KR20190017173A

KR20190017173A - 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20190017173A
Application number: KR1020170101578A
Authority: KR
Inventors: 조은경; 최서연; 이태룡; 고용송; 김새롬; 홍가혜
Original assignee: (주)아모레퍼시픽; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2019-02-20
Also published as: KR101998103B1

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 중간엽 줄기세포를 나노입경을 갖는 나노베지클을 대량생산하여 탈모 방지 또는 발모 촉진하는 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

Description

중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물{Composition for prevention of hair loss or promotion of hair growth, including nanovesicle from mesenchymal stem cells}

본 발명은 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 중간엽 줄기세포를 나노입경을 갖는 나노베지클을 대량생산하여 탈모 방지 또는 발모 촉진하는 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것 이다.

최근 사회적 스트레스의 증가와 더불어 환경오염 및 인스턴트 식품 등 서구화된 식습관, 잦은 파마와 염색 등으로 인하여 탈모 인구가 점차 증가하고 있다. 모발의 주기는 모발을 성장시키는 성장기(anagen), 성장을 종료하고 모구부가 축소하는 시기인 퇴화기(catagen), 모유두가 활동을 멈추고 모발을 두피에 머무르게 하는 시기인 휴지기(talogen), 모유두가 활동을 시작하거나 또는 새로운 모발을 발생시켜 오래된 모발을 탈모시키는 시기인 발생기로 나눌 수 있다.

성장기(anagen stage; 2~7년)는 모발이 성장하는 기간으로, 다시 모발이 모구로부터 모포로 나가려는 모발 생성 단계와 딱딱한 케라틴이 모낭 안에서 만들어지는 단계로 나누어진다. 모발은 퇴행기까지 자가성장을 계속한다. 퇴행기(catagen stage; 2~3주)는 성장기가 끝나고, 모발의 형태를 유지하면서 대사과정이 느려지는 시기로, 이 단계에서는 케라틴을 만들어내지 않는다. 퇴화기는 전체 모발의 1%를 차지한다. 이때 모구부가 수축하여 모유두로 나눠지며 모낭에 둘러싸여 위쪽으로 올라가고, 세포분열은 정지상태이다. 휴지기(talogen stage; 3개월)는 모유두가 위축되고 모낭이 차츰 쪼그라들며, 모근이 위쪽으로 밀려 올라가 빠진다. 모발이 없어지는 시기로서 다음 성장기 단계가 시작될 때까지의 수명은 3~4개월이다.

정상인 사람이 성장기 상태의 모발이 많은데 비해 탈모증(alopecia)인 사람은 휴지기 상태의 모발이 많아 눈으로 보이는 탈모현상이 나타내게 된다. 탈모가 진행될수록 성장기의 기간이 짧아지고 이로 인해 모발은 점점 소형화된다. 따라서, 탈모의 치료를 위해서는 휴지기 상태의 모낭을 성장기로 빨리갈 수 있도록 하고, 짧아진 성장기를 늘려주는 것이 중요하다.

한편, 대부분의 동물 세포는 다양한 크기와 성분을 갖는 세포 내 기원의 세포외 소낭(extracellular vesicle)을 분비할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이러한 세포외 소낭은 혈액, 소변, 타액 및 세포 배양액을 포함하는 모든 생물학적 유체(biological fluids)에서 발견된다(Loyer X, Vion AC, Tedgui A, Boulanger CM. Microvesicles as cell-cell messengers in cardiovascular diseases. Circ Res 2014;114:345-53)(Ohno S, Ishikawa A, Kuroda M. Roles of exosomes and microvesicles in disease pathogenesis. Adv Drug Deliv Rev 2013;65:398-401).

세포외 소낭은 작게는 직경 약 20 nm부터 크게는 직경 약 5 ㎛의 크기를 갖는 막 구조 소낭체로서, 그 크기와 구성에서 이질성이 있고, 엑소좀(exosome, 약 30~100 nm), 엑토좀(ectosome), 마이크로소낭(microvesicle, 약 100~1,000 nm), 마이크로입자(microparticle) 등의 다수의 상이한 종을 포함한다.

상기 세포외 소낭의 상이한 유형은 이의 기원, 직경, 수크로즈에서의 밀도, 형상, 침강 속도, 지질 조성물, 단백질 마커 또는 분비 방식(즉, 신호(유도성)에 의한 것인지 자발적(구성적)인 것인지) 등에 기초하여 구별된다. 예컨대, 마이크로소낭은 약 100 내지 1,000 nm의 불규칙한 형상을 갖는 막 소낭으로서 원형질막 바깥쪽을 향하여 출아(원형질막에서 기원)되며, 인테그린, 셀렉틴, CD40 리간드를 포함하는 마커, 포스파티딜세린을 포함하는 지질을 갖는 것으로 알려져 있다. 한편, 엑소좀은 약 30 내지 100 nm(<200 nm)의 컵 형상을 갖는 가장 작은 막 소낭으로서 후기 엔도좀의 안쪽에서 출아(엔도좀에서 기원)되며, CD63, CD9의 테트라스파닌, TSG101, ESCRT을 포함하는 마커, 콜레스테롤, 스핑고미엘린, 세라마이드, 포스파티딜세린을 포함하는 지질을 갖는 것으로 알려져 있다.

세포외 소낭은 분비하는 기원 세포(공여 세포)의 상태를 반영하며, 어떤 세포에서 분비되었는가에 따라 다양한 생물학적 활성을 나타내고, 세포들 사이에 유전 물질과 단백질을 옮기면서 세포 간 상호작용에 중요한 역할을 한다.

이에 따라, 세포외 소낭을 이용하여 치료 및 약학적 조성물로 사용하기 위한 연구가 활발히 진행중이다.

예로써, 세포외 소낭을 이용한 발모촉진 또는 탈모방지에 관한 종래기술로 미국특허공보 US2015-0024011호에는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MCS)와 같은 줄기세포로부터 유래된 엑소좀을 이용하여 사람의 육모를 촉진시키는 용도에 관하여 기재하고 있으며, 대한민국 공개특허 2016-0076654호에는 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 엑소좀을 유효성분으로 하는 세포노화 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개시하고 있다.

그러나, 상기 상술한 종래기술은 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 수득하는하는 것으로, 엑소좀의 양이 매우 적어 대량생산하는 것이 불가능하고, 이를 얻기 위해서는 수차례 반복하거나 수일에 걸쳐 줄기세포로부터 엑소좀을 수득하는 공정이 필요하다. 이로써, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀과 동일한 구조를 가지면서 발모촉진 또는 탈모방지 효과를 나타내고 또한 대량생산이 가능한 나노베지클의 개발이 필요하다.

미국특허공보 US2015-0024011호 (Use of exosomes to promote or enhance hair growth) 대한민국 공개특허 2016-0076654호 (엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 치료용 약학조성물)

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또한 발모 촉진용 조성물을 제조하였으며, 이러한 조성물이 종래의 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함한 조성물에 비해 생산효율이 높고, 대량생산이 가능할 뿐만 아니라 탈모 방지 또는 발모 촉진 효과가 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 대량생산이 가능하면서 탈모 방지 또는 발모 촉진효과가 우수한 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또한 발모 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따르면 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 나노베지클의 평균 입경크기가 30 내지 100nm일 수 있다.

상기 나노베지클의 농도는 28ng/ml 내지 9㎍/ml일 수 있다.

상기 나노베지클의 입자 PDI(polydispersity index)는 0.01 내지 0.5 일 수 있다.

상기 나노베지클은 모유두 세포(dermal papilla cell, DP)를 활성화하여 모발 성장을 유도할 수 있다.

상기 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 경피투여, 피하주사 또는 피부외용 제형일 수 있다.

상기 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 용액, 크림, 로션, 샴푸, 헤어토닉, 스프레이, 및 겔 중에서 선택된 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 1) 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; 2) 배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포를 침전시키는 단계; 3) 침전된 중간엽 줄기세포를 인산완충용액(phosphate buffered saline)에 재부유(resuspension)하여 중간엽 줄기세포 용액을 수득하는 단계; 4) 상기 중간엽 줄기세포 용액을 여과시키는 단계; 및 5) 상기 중간엽 줄기세포 용액을 밀도구배 초원심분리하여 나노베지클을 수득하는 단계에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 나노베지클의 평균 입경크기가 30 내지 100nm일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 4) 단계에서 10㎛, 5㎛ 및 1㎛ 막 여과기(membrane filter)를 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 중간엽 줄기세포(mesencymal stem cell) 유래 나노베지클을 포함함으로써, 새로운 모발을 생성하는 발모 기능, 또는 상기 발모를 촉진시키는 기능뿐만 아니라 두피에서 모발이 탈락되는 현상을 방지할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 단순한 제조방법을 통해 탈모 방지 또는 발모 촉진을 유도하는 나노베지클을 대량생산이 가능하다.

도 1a는 전자현미경(transmission electron microscope, TEM)을 이용하여 얻은 실시예의 나노베지클의 이미지이며, b는 실시예의 나노베지클에 대한 동적 광산란 입도 분석 곡선 이다.
도 2는 실시예의 나노베지클에 의한 모유두 세포 생존능력 평가에 대한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예의 나노베지클에 의한 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 활성 평가에 대한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예의 나노베지클에 의한 평균 모발 성장 길이를 나타낸 도면이다.

본 발명은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 언급하는 "엑소좀"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것을 말한다.

본 명세서에서 언급하는 "중간엽 줄기세포 유래 나노베지클"이란 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀과 동일한 입자 크기 및 제타포텐셜을 갖으나, 상기 엑소좀과 달리 세포들로부터 분비되는 물질이 아니며, 중간엽 줄기세포를 상기 엑소좀과 동일한 입자 크기를 갖도록 물리적으로 여과기를 통해 얻은 나노입자를 말한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 나노베지클의 평균 입경크기는 상기 중간엽 줄기세포로부터 얻을 수 있는 엑소좀의 크기와 동일한 것으로 30 내지 100nm일 수 있다. 이때, 상기 나노베지클의 제타포텐셜 값은 -20 내지 -10mV인 것으로, 상기 중간엽 줄기세포로부터 얻을 수 있는 엑소좀의 제타포텐셜 값과 동일한 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 나노베지클의 평균 입경크기가 30nm 미만일 경우 나노베지클의 비표면적이 증가하여 응집현상을 발생하여 탈모 방지 또는 발모 촉진 효과가 떨어질 수 있으며, 상기 나노베지클의 평균 입경크기가 100nm 초과할 경우 나노베지클의 비표면적이 줄어들어 모낭 조직 내 모낭세포에 접촉율이 떨어져 탈모 방지 또는 발목 촉진 효과가 떨어질 수 있다. 바람직하게는 40 내지 55nm 이며, 더욱 바람직하게는 42 내지 53nm이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 평균 입경크기가 30 내지 100nm 인 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함함으로써 매우 작은 입경크기의 나노베지클이 모낭 조직을 활성화시켜 탈모 방지 또는 발모 촉진 효과가 뛰어날 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 나노베지클의 농도는 28ng/ml 내지 9㎍/ml일 수 있으며, 상기 나노베지클의 농도가 28ng/ml 미만일 경우, 탈모 방지 또는 발모 촉진 효과가 매우 미비하고, 상기 나노베지클의 농도가 9㎍/ml 초과할 경우, 나노베지클이 모낭을 막아 발모 효과를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는 100ng/ml 내지 5㎍/ml 이며, 더욱 바람직하게는 225ng/ml 내지 1㎍/ml 이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 나노베지클의 입자 PDI(polydispersity index)는 0.01 내지 0.5 일 수 있으며, 상기 나노베지클의 입자 PDI가 0.01 미만일 경우 매우 균일한 나노베지클로 탈모 방지 또는 발모 효과의 재현성은 높아질 수 있으나, 제조시간이 길어지고 분리 및 정제공정이 추가되어 제조단가가 높아질 수 있고, 상기 나노베지클의 입자 PDI가 0.5 초과할 경우 나노베지클의 균일성이 떨어져 탈모 방지 또는 발모 효과에 대한 재현성이 낮아질 수 있다. 바람직하게는 0.01 내지 0.3이며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.2이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, PDI(polydispersity index)는 0.01 내지 0.5인 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함함으로써 균일한 입경분포를 갖는 나노베지클이 모낭 조직을 활성화시켜 탈모 방지 또는 발모 촉진 효과가 뛰어나고 이의 효과에 대한 재현성이 높을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 나노베지클은 모유두 세포(dermal papilla cell, DP)를 활성화하여 모발 성장을 유도할 수 있으며, 내모근초 세포(inner root sheath cell, IRS) 또는 외모근초 세포(outer root sheath cell, ORS)의 대사를 활성화하여 모발 성장 및 발육을 유도할 수 있다.

또한, 상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포로부터 제조된 것으로 줄기세포가 갖는 분화능을 가질 수 있으며, 생체적합성이 매우 뛰어난 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 경피투여, 피하주사 또는 피부외용 제형일 수 있다. 예를 들어, 경피투여 제형의 한 양태는 연고제로, 이 제형은 당업계 공지된 바를 기초로 연고기제, 기타 첨가제 등을 적절히 배합 처리함으로써 제조할 수 있다. 연고기제는 예를 들면, 고급 지방산 또는 그의 에스테르류 (예, 아디프산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 아디프산에스테르, 미리스트산에스테르, 팔미트산에스테르, 세바스산디메틸, 라우르산헥실, 이소옥탄산세틸), 납류 (예, 경랍, 밀랍, 셀레신), 계면활성제 (예, 폴리옥시에틸렌알킬에테르인산에스테르), 고급 알코올(예, 세탄올, 스테아릴 알코올, 세토스테아릴알코올), 실리콘유 (예, 디메틸폴리실록산, 메틸페닐폴리실록산, 글리콜메틸폴리실록산, 실리콘글리콜폴리머), 탄화수소류 (예, 친수와세린, 백색와세린, 정제라놀린, 유동파라핀), 물, 보습제 (예, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 소르비톨), 감염방지제 등에서 적절히 선택하여 이용될 수 있다. 또한, 피하주사는 직접 피하에 주입하는 제형이며, 피부외용의 제형은 피부에 도포하는 제형으로 당업계에 통상적인 기술에 따라 목적하는 효과를 이루기 위해 다른 성분들을 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 예컨대, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 리브온(leave-on)형, 미스트 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 샴푸, 린스, 바디클렌저 등의 세정제, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 모발 영양화장수, 헤어에센스, 헤어세럼 스칼프트리트먼트, 헤어트리트먼트, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어로션, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물, 수중유(O/W)형, 유중수(O/W)형 등의 기초 화장료로 제형화 될 수 있다.

또한, 상기 조성물은, 각각의 제형에 있어서 상기한 필수성분 이외에 다른 성분들은 기타 외용제의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적합하게 선정하여 배합할 수 있다. 예컨대, 자외선 차단제, 헤어 컨디셔닝제, 향료등을 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유할 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화장료 조성물에 추가적으로 점증제를 함유할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 포함되는 점증제는 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 하이드록시 구아닌, 하이드록시 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄, 세테아릴 알콜, 스테아릭산, 카라기난 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 카르복시 비닐 폴리머가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종의 기제와 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면, 당업계에 통상적인 방부제, 색소, 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.

상기 방부제는 구체적으로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) 또는 1,2-헥산디올 (1,2-Hexanediol) 등이 될 수 있고, 향료는 인공향료 등이 될 수 있다.

그리고, 본 발명의 일 실시예에서, 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 중간엽 줄기세포(mesencymal stem cell) 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다.

상기 제조방법은 1) 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; 2) 배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포를 침전시키는 단계; 3) 침전된 중간엽 줄기세포를 인산완충용액(phosphate buffered saline)에 재부유(resuspension)하여 중간엽 줄기세포 용액을 수득하는 단계; 4) 상기 중간엽 줄기세포 용액을 여과시키는 단계; 및 5) 상기 중간엽 줄기세포 용액을 밀도구배 초원심분리하여 나노베지클을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 1) 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계는 세포의 수를 증가시키는 단계로 계대배양하는 단계일 수 있으며, passage6 까지 계대배양하는 것이 바람직하다.

상기 2) 배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포를 침전시키는 단계는 사멸한 중간엽 줄기세포는 제거하여 살아있는 중간엽 줄기세포만을 분리하는 단계로 500×g 내지 1000×g 에서 원심분리하는 것이 바람직하며, 원심분리 시간은 3분 내지 10분 사이인 것이 바람직하다.

상기 1) 단계와 2) 단계 사이에 배양된 중간엽 줄기세포를 인산완충용액(phosphate buffered saline)으로 세포를 워싱(washing)하는 단계 및 스크래퍼(cell scrapper)를 이용하여 세포를 떼어내는 단계를 추가할 수 있으며, 세포를 워싱함으로써 사멸한 중간엽 줄기세포를 1차적으로 제거하고, 중간엽 줄기세포를 떼어내는 것이 수월해질 수 있다.

상기 3) 침전된 중간엽 줄기세포를 인산완충용액에 재부유(resuspension)하여 중간엽 줄기세포 용액을 수득하는 단계는 중간엽 줄기세포를 여과하기 용이하도록 준비하는 단계로 상기 중간엽 줄기세포를 재부유시 약한 압력으로 중간엽 줄기세포에 손상이 가지않도록 하는 것이 바람직하다.

상기 4) 상기 중간엽 줄기세포 용액을 여과시키는 단계는 여과를 통해 중간엽 줄기세포의 입경크기를 줄이고, 중간엽 줄기세포가 균일한 형태를 갖기 위한 단계이다. 바람직하게는 다양한 기공크기를 갖는 막 여과기(membrane filter)를 이용하여 순차적으로 여과하는 것이다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포의 전체 또는 일부분을 파쇄하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 4) 단계에서 여과는 0.4 내지 15㎛ 크기의 막 여과기로 여과할 수 있다. 상기 여과 공정을 통해 상기 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클의 입자 PDI를 줄여 균일한 입자크기를 가진 나노베지클을 수득할 수 있다.

상기 5) 상기 중간엽 줄기세포 용액을 밀도구배 초원심분리하여 나노베지클을 수득하는 단계는 밀도구배에 용이한 물질을 농도별로 제조하여 농도구배가 있도록 만든 용액에 상기 중간엽 줄기세포 용액을 추가하여 원심분리하여 고순도의 나노베지클을 수득하는 단계이다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 5) 단계에서 상기 중간엽 줄기세포 용액을 50,000 내지 200,000×g의 초원심분리에서 침강하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 5) 단계에서 0%, 10% 및 50%의 이오딕사놀 순차적으로 추가하여 밀도구배 초원심분리를 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 5) 단계에서의 밀도구배는 밀도가 다른 물질을 구분할 때 가장 많이 사용되는 방법으로서, 이 방법의 구체적인 예로는 피콜(ficoll), 글리세롤(glycerol), 수크로즈(sucrose), 염화세슘(cesium chloride), 이오딕사놀(iodixanol) 등의 밀도구배 분리 물질을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 밀도 구배는 초원심분리와 함께 사용될 수 있다. 또한, 바람직한 밀도구배 분리 물질은 이오딕사놀이나, 이에 제한되지 않는다.

이때, 상기 이오딕사놀의 농도는 0 내지 100%인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0 내지 50%이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물의 제조방법은 막 여과 및 밀도구배 초원심분리를 수행함으로써, 매우 공정이 단순하다.

또한, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물의 제조방법을 통하여 상기 중간엽 줄기세포 개체 하나당 30,000 내지 40,000개의 나노베지클을 얻을 수 있어 대량생산이 가능하다.

본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 멸균수 또는 정제수를 포함하여 탈모 방지용 키트 또는 발모 촉진용 키트를 제공할 수 있다. 상기 키트는 즉시 사용 가능하도록(ready-to-use) 밀봉된 포장재 또는 포장용기에 담긴 키트일 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

제조예 1: 나노베지클 제조

인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)로부터 나노베지클을 제조하기 위해서, 먼저 인간 중간엽 줄기세포를 passage 6까지 세포배양하였다. 그 후, 인산완충용액(phosphate buffered saline)으로 세포를 두 번 워싱(washing)한 후, 멸균된 세포 스크래퍼(cell scrapper)를 이용하여 세포를 떼어내고, 600×g에서 5분동안 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 침전된 세포는 인산완충용액으로 재부유(resuspension) 시킨 후, 10㎛, 5㎛ 및 1㎛의 막 여과기(membrane filter)를 이용하여 각각 5번씩 순차적으로 세포용액을 여과기로 통과시켜 나노베지클을 제조하였다. 균일하고 고순도의 나노베지클을 분리하기 위해서, 튜브에 50%, 10%, 0% 이오딕사놀(iodixanol)을 각각 아래서부터 쌓고 4℃, 100,000×g에서 2시간동안 밀도구배 초원심분리(density gradient ultracentrifugation)를 수행하였다. 10%와 50% 이오딕사놀 사이에 존재하는 순수한 나노베지클층을 모으고, 버퍼 교체(buffer change)를 위해 HEPES 완충용액(HEPES buffered saline)으로 희석하여 초원심분리(ultracentrifugation)를 100,000×g, 4℃ 조건에서 2시간동안 수행하여 나노베지클을 제조하였다.

실시예

상기 제조예 1 로부터 제조된 나노베지클.

비교예

하기 방법으로 제조된 엑소좀.

먼저, 엑소좀이 제거된 우혈청(fetal bovine serum, FBS)는 150,000×g로 4에서 16시간 동안 초원심분리를 수행하였다. 10%의 엑소좀이 제거된 우혈청이 포함된 배지에서 인간 중간엽 줄기 세포를 37에서 24시간 동안 배양하였다. 이어 상기 배양된 세포를 수확하여 4 인산완충용액(PBS - NaCl 137mmol/L, KCl 2.7 mmol/L Na₂NPO₄ 10mmol/L, KH₂PO₄ 1.8mmol/L) 중에서 초음파로 파쇄한 후 세포잔해를 비롯한 세포는 500×g에서 10분간 그리고 3000×g에서 15분간 연속적으로 원심분리를 수행하여 제거하였다. 최종적으로 엑소좀 펠렛은 150,000×g로 4에서 2시간 동안 초원심분리를 수행하여 수득하고, 인산완충용액에 재현탁하였다. 엑소좀이 포함한 단백질의 양은 브래드포드 분석법으로 정량하여, 최종농도를 인산완충용액 중에 1mg/ml로 맞추었다.

실험예 1 : 입자크기 측정

상기 실시예의 입자크기를 측정하기 위해, 전자현미경 및 동적 광산란 입도 분석기를 이용하였다.

상기 실시예의 나노베지클은 글로우로 방전되고 탄소로 코팅된 구리 그리드(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)에 올렸다. 상기 실시예의 나노베지클이 1시간 동안 그리드에 흡수되도록 한 후, 그리드를 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정시키고 증류수로 헹구어 준 다음 2% 우라닐아세테이트로음(Ted Pella, Redding, CA)으로 염색 하였다. 100kV의 가속 전압에서 나노베지클의 입자크기를 전자현미경(transmission electron microscope, TEM)을 이용하여 측정하였다. 이로부터 얻은 상기 실시예의 입자크기는 30 내지 100nm임을 확인했다. 이의 결과를 도 1a에 나타냈다.

또한, 상기 실시예의 나노베지클의 입자 크기의 분포를 확인하기 위해 동적 광산란 입도 분석기를 이용하여 측정하였다. 이로부터 측정된 나노베지클의 동적 광산란 입도 분석 곡선은 도 1b에 나타냈다.

상기 도 1a 및 b에 도시된 바와 같이, 실시예의 나노베지클의 평균 입자 크기는 47.6nm를 가졌으며, 매우 균일한 입자 크기의 분포를 가지는 것을 확인했다.

실험예 2

상기 실시예와 비교예를 비교하기 위하여, 실시예 및 비교예의 입자 크기를 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였으며, 동적 광산란 입도 분석기를 이용하여 제타포텐셜(zeta potential)을 측정하여 하기 표 1에 나타냈다.

또한, 인간 중간엽 줄기세포 1x10⁷cell 당 획득한 실시예 및 비교예의 입자 농도를 하기 표 1에 나타냈다.

구분	실시예	비교예
입자크기(nm)	47.6±5.0	38.1±2.6
제타포텐셜(mV)	-14.1±0.4	-14.1±0.9
입자농도 (1x10⁹particles/1x10⁷cells)	357.0±26.0	1.8±0.7

상기 표 1과 같이, 실시예의 나노베지클은 비교예의 엑소좀과 유사한 입자크기 및 제타포텐셜값을 갖는 것을 확인했다. 한편, 인간 중갑엽 줄기세포 1x10⁷cell 당 획득한 입자 농도는 실시예 경우 비교예 비해 200배 높은 것을 나타냈다. 이의 결과로부터 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진 조성물을 제조함에 있어 대량생산이 가능한 것을 확인했다.

실험예 3 : 발모효과

1) 모유두 세포(dermal papilla cell, DP) 생존능력 측정 평가 in vitro

상기 실시예의 나노베지클이 갖는 모낭 조직과 관련 세포에서의 생존능력을 평가하기 위해, WST-1 kit를 이용하였다. 우선적으로 모유두 세포는 10% 우혈청(fetal bovine serum, FBS)와 1% 페니실린(penicillin)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 이용하여 37, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양된 세포를 96 well plate에 분주한(1x10⁴cells/well) 후 37 CO₂ 배양기에서 24시간 배양했다. 이 후 상기 실시예의 나노베지클을 각 농도별(28, 55, 112, 225, 450, 900, 1120, 2250, 4500, 9000ng/ml)로 희석시켜 각 well에 처리하여 24, 72, 120시간 동안 배양시켰다. 그 다음, WST-1 반응액을 첨가제(supplement)가 제외된 배지에 1/10로 희석하고 이를 각 well당 100㎕씩 처리하여 37 배양기에 넣고 1시간 후에 ELISA microplate reader(SoftMax Pro5, Molecular Devices, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 동일한 모유도 세포에 DMSO(dimethyl sulfoxide)만을 처리하여 이를 대조군으로 설정하였으며, 상기 실시예의 나노베지클이 아닌 10μM 미녹시딜 분말제형을 처리하여 이를 양성대조군으로 설정하였다. 그리고, 대조군의 흡광도 값을 100%로 하여 양성대조군 및 실시예의 상대 흡광도를 환산하여 도 2에 그래프로 나타냈다.

상기 도 2에 도시된 바와 같이, 나노베지클의 농도별 처리에 의한 모유두세포 생존력을 측정한 결과, 저농도에서 고농도까지 나노베지클은 모유두 세포의 손상을 나타내지 않음을 확인했다. 또한, 실시예의 나노베지클은 양성대조군 및 대조군과 동일한 모유두 세포의 생존능력을 가지는 것을 확인했다. 이에 따라 본발명에 따른 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클은 모유두 세포의 생존능력을 저하시키지 않으며 독성이 없음을 확인했다.

2) 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 활성 평가

상기 실시예의 나노베지클이 갖는 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 평가하기 위해, 알칼리성 인산가수분해효소 분석키트(SensoLyte®, Anaspec)를 이용하여 실시하였다. 우선 모유두세포를 6 well plate에 분주한 (1x10⁵ cells/well) 후 37 CO₂ 배양기에서 24시간 배양했다. 이 후 실시예를 각 농도별(56, 225, 450, 900ng/ml)로 희석시켜 각 well에 처리하여 48, 120시간 동안 배양시켰다. 그 다음 세포 파쇄액(lysate)을 획득하여, 알칼리성 인산가수분해효소 분석키트의 메뉴얼에 따라 평가하기 위해 ELISA microplate reader(SoftMax Pro5, Molecular Devices, USA)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 동일한 모유도 세포에 DMSO(dimethyl sulfoxide)만을 처리하여 이를 대조군으로 설정하였으며, 대조군의 흡광도 값을 100%로 하여 실시예의 상대 흡광도를 환산하여 도 3에 그래프로 나타냈다.

상기 도 3에 도시된 바와 같이, 모유두 세포에서 후보물질의 농도별 처리에 의한 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 측정한 결과, 실시예의 농도가 증가함에 따라 알칼리성 인산가수분해효소 활성이 증가하였고, 더욱이 시간에 지남에 따라 그 격차가 벌어지는 경향성을 확인하였다. 이의 값은 통계적으로 유의함을 확인하였다. 상기 실시예의 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 증가시키는 것을 확인함에 따라서, 모유두 세포의 형태확인뿐만 아니라 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클이 중간엽 줄기세포의 분화능을 가지는 것을 확인하였다.

3) 모낭 조직 배양 평가 ex vivo

먼저, 실시예의 나노베지클의 모발 성장 효과를 확인하기 위해 모낭 조직을 배양하였다. 구체적으로 후두부에서 생검 된 남성 기여자의 모낭 조직은 실험에 사용되기 위하여 정리과정을 걸친 후 1% 페니실린(penicillin), 2mM 글루타민(glutamine) 및 10ng/mL 하이드로코르티손(hydrocortisone)이 포함된 Serum-free William's E medium(Invitrogen, Paisley, UK)을 이용하여 37, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

그 다음, 현미경을 통해 손상이 없으며 성장기(anagen-hair cycle)에 해당하는 남성 기여자의 모낭 조직을 분리하여 이를 실험에 사용하였다. 실험군 당 5가닥을 형성하였으며, 배지에 담겨 24 well plate에서 배양하였다. 이때 각 well에 농도별(1.12, 2.25, 4.5, 9㎍/ml)로 실시예의 나노베지클을 첨가 하였다. 총 6일간의 배양 기간 이후 현미경으로 촬영하여 모발 성장 길이를 측정하고 이의 평균값을 환산하여 도 4에 나타냈다. 또한 동일한 모낭 조직에 아무것도 처리하지 않은 모낭 조직을 대조군으로 설정하였으며, 상기 실시예의 나노베지클이 아닌 10μM 미녹시딜 분말제형을 처리한 모낭 조직을 양성대조군으로 설정하여 동일한 조건에서 배양하였다. 이후 대조군 및 양성대조군의 모발 성장 길이를 측정하여 이의 평균값을 환산하여 도 4에 나타냈다.

상기 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 실시예의 나노베지클을 처리한 모낭 조직의 경우 대조군과 양성대조군에 비교하여 월등히 모발이 성장한 경향을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 처리한 모낭 조직은 우수한 모발 성장효과를 보임을 확인했다.

Claims

중간엽 줄기세포(mesencymal stem cell) 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 나노베지클의 평균 입경크기가 30 내지 100nm인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 나노베지클의 농도는 28ng/ml 내지 9㎍/ml인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 나노베지클의 입자 PDI(polydispersity index)는 0.01 내지 0.5인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 나노베지클은 모유두 세포(dermal papilla cell, DP)를 활성화하여 모발 성장을 유도하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 경피투여, 피하주사 또는 피부외용 제형인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 용액, 크림, 로션, 샴푸, 헤어토닉, 스프레이, 및 겔 중에서 선택된 어느 하나의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은
1) 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계;
2) 배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포를 침전시키는 단계;
3) 침전된 중간엽 줄기세포를 인산완충용액(phosphate buffered saline)에 재부유(resuspension)하여 중간엽 줄기세포 용액을 수득하는 단계;
4) 상기 중간엽 줄기세포 용액을 여과시키는 단계; 및
상기 중간엽 줄기세포 용액을 밀도구배 초원심분리하여 나노베지클을 수득하는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물의 제조방법.
제 8항에 있어서,
상기 나노베지클의 평균 입경크기가 30 내지 100nm인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물의 제조방법.
제 8항에 있어서,
상기 4) 단계는 10㎛, 5㎛ 및 1㎛의 막 여과기(membrane filter)를 사용하여 중간엽 줄기세포 용액을 여과하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물의 제조방법.