somit ohne Zentrifugieren ablaufen. Dies kann den apparativen Aufwand, welcher zur Durchführung des Verfahrens erforderlich ist, vorteilhaft gering halten.
Anschließend wurde die Zellsuspension in ein Kryoröhrchen überführt und daraus wieder in die Thrombin-Spritze mit Kanüle aufgezogen.
Zur Behandlung von Hautwunden wurde den Patienten 2 ml Fibrinogen- Lösung auf die Wundfläche aufgebracht. Anschließend wurde die Thrombin-Zell- Lösung aufgebracht. Die Wunde wurde auf übliche Weise verbunden. Der erste Verbandswechsel fand jeweils nach 5 Tagen statt.
Zur Behandlung von Narbengewebe wie hypertrophen Narben sowie Keloidbildung waren die behandelten Patienten wie folgt vorbereitet gewesen. Nach örtlicher Betäubung des Wundbereichs wurde das Narbengewebe mittels Dermabrasio oder unter Verwendung eines Erbium- YAG-Lasers abgetragen. Anschließend begann das erfindungsgemäße Verfahren mit dem Aufbringen der Zellsuspension und des Fibrinklebers (optional) mittels einer Spritze oder einer Spray- Vorrichtung. Die behandelten Areale wurden mit Folienverband abgedeckt. Ein erster Verbandswechsel erfolgte nach 5 bis 7 Tagen.
Im Folgenden wird das Beispiel der Behandlung eines Patienten, bei dem sowohl eine Begünstigung der Wundheilung, des Haarwachstums die Vermeidung von Keloidbildung im Bereich des behandelten zweiten Hautbereichs beobachtet werden konnte, beschrieben:
Der Patient, männlich, 29 Jahre, wurde 1991 an der Bauchmuskulatur operiert. In Folge der Operation entstand Keloid im Narbenbereich. Dieses wurde über Jahre mit verschiedenen üblichen Cremes ohne kosmetische Verbesserung behandelt.
Bereits eine einmalige Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren im Jahr 2009 führte zu einer kompletten Epithelisierung der vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Dermabrasio geschaffenen akuten Wunde innerhalb von nur 4 Tagen. Eine Keloidbildung konnte im Verlauf der folgenden Monate bis heute nicht beobachtet werden; es kam zu keiner Keloidbildung.
Hingegen konnte eine der umgebenden Hautareale angepasste Pigmentierung beobachtet werden; ferner ein Wachsen von Haaren auf der behandelten akuten Wunde. Dabei wurden bei dem Patienten zumindest auch Melanoyzten- Vorläuferzellen aufgetragen.
Ein Haarwachstum wurde bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auch bei Patienten in Bereichen ohne Narbengewebe, also in narbenfreiem Gewebe, beobachtet. Dies war insbesondere an Stellen erstaunlich, an welchen vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens keine Haare (mehr) gewachsen waren. Bei der Behandlung akuter oder chronischer Wunden wurde wie folgt vorgegangen: An eine vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens gesäuberte Wunde, wobei z.B. mit einem scharfen Löffel Fibrinbeläge oder nekrotisches Gewebe abgetragen wurden, wurde das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt: Zunächst wurden die Zellsuspension und der Fibrinkleber (optional) mittels einer Spritze oder einer Spray- Vorrichtung aufgebracht und die behandelten Areale mit Folienverband abgedeckt. Ein erster Verbandswechsel erfolgte nach ca. 3 bis 5 Tagen.
In einem weiteren exemplarischen Ausführungsbeispiel wurden bei einer weiteren Person mit einem seit Jahren unverändert bestehenden Vitiligoherd von rund zehn Quadratzentimetern Fläche am Handrücken 50 Anagenhaare aus der Kopfhaut gezupft. Die abgetrennten Haarwurzeln wurden für 25 min in Trypsin/EDTA-Lösung, 0,8 %-ig, bei 37°C inkubiert. Hierbei lösten sich epitheliale Zellen vom Haarschaft. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Humanserum beendet. Die mit der Trypanblau-Exklusion gemessene Vitalität der Zellen lag dabei bei über 50 %. Die Zellsuspension wurde bei 500 x g zentrifugiert, und das zellhaltige Sediment wurde in 2 ml einer Thrombin-Lösung suspendiert. Die zur Heilung der Hautwunden vorgesehene Fläche am Handrücken wurde nach eingehender Desinfektion mittels Dermabrasio de-epidermisiert. Nach Aufbringen von 2 ml einer Fibrin-Lösung auf die Wundfläche wurde die Zellsuspension aufgetragen. Das Behandlungsareal wurde anschließend mit einem herkömmlichen Wundverband okklusiv abgedeckt. Ein Verbandswechsel erfolgte alle drei Tage. Nach einer innerhalb von zwei Wochen abgeschlossenen Reepithelisierung wurde das Behandlungsareal zwei Mal wöchentlich mit Breitspektrum-Ultraviolett unterhalb der Erythem-Schwelle belichtet. Eine vollständige Angleichung der Pigmentierung des behandelten Hautbereichs an eine diesen umgebende Haut konnte auf diese Weise im Verlauf von acht Wochen erzielt werden. Zum Unterdrücken einer Autoimmunreaktion können im Falle einer Vitiligo zeitlich begrenzt geeignete Wirkstoffe wie topische oder systemische Kortikosteroide oder topische Calcineurin-Inhibitoren eingesetzt werden.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs, gekennzeichnet durch den Schritt:
Aufbringen von Zellen, welche aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen wurden, auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen (kurz: Vorläuferzellen) sind oder solche umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellen oder Vorläuferzellen jeweils aus Haarwurzelscheiden des ersten Hautbereichs mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut oder einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders oder anderweitig aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen wurden.
4. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs ein Fördern der primären oder sekundären Heilung von Wunden ist oder dieses umfasst.
5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs ein Vermindern oder Verhindern des Entstehens von hypertrophem Narbengewebe oder von eloid ist oder dieses umfasst.
6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Begünstigen der Heilung von Hautwunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs ein Erhöhen oder Begünstigen der Behaarung einer Narbe oder von Haut des zweiten Hautbereichs ist oder dieses umfasst.
7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt
Vorbereiten der gewonnenen Zellen oder Vorläuferzellen vor dem Aufbringen.
8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt
Aufbringen der gewonnenen Zellen oder Vorläuferzellen ohne jeweils diese zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu haben.
9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den Schritt
Vorbereiten des zweiten Hautbereichs zur Aufnahme der gewonnenen Zellen oder Vorläuferzellen.
10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den Schritt
Stimulieren der Zellen oder Vorläuferzellen nach ihrem Aufbringen auf den zweiten Hautbereich.
11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Spender und Empfänger identisch sind.
12. Zellen, insbesondere elanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders, gewonnen zu ihrem Einsatz in oder auf einem zweiten Hautbereich zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge des zweiten Hautbereichs eines Empfängers.
13. Zellen nach Anspruch 12, gewonnen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut oder einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders oder anderweitig aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders.
14. Zellen nach Anspruch 12 oder 13, gewonnen und vorgesehen zu ihrem Aufbringen auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers oder zum Herstellen eines Präparats, ohne vor ihrem Aufbringen oder vor dem Herstellen zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
15. Präparat mit Zellen gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14.
16. Verwenden von Zellen, insbesondere Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen, gewonnen aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders zum Erzeugen eines Präparats zum Begünstigen der Heilung von Wunden und/oder der Wiederherstellung der Funktion der Haut und/oder ihrer Hautanhänge eines zweiten Hautbereichs eines Empfängers.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Zellen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut oder einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders oder anderweitig aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen sind.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Zellen gewonnen und vorgesehen sind zu ihrem Aufbringen auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers oder zum Herstellen eines Präparats, ohne vor ihrem Aufbringen oder vor dem Herstellen zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
19. Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, welche Zellen der Haarwurzelscheide, insbesondere Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, aufweist, insbesondere zur Verwendung in einem der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 sowie 16 bis 18, mit wenigstens einem oder mehreren der folgenden Schritte:
Enzymatisches Ablösen von Zellen von der Haarwurzelscheide;
Stoppen des enzymatischen Ablösens, insbesondere durch die Zugabe von
Humanserum;
Zentrifugieren oder Filtrieren der Suspension zum Erhalten eines Sediments oder Zellkonzentrats;
Suspendieren des zellhaltigen Sediments Konzentrats, insbesondere in einer Thrombin-Lösung;
Überführen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments oder des Konzentrats in eine biokompatible Lösung;
Einbringen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments oder des Konzentrats in einen biokompatiblen Träger; und/oder
Herstellen eines Zellextraktes.
20. Verfahren nach Anspruch 16 bis 19, wobei das Verfahren ein Kultivieren der Zellen der Haarwurzelscheide nicht umfasst.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20 wobei das Verfahren den Schritt eines Zentrifugierens und/oder Filtrierens, insbesondere des Zentrifugierens und/oder Filtrierens der Suspension zum Erhalten eines Sediments, nicht umfasst.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21 , wobei das Verfahren den Schritt eines Stoppens des enzymatischen Ablösens nicht umfasst.
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