DE102015119880A1

DE102015119880A1 - Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln und de novo Papillen sowie deren Verwendung für in vitro Tests und in vivo Implantate

Info

Publication number: DE102015119880A1
Application number: DE102015119880.0A
Authority: DE
Inventors: Gerd Lindner
Original assignee: Technische Universitaet Berlin
Current assignee: Technische Universitaet Berlin
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2017-05-18
Anticipated expiration: 2035-11-18
Also published as: DE102015119880B4; JP7370613B2; AU2016357986A1; JP2018533960A; JP2022031757A; EP3377616A1; US20200255799A1; CN108473951A; US11174463B2; WO2017084999A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen, umfassend die Schritte a) Bereitstellen von isolierten Haarpapillenfibroblasten (DPF) aus zumindest einer Haarpapille (DP) aus mindestens einem Haarfollikel, b) Bereitstellen von isolierten Bindegewebsfibroblasten (CTSF) aus mindestens einem Haarfollikel und c) Co-Kultivierung der DPF mit den CTSF unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.

Description

Genetisch bedingter Haarausfall, auch bekannt unter der Bezeichnung androgenetische Alopezie, ist ein sehr weit verbreitetes psychoemotional belastendes Krankheitsbild mit erheblichen Auswirkungen auf die Leistungsfähigkeit der Betroffenen in unserer Gesellschaft. Als Ursache für den genetisch bedingten Haarausfall gilt eine Überempfindlichkeit der Haarfollikel gegen das Steroidhormon Dihydrotestosteron.
Neben der medikamentösen Behandlung der androgenetischen Alopezie besteht die Möglichkeit einer Haartransplantation, welche bisher immer noch die weitaus besten kosmetischen Ergebnisse erzielt. Dabei handelt es sich um eine Umverteilung von intakten androgen-insensitiven Haarfollikeln aus dem okzipitalen Nacken- oder lateralen Schläfenbereich in den Oberkopf bzw. den frontalen Glatzenbereich.
Auch wenn die Techniken der modernen Haartransplantation immer ausgefeilter und effizienter werden, sind jedoch insbesondere bei weit fortgeschrittenem Haarausfall naturgemäß nicht genügend Spenderhaare vorhanden um eine ausreichende, kosmetisch relevante Haardichte und somit ein zufriedenstellendes Behandlungsergebnis erzielen zu können. Für die Durchführung einer Haartransplantation sind geeignete Haartransplantate oder Zellen als Material nötig, welche dem Empfänger eingesetzt werden. Die Vervielfältigung der benötigten Zellen benötigt in der Regel mehrere Wochen. Des Weiteren muss die Vervielfältigung unter Reinraumbedingungen stattfinden, was das Produkt zu einem sogenannten ATMP (Advanced Therapeutic Medicinal Product) klassifiziert, welches außerordentlich hohe Entwicklungs- und Markteintrittshürden hat.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen oder mehrere Nachteile des Standes der Technik zu vermindern oder zu vermeiden. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem de novo Papillen bzw. Haarfollikel hergestellt werden können.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von de novo Papillen, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten Haarpapillenfibroblasten (DPF, Abkürzung für englisch dermal hair papilla fibroblasts) aus zumindest einer Haarpapille (DP, Abkürzung für englisch dermal papilla) aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von isolierten Bindegewebsfibroblasten (CTSF, Abkürzung für englisch connective tissue sheath fibroblasts) aus mindestens einem Haarfollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF mit den CTSF unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass de novo Papillen aus Mischungen aus zumindest DPF und CTSF hergestellt werden können. Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren kann im Vergleich zu im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Vervielfältigung von Haarfollikeln in kürzerer Zeit durchgeführt werden. Entsprechend ist es möglich innerhalb eines Tages Zellpopulationen aus Haarfollikeln zu gewinnen, mithilfe dieser Zellen de novo Papillen und/oder Haarfollikel in einer größeren Anzahl herzustellen und diese neu generierten de novo Papillen bzw. Haarfollikel in die zu behandelnde haarlose Kopfhaut zu implementieren, so dass an diesen Stellen wieder neue Haare gebildet werden können.
Soweit nachfolgend der Kontext nicht eindeutig etwas anderes ergibt, ist bei der Verwendung von Singular-Formen bzw. Plural-Formen stets sowohl die Ein- als auch die Mehrzahl umfasst.
Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich auf die Herstellung von de novo Papillen. Der Begriff „de novo Papille“, „Neopapille“ oder „Sphäroid“ werden synonym verwendet und bezeichnen ein im Wesentliches sphäroides Zellaggregat aus Haarpapillenfibroblasten (DPF) und Bindegewebsfibroblasten (CTSF). Die de novo Papille umfasst also eine Mischung aus zumindest DPF und CTSF. Die de novo Papillen bestehen aus ca. 2 bis 20000 Zellen, bevorzugt aus 10 bis 15000, besonders bevorzugt aus 500 bis 10000, ganz besonders bevorzugt aus 1000 bis 5000 Zellen. Vorzugsweise weist die de novo Papille zumindest die halbe Größe einer physiologischen Haarpapille (DP) eines Haarfollikels nach Isolierung derselben auf. Ebenfalls bevorzugt weist die de novo Papille die ungefähre Form einer physiologischen DP eines Haarfollikels nach Isolierung derselben auf.
Die de novo Papille kann eine Beschichtung umfassen, welche ein oder mehrere unterschiedliche extrazelluläre Matrixproteine wie beispielsweise Kollagen IV, Fibronektin und/oder Laminin enthält. Diese Beschichtung kann durch die DPF und CTSF selbst entstehen, während diese die de novo Papille ausbilden. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die de novo Papille auch während und/oder nach ihrer Formierung durch zusätzliche Zugabe von einem oder mehreren unterschiedlichen extrazellulären Matrixproteinen zum Kulturmedium beschichtet werden.
Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird in vitro durchgeführt. Als „in vitro“ wird jede Umgebung verstanden, die sich nicht innerhalb eines lebenden Organismus, z.B. einem menschlichen oder tierischen Körpers, befindet. Das erfindungsgemäße in vitro Nachweisverfahren umfasst also ausdrücklich kein Verfahren, welches am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden in einem ersten Verfahrensschritt a) isolierte Haarpapillenfibroblasten (DPF) aus zumindest einer Haarpapille (DP) bereitgestellt, wobei die DP aus mindestens einem Haarfollikel stammt.
Die Bereitstellung der DP aus dem Haarfollikel und die Isolierung der DPF aus der DP kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Isolierte Haarfollikel werden z.B. mit einer Pinzette am Haarschaft fixiert und die Bindegewebsscheide wird z.B. mit einer weiteren Pinzette diametral vom Haarschaft getrennt, so dass der Bulbus umgestülpt wird und somit die DPF und der Haarschaft mit der Haarmatrix freiliegen. Dadurch können die DP vom restlichen Teil des Haarfollikels getrennt werden was z.B. mithilfe einer Nadel oder Kanüle geschehen kann.
Anschließend werden die isolierten DP beispielsweise in ein Zellkulturgefäß überführt und mechanisch auf der Oberfläche des Zellkulturgefäßes fixiert. Vorzugsweise werden die DPF dadurch erhalten, dass die isolierte DP mechanisch am Boden des Zellkulturgefäßes arretiert wird, z.B. mittels einer Nadelspitze oder einem Skalpell. Die Morphologie der DP bleibt dabei in etwa erhalten, jedoch wird die Basallamina der DP leicht perforiert, so dass die DPF aus der DP migrieren können. Die DPF können auch mithilfe einer enzymatischen oder nicht-enzymatischen Trennung aus der DP erhalten werden.
Es besteht die Möglichkeit, dass die DPF nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten DPF um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten DPF handeln.
Die Haarfollikel, aus denen die DP und die DPF isoliert werden, stammen aus Gewebe. Dem Fachmann sind Verfahren zur Entnahme von Haarfollikeln aus Gewebe bekannt. Bevorzugt werden die Haarfollikel nach Standards guter medizinsicher Praxis aus dem Gewebe entnommen. Vorzugsweise erfolgt die Entnahme der Haarfollikel aus dem Gewebe derart, dass sie im Wesentlichen intakt, d.h. unbeschädigt, bleiben. Die Entnahme der Haarfollikel aus dem Gewebe kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: i) Abtrennung der Epidermis von der darunterliegenden Dermis bzw. Fettgewebe beim Gewebe, vorzugsweise unter Verwendung eines Skalpells; ii) Präparation von Haaren aus der Dermis bzw. dem Fettgewebe des Gewebes. Die entnommenen Haare umfassen an ihrem proximalen Ende die Haarfollikel. Optional kann vor Schritt ii) die Dermis bzw, das Fettgewebe komprimiert werden, damit die darin vorhandenen Haarfollikel leichter herauspräpariert werden können. Das Komprimieren kann dabei beispielsweise mithilfe einer Pinzette durchgeführt werden.
Vorzugsweise findet die Entnahme der Haarfollikel unter dem Mikroskop statt. Vorzugsweise werden die Haarfollikel aus Stanzbiopsien gewonnen, die aus bevorzugt einzelnen follikulären Einheiten (FE) bestehen. Eine Follikuläre Einheit ist die Bezeichnung für eine Gruppe von 1–4 Haarfollikeln, die räumlich dicht beieinander wachsen, durch eine Gewebskapsel umgeben und durch einen gemeinsamen Muskel bewegt wird (M. arrector pilli). Man gewinnt die follikulären Einheiten entweder durch Präparation unter einem Stereomikroskop aus einem vorher entnommenen Kopfhautstreifen oder exakter durch direkte Punktion der Kopfhaut mittels einer Hohlnadel. Letztere Methode nennt man Follicular Unit Extraction (FUE).
Das Gewebe aus dem die Haarfollikel, für z.B. die Isolation der DP bzw. DPF, gewonnen werden können stammt aus einem Säugetier. Dieses Säugetier kann ein Mensch, Affe, Schwein, Hund, Katze oder Nagetier sein, bevorzugt ein Mensch. Das Säugetier stellt also einen Spender für das, den Haarfollikel enthaltene, Gewebe dar. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Säugetier um einen menschlichen Patienten, der an Haarausfall leidet.
Das Gewebe umfasst bevorzugt Haut. Dabei kann das Gewebe aus jeder behaarten Körperregion gewonnen werden vorzugsweise aus Kopf, Brust, Augenbrauen, Bart, Genitalbereich, Bein oder anderen Körperregionen. Besonders bevorzugt wird das Gewebe aus einer Körperregion entnommen, die sich in der Nähe der vom Haarausfall betroffenen Körperstelle befindet. Betrifft beispielsweise der Haarausfall den Oberkopf, also den zwischen Stirn und Hinterkopf gelegenen Teil des Kopfes, so kann das Gewebe bevorzugt aus dem Nacken- oder Schläfenbereich des Kopfes entnommen werden. Vorzugsweise wird das Gewebe mittels einer Biopsie erhalten.
Bevor die Haarfollikel, für z.B. die Isolation der DP bzw. DPF, aus dem Gewebe entnommen werden, kann dieses Gewebe einem oder mehreren Reinigungsschritten unterzogen werden, um möglicherweise vorhandene störende Substanzen von dem Gewebe zu entfernen.
In Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden isolierte Bindegewebsfibroblasten (CTSF) aus mindestens einem Haarfollikel bereitgestellt.
Die Bereitstellung der CTSF aus dem Haarfollikel kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Isolierte Haarfollikel werden z.B. mit einer Pinzette am Haarschaft fixiert und die Bindegewebsscheide wird z.B. mit einer weiteren Pinzette diametral vom Haarschaft getrennt, so dass der Bulbus umgestülpt wird. Dadurch können der proximale Teil des Bulbus mit den CTSF vom restlichen Teil des Haarfollikels getrennt werden was z.B. mithilfe einer Nadel oder Kanüle geschehen kann.
Anschließend wird die isolierte Bindegewebsscheide beispielsweise in ein Zellkulturgefäß überführt und mechanisch auf der Oberfläche des Zellkulturgefäßes fixiert. Vorzugsweise werden die CTSF dadurch erhalten, dass die isolierte Bindegewebsscheide mechanisch am Boden des Zellkulturgefäßes arretiert wird, z.B. mittels einer Nadelspitze oder einem Skalpell. Die Morphologie der Bindegewebsscheide bleibt dabei in etwa erhalten, jedoch wird das Bindegewebe leicht perforiert, so dass die CTSF aus dem Bindegewebe migrieren können. Vorzugsweise können die CTSF auch mithilfe einer enzymatischen oder nicht-enzymatischen Trennung aus dem Bindegewebe erhalten werden.
Es besteht die Möglichkeit, dass die CTSF nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten CTSF um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten CTSF handeln.
Die Haarfollikel, aus denen die CTSF isoliert werden, stammen aus Gewebe. Dem Fachmann sind Verfahren zur Entnahme von Haarfollikeln aus Gewebe bekannt. Bevorzugt werden die Haarfollikel nach Standards guter medizinsicher Praxis aus dem Gewebe entnommen. Vorzugsweise erfolgt die Entnahme der Haarfollikel aus dem Gewebe derart, dass sie im Wesentlichen intakt, d.h. unbeschädigt, bleiben. Die Entnahme der Haarfollikel aus dem Gewebe kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: i) Abtrennung der Epidermis von der darunterliegenden Dermis bzw. Fettgewebe beim Gewebe, vorzugsweise unter Verwendung eines Skalpells; ii) Präparation von Haaren aus der Dermis bzw. dem Fettgewebe des Gewebes. Die entnommenen Haare umfassen an ihrem proximalen Ende die Haarfollikel. Optional kann vor Schritt ii) die Dermis bzw, das Fettgewebe komprimiert werden, damit die darin vorhandenen Haarfollikel leichter herauspräpariert werden können. Das Komprimieren kann dabei beispielsweise mithilfe einer Pinzette durchgeführt werden. Vorzugsweise findet die Entnahme der Haarfollikel unter dem Mikroskop statt.
Das Gewebe aus dem die Haarfollikel, für z.B. die Isolation der CTSF, gewonnen werden können stammt aus einem Säugetier. Dieses Säugetier kann ein Mensch, Affe, Schwein, Hund, Katze oder Nagetier sein, bevorzugt ein Mensch. Das Säugetier stellt also einen Spender für das, den Haarfollikel enthaltene, Gewebe dar. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Säugetier um einen menschlichen Patienten, der an Haarausfall leidet.
Das Gewebe umfasst bevorzugt Haut. Dabei kann das Gewebe aus jeder behaarten Körperregion gewonnen werden vorzugsweise aus Kopf, Brust, Augenbrauen, Bart, Genitalbereich, Bein oder anderen Körperregionen. Besonders bevorzugt wird das Gewebe aus einer Körperregion entnommen, die sich in der Nähe der vom Haarausfall betroffenen Körperstelle befindet. Betrifft beispielsweise der Haarausfall den Oberkopf, also den zwischen Stirn und Hinterkopf gelegenen Teil des Kopfes, so kann das Gewebe bevorzugt aus dem Nacken- oder Schläfenbereich des Kopfes entnommen werden. Vorzugsweise wird das Gewebe mittels einer Biopsie erhalten.
Bevor die Haarfollikel, für z.B. die Isolation der CTSF, aus dem Gewebe entnommen werden, kann dieses Gewebe einem oder mehreren Reinigungsschritten unterzogen werden, um möglicherweise vorhandene störende Substanzen von dem Gewebe zu entfernen.
Die DPF und CTSF werden also aus isolierten Haarfollikeln gewonnen. Dabei können die DPF und CTSF aus demselben Haarfollikel gewonnen werden. Die DPF und CTSF können aber auch aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen werden. Werden die DPF und CTSF aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen, können diese Haarfollikel aus dem gleichen Gewebe isoliert worden sein, beispielsweise aus einem Gewebe, welches z.B. aus dem Nackenbereich des Kopfes eines Spenders entnommen wurde. Werden die DPF und CTSF aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen, so können diese Haarfollikel auch aus verschiedenen Geweben isoliert worden sein, so dass beispielsweise eins der Gewebe z.B. aus dem Nackenbereich des Kopfes eines Spenders entnommen wurde und das andere Gewebe z.B. aus dem Bart eines Spenders. Es kann sich bei dem Spender um denselben Spender oder einen anderen Spender handeln. Sofern es sich um einen anderen Spender handelt, ist dieser vorzugsweise ein allogener Spender. Vorzugsweise handelt es sich um denselben, also autologen, Spender.
Im nachfolgenden Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Co-Kultivierung der DPF und CTSF unter im Wesentlichen nicht adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.
Unter dem Ausdruck “nicht-adhärente Zellkulturbedingungen” werden im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens Zellkulturbedingungen verstanden, bei denen die Zellen im Wesentlichen keinen direkten und/oder andauernden Kontakt zur Oberfläche des Zellkulturgefäßes haben. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Oberflächen des Zellkulturgefäßes aus einem Material bestehen und/oder eine anti-Adhäsionsbeschichtung aufweisen, welche/s die Zellanheftung reduziert oder im Wesentlichen verhindert. Geeignete Kulturgefäße und/oder Beschichtungen für diese Zellkulturgefäße sind dem Fachmann bekannt. Derartige nicht-adhärente Zellkulturgefäße können beispielsweise aus Glas oder Polystyrol gefertigt sein. Vorzugsweise sind die Oberflächen des Zellkulturgefäßes mit kontaktinhibierenden Materialien wie PTFE, poly-HEMA, Agarose oder Fluorocarbon-Lösungen beschichtet.
Unter die Definition der nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen fällt erfindungsgemäß ebenfalls die sogenannte Kultivierungsmethode des „Hängenden Tropfens“ („Hanging Drop“-Technologie), bei der sich die Zellen innerhalb eines Tropfens aus Nährmedium befinden. Die Oberflächenspannung der Flüssigkeit hält den Tropfen in hängender Position an der Oberfläche des Zellkulturgefäßes und umschließt die sich darin befindenden Zellen. Aufgrund der Schwerkraft sammeln sich die Zellen im unteren Teil des Tropfens und haben im Wesentlichen keinen direkten Kontakt zum Kulturgefäß. Innerhalb des Tropfens können sich die Zellen zu Sphäroiden formieren.
Durch die Co-Kultivierung der DPF und CTSF entstehen im Wesentlichen sphäroide Zellaggregate, die physiologischen DP hinsichtlich ihrer Form und Größe ähneln.
Die DPF und CTSF können in einem gleichen oder in einem unterschiedlichen Verhältnis co-kultiviert werden. Vorzugsweise werden die DPF und CTSF in einem Verhältnis von 1–20:1–20 co-kultiviert, bevorzugt 1–10:1–10, besonders bevorzugt 1–5:1–5, ganz besonders bevorzugt 1–2,5:1–2,5, insbesondere bevorzugt 1:1.
In einer Ausführungsform wird für die Co-Kultivierung der DPF und CTSF in Schritt c) eine 2Zellkonzentration von 2 bis 20000 DPF + CTSF/mm des Zellkulturgefäßes gewählt, bevorzugt 10 bis 15000, besonders bevorzugt 500 bis 10000, ganz besonders bevorzugt 1000 bis 5000.
Die Co-Kultivierung der DPF und CTSF findet in Zellkulturgefäßen statt wobei dem Fachmann geeignete Zellkulturgefäße bekannt sind. Bei diesen Zellkulturgefäßen kann es sich beispielsweise um kommerziell erhältliche Zellkulturplatten, -schalen oder -flaschen handeln. Die Zellkulturgefäße können ein oder mehrere Kavitäten aufweisen. Die Co-Kultivierung der DPF und CTSF findet vorzugsweise in einer Kavität eines Zellkulturgefäßes statt. Bei den Zellkultusgefäßen kann es sich um sogenannte Multiwellplatten mit mehr als einer Kavität handeln. Bevorzugt weisen die Zellkulturgefäße 2 bis 10000 Kavitäten auf, besonders bevorzugt 4 bis 1536, ganz besonders bevorzugt 6 bis 384.
Die Böden der Zellkulturgefäß-Kavitäten können eben oder uneben geformt sein. Vorzugsweise sind die Kavitätenböden als Rundbogen ausgeformt. Ebenfalls bevorzugt sind Kavitäten, die trichterförmig ausgeformt sind.
In einer Ausführungsform werden die DPF und CTSF vor deren Co-Kultivierung in Schritt c) mittels Zentrifugation am Boden der Zellkulturgefäße sedimentiert. Durch diese initiale Konzentrierung der DPF und CTSF am Boden des Zellkulturgefäßes wird eine schnellere Zellaggregatbildung erreicht.
Die Co-Kultivierung der DPF und CTSF findet für mindestens 1 min statt, bevorzugt für 10 min bis 14 Tage, besonders bevorzugt für 20 min bis 48h, ganz besonders bevorzugt für 30 min bis 24h, insbesondere bevorzugt für 1h bis 4h.
Vorzugsweise findet die Co-Kultivierung der DPF und CTSF in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Anwesenheit von Blutplasma und/oder Blutserum statt. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Blutplasma und/oder Blutserum um humanes Blutplasma und/oder Blutserum, bevorzugt um autologes Blutplasma und/oder Blutserum. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Blutplasma und/oder Blutserum um 1–100%iges Blutplasma bzw. Blutserum, bevorzugt um 15–75%iges, besonders bevorzugt um 30–50%iges.
Die Co-Kultivierung der DPF und CTSF in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann unter im Wesentlichen statischen Bedingungen oder unter Bewegung stattfinden. Vorzugsweise findet die Co-Kultivierung unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen statt.
Bei der Co-Kultivierung der DPF und CTSF in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens können zusätzlich noch weitere Zelltypen anwesend sein. Vorzugsweise sind bei der Co-Kultivierung zusätzlich Endothelzellen (EZ) und/oder Zellen von stromalen vaskulären Fraktionen (SVF) anwesend.
Methoden zur Gewinnung der EZ sind dem Fachmann bekannt. Die EZ können aus Blutgefäßen gewonnen werden, bevorzugt aus Blutgefäßen, welche sich an oder in Haarfollikeln befinden. Vorzugsweise werden die EZ aus einem humanen Spender gewonnen. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um autologe EZ. Es besteht die Möglichkeit, dass die EZ nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten EZ um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten EZ handeln. Durch das Vorhandensein von EZ bei der Co-Kultivierung der DPF mit den CTSF in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens entstehen de novo Papillen, welche DPF, CTSF und EZ umfassen. Derartige de novo Papillen, oder aus ihnen generierte Haarfollikel, können für die Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge in die Haut eines Säugetiers eingebracht werden. Solche de novo Papillen oder aus ihnen generierte Haarfollikel ermöglichen nach der Transplantation in die Haut eine beschleunigte Bildung von Blutgefäßen an den Papillen bzw. Haarfollikeln und somit eine verbesserte Bildungs- bzw. Anwuchsrate der daraus entstehenden Haare.
Methoden zur Gewinnung der SVF sind dem Fachmann bekannt. Die SVF können beispielsweise mittels Fettgewebsexzision oder Liposuktion gewonnen werden. Vorzugsweise wird die SVF aus einem humanen Spender gewonnen, besonders bevorzugt handelt es sich dabei um eine autologe SVF. Die SVF umfassen verschiedene Zellpopulationen wie Vorläufer von Fettzellen (Präadipozyten), Endothelzellen, endotheliale Muskelzellen, Fibroblasten, Makrophagen oder Blutzellen. Es besteht die Möglichkeit, dass bestimmte Bestandteile der SVF nach ihrer Gewinnung aus dem Spender aus der SVF entfernt werden, was durch einen oder mehrere Wasch-, Reinigungs- oder Isolierungsschritte erfolgen kann oder auch durch gezieltes Abtrennen oder Entfernen der Bestandteile. Ebenfalls ist es möglich, dass die SVF nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten SVF um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten SVF handeln. Durch die Anwesenheit der SVF bei der Co-Kultivierung in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine erhöhte bzw. schnellere Zellmultiplikation der DPF und CTSF erreicht und entsprechend die Bildung der de novo Papillen beschleunigt.
Die weiteren Zelltypen können in einem gleichen oder in einem unterschiedlichen Verhältnis zu den DPF und CTSF anwesend sein. Vorzugsweise werden die DPF, CTSF und EZ oder SVF in einem Verhältnis von 1–0:1–20:1–20 co-kultiviert, bevorzugt 1–10:1–10:1–10, besonders bevorzugt 1–5:1–5:1–5, ganz besonders bevorzugt 1–2,5:1–2,5:1–2,5, insbesondere bevorzugt 1:1:1. Werden die DPF und CTSF zusammen mit EZ und SVF kultiviert, so erfolgt die Co-Kultivierung vorzugsweise in einem Verhältnis von 1–20:1–20:1–20:1–20, bevorzugt 1–10:1–10:1–10:1–10, besonders bevorzugt 1–5:1–5:1–5:1–5, ganz besonders bevorzugt 1–2,5:1–2,5:1–2,5:1–2,5, insbesondere bevorzugt 1:1:1:1.
Während der Entstehung der de novo Papille bildet sich in der Regel eine Schicht aus extrazellulären Matrixproteinen in und/oder um das Zellaggregat aus, welche in der Regel von den DPF und/oder CTSF gebildet wird. Alternativ oder zusätzlich dazu besteht die Möglichkeit die de novo Papille während und/oder nach Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit extrazellulären Matrixproteinen zu beschichten. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass z.B. eine Zusammensetzung umfassend diese extrazellulären Matrixproteine zusätzlich zum Kulturmedium hinzugefügt wird, um die Entstehung dieser Papillenbeschichtung zu erleichtern und/oder zu beschleunigen. Ebenfalls ist es möglich, dass die de novo Papillen erst vom Kulturmedium abtrennt und dann mit einer Zusammensetzung umfassend diese extrazellulären Matrixproteine versetzt werden. Diese Zusammensetzung der hinzugefügten extrazellulären Matrixproteine umfasst bevorzugt Kollagen IV, Fibronectin und/oder Laminin. Vorzugsweise umfasst oder besteht diese Zusammensetzung der zusätzlich hinzugefügten extrazellulären Matrixproteine Kollagen IV, Fibronectin und Laminin, bevorzugt in einem Verhältnis von 2–6:0,5–2:0,5–2 Gewichtsteilen, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 3–5:0,5–1,5:0,5–1,5 Gewichtsteilen, ganz besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 4:1:1,15 Gewichtsteilen. Die Zusammensetzung der extrazellulären Matrixproteine kann auch in Kombination mit anderen Matrices eingesetzt werden. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung der extrazellulären Matrixproteine weiterhin andere Kollagene (wie z.B. Kollagen I, Kollagen 10 A1, Kollagen 18 A1), Glykosaminoglykane und/oder Proteoglykane, vorzugsweise Heparansulfate, Decorin, Keratansulfate, Biglykan, Aggrecan, Versican, Perlecan, Osteopontin, CD44v3 und/oder Syndecan.
Vorzugsweise wird die de novo Papille durch Zugabe von extrazellulären Matrixproteinen ins Zellkulturmedium mit diesen Matrixproteinen beschichtet. Die Beschichtung der de novo Papille mit den extrazellulären Matrixproteinen findet bevorzugt ebenfalls unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen statt. Die Beschichtung der de novo Papille findet für mindestens 1 min statt, bevorzugt für 10 min bis 14 Tage, besonders bevorzugt für 20 min bis 48 h, ganz besonders bevorzugt für 30 min bis 24 h, insbesondere bevorzugt für 1h bis 4h.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf de novo Papillen, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten DPF aus zumindest einer DP aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von CTSF aus mindestens einem Haarfollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF und CTSF und zusätzlich EZ unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten. Vorzugsweise werden die DPF, CTSF und EZ in einem Verhältnis von 1–20:1–20:1–20 co-kultiviert. Die de novo Papillen werden vorzugsweise durch Zugabe von extrazellulären Matrixproteinen ins Zellkulturmedium mit diesen Matrixproteinen beschichtet. Die Co-Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Die Co-Kultivierung kann vorzugsweise in einer zylindrischen Kavität stattfinden, welche bevorzugt einen Rundboden aufweist. Es ist möglich die Co-Kultivierung in Multiwell-Zellkulturgefäßen mit beispielsweise 96- oder 384-wells durchzuführen. Des Weiteren kann die Co-Kultivierung in Anwesenheit von Blutplasma und/oder Blutserum stattfinden. Bevorzugt stammen die DPF, CTSF und EZ von einem Spender.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten DPF aus zumindest einer DP aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von CTSF aus mindestens einem Haarfollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF und CTSF und zusätzlich SVF unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten. Vorzugsweise werden die DPF, CTSF und SVF in einem Verhältnis von 1–20:1–20:1–20 co-kultiviert. Die de novo Papillen werden vorzugsweise mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet. Die Co-Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Des Weiteren kann die Co-Kultivierung in Anwesenheit von Blutplasma und/oder Blutserum stattfinden. Bevorzugt stammen die DPF, CTSF und SVF von einem Spender.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten DPF aus zumindest einer DP aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von CTSF aus mindestens einem Haarfollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF, CTSF sowie zusätzlich EZ und SVF unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen. Vorzugsweise werden die DPF, CTSF, EZ und SVF in einem Verhältnis von 1–20:1–20:1–20:1–20 co-kultiviert. Die de novo Papillen werden vorzugsweise mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet. Die Co-Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Des Weiteren kann die Co-Kultivierung in Anwesenheit von Blutplasma und/oder Blutserum stattfinden. Bevorzugt stammen die DPF, CTSF, EZ und SVF von einem Spender.
Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von mindestens einer de novo Papille hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen; b) Bereitstellen von mindestens einer weiteren Zellpopulation ausgewählt aus Keratinocyten (KC), Melanocyten (MC) oder Bindegewebsfibroblasten (CTSF); und c) Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren Zellpopulation unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen.
Der mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte „Haarfollikel“ bezeichnet eine im Vergleich zu natürlichen Haarfollikeln unvollständige Follikel-Struktur, welche einen kondensierten Kern (Papille) aus Fibroblasten mesenchymalen Ursprungs und eine umhüllende äußere und/oder innere epitheliale Haarwurzelscheide umfassen kann allerdings ohne weitere Zelltypen oder Strukturen wie Muskel- oder Nervenzellen, Blutgefäße etc. zu enthalten, so dass der Haarfollikel eine verringerte Größe im Vergleich zu natürlichen Haarfollikeln aufweist. Ein Haarfollikel ist zusammengesetzt aus einer de novo Papille aus zumindest DPF und CTSF, welche stabil mit mindestens einer weiteren Zellpopulation ausgewählt aus Keratinocyten (KC), Melanocyten (MC) oder Fibroblasten, wie z.B. CTSF, bedeckt oder kolonisiert ist. Vorzugsweise ist ein Haarfollikel zusammengesetzt aus einer de novo Papille, welche stabil mit mindestens einer weiteren Zellpopulation ausgewählt aus KC, MC oder CTSF bedeckt oder kolonisiert ist, wobei die mindestens eine weitere Zellpopulation aus einem Haarfollikel gewonnen werden kann oder gewonnen wird. Der Haarfollikel weist eine dreidimensionale, gegebenenfalls räumlich begrenzte Form auf, welche dem dreidimensionalen Erscheinungsbild eines physiologischen Haarfollikels ähnelt. Die Haarfollikel können eine polare Struktur aufweisen, beispielsweise eine spitze Auswölbung auf einer Seite des Haarfollikel, die an Strukturen der frühen Morphogenese physiologischer Haarfollikel erinnern.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Haarfollikel wird in einem ersten Verfahrensschritt a) mindestens eine de novo Papille bereitgestellt, wobei die de novo Papille nach dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
In Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der Haarfollikel wird mindestens eine weitere Zellpopulation ausgewählt aus KC, MC oder CTSF bereitgestellt.
Im nachfolgenden Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der Haarfollikel erfolgt die Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren Zellpopulation ausgewählt aus Keratinocyten (KC), Melanocyten (MC) oder Bindegewebsfibroblasten (CTSF), unter im Wesentlichen nicht adhärenten Zellkulturbedingungen. Die KC, MC und/oder CTSF müssen dabei nicht von einem Haarfollikel stammen, sondern können aus anderen Säugetier-Geweben, wie z.B. Haut, gewonnen werden. Vorzugsweise kann die mindestens eine weitere Zellpopulation aus einem Haarfollikel gewonnen werden und/oder wird sie aus einem Haarfollikel gewonnen.
Dabei können die KC, MC und/oder CTSF aus demselben Haarfollikel gewonnen werden. Die KC, MC und/oder CTSF können aber auch aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen werden. Werden die KC, MC und/oder CTSF aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen, können diese Haarfollikel aus dem gleichen Gewebe isoliert worden sein, beispielsweise aus einem Gewebe, welches z.B. aus dem Nackenbereich des Kopfes eines Spenders entnommen wurde. Werden die KC, MC und/oder CTSF aus unterschiedlichen Haarfollikeln gewonnen, so können diese Haarfollikel auch aus verschiedenen Geweben isoliert worden sein, so dass beispielsweise eins der Gewebe z.B. aus dem Nackenbereich des Kopfes eines Spenders entnommen wurde und ein anderes Gewebe z.B. aus dem Bart eines Spenders. Im letzteren Fall kann es sich bei dem Spender um denselben Spender oder einen anderen Spender handeln. Sofern es sich um einen anderen Spender handelt, ist dieser vorzugsweise ein allogener Spender. Vorzugsweise handelt es sich um denselben, also autologen, Spender.
Besonders bevorzugt wird die mindestens eine weitere Zellpopulation aus demselben Haarfollikel gewonnen, aus dem die DP isoliert wurde. Es besteht die Möglichkeit, dass die KC, MC und/oder CTSF, nach ihrer Isolierung und vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Haarfollikel zwischenkultiviert werden, beispielsweise um sie zu vervielfältigen. Entsprechend kann es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten KC, MC und/oder CTSF um Nachkommen oder Klone der ursprünglich isolierten KC, MC und/oder CTSF handeln.
Die mindestens eine weitere Zellpopulation kann in einem gleichen oder in einem unterschiedlichen Verhältnis zu der de novo Papille anwesend sein. Vorzugsweise wird die de novo Papille mit KC, MC und/oder CTSF in einem Verhältnis von 1–10:1–50 co-kultiviert, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 1–5:1–40. Vorzugsweise wird die de novo Papille mit KC und MC co-kultiviert, bevorzugt in einem Verhältnis von 1–10:1–50:1–50, bevorzugt in einem Verhältnis von 1–5:1–20:1–20. Besonders bevorzugt wird die de novo Papille mit KC, MC und CTSF co-kultiviert, bevorzugt in einem Verhältnis von 1–10:1–50:1–50:1–50. Dabei erfolgt vorzugsweise zuerst die Co-Kultivierung der de novo Papille mit den KC und MC, so dass die KC und MC eine Schicht um die de novo Papille ausbilden, und anschließend die Co-Kultivierung mit den CTSF. Durch die dadurch entstehende Ummantelung mit CTSF werden Haarfollikel gebildet, mit denen eine verbesserte Hautintegration erreicht werden kann.
Die Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren Zellpopulation findet für mindestens 10 min statt, bevorzugt für 20 min bis 3 Wochen, besonders bevorzugt für 30 min bis 24h, ganz besonders bevorzugt für 1h bis 4h.
Die Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren Zellpopulation in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der Haarfollikel kann unter im Wesentlichen statischen Bedingungen oder unter Bewegung stattfinden. Vorzugsweise findet die Co-Kultivierung unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen statt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln die Schritte: a) Bereitstellen von mindestens einer de novo Papille hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen; b) Bereitstellen von KC und MC; und c) Co-Kultivierung der de novo Papille mit den KC und MC unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen. Dabei umfasst die de novo Papille bevorzugt DPF, CTSF und zusätzlich EZ und/oder SVF. Die de novo Papille ist vorzugsweise mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet. Vorzugsweise werden die de novo Papille, KC und MC in einem Verhältnis von 1–10:1–50:1–50 co-kultiviert. Die Co-Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Die Co-Kultivierung kann vorzugsweise in einer zylindrischen Kavität stattfinden, welche bevorzugt einen Rundboden aufweist. Es ist möglich die Co-Kultivierung in Multiwell-Zellkulturgefäßen mit beispielsweise 96- oder 384-wells durchzuführen. Bevorzugt stammen sowohl die Zellen für die Herstellung der de novo Papille, als auch die KC und MC von einem Spender.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln die Schritte: a) Bereitstellen von mindestens einer de novo Papille hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen; b) Bereitstellen von KC, MC und CTSF; und c) Co-Kultivierung der de novo Papille mit den KC, MC und CTSF unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen. Dabei umfasst die de novo Papille bevorzugt DPF, CTSF und zusätzlich EZ und/oder SVF. Die de novo Papille ist vorzugsweise mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet. Vorzugsweise werden die de novo Papille, KC, MC und CTSF in einem Verhältnis von 1–10:1–50:1–50:1–50 co-kultiviert. Die Co-Kultivierung kann unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfinden. Die Co-Kultivierung kann vorzugsweise in einer zylindrischen Kavität stattfinden, welche bevorzugt einen Rundboden aufweist. Es ist möglich die Co-Kultivierung in Multiwell-Zellkulturgefäßen mit beispielsweise 96- oder 384-wells durchzuführen. Bevorzugt stammen sowohl die Zellen für die Herstellung der de novo Papille, als auch die KC, MC und die CTSF von einem Spender.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem Haarfollikel, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden.
Die de novo Papillen und/oder die Haarfollikel, welche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, können für die Herstellung eines Hautäquivalents verwendet werden. Vorzugsweise werden die Hautäquivalente auf Basis einer Hautmatrix hergestellt, wobei es sich bei der Hautmatrix beispielsweise um eine künstliche Hautmatrix wie z.B. Matriderm^® oder um eine Spenderhaut handeln kann. In diese Hautmatrix werden Insertionsstellen, z.B. in Form von Perforierungen, für die de novo Papillen und/oder die Haarfollikel eingebracht, beispielsweise mittels eines Stempels, Skalpells oder Lasers. Diese Insertionsstellen können in regelmäßigen oder in unregelmäßigen Abständen zueinander in die Hautmatrix eingebracht werden. Die de novo Papillen und/oder Haarfollikel werden in die Insertionsstellen der Hautmatrix eingebracht. Entsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Hautäquivalent, welches die de novo Papille und/oder die Haarfollikel, welche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, umfasst. Das Hautäquivalent kann zusätzlich eine oder mehrere Schichten aus KC und/oder MC umfassen, wobei diese Schicht/en vorzugsweise über die sich in der Hautmatrix befindlichen de novo Papillen und/oder Haarfollikel angelegt werden. Weiterhin kann das Hautäquivalent andere Zellen und/oder Zellstrukturen wie Immunzellen (dendritische Zellen, Lymphozyten, etc), neuronale Zellen, Talg- und Schweißdrüsenzellen/Gewebe, Muskelzellen/fasern, Gefäßstrukturen und weitere Zelltypen umfassen, die in natürlicher, gesunder oder kranker Haut enthalten sind.
Die de novo Papillen und/oder die Haarfollikel, welche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, können für die Herstellung eines Implantats verwendet werden. Entsprechend bezieht sich vorliegenden Erfindung auch auf ein Implantat, welches die de novo Papillen und/oder die Haarfollikel, welche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, optional zusammen mit pharmazeutisch tolerierbaren Adjuvantien umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Transplantat, welches eine effektive Menge des Hautäquivalents optional zusammen mit pharmazeutisch tolerierbaren Adjuvantien umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der de novo Papille, der Haarfollikel, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, und/oder des Hautäquivalents umfassen die de novo Papillen und/oder Haarfollikel für die therapeutische Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge. Für die therapeutische Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge ist es bevorzugt, dass für die Herstellung der de novo Papillen und/oder Haarfollikel allogene Zellen verwendet werden, was bedeutet dass der Spender der verwendeten Zellen und der Empfänger der hergestellten de novo Papillen und/oder Haarfollikel der gleichen Art angehören, d.h. dass sowohl Spender als auch Empfänger beispielsweise Menschen sind. Besonders bevorzugt ist es für die therapeutische Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge, dass für die Herstellung der de novo Papillen und/oder Haarfollikel autologe Zellen verwendet werden, was bedeutet dass der Spender der verwendeten Zellen und der Empfänger der hergestellten de novo Papillen und/oder Haarfollikel identisch ist, beispielsweise also derselbe Mensch ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der erfindungsgemäßen de novo Papille, Haarfollikel und/oder Hautäquivalente zur in vitro Testung von haarwuchs-regulierenden Substanzen.
Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung der erfindungsgemäßen de novo Papille, Haarfollikel und/oder Hautäquivalente zur in vitro Testung von Substanzen auf toxische Eigenschaften.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dazu kann das Kit die/das erfindungsgemäße/n de novo Papillen, die Haarfollikel, das Hautäquivalent, das Implantat und/oder das Transplantat umfassen, um beispielsweise die erfinderischen Verfahren zur Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge oder dem Screening von Substanzen durchzuführen. Gegebenenfalls kann das Kit auch eine Gebrauchsanweisung zur Verwendung des Kits und/oder zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten. Ferner kann das Kit weitere Bestandteile zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten wie beispielsweise Reaktionsgefäße, Filter, Lösungen und/oder andere Mittel.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Zustandes von reduzierter Haarmenge, wobei die/das erfindungsgemäße/n de novo Papille, Haarfollikel und/oder Hautäquivalente in die Haut eines Säugetiers eingebracht werden, welches diese Behandlung benötigt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum in vitro Screening von Substanzen mit haarwuchs-regulierenden Eigenschaften, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Probe der/des erfindungsgemäßen de novo Papille, Haarfollikel und/oder Hautäquivalents; b) Aufteilen der entsprechenden Probe in Portionen; c) inkubieren mindestens einer Portion mit Substanzen, die getestet werden sollen; und d) Vergleichen der Parameter der Haareigenschaften in der Portion mit einer anderen Portion, die nicht mit den Substanzen inkubiert wurde
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und den dazugehörigen Figuren näher erläutert.
Figuren
1 zeigt:

A) Eine Kopfhaut-Biopsie, die für eine FUT-Haartransplantation entnommen wurde aus der einzelne Haarfollikel zur Zellisolation präpariert werden können.
B) Einzelne Follikuläre Einheiten, die für eine FUE-Haartransplantation entnommen wurden. Aus dieser lassen sich die einzelnen Zelltypen ebenfalls isolieren.
C) Aus einer FU herauspräparierter proximaler Haarfollikel, der im folgenden angeschnitten und diametral umgestülpt wird um CTS und DP (roter Kreis) freizulegen.
D) Proximaler Haarfollikel nach der Umstülpung und Entfernung der CTS mit DP. Es ist nur noch der Haarschaft mit dem umgebenden epithelialen Gewebe (KC, Mel) vorhanden. Der rote Kreis markiert die fehlende DP.
E) CTS Gewebehülle, die noch mit der DP verbunden ist und CTFS Zellen und Endothelzellen beinhaltet.
F) Abgetrennte DP von der CTS für die weitere Zelldissoziation aus dem Gewebeverbund.

2 zeigt:
Eine mikroskopische Aufnahme einer Follikulären Einheit sowie eine illustrative Zeichnung des schematischen Aufbaus einer Follikulären Einheit. Aus den jeweiligen Geweben können die für die de novo Papillen und In vitro Haarfollikel benötigten Zellen isoliert werden. Die FU besteht im Wesentlichen aus dem Haarschaft, der Epidermis, Dermis, Talgdrüse, Bindegewebsscheide (CTS; CTSF), Wurzelscheiden (ORS, IRS; KC), Schweißdrüse, Blutgefäße (Endothelzellen), Pigmenteinheit (Melanozyten), Dermale Papille (DPF) und dem Fettgewebe (Adipozyten; SVF).
3 zeigt:

A) Eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer Dermalen Papille nach der Umstülpung und Trennung von der CTS
B) Eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer de novo Papille generiert aus DPF und CTSF unter nichtadhärenten Zellkulturbedingungen
C) In vitro Haarfollikel bestehend aus einer de novo Papille und umliegenden Keratinozyten und Melanozyten, die in einer nicht-adhärenten Rundbodenkavität einer Multiwell-Zellkulturplatte einen in vitro-Haarfollikel gebildet haben. Man kann deutlich die Polarisierung und die Differenzierung der die umgebende Keratinozytenschichten beobachten. Außerdem kann man Pigmentablagerungen (dunkle Melaningranula) erkennen.
D) Kryostatgewebeschnitt eines in vitro Haarfollikels, der immunhistologisch mit einem Fluoreszenzmarker gegen das DP markierende Chondroitin4-Sulphat gefärbt wurde. Hier kann man eine deutliche Kompartimentierung der DP (de novo Papille) und den umliegenden epithelialen (KC) Zellen beobachten.
E) Kryostatgewebeschnitt eines in vitro Haarfollikels, der immunhistologisch mit einem Fluoreszenzmarker gegen das Melanozyten-markierende TRP1-Protein gefärbt ist. Man kann eine gleichmäßige Verteilung der pigmentbildenden Melanozyten in den in in vitro-Haarfollikel-Kompartimenten erkennen.
F) Kryostatgewebeschnitt eines in vitro-Haarfollikels, der immunhistologisch mit einer Fluoreszenzmarker-Doppelfärbung gegen Keratin 15 (rot) und Keratin 10 (grün) angefärbt wurde. Hier kann man eine Differenzierung der die de novo Papille umgebenden Keratinozyten beobachten, die zum einen Stammzellcharakter (K15-Expression) aufweisen und in den umliegenden Schichten bereits weiter ausdifferenziert (K10) sind.

Beispiele
Beispiel 1
Isolation der verschiedenen Zelltypen aus Haarfollikeln
Die Isolierung von DPF, CTSF, MC, KC aus dem humanen Haarfollikel erfolgt in modifizierter Form der Standardprotokolle (z.B. beschrieben in „Magerl et al.“). Isolierte Haarfollikel aus Stanzbiopsien oder präparierte Haarfollikel aus einer FUT Haartransplantationen werden mit einer Pinzette am Haarschaft fixiert und die Bindegewebsscheide angeschnitten und diametral mit einer weiteren Pinzette vorsichtig voneinander getrennt, so dass der Bulbus umgestülpt wird und Dermale Papille und der Haarschaft mit der Haarmatrix freiliegen. Dadurch können der proximale Teil des Bulbus mit den Bindegewebsscheiden-Fibroblasten und die Dermalen Papille sehr leicht mit Hilfe einer Nadel/Kanüle vom Rest des Haarfollikels getrennt werden. Auch der Haarschaft, der die ebenso benötigten Haarmatrix-Keratinozyten und Melanozyten beinhaltet wird dabei für die weitere Kultivierung optimal präpariert.
Die so extrahierten Dermalen Papillen und Bindegewebshüllen der entnommenen Haarfollikel werden jeweils in einem separaten Gefäß mit Medium gesammelt. Mittels schonendem Gewebeaufschluss durch einen Gewebe-Dissoziierer und dem dazugehörigen Extractions-Kit (z.B. gentleMACS Dissociator #130-093-235, whole skin dissociation kit #130-101-540, Miltenyi Biotec) werden die DPF und CTSF aus dem Gewebeverband herausgelöst und vereinzelt. Hierzu werden jeweils die isolierten Gewebefragmente (Dermale Papille, Bindegewebshülle und Haarschaft mit epithelialen / neuroektodermalen Zellen), 435 µl Puffer L, und ein Enzym-Mix aus 12,5 mg Enzym P und/oder 4.50 mg Enzym D und/oder 2,5 mg Enzym A in ein gentleMACS C-Tube gegeben und vorsichtig gemischt.
Die Probe wird in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1–3 Stunden oder über Nacht Inkubiert, wobei längere Inkubationszeiten die Zellausbeute erhöhen. Nach der Inkubation wird die Probe durch Zugabe von 0,5 ml kaltem Zellkulturmedium verdünnt. Das C-Tube wird verschlossen und kopfstehend auf die Hülse des gentleMACS Dissociators befestigen. Anschließend wird das das Programm „h_skin_01“ durchlaufen. Nach Beendigung des Programms, wird ein kurzer Zentrifugationsschritt angeschlossen, um das Probenmaterial am Boden zu sammeln. Die Zellen können mit frischem Medium gewaschen werden und die Zellsuspension durch 70 µm – Filter separiert werden. Auf eine oben beschriebene Hinzugabe von Enzymen, die bei einer direkten autologen Therapie unerwünscht sind, kann mit Hilfe weiterer Dissoziationsläufe verzichtet werden obwohl dann mit geringeren Zellausbeuten gerechnet werden muss.
Beispiel 2
Herstellung von Zellen einer stromalen vaskulären Fraktion (SVF)
Eine 1 Liter Fraktion einer tumeszenten Fettabsaugung aus subkutanen Bauch- oder Hüftfett, wird entnommen und z.B mit dem etablierten Verfahren PureGraft^TM (Cytori GmbH, Schweiz) aufbereitet. Dabei wird zentrifugiert und konzentriert um die tumeszente Lösung zu entfernen. Anschließend wird für 60min bei 37°C in 0.15% (W/V) Collagenase NB 6 GMP Grade aus Clostridium histolyticum (0.12U/mg collagenase; SERVA Electrophoresis GmbH) verdünnt in Phosphat-gepufferter Saline (PBS; Gibco) verdaut. Nach der Zentrifugation bei 180 g für 10 Minuten, wird die lipidreiche Schicht verworfen und das Zellpellet einmal mit PBS gewaschen. Erytrozythen werden durch 2minütige Inkubation in Lysispuffer (0.15M Ammoniumchloride, Sigma-Aldrich) aufgelöst. Die gewonnene stromale vaskuläre Fraktion (SVF) wird in Komplettmedium (KM, Gibco) aufgenommen.
Beispiel 3
Herstellung von Zellen aus der äußeren Haarwurzelscheide (ORS KC)
Der entsprechende Bereich mit Kopf- oder Barthaaren wird gewaschen und desinfiziert (70% Ethanol) und jeweils 20–30 Haare mit einer mit Gummi beschichteten Pinzette gezupft. Nur die Haare mit einer anhaftenden Gewebeschicht werden in ein Gefäß überführt und in PBS gespült. Anschließend werden die Haare in 2ml Trypsin/EDTA Lösung bei 37°C für 20 Minuten inkubiert und darauffolgend kurz mit einem Schüttler gemischt. Die Enzymreaktion wird mit 4ml Trypsin-Inhibitor gestoppt. Es wird mit PBS gewaschen und die Suspension bei 200g für 5 Minuten zentrifugiert. Die Zellen können dann in Medium aufgenommen werden und für die weitere Kultivierung oder nach Zellzählung für die weitere in vitro Haarfollikel-Herstellung verwendet werden.
Beispiel 4
Herstellung von de novo Papillen
1500 DPF und CTSF Zellen werden in eine Kavität einer 384 ultra low attachment Rundboden Multiwellplatte (Corning) pipettiert (in DMEM + 10% FCS und DermaLife-Medium im Verhältnis 1:1) oder wahlweise vorher mit Zellen der SVF oder Endothelzellen gemischt und dann in die Kavitäten der Multiwellplatte überführt. Diese wird für 2 min bei 200g zentrifugiert und unter Rotationsbewegungen bei 20 Runden pro Minute für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für die längere Kultur wird täglich Medium gewechselt.
Beispiel 5
Herstellung von In vitro Haarfollikeln
Ein Gemisch aus Melanozyten und Keratinozyten, die bei der Gewebedissoziation von isolierten oder gezupften Haarschäften hervorgegangen sind werden in Zellkulturmedium aufgenommen und jeweils zu den de novo Papillen dazu pipettiert (15.000 Zellen/Multiwellkavität). Diese Suspension wird für 1 min bei 200g zentrifugiert und unter Rotationsbewegungen bei 20 Runden pro Minute für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für die längere Kultur wird täglich Medium gewechselt.

Claims

Verfahren zur Herstellung von de novo Papillen, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von isolierten Haarpapillenfibroblasten (DPF) aus zumindest einer Haarpapille (DP) aus mindestens einem Haarfollikel; b) Bereitstellen von isolierten Bindegewebsfibroblasten (CTSF) aus mindestens einem Haafollikel; und c) Co-Kultivierung der DPF mit den CTSF unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen zur Bildung von sphäroiden Zellaggregaten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DPF und die CTSF in einem Verhältnis von 1–20:1–20 co-kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei bei der Co-Kultivierung in Schritt c) zusätzlich Endothelzellen (EZ) und/oder Zellen von stromalen vaskulären Fraktionen (SVF) anwesend sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die de novo Papillen aus 2 bis 20000 Zellen bestehen, bevorzugt 10 bis 15000, besonders bevorzugt 1000 bis 10000, ganz besonders bevorzugt 1500 bis 5000.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die de novo Papillen mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Co-Kultivierung unter Rotations-, Schwenk- oder Schüttelbewegungen stattfindet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Co-Kultivierung für mindestens 10 min stattfindet, bevorzugt für 20 min bis 48h.
De novo Papille hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Verfahren zur Herstellung von Haarfollikeln, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von mindestens einer de novo Papille hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7; b) Bereitstellen von mindestens einer weiteren Zellpopulation ausgewählt aus Keratinocyten (KC), Melanocyten (MC) oder Bindegewebsfibroblasten (CTSF); und c) Co-Kultivierung der de novo Papille mit der mindestens einen weiteren Zellpopulation unter im Wesentlichen nicht-adhärenten Zellkulturbedingungen.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die de novo Papille mit KC, MC und/oder CTSF in einem Verhältnis von 1–10:1–50 co-kultiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die mindestens eine weitere Zellpopulation aus einem Haarfollikel gewonnen werden kann und/oder aus diesem gewonnen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Co-Kultivierung für mindestens 10 min stattfindet, bevorzugt für 20 min bis 48h.
Haarfollikel hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12.
Hautäquivalent umfassend die de novo Papille nach Anspruch 8 und/oder die Haarfollikel nach Anspruch 13.
Transplantat umfassend eine effektive Menge an Hautäquivalent nach Anspruch 14, optional zusammen mit pharmazeutisch tolerierbaren Adjuvantien.