EP3377616A1 - Verfahren zur herstellung von haarfollikeln und de novo papillen sowie deren verwendung für in vitro tests und in vivo implantate - Google Patents

Verfahren zur herstellung von haarfollikeln und de novo papillen sowie deren verwendung für in vitro tests und in vivo implantate

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Publication number
EP3377616A1
EP3377616A1 EP16797504.4A EP16797504A EP3377616A1 EP 3377616 A1 EP3377616 A1 EP 3377616A1 EP 16797504 A EP16797504 A EP 16797504A EP 3377616 A1 EP3377616 A1 EP 3377616A1
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EP
European Patent Office
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hair
ctsf
novo
dpf
papilla
Prior art date
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Pending
Application number
EP16797504.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerd Lindner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Berlin
Original Assignee
Technische Universitaet Berlin
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Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Berlin filed Critical Technische Universitaet Berlin
Publication of EP3377616A1 publication Critical patent/EP3377616A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0627—Hair cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts

Definitions

  • the object of the present invention is to reduce or avoid one or more disadvantages of the prior art.
  • the present invention achieves this object by providing a method for producing de novo papillae, comprising the steps of: a) providing isolated papilla fibroblasts (DPF) from at least one hair papilla (DP, abbreviation for English dermal papilla ) from at least one hair follicle; b) providing isolated connective tissue fibroblasts (CTSF,
  • de novo papillae can be prepared from mixtures of at least DPF and CTSF.
  • Manufacturing process can be performed in a shorter time compared to known in the art for the duplication of hair follicles. Accordingly, it is possible within a day to gain cell populations from hair follicles, using these cells to produce de novo papillae and / or hair follicles in a larger number and to implement these newly generated de novo papillae or hair follicles into the hairless scalp to be treated, thus new hair can be formed again in these places.
  • the method according to the invention relates to the production of de novo papillae.
  • de novo papilla neopapilla
  • spheroid are used interchangeably to refer to a substantially spheroidal cell aggregate of hair papillary fibroblasts (DPF) and connective tissue fibroblasts (CTSF)
  • the de novo papilla thus comprises a mixture of at least DPF and CTSF.
  • the de novo papillae consist of approximately 2 to 20,000 cells, preferably 10 to 15,000, more preferably 500 to 10,000, most preferably 1,000 to 5,000 cells.
  • the de novo papilla has at least half the size of a physiological hair papilla (DP
  • DP physiological hair papilla
  • the de novo papilla also preferably has the approximate shape of a physiological DP of a hair follicle after isolation thereof.
  • the de novo papilla may comprise a coating which includes one or more
  • the de novo papilla contains different extracellular matrix proteins such as collagen IV, fibronectin and / or laminin. This coating can be created by the DPF and CTSF themselves while they form the de novo papilla. Alternatively or additionally, the de novo papilla may also be coated during and / or after its formation by the additional addition of one or more different extracellular matrix proteins to the culture medium.
  • the production method of the present invention is carried out in vitro.
  • in vitro is meant any environment that is not within a living organism, eg, a human or animal body
  • detection method explicitly does not include a method which is performed on the human or animal body.
  • isolated hair papillary fibroblasts (DPF) from at least one hair papilla (DP) are provided in a first method step a), the DP originating from at least one hair follicle.
  • the provision of the DP from the hair follicle and the isolation of the DPF from the DP can be carried out, for example, as follows: Isolated hair follicles are e.g. fixed with tweezers on the hair shaft and the connective tissue sheath is e.g. with another pair of tweezers diametrically separated from the hair shaft, so that the bulbus is everted and thus exposed the DPF and the hair shaft with the hair matrix. This allows the DP to be separated from the remainder of the hair follicle, e.g. can be done with the help of a needle or cannula.
  • the isolated DP are for example transferred to a cell culture vessel and fixed mechanically on the surface of the cell culture vessel.
  • the DPF are obtained by mechanically arresting the isolated DP at the bottom of the cell culture vessel, e.g. using a needle point or a scalpel.
  • the morphology of the DP remains approximately the same, but the basal lamina of the DP is slightly perforated so that the DPF can migrate out of the DP.
  • the DPF can also be obtained by enzymatic or non-enzymatic separation from the DP.
  • the DPF may be cultured after their isolation and before their use in the process according to the invention, for example in order to duplicate them. Accordingly, the DPF used in the process according to the invention can be descendants or clones of the originally isolated DPF.
  • the hair follicles from which the DP and DPF are isolated originate from tissue.
  • the hair follicles are removed from the tissue according to standards of good medical practice.
  • the removal of hair follicles from the tissue is such that they are substantially intact, i. undamaged, stay.
  • the removal of the hair follicles from the tissue can be carried out, for example, as follows: i) separation of the
  • Epidermis of the underlying dermis or fatty tissue preferably using a scalpel; ii) preparation of hair from the dermis or the
  • the extracted hairs include the hair follicles at their proximal end.
  • the dermis or fatty tissue can be compressed so that the hair follicles present therein can be more easily removed.
  • the compression can be carried out for example with the help of tweezers.
  • the removal of the hair follicles takes place under the microscope.
  • the hair follicles are obtained from punch biopsies, which consist of preferably individual follicular units (FE).
  • FE follicular unit
  • a follicular unit is the name given to a group of 1 to 4 hair follicles that grow in close proximity to each other
  • the tissue capsule is surrounded and moved by a common muscle (M. arrector pilli).
  • the follicular units are either recovered by dissection under one
  • the latter method is called
  • FUE Follicular Unit Extraction
  • the tissue from which the hair follicles can be obtained from a mammal.
  • This mammal may be a human, monkey, pig, dog, cat or rodent, preferably a human.
  • the mammal is a donor to the tissue containing the hair follicle. More preferably, the mammal is a human patient suffering from hair loss.
  • the tissue preferably comprises skin. This can make the tissue of each hairy
  • Body region are preferably obtained from the head, chest, eyebrows, beard,
  • the tissue is removed from a body region located near the body site affected by hair loss.
  • the tissue can preferably be removed from the neck or temporal region of the head.
  • the tissue is obtained by biopsy.
  • this tissue Before the hair follicles, e.g. the isolation of the DP or DPF, are removed from the tissue, this tissue can be subjected to one or more purification steps to remove any interfering substances from the tissue.
  • step b) of the method according to the invention isolated connective tissue fibroblasts (CTSF) are provided from at least one hair follicle.
  • CSF connective tissue fibroblasts
  • the provision of the CTSF from the hair follicle can be carried out, for example, as follows: Isolated hair follicles are fixed with tweezers on the hair shaft, for example, and the connective tissue sheath is separated diametrically from the hair shaft with another tweezers so that the bulbus is everted. This allows the proximal part of the bulb to be separated from the rest of the hair follicle with the CTSF, which can be done using a needle or cannula, for example. Subsequently, the isolated connective tissue sheath is transferred, for example, into a cell culture vessel and fixed mechanically on the surface of the cell culture vessel.
  • the CTSF are obtained by mechanically arresting the isolated connective tissue sheath at the bottom of the cell culture vessel, eg by means of a needle tip or a needle tip
  • the morphology of the connective tissue sheath is approximately preserved, but the connective tissue is slightly perforated so that the CTSF can migrate from the connective tissue.
  • the CTSF may also be obtained by enzymatic or non-enzymatic separation from the connective tissue.
  • the CTSF may be cultured after their isolation and before their use in the process according to the invention, for example to duplicate them. Accordingly, the CTSF used in the process according to the invention may be descendants or clones of the originally isolated CTSF.
  • the hair follicles from which the CTSF is isolated originate from tissue.
  • the hair follicles are removed from the tissue according to standards of good medical practice.
  • the removal of hair follicles from the tissue is such that they are substantially intact, i. undamaged, stay.
  • Removal of the hair follicles from the tissue can, for example, be carried out as follows: i) removal of the epidermis from the underlying dermis or fatty tissue, preferably using a scalpel; ii) preparation of hair from the dermis or the fatty tissue of the tissue.
  • the extracted hairs include the hair follicles at their proximal end.
  • the dermis or fatty tissue can be compressed so that the hair follicles present therein can be more easily removed.
  • the compression can be carried out for example with the help of tweezers.
  • the removal of the hair follicles takes place under the microscope.
  • the tissue from which the hair follicles comes from a mammal.
  • This mammal may be a human, monkey, pig, dog, cat or rodent, preferably a human.
  • the mammal is a donor to the tissue containing the hair follicle. More preferably, the mammal is a human patient suffering from hair loss.
  • the tissue preferably comprises skin.
  • the tissue can be obtained from any hairy body region, preferably from the head, chest, eyebrows, beard, genital area, leg or other body regions. More preferably, the tissue is removed from a body region located near the body site affected by hair loss. For example, hair loss affects the head, so the between the forehead and the back of the head located part of the head, so the tissue may preferably be removed from the neck or temple area of the head.
  • the tissue is obtained by biopsy.
  • this tissue Before the hair follicles, e.g. the isolation of the CTSF from the tissue, this tissue may be subjected to one or more purification steps to remove any interfering substances present from the tissue.
  • the DPF and CTSF are thus obtained from isolated hair follicles.
  • the DPF and CTSF can be obtained from the same hair follicle.
  • the DPF and CTSF can also be obtained from different hair follicles. If the DPF and CTSF are obtained from different hair follicles, these hair follicles may have been isolated from the same tissue, for example from a tissue which is e.g. was taken from the neck area of the head of a donor. If the DPF and CTSF are obtained from different hair follicles, then these hair follicles may have been isolated from various tissues, such that, for example, one of the tissues is e.g. was taken from the neck area of the head of a donor and the other tissue e.g. from the beard of a donor.
  • the donor may be the same donor or donor. If it is another donor, this is preferably an allogeneic donor. Preferably, it is the same, so autologous, donor.
  • step c) of the process according to the invention the co-cultivation of the DPF and CTSF takes place under essentially non-adherent cell culture conditions for the formation of spheroidal cell aggregates.
  • non-adherent cell culture conditions means cell culture conditions in which the cells have essentially no direct and / or lasting contact with the surface of the cell
  • Cell culture vessel have. This can be achieved, for example, in that the surfaces of the cell culture vessel consist of a material and / or have an anti-adhesion coating, which reduces or attaches the cell attachment
  • Suitable culture vessels and / or coatings for these cell culture vessels are known to the person skilled in the art.
  • Such non-adherent cell culture vessels can be made of glass or polystyrene, for example.
  • the surfaces of the cell culture vessel are coated with contact-inhibiting materials such as PTFE, polyHEMA, agarose or fluorocarbon solutions.
  • the definition of the non-adherent cell culture conditions also includes the so-called cultivation method of the "hanging drop"("Hanging).
  • the surface tension of the liquid keeps the drop in a hanging position on the surface of the cell culture vessel and encloses the cells inside it Part of the drop and essentially have no direct contact with the culture vessel. Within the drop, the cells can form into spheroids.
  • the DPF and CTSF can be co-cultured in the same or different ratio.
  • the DPF and CTSF are co-cultured in a ratio of 1-20: 1-20, preferably 1-10: 1-10, more preferably 1-5: 1-5, most preferably 1-2.5: 1 -2.5, particularly preferably 1: 1.
  • a cell concentration of 2 to 20,000 DPF + CTSF / mm 2 of the cell culture vessel is selected for co-cultivation of the DPF and CTSF in step c), preferably 10 to 15,000, more preferably 500 to 10,000, most preferably 1,000 to 5,000 ,
  • the cell culture vessels may be, for example, commercially available cell culture plates, dishes or bottles.
  • the cell culture vessels may have one or more cavities.
  • the co-cultivation of the DPF and CTSF preferably takes place in a well of a cell culture vessel.
  • the cell culture vessels may be so-called multiwell plates with more than one cavity.
  • the cell culture vessels preferably have 2 to 10,000 cavities, particularly preferably 4 to 1536, very particularly preferably 6 to 384.
  • the bottoms of the cell culture vessel cavities may be flat or uneven.
  • the cavity bottoms are formed as a round arch. Also preferred are cavities which are funnel-shaped.
  • the DPF and CTSF are sedimented by centrifugation at the bottom of the cell culture vessels prior to their co-cultivation in step c). This initial concentration of the DPF and CTSF at the bottom of the cell culture vessel results in faster cell aggregation.
  • the co-cultivation of the DPF and CTSF takes place for at least 1 min, preferably for 10 min to 14 days, particularly preferably for 20 min to 48 h, very particularly preferably for 30 min to 24 h, particularly preferably for 1 h to 4 h.
  • the co-cultivation of the DPF and CTSF preferably takes place in step c) of the method according to the invention in the presence of blood plasma and / or blood serum.
  • the blood plasma and / or blood serum are human blood plasma and / or blood serum, preferably autologous blood plasma and / or blood serum.
  • the blood plasma and / or blood serum is 1 to 100% blood plasma or blood serum, preferably 15 to 75%, particularly preferably 30 to 50% pure.
  • the co-cultivation of the DPF and CTSF in step c) of the process according to the invention can take place under essentially static conditions or with agitation.
  • step c) of the method according to the invention additional cell types may additionally be present.
  • endothelial cells (EZ) and / or cells of stromal vascular fractions (SVF) are additionally present during co-culture.
  • the EZ can be obtained from blood vessels, preferably from blood vessels, which are on or in
  • the DC are obtained from a human donor.
  • This is particularly preferably autologous DC.
  • development cooperation may take place after its isolation and prior to its use in the
  • the DCs used in the method according to the invention may be descendants or clones of the originally isolated DC.
  • the presence of EZ in the cocultivation of the DPF with the CTSF in step c) of the method according to the invention produces de novo papillae comprising DPF, CTSF and EZ.
  • Such de novo papillae, or hair follicles generated from them can be incorporated into the skin of a mammal for the treatment of a reduced amount of hair.
  • Such de novo papillae or hair follicles generated from them allow accelerated formation of the skin after transplantation into the skin
  • the SVF can be obtained for example by means of fatty tissue excision or liposuction.
  • the SVF is obtained from a human donor, more preferably is an autologous SVF.
  • the SVFs include various Cell populations such as precursors of fat cells (pre-adipocytes), endothelial cells, endothelial muscle cells, fibroblasts, macrophages or blood cells.
  • pre-adipocytes precursors of fat cells
  • endothelial cells endothelial cells
  • endothelial muscle cells fibroblasts
  • macrophages or blood cells.
  • certain components of the SVF may be removed from the SVF after they have been recovered from the donor, which may be accomplished by one or more wash, sanitize, or
  • Isolation steps can be done or by targeted separation or removal of the ingredients. It is also possible that the SVF be cultured after their isolation and before their use in the process according to the invention, for example, to reproduce them. Accordingly, the SVF used in the process according to the invention can be descendants or clones of the originally isolated SVF.
  • the presence of the SVF in the co-cultivation in step c) of the method according to the invention results in an increased or faster cell multiplication of the DPF and CTSF and correspondingly accelerates the formation of the de novo papillae.
  • the other cell types may be present in the same or different ratio to the DPF and CTSF.
  • the DPF, CTSF and EZ or SVF are co-cultured in a ratio of 1 -20: 1 -20: 1 -20, preferably 1 -10: 1 -10: 1 -10, particularly preferably 1 -5: 1 - 5: 1 -5, very particularly preferably 1 -2.5: 1 -2.5: 1 -2.5, particularly preferably 1: 1: 1.
  • the co-cultivation is preferably carried out in a ratio of 1 -20: 1 -20: 1 -20: 1 -20, preferably 1 -10: 1 -10: 1. 10: 1-10, more preferably 1-5: 1-5: 1-5, most preferably 1-2.5: 1- 2.5: 1-2.5: 1-2.5 , more preferably 1: 1: 1: 1.
  • a layer of extracellular matrix proteins usually forms in and / or around the cell aggregate, which is usually formed by the DPF and / or CTSF.
  • This can for example be achieved by e.g. a composition comprising these extracellular matrix proteins in addition to the culture medium is added in order to facilitate and / or accelerate the formation of this papillae coating.
  • the de novo papilla separates first from the culture medium and then with a
  • compositions comprising these extracellular matrix proteins are added.
  • This composition of the extracellular matrix proteins added preferably comprises collagen IV, fibronectin and / or laminin.
  • this composition comprises or consists of the additionally added extracellular matrix proteins collagen IV, fibronectin and laminin, preferably in a ratio of 2-6: 0.5-2: 0.5-2 parts by weight, more preferably in a ratio of 3-5: 0.5-1, 5: 0.5-1, 5 parts by weight, most preferably in a ratio of 4: 1: 1, 15 parts by weight.
  • the Composition of the extracellular matrix proteins can also be used in combination with other matrices.
  • the extracellular matrix protein composition further comprises other collagens (such as collagen I, collagen 10A1, collagen 18A1), glycosaminoglycans and / or proteoglycans, preferably
  • the de novo papilla is coated by adding extracellular matrix proteins into the cell culture medium with these matrix proteins.
  • the coating of the de novo papilla with the extracellular matrix proteins preferably also takes place in the
  • Substantially non-adherent cell culture conditions take place.
  • the coating of the de novo papilla takes place for at least 1 min, preferably for 10 min to 14 days, particularly preferably for 20 min to 48 h, very particularly preferably for 30 min to 24 h, particularly preferably for 1 h to 4 h.
  • the present invention also relates to de novo papillae, which are produced by the method according to the invention.
  • the method of making de novo papillae comprises the steps of: a) providing isolated DPF from at least one DP from at least one hair follicle; b) providing CTSF from at least one hair follicle; and c) co-culturing the DPF and CTSF and additionally EZ under essentially non-adherent cell culture conditions to form spheroidal cell aggregates.
  • the DPF, CTSF and EZ are cocultivated in a ratio of 1 -20: 1 -20: 1 -20.
  • the de novo papillae are preferably coated by addition of extracellular matrix proteins into the cell culture medium with these matrix proteins.
  • the co-cultivation can take place under rotation, pivoting or shaking movements.
  • the co-cultivation may preferably take place in a cylindrical cavity, which preferably has a round bottom. It is possible to carry out the co-cultivation in multiwell cell culture vessels with, for example, 96 or 384 wells.
  • the co-cultivation may take place in the presence of blood plasma and / or blood serum.
  • the DPF, CTSF and EZ are from a donor.
  • the method for producing de novo papillae comprises the steps: a) providing isolated DPF from at least one DP from at least one hair follicle; b) providing CTSF from at least one hair follicle; and c) co-culturing the DPF and CTSF and additionally SVF under substantially non-adherent cell culture conditions to form spheroidal cell aggregates.
  • the DPF, CTSF and SVF are in a ratio of 1 -20: 1 -20: 1 -20 co- cultured.
  • the de novo papillae are preferably coated with extracellular matrix proteins.
  • the co-cultivation may take place under rotation, panning or shaking. Furthermore, the co-cultivation may take place in the presence of blood plasma and / or blood serum.
  • the DPF, CTSF and SVF are from a donor.
  • the method for producing de novo papillae comprises the steps: a) providing isolated DPF from at least one DP from at least one hair follicle; b) providing CTSF from at least one hair follicle; and c) co-culturing the DPF, CTSF and additionally EZ and SVF under substantially non-adherent cell culture conditions.
  • the DPF, CTSF, EZ and SVF are co-cultured in a ratio of 1 -20: 1 -20: 1 -20: 1 -20.
  • the de novo papillae are preferably coated with extracellular matrix proteins.
  • the co-cultivation may take place under rotation, panning or shaking.
  • co-culture may take place in the presence of blood plasma and / or blood serum.
  • the DPF, CTSF, EZ and SVF are from a donor.
  • the present invention relates to a method for producing hair follicles, comprising the steps of: a) providing at least one de novo papilla produced by the method according to the invention for the production of de novo papillae; b) providing at least one further cell population selected from keratinocytes (KC), melanocytes (MC) or connective tissue fibroblasts (CTSF); and c) co-culturing the de novo papilla with the at least one other cell population under substantially non-adherent cell culture conditions.
  • KC keratinocytes
  • MC melanocytes
  • CTSF connective tissue fibroblasts
  • the "hair follicle” produced by the method of the present invention refers to an incomplete follicular structure compared to natural hair follicles, which may comprise a condensed core (papilla) of fibroblasts of mesenchymal origin and an enveloping outer and / or inner epithelial hair root sheath but without other cell types or structures such as muscle or nerve cells, blood vessels, etc., so that the hair follicles have a reduced size compared to natural ones
  • a hair follicle is composed of a de novo papilla of at least DPF and CTSF stable with at least one other cell population selected from keratinocytes (KC), melanocytes (MC) or fibroblasts, e.g. CTSF, covered or colonized.
  • KC keratinocytes
  • MC melanocytes
  • fibroblasts e.g. CTSF
  • a hair follicle is composed of a de novo papilla stable with at least one other cell population selected from KC,
  • the MC or CTSF is covered or colonized, wherein the at least one further cell population can be obtained from a hair follicle or is recovered.
  • the hair follicle has a three-dimensional, possibly spatially limited form, which the
  • the Hair follicles may have a polar structure, such as a sharp bulge on one side of the hair follicle, reminiscent of structures of early morphogenesis of physiological hair follicles.
  • At least one de novo papilla is provided in a first method step a), wherein the de novo papilla was produced by the method described above.
  • step b) of the method according to the invention for producing the hair follicles at least one further cell population selected from KC, MC or CTSF is provided.
  • step c) of the method according to the invention for producing the hair follicles the co-culture of the de novo papilla with the at least one further cell population selected from keratinocytes (KC), melanocytes (MC) or
  • CTSF Connective tissue fibroblasts
  • the KC, MC and / or CTSF do not have to be from one
  • Hair follicles but may be derived from other mammalian tissues, e.g. Skin, to be won.
  • the at least one further cell population can be obtained from a hair follicle and / or it is obtained from a hair follicle.
  • the KC, MC and / or CTSF can be obtained from the same hair follicle.
  • the KC, MC and / or CTSF can also be obtained from different hair follicles. If the KC, MC and / or CTSF are derived from different hair follicles, these hair follicles may have been isolated from the same tissue, for example from a tissue which is e.g. was taken from the neck area of the head of a donor. If the KC, MC and / or CTSF are derived from different hair follicles, these hair follicles may also have been isolated from different tissues such that, for example, one of the tissues is e.g.
  • the donor was taken from the neck area of the head of a donor and another tissue e.g. from the beard of a donor.
  • the donor may be the same donor or donor. If it is another donor, this is preferably an allogeneic donor. Preferably, it is the same, so autologous, donor.
  • the at least one further cell population is obtained from the same hair follicle from which the DP has been isolated.
  • inventive method for producing the hair follicles are cultured, for example, to duplicate them. Accordingly, it can be in the KC, MC and / or CTSF used by offspring or clones of the originally isolated KC, MC and / or CTSF act according to the invention.
  • the at least one further cell population may be in the same or in one
  • the de novo papilla is co-cultured with KC, MC and / or CTSF in a ratio of 1-10: 1-50, more preferably in a ratio of 1-5: 1-40.
  • the de novo papilla is co-cultured with KC and MC, preferably in a ratio of 1-10: 1-50: 1-50, preferably in a ratio of 1-5: 1-20: 1-20.
  • the de novo papilla is co-cultured with KC, MC and CTSF, preferably in a ratio of 1-10: 1-50: 1-50: 1-50.
  • the co-cultivation of the de novo papilla with the KC and MC is preferably carried out first, so that the KC and MC form a layer around the de novo papilla, and then the co-cultivation with the CTSF.
  • Sheath with CTSF hair follicles are formed with which improved
  • the co-cultivation of the de novo papilla with the at least one further cell population takes place for at least 10 minutes, preferably for 20 minutes to 3 weeks, particularly preferably for 30 minutes to 24 hours, very particularly preferably for 1 hour to 4 hours.
  • the co-cultivation of the de novo papilla with the at least one further cell population in step c) of the method according to the invention for producing the hair follicles can take place under substantially static conditions or with movement.
  • the co-cultivation takes place under rotation, pivoting or shaking movements.
  • Hair follicles the steps: a) providing at least one de novo papilla produced by the method according to the invention for the production of de novo papillae; b)
  • the de novo papilla preferably comprises DPF, CTSF and additionally EZ and / or SVF.
  • the de novo papilla is preferably coated with extracellular matrix proteins.
  • the de novo papilla, KC and MC are co-cultured in a ratio of 1-10: 1-50: 1-50.
  • the co-cultivation can take place under rotation, pivoting or shaking movements.
  • the co-cultivation may preferably take place in a cylindrical cavity, which preferably has a round bottom.
  • both the cells for the production of the de novo papilla, as well as the KC and MC come from a donor.
  • the method for the production of hair follicles comprises the steps: a) provision of at least one de novo papilla prepared by the method according to the invention for the production of de novo papillae; b)
  • the de novo papilla preferably comprises DPF, CTSF and additionally EZ and / or SVF.
  • the de novo papilla is preferably coated with extracellular matrix proteins.
  • the de novo papilla, KC, MC and CTSF are co-cultured in a ratio of 1 -10: 1 -50: 1 -50: 1 -50.
  • the co-cultivation may take place under rotation, panning or shaking.
  • the co-cultivation may preferably take place in a cylindrical cavity, which preferably has a round bottom.
  • both the cells for the production of the de novo papilla, as well as the KC, MC and the CTSF originate from a donor.
  • the present invention also includes hair follicles produced by the
  • the de novo papillae and / or the hair follicles produced by one of the methods of the present invention can be used for the preparation of a skin equivalent.
  • the skin equivalents are prepared on the basis of a skin matrix, wherein the skin matrix is, for example, an artificial dermal matrix, such as e.g. Matriderm® or a donor skin. Become into this skin matrix
  • Insertion sites for example in the form of perforations, for the de novo introduced papillae and / or hair follicles, for example by means of a punch, scalpel or laser. These insertion sites may be introduced into the skin matrix at regular or irregular intervals.
  • the de novo papillae and / or hair follicles are inserted into the insertion sites of the dermal matrix.
  • the present invention also relates to a skin equivalent comprising the de novo papilla and / or the hair follicles produced by one of the methods of the invention.
  • the skin equivalent may additionally comprise one or more layers of KC and / or MC, which layer (s) are preferably applied via the de novo papillae and / or hair follicles located in the dermal matrix.
  • the skin equivalent may include other cells and / or cell structures such as immune cells (dendritic cells, lymphocytes, etc.), neuronal cells, sebaceous and sweat gland cells / tissues, muscle cells / fibers, vascular structures and other cell types contained in natural, healthy or diseased skin are.
  • the de novo papillae and / or hair follicles produced by one of the methods of the invention may be used for the manufacture of an implant. Accordingly, the present invention also relates to an implant comprising the de novo papillae and / or the hair follicles produced by one of the methods of the invention, optionally together with pharmaceutically tolerable ones
  • the present invention also relates to the use of the de novo papilla, the hair follicles produced by the method according to the invention and / or the skin equivalent comprising the de novo papillae and / or hair follicles for the
  • allogeneic cells be used for the production of the de novo papillae and / or hair follicles, which means that the donor of the cells used and the recipient of the de novo papillae and / or hair follicles produced are the same Belong to species, ie that both donor and recipient are, for example, humans.
  • autologous cells be used for the production of the de novo papillae and / or hair follicles, which means that the donor of the cells used and the recipient of the de novo papillae produced and / or Hair follicle is identical, ie, for example, is the same human.
  • the present invention also relates to the use of the de novo papilla, hair follicles and / or skin equivalents according to the invention for the in vitro testing of hair growth-regulating substances.
  • the present invention also relates to the use of the de novo papilla, hair follicles and / or skin equivalents according to the invention for the in vitro testing of substances for toxic properties.
  • the present invention also includes a kit for carrying out the invention
  • the kit can be the de novo papillae according to the invention
  • Hair follicle, the skin equivalent, the implant and / or the graft for example, the inventive method for treating a condition of reduced
  • Kit also includes instructions for using the kit and / or performing it of the inventive method. Furthermore, the kit may contain further constituents for carrying out the method according to the invention, such as, for example
  • Reaction vessels Reaction vessels, filters, solutions and / or other means.
  • the present invention comprises a method for treating a
  • the present invention also relates to a method for in vitro screening of substances having hair growth-regulating properties, comprising the following steps: a) providing a sample of the de novo papilla according to the invention,
  • Hair follicles and / or skin equivalents b) dividing the corresponding sample into portions; c) incubate at least one portion of substances to be tested; and d) comparing the parameters of the hair properties in the portion with another portion that was not incubated with the substances
  • Figures Figure 1 shows:
  • FIG. 2 shows:
  • the FU consists essentially of the hair shaft, the epidermis, dermis, sebaceous gland, connective tissue sheath (CTSF), root sheaths (ORS, IRS, KC), sweat gland, blood vessels (endothelial cells), pigment unit (melanocytes), dermal papilla (DPF) and adipose tissue (adipocytes, SVF).
  • FIG. 3 shows:
  • DP de novo papilla
  • KC epithelial
  • the hair shaft which also contains the hair matrix keratinocytes and melanocytes required, is optimally prepared for further cultivation.
  • Hair follicles are each collected in a separate vessel with medium.
  • tissue dissociator and the associated Extractions kit eg gentleMACS Dissociator # 130-093-235, whole skin dissociation kit # 130-101 -540, Miltenyi Biotec
  • the DPF and CTSF are removed from the tissue and separated , For this purpose, each of the isolated tissue fragments
  • the sample is incubated in a 37 ° C water bath for 1 to 3 hours or overnight, with longer incubation times increasing cell yield. After incubation, dilute the sample by adding 0.5 ml of cold cell culture medium. The C-Tube is closed and fastened inverted on the sleeve of the gentleMACS Dissociator.
  • WPF stromal vascular fraction
  • the corresponding area with head or beard hair is washed and disinfected (70% ethanol) and each 20-30 hair plucked with a rubber-coated tweezers. Only the hair with an adherent layer of tissue is transferred to a vessel and rinsed in PBS. Subsequently, the hairs are incubated in 2 ml trypsin / EDTA solution at 37 ° C for 20 minutes and then mixed briefly with a shaker. The enzyme reaction is stopped with 4 ml trypsin inhibitor. Wash with PBS and centrifuge the suspension at 200g for 5 minutes. The cells can then be taken up in medium and used for further culture or after cell counting for further in vitro hair follicle preparation.
  • Round bottom Multiwell plate (Corning) pipetted (in DMEM + 10% FCS and DermaLife medium in a ratio of 1: 1) or mixed beforehand with cells of the SVF or endothelial cells and then transferred into the wells of the multiwell plate. This will last for 2 min at 200g centrifuged and incubated under rotation at 20 rounds per minute for 20 min at room temperature. For the longer culture daily medium is changed.
  • a mixture of melanocytes and keratinocytes resulting from tissue dissociation from isolated or plucked hair shafts are taken up in cell culture medium and pipetted in each case to the de novo papillae (15,000

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen, umfassend die Schritte a) Bereitstellen von isolierten Haarpapillenfibroblasten (DPF) aus zumindest einer Haarpapille (DP) aus mindestens einem Haarfollikel, b) Bereitstellen von isolierten Bindegewebsfibroblasten (CTSF) aus mindestens einem Haarfollikel und c) Co- Kultivierung der DPF mit den CTSF unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.

Description

Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln und de novo Papillen sowie deren Verwendung für in vitro Tests und in vivo Implantate
Genetisch bedingter Haarausfall, auch bekannt unter der Bezeichnung androgenetische Alopezie, ist ein sehr weit verbreitetes psychoemotional belastendes Krankheitsbild mit erheblichen Auswirkungen auf die Leistungsfähigkeit der Betroffenen in unserer
Gesellschaft. Als Ursache für den genetisch bedingten Haarausfall gilt eine
Überempfindlichkeit der Haarfollikel gegen das Steroidhormon Dihydrotestosteron.
Neben der medikamentösen Behandlung der androgenetischen Alopezie besteht die Möglichkeit einer Haartransplantation, welche bisher immer noch die weitaus besten kosmetischen Ergebnisse erzielt. Dabei handelt es sich um eine Umverteilung von intakten androgen-insensitiven Haarfollikeln aus dem okzipitalen Nacken- oder lateralen
Schläfenbereich in den Oberkopf bzw. den frontalen Glatzenbereich.
Auch wenn die Techniken der modernen Haartransplantation immer ausgefeilter und effizienter werden, sind jedoch insbesondere bei weit fortgeschrittenem Haarausfall naturgemäß nicht genügend Spenderhaare vorhanden um eine ausreichende, kosmetisch relevante Haardichte und somit ein zufriedenstellendes Behandlungsergebnis erzielen zu können. Für die Durchführung einer Haartransplantation sind geeignete Haartransplantate oder Zellen als Material nötig, welche dem Empfänger eingesetzt werden. Die
Vervielfältigung der benötigten Zellen benötigt in der Regel mehrere Wochen. Des Weiteren muss die Vervielfältigung unter Reinraumbedingungen stattfinden, was das Produkt zu einem sogenannten ATMP (Advanced Therapeutic Medicinal Product) klassifiziert, welches außerordentlich hohe Entwicklungs- und Markteintrittshürden hat.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen oder mehrere Nachteile des Standes der Technik zu vermindern oder zu vermeiden. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem de novo Papillen bzw. Haarfollikel hergestellt werden können.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von de novo Papillen, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten Haarpapillenfibroblasten (DPF, Abkürzung für englisch dermal hair papilla fibroblasts) aus zumindest einer Haarpapille (DP, Abkürzung für englisch dermal papilla) aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von isolierten Bindegewebsfibroblasten (CTSF,
Abkürzung für englisch connective tissue sheath fibroblasts) aus mindestens einem Haarfollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF mit den CTSF unter im Wesentlichen nicht- adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass de novo Papillen aus Mischungen aus zumindest DPF und CTSF hergestellt werden können. Das erfindungsgemäße
Herstellungsverfahren kann im Vergleich zu im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Vervielfältigung von Haarfollikeln in kürzerer Zeit durchgeführt werden. Entsprechend ist es möglich innerhalb eines Tages Zellpopulationen aus Haarfollikeln zu gewinnen, mithilfe dieser Zellen de novo Papillen und/oder Haarfollikel in einer größeren Anzahl herzustellen und diese neu generierten de novo Papillen bzw. Haarfollikel in die zu behandelnde haarlose Kopfhaut zu implementieren, so dass an diesen Stellen wieder neue Haare gebildet werden können.
Soweit nachfolgend der Kontext nicht eindeutig etwas anderes ergibt, ist bei der Verwendung von Singular-Formen bzw. Plural-Formen stets sowohl die Ein- als auch die Mehrzahl umfasst.
Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich auf die Herstellung von de novo Papillen. Der Begriff„de novo Papille",„Neopapille" oder„Sphäroid" werden synonym verwendet und bezeichnen ein im Wesentliches sphäroides Zellaggregat aus Haarpapillenfibroblasten (DPF) und Bindegewebsfibroblasten (CTSF). Die de novo Papille umfasst also eine Mischung aus zumindest DPF und CTSF. Die de novo Papillen bestehen aus ca. 2 bis 20000 Zellen, bevorzugt aus 10 bis 15000, besonders bevorzugt aus 500 bis 10000, ganz besonders bevorzugt aus 1000 bis 5000 Zellen. Vorzugsweise weist die de novo Papille zumindest die halbe Größe einer physiologischen Haarpapille (DP) eines Haarfollikels nach Isolierung derselben auf. Ebenfalls bevorzugt weist die de novo Papille die ungefähre Form einer physiologischen DP eines Haarfollikels nach Isolierung derselben auf.
Die de novo Papille kann eine Beschichtung umfassen, welche ein oder mehrere
unterschiedliche extrazelluläre Matrixproteine wie beispielsweise Kollagen IV, Fibronektin und/oder Laminin enthält. Diese Beschichtung kann durch die DPF und CTSF selbst entstehen, während diese die de novo Papille ausbilden. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die de novo Papille auch während und/oder nach ihrer Formierung durch zusätzliche Zugabe von einem oder mehreren unterschiedlichen extrazellulären Matrixproteinen zum Kulturmedium beschichtet werden.
Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird in vitro durchgeführt. Als„in vitro" wird jede Umgebung verstanden, die sich nicht innerhalb eines lebenden Organismus, z.B. einem menschlichen oder tierischen Körpers, befindet. Das erfindungsgemäße in vitro Nachweisverfahren umfasst also ausdrücklich kein Verfahren, welches am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden in einem ersten Verfahrensschritt a) isolierte Haarpapillenfibroblasten (DPF) aus zumindest einer Haarpapille (DP) bereitgestellt, wobei die DP aus mindestens einem Haarfollikel stammt.
Die Bereitstellung der DP aus dem Haarfollikel und die Isolierung der DPF aus der DP kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Isolierte Haarfollikel werden z.B. mit einer Pinzette am Haarschaft fixiert und die Bindegewebsscheide wird z.B. mit einer weiteren Pinzette diametral vom Haarschaft getrennt, so dass der Bulbus umgestülpt wird und somit die DPF und der Haarschaft mit der Haarmatrix freiliegen. Dadurch können die DP vom restlichen Teil des Haarfollikels getrennt werden was z.B. mithilfe einer Nadel oder Kanüle geschehen kann.
Anschließend werden die isolierten DP beispielsweise in ein Zellkulturgefäß überführt und mechanisch auf der Oberfläche des Zellkulturgefäßes fixiert. Vorzugsweise werden die DPF dadurch erhalten, dass die isolierte DP mechanisch am Boden des Zellkulturgefäßes arretiert wird, z.B. mittels einer Nadelspitze oder einem Skalpell. Die Morphologie der DP bleibt dabei in etwa erhalten, jedoch wird die Basallamina der DP leicht perforiert, so dass die DPF aus der DP migrieren können. Die DPF können auch mithilfe einer enzymatischen oder nicht- enzymatischen Trennung aus der DP erhalten werden.
Es besteht die Möglichkeit, dass die DPF nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten DPF um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten DPF handeln.
Die Haarfollikel, aus denen die DP und die DPF isoliert werden, stammen aus Gewebe. Dem
Fachmann sind Verfahren zur Entnahme von Haarfollikeln aus Gewebe bekannt. Bevorzugt werden die Haarfollikel nach Standards guter medizinsicher Praxis aus dem Gewebe entnommen. Vorzugsweise erfolgt die Entnahme der Haarfollikel aus dem Gewebe derart, dass sie im Wesentlichen intakt, d.h. unbeschädigt, bleiben. Die Entnahme der Haarfollikel aus dem Gewebe kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: i) Abtrennung der
Epidermis von der darunterliegenden Dermis bzw. Fettgewebe beim Gewebe, vorzugsweise unter Verwendung eines Skalpells; ii) Präparation von Haaren aus der Dermis bzw. dem
Fettgewebe des Gewebes. Die entnommenen Haare umfassen an ihrem proximalen Ende die Haarfollikel. Optional kann vor Schritt ii) die Dermis bzw, das Fettgewebe komprimiert werden, damit die darin vorhandenen Haarfollikel leichter herauspräpariert werden können.
Das Komprimieren kann dabei beispielsweise mithilfe einer Pinzette durchgeführt werden. Vorzugsweise findet die Entnahme der Haarfollikel unter dem Mikroskop statt. Vorzugsweise werden die Haarfollikel aus Stanzbiopsien gewonnen, die aus bevorzugt einzelnen follikulären Einheiten (FE) bestehen. Eine Follikuläre Einheit ist die Bezeichnung für eine Gruppe von 1 -4 Haarfollikeln, die räumlich dicht beieinander wachsen, durch eine
Gewebskapsel umgeben und durch einen gemeinsamen Muskel bewegt wird (M. arrector pilli). Man gewinnt die follikulären Einheiten entweder durch Präparation unter einem
Stereomikroskop aus einem vorher entnommenen Kopfhautstreifen oder exakter durch direkte Punktion der Kopfhaut mittels einer Hohlnadel. Letztere Methode nennt man
Follicular Unit Extraction (FUE).
Das Gewebe aus dem die Haarfollikel, für z.B. die Isolation der DP bzw. DPF, gewonnen werden können stammt aus einem Säugetier. Dieses Säugetier kann ein Mensch, Affe, Schwein, Hund, Katze oder Nagetier sein, bevorzugt ein Mensch. Das Säugetier stellt also einen Spender für das, den Haarfollikel enthaltene, Gewebe dar. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Säugetier um einen menschlichen Patienten, der an Haarausfall leidet.
Das Gewebe umfasst bevorzugt Haut. Dabei kann das Gewebe aus jeder behaarten
Körperregion gewonnen werden vorzugsweise aus Kopf, Brust, Augenbrauen, Bart,
Genitalbereich, Bein oder anderen Körperregionen. Besonders bevorzugt wird das Gewebe aus einer Körperregion entnommen, die sich in der Nähe der vom Haarausfall betroffenen Körperstelle befindet. Betrifft beispielsweise der Haarausfall den Oberkopf, also den zwischen Stirn und Hinterkopf gelegenen Teil des Kopfes, so kann das Gewebe bevorzugt aus dem Nacken-oder Schläfenbereich des Kopfes entnommen werden. Vorzugsweise wird das Gewebe mittels einer Biopsie erhalten.
Bevor die Haarfollikel, für z.B. die Isolation der DP bzw. DPF, aus dem Gewebe entnommen werden, kann dieses Gewebe einem oder mehreren Reinigungsschritten unterzogen werden, um möglicherweise vorhandene störende Substanzen von dem Gewebe zu entfernen.
In Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden isolierte Bindegewebsfibroblasten (CTSF) aus mindestens einem Haarfollikel bereitgestellt.
Die Bereitstellung der CTSF aus dem Haarfollikel kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Isolierte Haarfollikel werden z.B. mit einer Pinzette am Haarschaft fixiert und die Bindegewebsscheide wird z.B. mit einer weiteren Pinzette diametral vom Haarschaft getrennt, so dass der Bulbus umgestülpt wird. Dadurch können der proximale Teil des Bulbus mit den CTSF vom restlichen Teil des Haarfollikels getrennt werden was z.B. mithilfe einer Nadel oder Kanüle geschehen kann. Anschließend wird die isolierte Bindegewebsscheide beispielsweise in ein Zellkulturgefäß überführt und mechanisch auf der Oberfläche des Zellkulturgefäßes fixiert. Vorzugsweise werden die CTSF dadurch erhalten, dass die isolierte Bindegewebsscheide mechanisch am Boden des Zellkulturgefäßes arretiert wird, z.B. mittels einer Nadelspitze oder einem
Skalpell. Die Morphologie der Bindegewebsscheide bleibt dabei in etwa erhalten, jedoch wird das Bindegewebe leicht perforiert, so dass die CTSF aus dem Bindegewebe migrieren können. Vorzugsweise können die CTSF auch mithilfe einer enzymatischen oder nicht- enzymatischen Trennung aus dem Bindegewebe erhalten werden.
Es besteht die Möglichkeit, dass die CTSF nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten CTSF um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten CTSF handeln.
Die Haarfollikel, aus denen die CTSF isoliert werden, stammen aus Gewebe. Dem
Fachmann sind Verfahren zur Entnahme von Haarfollikeln aus Gewebe bekannt. Bevorzugt werden die Haarfollikel nach Standards guter medizinsicher Praxis aus dem Gewebe entnommen. Vorzugsweise erfolgt die Entnahme der Haarfollikel aus dem Gewebe derart, dass sie im Wesentlichen intakt, d.h. unbeschädigt, bleiben. Die Entnahme der Haarfollikel aus dem Gewebe kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: i) Abtrennung der Epidermis von der darunterliegenden Dermis bzw. Fettgewebe beim Gewebe, vorzugsweise unter Verwendung eines Skalpells; ii) Präparation von Haaren aus der Dermis bzw. dem Fettgewebe des Gewebes. Die entnommenen Haare umfassen an ihrem proximalen Ende die Haarfollikel. Optional kann vor Schritt ii) die Dermis bzw, das Fettgewebe komprimiert werden, damit die darin vorhandenen Haarfollikel leichter herauspräpariert werden können. Das Komprimieren kann dabei beispielsweise mithilfe einer Pinzette durchgeführt werden. Vorzugsweise findet die Entnahme der Haarfollikel unter dem Mikroskop statt.
Das Gewebe aus dem die Haarfollikel, für z.B. die Isolation der CTSF, gewonnen werden können stammt aus einem Säugetier. Dieses Säugetier kann ein Mensch, Affe, Schwein, Hund, Katze oder Nagetier sein, bevorzugt ein Mensch. Das Säugetier stellt also einen Spender für das, den Haarfollikel enthaltene, Gewebe dar. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Säugetier um einen menschlichen Patienten, der an Haarausfall leidet.
Das Gewebe umfasst bevorzugt Haut. Dabei kann das Gewebe aus jeder behaarten Körperregion gewonnen werden vorzugsweise aus Kopf, Brust, Augenbrauen, Bart, Genitalbereich, Bein oder anderen Körperregionen. Besonders bevorzugt wird das Gewebe aus einer Körperregion entnommen, die sich in der Nähe der vom Haarausfall betroffenen Körperstelle befindet. Betrifft beispielsweise der Haarausfall den Oberkopf, also den zwischen Stirn und Hinterkopf gelegenen Teil des Kopfes, so kann das Gewebe bevorzugt aus dem Nacken-oder Schläfenbereich des Kopfes entnommen werden. Vorzugsweise wird das Gewebe mittels einer Biopsie erhalten.
Bevor die Haarfollikel, für z.B. die Isolation der CTSF, aus dem Gewebe entnommen werden, kann dieses Gewebe einem oder mehreren Reinigungsschritten unterzogen werden, um möglicherweise vorhandene störende Substanzen von dem Gewebe zu entfernen.
Die DPF und CTSF werden also aus isolierten Haarfollikeln gewonnen. Dabei können die DPF und CTSF aus demselben Haarfollikel gewonnen werden. Die DPF und CTSF können aber auch aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen werden. Werden die DPF und CTSF aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen, können diese Haarfollikel aus dem gleichen Gewebe isoliert worden sein, beispielsweise aus einem Gewebe, welches z.B. aus dem Nackenbereich des Kopfes eines Spenders entnommen wurde. Werden die DPF und CTSF aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen, so können diese Haarfollikel auch aus verschiedenen Geweben isoliert worden sein, so dass beispielsweise eins der Gewebe z.B. aus dem Nackenbereich des Kopfes eines Spenders entnommen wurde und das andere Gewebe z.B. aus dem Bart eines Spenders. Es kann sich bei dem Spender um denselben Spender oder einen anderen Spender handeln. Sofern es sich um einen anderen Spender handelt, ist dieser vorzugsweise ein allogener Spender. Vorzugsweise handelt es sich um denselben, also autologen, Spender.
Im nachfolgenden Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Co-Kultivierung der DPF und CTSF unter im Wesentlichen nicht adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.
Unter dem Ausdruck "nicht-adhärente Zellkulturbedingungen" werden im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens Zellkulturbedingungen verstanden, bei denen die Zellen im Wesentlichen keinen direkten und/oder andauernden Kontakt zur Oberfläche des
Zellkulturgefäßes haben. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Oberflächen des Zellkulturgefäßes aus einem Material bestehen und/oder eine anti- Adhäsionsbeschichtung aufweisen, welche/s die Zellanheftung reduziert oder im
Wesentlichen verhindert. Geeignete Kulturgefäße und/oder Beschichtungen für diese Zellkulturgefäße sind dem Fachmann bekannt. Derartige nicht-adhärente Zellkulturgefäße können beispielsweise aus Glas oder Polystyrol gefertigt sein. Vorzugsweise sind die Oberflächen des Zellkulturgefäßes mit kontaktinhibierenden Materialien wie PTFE, poly- HEMA, Agarose oder Fluorocarbon-Lösungen beschichtet.
Unter die Definition der nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen fällt erfindungsgemäß ebenfalls die sogenannte Kultivierungsmethode des„Hängenden Tropfens" („Hanging Drop"-Technologie), bei der sich die Zellen innerhalb eines Tropfens aus Nährmedium befinden. Die Oberflächenspannung der Flüssigkeit hält den Tropfen in hängender Position an der Oberfläche des Zellkulturgefäßes und umschließt die sich darin befindenden Zellen. Aufgrund der Schwerkraft sammeln sich die Zellen im unteren Teil des Tropfens und haben im Wesentlichen keinen direkten Kontakt zum Kulturgefäß. Innerhalb des Tropfens können sich die Zellen zu Sphäroiden formieren.
Durch die Co-Kultivierung der DPF und CTSF entstehen im Wesentlichen sphäroide
Zellaggregate, die physiologischen DP hinsichtlich ihrer Form und Größe ähneln.
Die DPF und CTSF können in einem gleichen oder in einem unterschiedlichen Verhältnis co- kultiviert werden. Vorzugsweise werden die DPF und CTSF in einem Verhältnis von 1 -20:1 - 20 co-kultiviert, bevorzugt 1 -10:1 -10, besonders bevorzugt 1 -5:1 -5, ganz besonders bevorzugt 1 -2,5:1 -2,5, insbesondere bevorzugt 1 :1 .
In einer Ausführungsform wird für die Co-Kultivierung der DPF und CTSF in Schritt c) eine Zellkonzentration von 2 bis 20000 DPF+CTSF/mm2 des Zellkulturgefäßes gewählt, bevorzugt 10 bis 15000, besonders bevorzugt 500 bis 10000, ganz besonders bevorzugt 1000 bis 5000.
Die Co-Kultivierung der DPF und CTSF findet in Zellkulturgefäßen statt wobei dem
Fachmann geeignete Zellkulturgefäße bekannt sind. Bei diesen Zellkulturgefäßen kann es sich beispielsweise um kommerziell erhältliche Zellkulturplatten, -schalen oder -flaschen handeln. Die Zellkulturgefäße können ein oder mehrere Kavitäten aufweisen. Die Co- Kultivierung der DPF und CTSF findet vorzugsweise in einer Kavität eines Zellkulturgefäßes statt. Bei den Zellkultusgefäßen kann es sich um sogenannte Multiwellplatten mit mehr als einer Kavität handeln. Bevorzugt weisen die Zellkulturgefäße 2 bis 10000 Kavitäten auf, besonders bevorzugt 4 bis 1536, ganz besonders bevorzugt 6 bis 384.
Die Böden der Zellkulturgefäß-Kavitäten können eben oder uneben geformt sein.
Vorzugsweise sind die Kavitätenböden als Rundbogen ausgeformt. Ebenfalls bevorzugt sind Kavitäten, die trichterförmig ausgeformt sind.
In einer Ausführungsform werden die DPF und CTSF vor deren Co-Kultivierung in Schritt c) mittels Zentrifugation am Boden der Zellkulturgefäße sedimentiert. Durch diese initiale Konzentrierung der DPF und CTSF am Boden des Zellkulturgefäßes wird eine schnellere Zellaggregatbildung erreicht.
Die Co-Kultivierung der DPF und CTSF findet für mindestens 1 min statt, bevorzugt für 10 min bis 14 Tage, besonders bevorzugt für 20 min bis 48h, ganz besonders bevorzugt für 30 min bis 24h, insbesondere bevorzugt für 1 h bis 4h. Vorzugsweise findet die Co-Kultivierung der DPF und CTSF in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Anwesenheit von Blutplasma und/oder Blutserum statt. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Blutplasma und/oder Blutserum um humanes Blutplasma und/oder Blutserum, bevorzugt um autologes Blutplasma und/oder Blutserum. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Blutplasma und/oder Blutserum um 1 -100%iges Blutplasma bzw. Blutserum, bevorzugt um 15-75%iges, besonders bevorzugt um 30- 50%iges.
Die Co-Kultivierung der DPF und CTSF in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann unter im Wesentlichen statischen Bedingungen oder unter Bewegung stattfinden. Vorzugsweise findet die Co-Kultivierung unter Rotations-, Schwenk- oder
Schüttelbewegungen statt.
Bei der Co-Kultivierung der DPF und CTSF in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens können zusätzlich noch weitere Zelltypen anwesend sein. Vorzugsweise sind bei der Co- Kultivierung zusätzlich Endothelzellen (EZ) und/oder Zellen von stromalen vaskulären Fraktionen (SVF) anwesend.
Methoden zur Gewinnung der EZ sind dem Fachmann bekannt. Die EZ können aus Blutgefäßen gewonnen werden, bevorzugt aus Blutgefäßen, welche sich an oder in
Haarfollikeln befinden. Vorzugsweise werden die EZ aus einem humanen Spender gewonnen. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um autologe EZ. Es besteht die Möglichkeit, dass die EZ nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im
erfindungsgemäßen Verfahren zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten EZ um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten EZ handeln. Durch das Vorhandensein von EZ bei der Co-Kultivierung der DPF mit den CTSF in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens entstehen de novo Papillen, welche DPF, CTSF und EZ umfassen. Derartige de novo Papillen, oder aus ihnen generierte Haarfollikel, können für die Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge in die Haut eines Säugetiers eingebracht werden. Solche de novo Papillen oder aus ihnen generierte Haarfollikel ermöglichen nach der Transplantation in die Haut eine beschleunigte Bildung von
Blutgefäßen an den Papillen bzw. Haarfollikeln und somit eine verbesserte Bildungs- bzw. Anwuchsrate der daraus entstehenden Haare.
Methoden zur Gewinnung der SVF sind dem Fachmann bekannt. Die SVF können beispielsweise mittels Fettgewebsexzision oder Liposuktion gewonnen werden.
Vorzugsweise wird die SVF aus einem humanen Spender gewonnen, besonders bevorzugt handelt es sich dabei um eine autologe SVF. Die SVF umfassen verschiedene Zellpopulationen wie Vorläufer von Fettzellen (Präadipozyten), Endothelzellen, endotheliale Muskelzellen, Fibroblasten, Makrophagen oder Blutzellen. Es besteht die Möglichkeit, dass bestimmte Bestandteile der SVF nach ihrer Gewinnung aus dem Spender aus der SVF entfernt werden, was durch einen oder mehrere Wasch-, Reinigungs- oder
Isolierungsschritte erfolgen kann oder auch durch gezieltes Abtrennen oder Entfernen der Bestandteile. Ebenfalls ist es möglich, dass die SVF nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten SVF um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten SVF handeln. Durch die Anwesenheit der SVF bei der Co-Kultivierung in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine erhöhte bzw. schnellere Zellmultiplikation der DPF und CTSF erreicht und entsprechend die Bildung der de novo Papillen beschleunigt.
Die weiteren Zelltypen können in einem gleichen oder in einem unterschiedlichen Verhältnis zu den DPF und CTSF anwesend sein. Vorzugsweise werden die DPF, CTSF und EZ oder SVF in einem Verhältnis von 1 -20:1 -20:1 -20 co-kultiviert, bevorzugt 1 -10:1 -10:1 -10, besonders bevorzugt 1 -5:1 -5:1 -5, ganz besonders bevorzugt 1 -2,5:1 -2,5:1 -2,5, insbesondere bevorzugt 1 :1 :1 . Werden die DPF und CTSF zusammen mit EZ und SVF kultiviert, so erfolgt die Co-Kultivierung vorzugsweise in einem Verhältnis von 1 -20:1 -20:1 -20:1 -20, bevorzugt 1 - 10:1 -10:1 -10:1 -10, besonders bevorzugt 1 -5:1 -5:1-5:1 -5, ganz besonders bevorzugt 1 -2,5:1 - 2,5:1 -2,5:1 -2,5, insbesondere bevorzugt 1 :1 :1 :1.
Während der Entstehung der de novo Papille bildet sich in der Regel eine Schicht aus extrazellulären Matrixproteinen in und/oder um das Zellaggregat aus, welche in der Regel von den DPF und/oder CTSF gebildet wird. Alternativ oder zusätzlich dazu besteht die Möglichkeit die de novo Papille während und/oder nach Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit extrazellulären Matrixproteinen zu beschichten. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass z.B. eine Zusammensetzung umfassend diese extrazellulären Matrixproteine zusätzlich zum Kulturmedium hinzugefügt wird, um die Entstehung dieser Papillenbeschichtung zu erleichtern und/oder zu beschleunigen. Ebenfalls ist es möglich, dass die de novo Papillen erst vom Kulturmedium abtrennt und dann mit einer
Zusammensetzung umfassend diese extrazellulären Matrixproteine versetzt werden. Diese Zusammensetzung der hinzugefügten extrazellulären Matrixproteine umfasst bevorzugt Kollagen IV, Fibronectin und/oder Laminin. Vorzugsweise umfasst oder besteht diese Zusammensetzung der zusätzlich hinzugefügten extrazellulären Matrixproteine Kollagen IV, Fibronectin und Laminin, bevorzugt in einem Verhältnis von 2-6:0,5-2:0,5-2 Gewichtsteilen, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 3-5:0,5-1 ,5:0,5-1 ,5 Gewichtsteilen, ganz besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 4:1 :1 ,15 Gewichtsteilen. Die Zusammensetzung der extrazellulären Matrixproteine kann auch in Kombination mit anderen Matrices eingesetzt werden. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung der extrazellulären Matrixproteine weiterhin andere Kollagene (wie z.B. Kollagen I, Kollagen 10 A1 , Kollagen 18 A1 ), Glykosaminoglykane und/oder Proteoglykane, vorzugsweise
Heparansulfate, Decorin, Keratansulfate, Biglykan, Aggrecan, Versican, Perlecan,
Osteopontin, CD44v3 und/oder Syndecan.
Vorzugsweise wird die de novo Papille durch Zugabe von extrazellulären Matrixproteinen ins Zellkulturmedium mit diesen Matrixproteinen beschichtet. Die Beschichtung der de novo Papille mit den extrazellulären Matrixproteinen findet bevorzugt ebenfalls unter im
Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen statt. Die Beschichtung der de novo Papille findet für mindestens 1 min statt, bevorzugt für 10 min bis 14 Tage, besonders bevorzugt für 20 min bis 48 h, ganz besonders bevorzugt für 30 min bis 24 h, insbesondere bevorzugt für 1 h bis 4h.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf de novo Papillen, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten DPF aus zumindest einer DP aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von CTSF aus mindestens einem Haarfollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF und CTSF und zusätzlich EZ unter im Wesentlichen nicht- adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.
Vorzugsweise werden die DPF, CTSF und EZ in einem Verhältnis von 1 -20:1 -20:1 -20 co- kultiviert. Die de novo Papillen werden vorzugsweise durch Zugabe von extrazellulären Matrixproteinen ins Zellkulturmedium mit diesen Matrixproteinen beschichtet. Die Co- Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Die Co- Kultivierung kann vorzugsweise in einer zylindrischen Kavität stattfinden, welche bevorzugt einen Rundboden aufweist. Es ist möglich die Co-Kultivierung in Multiwell-Zellkulturgefäßen mit beispielsweise 96- oder 384-wells durchzuführen. Des Weiteren kann die Co-Kultivierung in Anwesenheit von Blutplasma und/oder Blutserum stattfinden. Bevorzugt stammen die DPF, CTSF und EZ von einem Spender.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten DPF aus zumindest einer DP aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von CTSF aus mindestens einem Haarfollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF und CTSF und zusätzlich SVF unter im Wesentlichen nicht- adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.
Vorzugsweise werden die DPF, CTSF und SVF in einem Verhältnis von 1 -20:1 -20:1 -20 co- kultiviert. Die de novo Papillen werden vorzugsweise mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet. Die Co-Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Des Weiteren kann die Co-Kultivierung in Anwesenheit von Blutplasma und/oder Blutserum stattfinden. Bevorzugt stammen die DPF, CTSF und SVF von einem Spender.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten DPF aus zumindest einer DP aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von CTSF aus mindestens einem Haarfollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF, CTSF sowie zusätzlich EZ und SVF unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen. Vorzugsweise werden die DPF, CTSF, EZ und SVF in einem Verhältnis von 1 -20:1 -20:1 -20:1 -20 co-kultiviert. Die de novo Papillen werden vorzugsweise mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet. Die Co-Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Des Weiteren kann die Co- Kultivierung in Anwesenheit von Blutplasma und/oder Blutserum stattfinden. Bevorzugt stammen die DPF, CTSF, EZ und SVF von einem Spender.
Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von mindestens einer de novo Papille hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen; b) Bereitstellen von mindestens einer weiteren Zellpopulation ausgewählt aus Keratinocyten (KC), Melanocyten (MC) oder Bindegewebsfibroblasten (CTSF); und c) Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren Zellpopulation unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen.
Der mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte„Haarfollikel" bezeichnet eine im Vergleich zu natürlichen Haarfollikeln unvollständige Follikel-Struktur, welche einen kondensierten Kern (Papille) aus Fibroblasten mesenchymalen Ursprungs und eine umhüllende äußere und/oder innere epitheliale Haarwurzelscheide umfassen kann allerdings ohne weitere Zelltypen oder Strukturen wie Muskel- oder Nervenzellen, Blutgefäße etc. zu enthalten, so dass der Haarfollikel eine verringerte Größe im Vergleich zu natürlichen
Haarfollikeln aufweist. Ein Haarfollikel ist zusammengesetzt aus einer de novo Papille aus zumindest DPF und CTSF, welche stabil mit mindestens einer weiteren Zellpopulation ausgewählt aus Keratinocyten (KC), Melanocyten (MC) oder Fibroblasten, wie z.B. CTSF, bedeckt oder kolonisiert ist. Vorzugsweise ist ein Haarfollikel zusammengesetzt aus einer de novo Papille, welche stabil mit mindestens einer weiteren Zellpopulation ausgewählt aus KC,
MC oder CTSF bedeckt oder kolonisiert ist, wobei die mindestens eine weitere Zellpopulation aus einem Haarfollikel gewonnen werden kann oder gewonnen wird. Der Haarfollikel weist eine dreidimensionale, gegebenenfalls räumlich begrenzte Form auf, welche dem
dreidimensionalen Erscheinungsbild eines physiologischen Haarfollikels ähnelt. Die Haarfollikel können eine polare Struktur aufweisen, beispielsweise eine spitze Auswölbung auf einer Seite des Haarfollikel, die an Strukturen der frühen Morphogenese physiologischer Haarfollikel erinnern.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Haarfollikel wird in einem ersten Verfahrensschritt a) mindestens eine de novo Papille bereitgestellt, wobei die de novo Papille nach dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
In Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der Haarfollikel wird mindestens eine weitere Zellpopulation ausgewählt aus KC, MC oder CTSF bereitgestellt.
Im nachfolgenden Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der Haarfollikel erfolgt die Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren Zellpopulation ausgewählt aus Keratinocyten (KC), Melanocyten (MC) oder
Bindegewebsfibroblasten (CTSF), unter im Wesentlichen nicht adhärenten
Zellkulturbedingungen. Die KC, MC und/oder CTSF müssen dabei nicht von einem
Haarfollikel stammen, sondern können aus anderen Säugetier-Geweben, wie z.B. Haut, gewonnen werden. Vorzugsweise kann die mindestens eine weitere Zellpopulation aus einem Haarfollikel gewonnen werden und/oder wird sie aus einem Haarfollikel gewonnen.
Dabei können die KC, MC und/oder CTSF aus demselben Haarfollikel gewonnen werden. Die KC, MC und/oder CTSF können aber auch aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen werden. Werden die KC, MC und/oder CTSF aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen, können diese Haarfollikel aus dem gleichen Gewebe isoliert worden sein, beispielsweise aus einem Gewebe, welches z.B. aus dem Nackenbereich des Kopfes eines Spenders entnommen wurde. Werden die KC, MC und/oder CTSF aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen, so können diese Haarfollikel auch aus verschiedenen Geweben isoliert worden sein, so dass beispielsweise eins der Gewebe z.B. aus dem Nackenbereich des Kopfes eines Spenders entnommen wurde und ein anderes Gewebe z.B. aus dem Bart eines Spenders. Im letzteren Fall kann es sich bei dem Spender um denselben Spender oder einen anderen Spender handeln. Sofern es sich um einen anderen Spender handelt, ist dieser vorzugsweise ein allogener Spender. Vorzugsweise handelt es sich um denselben, also autologen, Spender.
Besonders bevorzugt wird die mindestens eine weitere Zellpopulation aus demselben Haarfollikel gewonnen, aus dem die DP isoliert wurde. Es besteht die Möglichkeit, dass die KC, MC und/oder CTSF, nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im
erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Haarfollikel zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten KC, MC und/oder CTSF um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten KC, MC und/oder CTSF handeln.
Die mindestens eine weitere Zellpopulation kann in einem gleichen oder in einem
unterschiedlichen Verhältnis zu der de novo Papille anwesend sein. Vorzugsweise wird die de novo Papille mit KC, MC und/oder CTSF in einem Verhältnis von 1 -10:1 -50 co-kultiviert, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 1 -5:1 -40. Vorzugsweise wird die de novo Papille mit KC und MC co-kultiviert, bevorzugt in einem Verhältnis von 1 -10:1 -50:1 -50, bevorzugt in einem Verhältnis von 1 -5:1 -20:1 -20. Besonders bevorzugt wird die de novo Papille mit KC, MC und CTSF co-kultiviert, bevorzugt in einem Verhältnis von 1 -10:1 -50:1 - 50:1 -50. Dabei erfolgt vorzugsweise zuerst die Co-Kultivierung der de novo Papille mit den KC und MC, so dass die KC und MC eine Schicht um die de novo Papille ausbilden, und anschließend die Co-Kultivierung mit den CTSF. Durch die dadurch entstehende
Ummantelung mit CTSF werden Haarfollikel gebildet, mit denen eine verbesserte
Hautintegration erreicht werden kann.
Die Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren Zellpopulation findet für mindestens 10 min statt, bevorzugt für 20 min bis 3 Wochen, besonders bevorzugt für 30 min bis 24h, ganz besonders bevorzugt für 1 h bis 4h.
Die Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren Zellpopulation in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der Haarfollikel kann unter im Wesentlichen statischen Bedingungen oder unter Bewegung stattfinden. Vorzugsweise findet die Co-Kultivierung unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen statt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von
Haarfollikeln die Schritte: a) Bereitstellen von mindestens einer de novo Papille hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen; b)
Bereitstellen von KC und MC; und c) Co-Kultivierung der de novo Papille mit den KC und MC unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen. Dabei umfasst die de novo Papille bevorzugt DPF, CTSF und zusätzlich EZ und/oder SVF. Die de novo Papille ist vorzugsweise mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet. Vorzugsweise werden die de novo Papille, KC und MC in einem Verhältnis von 1 -10:1 -50:1 -50 co-kultiviert. Die Co- Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Die Co- Kultivierung kann vorzugsweise in einer zylindrischen Kavität stattfinden, welche bevorzugt einen Rundboden aufweist. Es ist möglich die Co-Kultivierung in Multiwell-Zellkulturgefäßen mit beispielsweise 96- oder 384-wells durchzuführen. Bevorzugt stammen sowohl die Zellen für die Herstellung der de novo Papille, als auch die KC und MC von einem Spender. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln die Schritte: a) Bereitstellen von mindestens einer de novo Papille hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen; b)
Bereitstellen von KC, MC und CTSF; und c) Co-Kultivierung der de novo Papille mit den KC, MC und CTSF unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen. Dabei umfasst die de novo Papille bevorzugt DPF, CTSF und zusätzlich EZ und/oder SVF. Die de novo Papille ist vorzugsweise mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet. Vorzugsweise werden die de novo Papille, KC, MC und CTSF in einem Verhältnis von 1 -10:1 -50:1 -50:1 -50 co-kultiviert. Die Co-Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Die Co-Kultivierung kann vorzugsweise in einer zylindrischen Kavität stattfinden, welche bevorzugt einen Rundboden aufweist. Es ist möglich die Co-Kultivierung in Multiwell- Zellkulturgefäßen mit beispielsweise 96- oder 384-wells durchzuführen. Bevorzugt stammen sowohl die Zellen für die Herstellung der de novo Papille, als auch die KC, MC und die CTSF von einem Spender.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem Haarfollikel, welche durch das
erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden.
Die de novo Papillen und/oder die Haarfollikel, welche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, können für die Herstellung eines Hautäquivalents verwendet werden. Vorzugsweise werden die Hautäquivalente auf Basis einer Hautmatrix hergestellt, wobei es sich bei der Hautmatrix beispielsweise um eine künstliche Hautmatrix wie z.B. Matriderm® oder um eine Spenderhaut handeln kann. In diese Hautmatrix werden
Insertionsstellen, z.B. in Form von Perforierungen, für die de novo Papillen und/oder die Haarfollikel eingebracht, beispielsweise mittels eines Stempels, Skalpells oder Lasers. Diese Insertionsstellen können in regelmäßigen oder in unregelmäßigen Abständen zueinander in die Hautmatrix eingebracht werden. Die de novo Papillen und/oder Haarfollikel werden in die Insertionsstellen der Hautmatrix eingebracht. Entsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Hautäquivalent, welches die de novo Papille und/oder die Haarfollikel, welche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, umfasst. Das Hautäquivalent kann zusätzlich eine oder mehrere Schichten aus KC und/oder MC umfassen, wobei diese Schicht/en vorzugsweise über die sich in der Hautmatrix befindlichen de novo Papillen und/oder Haarfollikel angelegt werden. Weiterhin kann das Hautäquivalent andere Zellen und/oder Zellstrukturen wie Immunzellen (dendritische Zellen, Lymphozyten, etc), neuronale Zellen, Talg- und Schweißdrüsenzellen/Gewebe, Muskelzellen/fasern, Gefäßstrukturen und weitere Zelltypen umfassen, die in natürlicher, gesunder oder kranker Haut enthalten sind. Die de novo Papillen und/oder die Haarfollikel, welche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, können für die Herstellung eines Implantats verwendet werden. Entsprechend bezieht sich vorliegenden Erfindung auch auf ein Implantat, welches die de novo Papillen und/oder die Haarfollikel, welche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, optional zusammen mit pharmazeutisch tolerierbaren
Adjuvantien umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Transplantat, welches eine effektive Menge des Hautäquivalents optional zusammen mit pharmazeutisch tolerierbaren
Adjuvantien umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der de novo Papille, der Haarfollikel, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, und/oder des Hautäquivalents umfassen die de novo Papillen und/oder Haarfollikel für die
therapeutische Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge. Für die
therapeutische Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge ist es bevorzugt, dass für die Herstellung der de novo Papillen und/oder Haarfollikel allogene Zellen verwendet werden, was bedeutet dass der Spender der verwendeten Zellen und der Empfänger der hergestellten de novo Papillen und/oder Haarfollikel der gleichen Art angehören, d.h. dass sowohl Spender als auch Empfänger beispielsweise Menschen sind. Besonders bevorzugt ist es für die therapeutische Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge, dass für die Herstellung der de novo Papillen und/oder Haarfollikel autologe Zellen verwendet werden, was bedeutet dass der Spender der verwendeten Zellen und der Empfänger der hergestellten de novo Papillen und/oder Haarfollikel identisch ist, beispielsweise also derselbe Mensch ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der erfindungsgemäßen de novo Papille, Haarfollikel und/oder Hautäquivalente zur in vitro Testung von haarwuchsregulierenden Substanzen.
Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung der erfindungsgemäßen de novo Papille, Haarfollikel und/oder Hautäquivalente zur in vitro Testung von Substanzen auf toxische Eigenschaften.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens. Dazu kann das Kit die/das erfindungsgemäße/n de novo Papillen, die
Haarfollikel, das Hautäquivalent, das Implantat und/oder das Transplantat umfassen, um beispielsweise die erfinderischen Verfahren zur Behandlung eines Zustandes von reduzierter
Haarmenge oder dem Screening von Substanzen durchzuführen. Gegebenenfalls kann das
Kit auch eine Gebrauchsanweisung zur Verwendung des Kits und/oder zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten. Ferner kann das Kit weitere Bestandteile zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten wie beispielsweise
Reaktionsgefäße, Filter, Lösungen und/oder andere Mittel.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines
Zustandes von reduzierter Haarmenge, wobei die/das erfindungsgemäße/n de novo Papille, Haarfollikel und/oder Hautäquivalente in die Haut eines Säugetiers eingebracht werden, welches diese Behandlung benötigt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum in vitro Screening von Substanzen mit haarwuchs-regulierenden Eigenschaften, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Probe der/des erfindungsgemäßen de novo Papille,
Haarfollikel und/oder Hautäquivalents; b) Aufteilen der entsprechenden Probe in Portionen; c) inkubieren mindestens einer Portion mit Substanzen, die getestet werden sollen; und d) Vergleichen der Parameter der Haareigenschaften in der Portion mit einer anderen Portion, die nicht mit den Substanzen inkubiert wurde
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und den dazugehörigen Figuren näher erläutert.
Figuren Figur 1 zeigt:
A) Eine Kopfhaut-Biopsie, die für eine FUT - Haartransplantation entnommen wurde aus der einzelne Haarfollikel zur Zellisolation präpariert werden können.
B) Einzelne Follikuläre Einheiten, die für eine FUE-Haartransplantation entnommen wurden. Aus dieser lassen sich die einzelnen Zelltypen ebenfalls isolieren.
C) Aus einer FU herauspräparierter proximaler Haarfollikel, der im folgenden
angeschnitten und diametral umgestülpt wird um CTS und DP (roter Kreis) freizulegen.
D) Proximaler Haarfollikel nach der Umstülpung und Entfernung der CTS mit DP. Es ist nur noch der Haarschaft mit dem umgebenden epithelialen Gewebe (KC, Mel) vorhanden. Der rote Kreis markiert die fehlende DP.
E) CTS Gewebehülle, die noch mit der DP verbunden ist und CTFS Zellen und
Endothelzellen beinhaltet.
F) Abgetrennte DP von der CTS für die weitere Zelldissoziation aus dem
Gewebeverbund. Figur 2 zeigt:
Eine mikroskopische Aufnahme einer Follikulären Einheit sowie eine illustrative
Zeichnung des schematischen Aufbaus einer Follikulären Einheit. Aus den jeweiligen Geweben können die für die de novo Papillen und In vitro Haarfollikel benötigten Zellen isoliert werden. Die FU besteht im Wesentlichen aus dem Haarschaft, der Epidermis, Dermis, Talgdrüse, Bindegewebsscheide (CTS; CTSF), Wurzelscheiden (ORS, IRS; KC), Schweißdrüse, Blutgefäße (Endothelzellen), Pigmenteinheit (Melanozyten), Dermale Papille (DPF) und dem Fettgewebe (Adipozyten; SVF).
Figur 3 zeigt:
A) Eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer Dermalen Papille nach der Umstülpung und Trennung von der CTS
B) Eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer de novo Papille generiert aus DPF und CTSF unter nichtadhärenten Zellkulturbedingungen
C) In vitro Haarfollikel bestehend aus einer de novo Papille und umliegenden
Keratinozyten und Melanozyten, die in einer nicht-adhärenten Rundbodenkavität einer Multiwell-Zellkulturplatte einen in v/'iro-Haarfollikel gebildet haben. Man kann deutlich die Polarisierung und die Differenzierung der die umgebende
Keratinozytenschichten beobachten. Außerdem kann man Pigmentablagerungen (dunkle Melaningranula) erkennen.
D) Kryostatgewebeschnitt eines in vitro Haarfollikels, der immunhistologisch mit einem Fluoreszenzmarker gegen das DP markierende Chondroitin4-Sulphat gefärbt wurde. Hier kann man eine deutliche Kompartimentierung der DP (de novo Papille) und den umliegenden epithelialen (KC) Zellen beobachten.
E) Kryostatgewebeschnitt eines in vitro Haarfollikels, der immunhistologisch mit einem Fluoreszenzmarker gegen das Melanozyten- markierende TRP1 -Protein gefärbt ist. Man kann eine gleichmäßige Verteilung der pigmentbildenden Melanozyten in den in in v/'iro-Haarfollikel- Kompartimenten erkennen.
F) Kryostatgewebeschnitt eines in v/'iro-Haarfollikels, der immunhistologisch mit einer Fluoreszenzmarker-Doppelfärbung gegen Keratin 15 (rot) und Keratin 10 (grün) angefärbt wurde. Hier kann man eine Differenzierung der die de novo Papille umgebenden Keratinozyten beobachten, die zum einen Stammzellcharakter (K15- Expression) aufweisen und in den umliegenden Schichten bereits weiter
ausdifferenziert (K10) sind. Beispiele
Beispiel 1
Isolation der verschiedenen Zelltvpen aus Haarfollikeln
Die Isolierung von DPF, CTSF, MC, KC aus dem humanen Haarfollikel erfolgt in modifizierter Form der Standardprotokolle (z.B. beschrieben in„Magerl et al."). Isolierte Haarfollikel aus Stanzbiopsien oder präparierte Haarfollikel aus einer FUT Haartransplantationen werden mit einer Pinzette am Haarschaft fixiert und die Bindegewebsscheide angeschnitten und diametral mit einer weiteren Pinzette vorsichtig voneinander getrennt, so dass der Bulbus umgestülpt wird und Dermale Papille und der Haarschaft mit der Haarmatrix freiliegen.
Dadurch können der proximale Teil des Bulbus mit den Bindegewebsscheiden-Fibroblasten und die Dermalen Papille sehr leicht mit Hilfe einer Nadel/Kanüle vom Rest des Haarfollikels getrennt werden. Auch der Haarschaft, der die ebenso benötigten Haarmatrix-Keratinozyten und Melanozyten beinhaltet wird dabei für die weitere Kultivierung optimal präpariert.
Die so extrahierten Dermalen Papillen und Bindegewebshüllen der entnommenen
Haarfollikel werden jeweils in einem separaten Gefäß mit Medium gesammelt. Mittels schonendem Gewebeaufschluss durch einen Gewebe-Dissoziierer und dem dazugehörigen Extractions-Kit (z.B. gentleMACS Dissociator # 130-093-235, whole skin dissociation kit #130-101 -540, Miltenyi Biotec) werden die DPF und CTSF aus dem Gewebeverband herausgelöst und vereinzelt. Hierzu werden jeweils die isolierten Gewebefragmente
(Dermale Papille, Bindegewebshülle und Haarschaft mit epithelialen / neuroektodermalen Zellen), 435 μΙ Puffer L, und ein Enzym-Mix aus 12,5 mg Enzym P und/oder 4.50 mg Enzym D und/oder 2,5 mg Enzym A in ein gentleMACS C-Tube gegeben und vorsichtig gemischt.
Die Probe wird in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1 -3 Stunden oder über Nacht Inkubiert, wobei längere Inkubationszeiten die Zellausbeute erhöhen. Nach der Inkubation wird die Probe durch Zugabe von 0,5 ml kaltem Zellkulturmedium verdünnt. Das C-Tube wird verschlossen und kopfstehend auf die Hülse des gentleMACS Dissociators befestigen.
Anschließend wird das das Programm„h_skin_01 " durchlaufen. Nach Beendigung des Programms, wird ein kurzer Zentrifugationsschritt angeschlossen, um das Probenmaterial am Boden zu sammeln. Die Zellen können mit frischem Medium gewaschen werden und die Zellsuspension durch 70 μηη -Filter separiert werden. Auf eine oben beschriebene
Hinzugabe von Enzymen, die bei einer direkten autologen Therapie unerwünscht sind, kann mit Hilfe weiterer Dissoziationsläufe verzichtet werden obwohl dann mit geringeren
Zellausbeuten gerechnet werden muss. Beispiel 2
Herstellung von Zellen einer stromalen vaskulären Fraktion (SVF)
Eine 1 Liter Fraktion einer tumeszenten Fettabsaugung aus subkutanen Bauch- oder Hüftfett, wird entnommen und z.B mit dem etablierten Verfahren PureGraft™ (Cytori GmbH, Schweiz) aufbereitet. Dabei wird zentrifugiert und konzentriert um die tumeszente Lösung zu entfernen. Anschließend wird für 60min bei 37°C in 0.15% (WA ) Collagenase NB 6 GMP Grade aus Clostridium histolyticum (0.12U/mg collagenase; SERVA Electrophoresis GmbH) verdünnt in Phosphat-gepufferter Saline (PBS; Gibco) verdaut. Nach der Zentrifugation bei 180 g für 10 Minuten, wird die lipidreiche Schicht verworfen und das Zellpellet einmal mit PBS gewaschen. Erytrozythen werden durch 2minütige Inkubation in Lysispuffer (0.15M Ammoniumchloride, Sigma-Aldrich) aufgelöst. Die gewonnene stromale vaskuläre Fraktion (SVF) wird in Komplettmedium (KM, Gibco) aufgenommen.
Beispiel 3
Herstellung von Zellen aus der äußeren Haarwurzelscheide (ORS KC)
Der entsprechende Bereich mit Kopf- oder Barthaaren wird gewaschen und desinfiziert (70% Ethanol) und jeweils 20-30 Haare mit einer mit Gummi beschichteten Pinzette gezupft. Nur die Haare mit einer anhaftenden Gewebeschicht werden in ein Gefäß überführt und in PBS gespült. Anschließend werden die Haare in 2ml Trypsin/EDTA Lösung bei 37°C für 20 Minuten inkubiert und darauffolgend kurz mit einem Schüttler gemischt. Die Enzymreaktion wird mit 4ml Trypsin-Inhibitor gestoppt. Es wird mit PBS gewaschen und die Suspension bei 200g für 5 Minuten zentrifugiert. Die Zellen können dann in Medium aufgenommen werden und für die weitere Kultivierung oder nach Zellzählung für die weitere in vitro Haarfollikel- Herstellung verwendet werden.
Beispiel 4
Herstellung von de novo Papillen
1500 DPF und CTSF Zellen werden in eine Kavität einer 384 ultra low attachment
Rundboden Multiwellplatte (Corning) pipettiert (in DMEM + 10% FCS und DermaLife-Medium im Verhältnis 1 :1 ) oder wahlweise vorher mit Zellen der SVF oder Endothelzellen gemischt und dann in die Kavitäten der Multiwellplatte überführt. Diese wird für 2 min bei 200g zentrifugiert und unter Rotationsbewegungen bei 20 Runden pro Minute für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für die längere Kultur wird täglich Medium gewechselt.
Beispiel 5
Herstellung von In vitro Haarfollikeln
Ein Gemisch aus Melanozyten und Keratinozyten, die bei der Gewebedissoziation von isolierten oder gezupften Haarschäften hervorgegangen sind werden in Zellkulturmedium aufgenommen und jeweils zu den de novo Papillen dazu pipettiert (15.000
Zellen/Multiwellkavität). Diese Suspension wird für 1 min bei 200g zentrifugiert und unter Rotationsbewegungen bei 20 Runden pro Minute für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für die längere Kultur wird täglich Medium gewechselt.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten Haarpapillenfibroblasten (DPF) aus zumindest einer Haarpapille (DP) aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von isolierten Bindegewebsfibroblasten (CTSF) aus mindestens einem Haafollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF mit den CTSF unter im Wesentlichen nicht- adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die DPF und die CTSF in einem Verhältnis von 1 - 20:1 -20 co-kultiviert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei bei der Co-Kultivierung in Schritt c)
zusätzlich Endothelzellen (EZ) und/oder Zellen von stromalen vaskulären Fraktionen (SVF) anwesend sind.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die de novo Papillen aus 2 bis 20000 Zellen bestehen, bevorzugt 10 bis 15000, besonders bevorzugt 1000 bis 10000, ganz besonders bevorzugt 1500 bis 5000.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die de novo Papillen mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Co-Kultivierung unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfindet.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Co-Kultivierung für mindestens 10 min stattfindet, bevorzugt für 20 min bis 48h.
8. De novo Papille hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von mindestens einer de novo Papille hergestellt nach einem
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7; b) Bereitstellen von mindestens einer weiteren Zellpopulation ausgewählt aus Keratinocyten (KC), Melanocyten (MC) oder Bindegewebsfibroblasten (CTSF); und c) Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren
Zellpopulation unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die de novo Papille mit KC, MC und/oder CTSF in einem Verhältnis von 1 -10:1 -50 co-kultiviert wird.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die mindestens eine weitere
Zellpopulation aus einem Haarfollikel gewonnen werden kann und/oder aus diesem gewonnen wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 1 1 , wobei die Co-Kultivierung für
mindestens 10 min stattfindet, bevorzugt für 20 min bis 48h.
13. Haarfollikel hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12.
14. Hautäquivalent umfassend die de novo Papille nach Anspruch 8 und/oder die
Haarfollikel nach Anspruch 13.
15. Transplantat umfassend eine effektive Menge an Hautäquivalent nach Anspruch 14, optional zusammen mit pharmazeutisch tolerierbaren Adjuvantien.
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