KR20190028677A - 고함량의 성장인자를 함유한 줄기세포 유래 엑소좀 - Google Patents

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KR20190028677A
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Abstract

본 발명은 EGF(표피세포성장인자) 및/또는 FGF(섬유아세포성장인자) 함유 배지에서 배양된 줄기세포로부터 수득된, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀에 관한 것이다. 상기 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀은 나노사이즈로 피부 진피층까지 침투하여 재생 효과를 높일 것으로 보이며, 다양한 성장인자를 다량 함유하고 있기 때문에 피부 구성세포인 섬유아세포의 증식과 활성화를 통한 피부 재생 및 항노화 효과, 콜라겐합성 증가, 모발 성장, 축소된 모낭 복원 및 상처치유 효과가 있다.

Description

고함량의 성장인자를 함유한 줄기세포 유래 엑소좀{Stem cell-derived exosomes containing a high amount of growth factors}
본 발명은 표피세포성장인자(Epithelial growth factor) 및/또는 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor) 함유 배지에서 배양된 줄기세포로부터 수득된, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀; 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
현대인들의 생활수준 향상과 더불어 노령인구가 증가함에 따라 노화방지, 주름개선, 미백, 자외선차단 등과 관련된 기능성 화장품에 대한 관심과 수요가 증가하고 있는 추세이다. 그러나, 기초 화장품 또는 기능성 화장품은 대부분 화학물질로 제조되기 때문에 인체에 대한 안정성 문제가 꾸준히 제기되었다. 이에 따라, 천연, 유기농 원료를 함유한 제품에 대한 관심이 증가하고 있으며, 관련 제품의 시장 규모 또한 증가하고 있다.
예컨대, 인간 배아줄기세포 배양액을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물(한국 공개특허 10-2015-0039343), 포유동물에서 유래한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부주름개선용 또는 피부노화억제용 화장료 조성물(한국 등록특허 10-1063299) 등이 개발된 바 있으나, 인간 배아줄기세포를 이용한다는 점에서 윤리적인 문제가 있었으며, 그의 효과가 미미하다는 문제점 등이 있었다.
중간엽줄기세포는 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor)와 같은 다양한 성장인자(growth factor)와 사이토카인을 분비하여 섬유아세포로부터 콜라겐의 생성을 촉진시켜 피부의 재생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이러한 특성을 가진 줄기세포를 이용한 화장품의 개발에 많은 관심이 고조되고 있으며, 특히 줄기세포의 유효 인자들에 대한 피부 내 침투력을 높일 수 있는 기술 개발과 관련된 연구가 이루어지고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor), 또는 이의 조합을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 기재된 방법에 의하여 제조된, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor), 또는 이의 조합을 포함하는, 줄기세포 엑소좀의 성장인자 함량 증가용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 제1양태는 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor), 또는 이의 조합을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제2양태는 제1양태의 제조방법에 의하여 제조된, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀을 제공한다.
본 발명의 제3양태는 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor), 또는 이의 조합을 포함하는, 줄기세포 엑소좀의 성장인자 함량 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제4양태는 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 제5양태는 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 제6양태는 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
엑소좀은 세포에서 유래된 지질 이중층으로 구성된 소낭(vesicle)으로, 세포 특유의 단백질, RNA 등을 포함한 상태로 세포 밖으로 분비되어 다른 세포에게 단백질과 RNA 등을 전달한다.
엑소좀에 포함되어 있는 단백질들은 세포막 형태의 인지질에 의해 보호되고 있어, 단백질 분해효소 등에 의해 활성을 쉽게 잃지 않아 가용성 형태의 단순 단백질(soluble protein)보다 안정적인 기능을 수행할 수 있다. 또한, 지질 이중층의 구조는 세포막과 쉽게 융합되므로 엑소좀 내의 물질들은 세포에 효율적으로 전달될 수 있다(Lai, R.C. et al., Biotechnol. Adv., 5, 543-551, 2013).
엑소좀은 세포를 배양한 후 수득된 배양액에서 수득할 수 있다. 엑소좀의 분리 및 검출(detection)은 복잡하다.
또한, 엑소좀은 해당 엑소좀이 유래된 세포 타입을 반영하는 RNA, 단백질, 지질 및 대사물질들을 함유한다. 엑소좀은 해당 엑소좀이 유래된 세포의 다양한 분자 구성성분들(예, 단백질들 및 RNA)을 함유한다. 엑소좀 단백질 조성은 해당 엑소좀이 유래된 세포 및 조직(tissue)에 따라 다양하나, 대부분의 엑소좀은 진화적으로 보존된 공통의 단백질 분자들 세트를 함유한다.
한편, 엑소좀 생산 및 함량은 엑소좀을 생산하는 세포가 받은 분자 신호에 의해 영향을 받을 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 표피세포성장인자(Epithelial growth factor, EGF) 및/또는 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF) 함유 배지를 이용하여, 골수, 지방, 제대혈 유래 중간엽줄기세포를 배양한 후 이의 배양액으로 분리된 엑소좀을 분석한 결과, 세포의 성장을 조절하는 표피세포성장인자(Epithelial growth factor, EGF); 및 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 형질전환성장인자(Transforming Growth Factor, TGF), 간세포증식인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF), 인슐린유사성장인자(Insulin-like growth factor, IGF) 및 혈소판유래증식인자(Platelet-derived growth factor, PDGF)와 같은 다양한 성장인자들이 다량 함유된 엑소좀이 생산되는 것을 발견하였으며, 엑소좀 내의 대표적인 성장 인자로는 주로 세포의 성장을 조절하는 EGF를 가장 많은 양 내포하고 있는 것을 발견하였다. 또한, 제대혈 유래 중간엽줄기세포가 골수, 지방 유래 중간엽줄기세포에 비하여 엑소좀 내에 다양한 성장 인자를 보다 많이 가지고 있음을 발견하였다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.
줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀은 나노사이즈로 피부 진피층까지 침투하여 재생 효과를 높일 것으로 보이며, 다양한 성장인자를 다량 함유하고 있기 때문에 피부 구성세포인 섬유아세포의 증식과 활성화를 통한 피부 재생 및 항노화 효과, 콜라겐합성 증가, 모발 성장, 축소된 모낭 복원 및 상처치유 효과가 있다.
따라서, 본 발명은 EGF, FGF, 또는 이의 조합을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 상기 줄기세포의 배지로부터 엑소좀을 분리하는 제2단계를 포함하는, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법에 의하여 제조된, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀을 제공한다.
이때, 상기 배지에 포함되는 EGF 및 FGF의 농도는 10 pg/ml 내지 10 ㎍/ml일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 EGF, FGF, 또는 이의 조합을 포함하는, 줄기세포 엑소좀의 성장인자 함량 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 엑소좀은 EGF 및/또는 FGF를 함유하지 않은 배지에서 배양된 줄기세포로부터 수득된 엑소좀 보다 성장인자 함량이 높다.
또한, 상기 엑소좀은 이를 함유한 배양액으로 생산 또는 사용될 수도 있으며, 상기 배양액으로부터 세포를 제거한 상태로 생산 또는 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 엑소좀을 제조하는 방법의 일구체예는 EGF 및/또는 FGF 함유 배지에서 줄기세포를 배양하여, EGF 함유 엑소좀을 생산 및 세포밖으로 분비시키는 단계; 및 상기 줄기세포의 배지(배양액)으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명은 줄기세포가 EGF 또는 다양한 성장인자를 다량 함유하는 엑소좀을 생산하기 위해, EGF 및/또는 FGF 함유 배지를 사용하는 것이 특징이다. 상기 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 예컨대, 상기 배지는 EGF 및/또는 FGF를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지일 수 있다.
본 발명에 따른 배지를 사용하여 수득된 엑소좀은 2종 이상의 성장인자를 함유하고 있으며, 가장 많은 함량의 성장인자가 EGF일 수 있다.
또는, 본 발명에 따른 배지를 사용하여 수득된 엑소좀은 표피세포성장인자(Epithelial growth factor, EGF); 및 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 형질전환성장인자(Transforming Growth Factor, TGF), 간세포증식인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF), 인슐린유사성장인자(Insulin-like growth factor, IGF) 및 혈소판유래증식인자(Platelet-derived growth factor, PDGF)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 성장인자를 함유할 수 있다.
나아가, 본 발명의 엑소좀은 상기 엑소좀을 생산 및 분비한 줄기세포의 기원(origin)을 반영하는 분자를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 엑소좀을 생산하는 세포는 성체줄기세포일 수 있다.
성체줄기세포는 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화하게 되는 미분화상태의 세포이다. 성체줄기세포는 인간 배아에서 추출한 배아 줄기세포와 달리 골수나 뇌세포 등 이미 성장한 신체조직에서 추출하기 때문에 윤리논쟁을 피할 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 제대혈로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell) 또는 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
EGF는 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 콜라겐의 생성을 촉진시켜 피부 재생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며(Stanley Cohen, Developmental Biology 12, 394-407, 1965; A. Colige et al., Journal of Cellular Physiology 145:450-457, 1990), 새로운 모낭 형성의 유발인자로 작용할 수 있고(Moo Yeol Hyun et al., International Wound Journal, 2014, doi: 10.1111/iwj.12354.), 상처치유에 우수한 효과를 나타낼 수 있음이 제시되고 있다(Hardwicke J et al., Surgeon., 2008 Jun;6(3):172-7.). 또한, 엑소좀은 세포막을 가로질러 물질을 전달할 수 있어 약물 전달을 위한 이상적인 소낭으로 평가되고 있는데, 이러한 지질 이중층 소낭 시스템은 피부 침투 문제점을 극복할 수 있으므로 약물을 피부 진피층까지 전달하기 위한 가장 효과적인 전략 중 하나로 평가되고 있다(Saahil Arora et al., Asian Journal of Pharmaceutics, 6, 4, 237-244, 2012).
따라서, 본 발명에 따른 엑소좀은 피부 상태 개선용 화장료 조성물, 피부 상태 개선용 의약외품 조성물, 피부 도포용 조성물, 또는 상처치유용 약학 조성물에 유효성분으로 사용될 수 있다.
여기서, "피부 상태 개선"이란, 피부 재생, 피부 탄력 개선, 피부 주름 방지 또는 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 모발 성장 및/또는 축소된 모낭 복원일 수 있다.
이때, "개선"이란, 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC) 배양액으로부터 분리된 엑소좀은 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 분리된 엑소좀보다 높은 수준으로 EGF, VEGF, TGF, HGF, FGF, IGF 및 PDGF 등의 다양한 성장 인자들을 함유하고 있는 것을 확인하였으며, 특히 EGF가 매우 많은 양으로 내포된 것을 확인하였다(도 2). 또한, 상기 엑소좀이 처리된 인간 피부 섬유아세포는 피부의 탄력에 관여하는 ECM 단백질들의 발현양이 높은 수준으로 증가함을 확인하였다(도 4). 상기 EGF 등의 성장 인자는 피부 구성세포인 섬유아세포의 증식을 촉진하며, 세포의 이동 및 콜라겐 합성 등을 촉진하므로, 상기 UCB-MSC 유래 엑소좀은 피부 재생, 피부 탄력 개선, 피부 주름 방지 또는 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 모발 성장 또는 축소된 모낭 복원 등의 우수한 피부 상태 개선 효과 및 상처치유 효과를 나타낼 것임을 시사하는 것이다.
한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 상기 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 글리세린, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 글리세린, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 엑소좀은 상기 화장료 조성물 총 중량의 0.0001 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 더욱 구체적으로 0.0005 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 엑소좀이 상기 범위 내로 포함될 때, 우수한 피부 상태 개선 효능을 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
여기서, "의약외품"이란, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중에서 의약품보다 작용이 경미하거나 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것을 의미한다. 사람이나 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의 상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
"피부 도포용 조성물" 또는 "상처치유용 조성물"은 약학 조성물일 수 있다.
따라서, 약학 조성물의 경우, 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 것에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용 가능"하다는 것은, 투여 시 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는, 약학 분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 것을 의미한다.
투여량은 피부 상태 개선을 위해 약학적으로 유효한 양일 수 있다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 또한, 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.
본 발명에서, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 이에 제한되지 않으나 구체적인 예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
또한, 다른 하나의 양태는 EGF 및/또는 FGF 함유 배지에서 배양된 줄기세포로부터 수득된, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태 개선 방법을 제공한다.
"개체"란, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 비롯한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 피부 상태 개선 방법에서, 상기 조성물은 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용하여 투여될 수 있으며, 상기 조성물을 피부에 도포하거나 분무하는 방법 또한 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 UCB-MSC(제대혈 유래 중간엽 줄기세포) 유래 엑소좀은 타 유래 엑소좀에 비하여 피부 재생, 모낭 형성 및 상처치유 등에 효과를 보이는 EGF를 높은 수준으로 포함하고 있으며, 엑소좀 특유의 지질 이중층 구조에 의하여 상기 EGF를 피부 진피층까지 전달할 수 있으므로, 피부 재생, 항노화 효과, 콜라겐합성 증가, 모발 성장 또는 축소된 모낭 복원 등의 피부 상태 개선 및 상처치유에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 각종 세포배양액으로부터 분리된 엑소좀의 Human Growth Factor Antibody Array 결과를 보여주는 이미지이다. CTL은 대조군으로서 엑소좀을 분리하기 전 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, UCB-MSC)의 배양액을 의미하고, UCB-MSC 엑소좀(exosome)은 UCB-MSC 배양액에서 분리된 엑소좀, AD-MSC 엑소좀은 지방조직 유래 MSC(human adipose-derived mesenchymal Stem Cells, AD-MSC) 배양액에서 분리된 엑소좀, BM-MSC 엑소좀은 골수유래 MSC(human bone marrow derived mesenchymal Stem cells, BM-MSC) 배양액에서 분리된 엑소좀을 의미한다.
도 2는 각종 세포배양액으로부터 분리된 엑소좀의 주요 성장 인자(growth factor)를 확인한 그래프이다. 구체적으로, A는 대조군인 CTL, 및 UCB-MSC, AD-MSC 또는 BM-MSC 배양액에서 분리된 엑소좀에 포함된 다양한 성장인자의 함량을 비교한 것이고, B는 상기 CTL을 제외한, UCB-MSC, AD-MSC 또는 BM-MSC 배양액에서 분리된 엑소좀에 포함된 주요 성장인자의 함량을 비교한 것이다.
도 3은 UCB-MSC의 배양 조건에 따른 엑소좀의 주요 성장인자의 함유량을 비교한 그래프이다. EGF 및 FGF를 포함하거나, 포함하지 않는 조건에서 UCB-MSC를 배양하였다. 구체적으로, A는 상기 엑소좀의 Human Growth Factor Antibody Array 결과를 보여주는 이미지이며, B는 상기 엑소좀에 포함된 성장인자의 함량을 비교한 그래프이다.
도 4는 UCB-MSC의 배양액에서 분리된 엑소좀의 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)에 대한 ECM(extracellular matrix) 발현양 증가 효과를 보여주는 그래프이다. ECM으로서 콜라겐 타입 1(Collagen type 1), 콜라겐 타입 3(collagen type 3), 엘라스틴(Elastin), 피브로넥틴(fibronectin)을 이용하였다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 중간엽 줄기세포의 세포 배양 및 배양액 수집
인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, UCB-MSC), 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(human adipose-derived mesenchymal Stem Cells, AD-MSC) 및 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(human bone marrow derived mesenchymal Stem cells, BM-MSC)를 다음과 같은 조건에서 배양하였다.
무혈청 배지로서 페놀 레드 등의 pH 지시약이 첨가되지 않은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)이 담겨있는 T25 Flask에 2x105의 수로 UCB-MSC, AD-MSC, BM-MSC를 분주한 뒤, 37℃, 5% CO2 배양기에서 2일간 배양하였다. 이후, 기존의 배양액을 제거하고 세포를 PBS로 세척한 뒤, 기존 배양액의 2.5배 양으로, 성장인자인 EGF 및 FGF가 첨가된 DMEM 배지; 또는 상기 성장인자가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 교체하였다. 교체된 배지를 이용하여 4일간 배양함으로써 UCB-MSC, AD-MSC, BM-MSC에 대한 배양액을 얻었다.
실시예 2. 배양액으로부터 엑소좀 분리
상기 실시예 1에서 수득한 배양액을 50ml 튜브에 옮긴 다음 회전속도 2,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 생성된 세포의 펠렛(pellet)은 버리고 상층액만을 취하여 새로운 50ml 튜브에 옮겼고, 2,000g에서 30분간 원심분리하였으며, 이를 통해 분리된 상층액은 다시 새로운 50ml 튜브에 옮겼다.
이어서, 상기 분리한 상층액 1ml에 Exosome Isolation Reagent(Invitrogen, Cat. No. 4478359)를 500㎕ 비율로 섞은 후, 4℃에서 항온처리(incubation)하였다. 24시간 뒤, 4℃, 10,000g에서 60분간 원심분리하여 형성된 엑소좀 펠렛을 1xPBS에 재현탁하여 분리된 엑소좀을 준비하였다.
실험예 1. 분리된 엑소좀의 유효성분 분석
실험예 1-1. 유효성분 내포 확인
줄기세포 배양액으로부터 분리한 엑소좀의 성분을 확인하기 위하여 Human Growth Factor Antibody Array(RayBiotech, Cat. No. AAH-GF-1-8)를 실시하였다. 엑소좀 내 함유 성분은 하기 표 1의 ARRAY MAP을 통해 확인하였고, Image J를 통해 Positive Control spot과 비교 분석하여 각 성장 인자들의 상대적인 함유량을 확인하였다.
Figure pat00001
구체적으로, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 배양액 그 자체인 UCB-MSC CM(CTL), UCB-MSC의 배양액에서 분리된 엑소좀(이하, 'UCB-MSC 엑소좀'으로 명명), AD-MSC의 배양액에서 분리된 엑소좀(이하, 'AD-MSC 엑소좀'으로 명명), BM-MSC의 배양액에서 분리된 엑소좀(이하, 'BM-MSC 엑소좀'으로 명명)에 포함된 성분을 비교하였다.
그 결과, 도 2의 A에서 볼 수 있듯이, 다양한 성장 인자들이 엑소좀의 내부에 존재하고 있음을 확인하였다. 특히 세포의 성장을 조절하는 EGF(표피세포성장인자)가 각 엑소좀 내에 가장 많이 내포되어 있음을 확인하였다. 또한, UCB-MSC 엑소좀이 AD-MSC 엑소좀 또는 BM-MSC 엑소좀보다 높은 수준으로 다양한 성장 인자들을 함유하고 있는 것을 확인하였다.
또한, 도 2의 B에서 볼 수 있듯이, 상기 성장 인자들 중에서 세포의 성장을 조절하는 EGF(표피세포성장인자), FGF(섬유아세포성장인자), VEGF(혈관내피성장인자), TGF(형질전환성장인자), PDGF(혈소판유래증식인자), HGF(간세포증식인자) 등에 대하여 확인한 결과, UCB-MSC 엑소좀이 타 유래 줄기세포 배양액으로부터 얻은 엑소좀보다 많은 양의 성장 인자들을 내포하고 있음을 확인하였고, 특히 EGF가 매우 많은 양 내포된 것을 확인하였다.
실험예 2. 세포 배양 조건에 따른 엑소좀의 유효성분 함량 비교
엑소좀의 유효성분 함량을 더욱 증가시킬 수 있는 방법을 개발하고자, 성장인자인 EGF 및 FGF가 첨가되거나, 첨가되지 않은 조건에서 UCB-MSC를 배양하였고, 배양된 상기 UCB-MSC로부터 분리된 엑소좀 내 유효성분의 함량을 Human Growth Factor Antibody Array를 통해 비교하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, EGF 및 FGF가 첨가된 배지 조건의 UCB-MSC 엑소좀은 TGFβ2(Transforming growth factor-beta 2), HGF, TGFβ3(Transforming growth factor-beta 3), bFGF, VEGF, EGF, PDGFAA(Platelet-derived growth factor-AA) 등의 모든 성장인자의 함유량이 1.5 내지 2배 증가함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, EGF 및 FGF를 이용하여 UCB-MSC를 배양하는 경우, 상기 세포에서 유래하는 엑소좀의 유효성분 함량을 더욱 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 3. 분리된 엑소좀의 피부 개선 효능 확인
상기 실험예 1을 통해, 본 발명의 UCB-MSC 엑소좀은 많은 양의 성장인자들을 내포하고 있음을 확인함에 따라, 이의 피부 개선 효능을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)에 상기 실시예 2에 따라 분리한 UCB-MSC 엑소좀을 처리하였고, 상기 세포의 ECM(extracellular matrix) 발현양을 qPCR을 통해 확인하였다. HDF를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2X105 세포 수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 실시예 2의 방법에 따라 분리한 엑소좀을 8.1X106 의 수로 가하고 48시간 동안 배양한 다음, 배양된 각 HDF로부터 토탈(total) RNA를 수득하고, 이로부터 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 각 cDNA를 주형으로 하고, 하기 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 실시간(real-time) qPCR을 수행함으로써 콜라겐 타입 1(Collagen type 1), 콜라겐 타입 3(collagen type 3), 엘라스틴(Elastin), 피브로넥틴(Fibronectin)의 mRNA 수준을 비교하였다. 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
이름 프라이머 구분
Collagen type I
 F: 5'-cacagaggtttcagtggtttgg-3' 서열번호 1
R: 5'-gcaccagtagcaccatcatttc-3' 서열번호 2
Collagen type III
 F: 5'-ctgaaattctgccatcctgaac-3' 서열번호 3
R: 5'-ggattgccgtagctaaactgaa-3' 서열번호 4
Elastin
 F: 5'-atcaacgttggtgctactgctt-3' 서열번호 5
R: 5'-atctttagaggagccccaggta-3' 서열번호 6
Fibronectin
 F: 5'-aagattggagagaagtgggacc-3' 서열번호 7
R: 5'-gagcaaatggcaccgagata-3' 서열번호 8
GAPDH
 F: 5'-gagtcaacggatttggtcgt-3' 서열번호 9
R: 5'-gacaagcttcccgttctcag-3' 서열번호 10
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 피부의 탄력에 관여하는 ECM 단백질인 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 등은 UCB-MSC 엑소좀을 처리한 경우에는, 엑소좀 미처리 시험군(non-treat)과 비교하여, 발현양이 높은 수준으로 증가함을 확인하였다. 콜라겐 타입 1은 약 7배, 콜라겐 타입 3는 약 1.5배, 엘라스틴은 약 5배, 피브로넥틴은 약 1.3배 증가함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 UCB-MSC 엑소좀은 피부 탄력을 증가시키는 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 제대혈 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀은 지방유래 또는 골수유래 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀에 비하여 많은 양의 성장인자들을 포함하고 있으며, 다량의 다양한 성장인자를 가진 상태로 피부 진피층까지 침투할 수 있으므로, 피부 구성세포인 섬유아세포의 증식과 활성화를 통한 피부 재생 및 항노화 효과, 콜라겐합성 증가, 모발 성장, 축소된 모낭 복원 및 상처치유 효과를 발휘할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Kangstem Biotech CO., LTD. <120> Stem cell-derived exosomes containing a high amount of growth factors <130> KPA151379-KR-P1-D1 <150> KR 10-2016-0003819 <151> 2016-01-12 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type I F-primer <400> 1 cacagaggtt tcagtggttt gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type I R-primer <400> 2 gcaccagtag caccatcatt tc 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type III F-primer <400> 3 ctgaaattct gccatcctga ac 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type III R-primer <400> 4 ggattgccgt agctaaactg aa 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Elastin F-primer <400> 5 atcaacgttg gtgctactgc tt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Elastin R-primer <400> 6 atctttagag gagccccagg ta 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin F-primer <400> 7 aagattggag agaagtggga cc 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin R-primer <400> 8 gagcaaatgg caccgagata 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F-primer <400> 9 gagtcaacgg atttggtcgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R-primer <400> 10 gacaagcttc ccgttctcag 20

Claims (15)

  1. 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor), 또는 이의 조합을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 성체줄기세포인 것인, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대혈 유래 줄기세포인 것인, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배지는 무혈청 배지인 것인, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배지는 표피세포성장인자, 섬유아세포성장인자, 또는 이의 조합을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지인 것인, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 2종 이상의 성장인자를 함유하고 있으며, 상기 성장인자 중 표피세포성장인자의 발현양이 가장 많은 것인, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 표피세포성장인자(Epithelial growth factor); 및 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor), 형질전환성장인자(Transforming Growth Factor), 간세포증식인자(Hepatocyte growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor), 인슐린유사성장인자(Insulin-like growth factor) 및 혈소판유래증식인자(Platelet-derived growth factor)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 성장인자를 함유하는 것인, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 줄기세포의 배지로부터 엑소좀을 분리하는 제2단계를 포함하는 것인, 제조방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의하여 제조된, 성장인자 함량이 높아진 엑소좀.
  10. 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor), 또는 이의 조합을 포함하는, 줄기세포 엑소좀의 성장인자 함량 증가용 조성물.
  11. 제9항의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 피부 상태의 개선은 피부 재생, 피부 탄력 개선, 피부 주름 방지 또는 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 모발 성장 및 축소된 모낭 복원으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 화장료 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 피부 도포용인 것인, 화장료 조성물.
  14. 제9항의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물.
  15. 제9항의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학 조성물.
KR1020190027136A 2016-01-12 2019-03-08 고함량의 성장인자를 함유한 줄기세포 유래 엑소좀 KR20190028677A (ko)

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102184428B1 (ko) * 2020-05-25 2020-11-30 주식회사 씨케이엑소젠 중배엽줄기세포 유래의 엑소좀 생산방법 및 이로부터 제조된 배양액
JP2021122206A (ja) * 2020-02-03 2021-08-30 株式会社フルステム エクソソーム産生促進剤及びエクソソーム産生促進方法
WO2022119417A1 (ko) * 2020-12-04 2022-06-09 주식회사 프리모리스 리포폴리사카라이드와 리포테이코산을 활용한 항염 및 재생 기능이 강화된 고농도 줄기세포 엑소좀 생산 방법
KR20220080050A (ko) * 2020-06-05 2022-06-14 주식회사 셀파크글로벌 모유두전구세포로부터 분리된 엑소좀 및 이의 용도

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10500231B2 (en) 2013-03-13 2019-12-10 University Of Miami Method for isolation and purification of microvesicles from cell culture supernatants and biological fluids
KR101998103B1 (ko) * 2017-08-10 2019-07-09 (주)아모레퍼시픽 중간엽 줄기세포 유래 나노베지클을 포함한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물
WO2019050240A1 (ko) * 2017-09-07 2019-03-14 주식회사 엑소코바이오 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트의 새로운 용도
EP3684336A4 (en) * 2017-09-22 2021-06-02 University of Miami METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF EPIDERMOLYSIS BULLOSA
KR101980453B1 (ko) * 2017-11-29 2019-08-30 재단법인 아산사회복지재단 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
WO2019112238A2 (ko) * 2017-12-10 2019-06-13 주식회사 엑소코바이오 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물
KR20190110933A (ko) * 2018-03-21 2019-10-01 주식회사 엑소코바이오 피부에 대한 ｉｐｌ 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법
WO2019190093A1 (ko) * 2018-03-29 2019-10-03 주식회사 엑소코바이오 피부에 대한 ｒｆ 에너지 인가와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법
KR102058444B1 (ko) 2018-07-26 2019-12-23 주식회사 엑소코바이오 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물
KR102176845B1 (ko) * 2018-10-02 2020-11-10 주식회사 스템온 유도된 엑소좀을 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물
KR20200087898A (ko) * 2019-01-11 2020-07-22 주식회사 엑소코바이오 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발이식 성공률 증가용 조성물
CN109943533B (zh) * 2019-03-29 2021-01-01 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用
WO2021025533A1 (ko) * 2019-08-07 2021-02-11 건국대학교 산학협력단 골격근 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물
CN110917117A (zh) * 2019-08-16 2020-03-27 广东先康达生物科技有限公司 一种含有脂肪干细胞外泌体的面膜
CN110840812A (zh) * 2019-11-27 2020-02-28 沣潮医药科技（上海）有限公司 胎体来源的外泌体在皮肤调节产品中的用途
CN110885786B (zh) * 2019-12-20 2023-08-15 中科细胞科技(广州)有限公司 细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用
CN113388584A (zh) * 2020-03-10 2021-09-14 路宝特（南京）环保科技有限公司 一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法及其应用
US20230151331A1 (en) * 2020-04-01 2023-05-18 Primoris Co., Ltd. Method for preparing culture medium containing high levels of high-potency exosomes secreted by cord blood stem cells, and use thereof
CN111705035A (zh) * 2020-05-09 2020-09-25 河南省遗传资源细胞库有限公司 一种采用干细胞外泌体对皮肤美白功效的研究方法
CN111956787A (zh) * 2020-07-06 2020-11-20 沃森克里克（北京）生物科技有限公司 一种毛发增长剂和育毛剂及其应用
CN111973630A (zh) * 2020-07-15 2020-11-24 沃森克里克（北京）生物科技有限公司 一种间充质干细胞来源的细胞生长因子制剂及其制备方法与应用
CN113144221B (zh) * 2021-03-17 2022-11-15 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 外泌体制剂及其制备方法和应用
CN112920996B (zh) * 2021-04-23 2023-05-02 广州研华生物科技有限公司 一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法
WO2022259526A1 (ja) * 2021-06-11 2022-12-15 株式会社フルステム エクソソーム産生促進剤及びエクソソーム産生促進方法
KR20220169510A (ko) * 2021-06-18 2022-12-28 충북대학교 산학협력단 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물
WO2023064390A1 (en) * 2021-10-17 2023-04-20 ELEVAI Labs, Inc. Exosome-based skincare product
CN114480270A (zh) * 2022-02-17 2022-05-13 郑州大学 一种MSCs培养上清液的制备方法及其产品与应用
WO2023168006A1 (en) * 2022-03-02 2023-09-07 CryoGen, LLC Compositions comprising exosomes, growth factors and fragments of mesenchymal stem cells for use in the treatment of skin
WO2024015123A1 (en) * 2022-07-14 2024-01-18 Elevai, Inc. Method of treating hair loss and formulation for treatment

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101640381B1 (ko) * 2008-02-22 2016-07-18 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 중간엽 줄기세포 입자
CN101327318A (zh) * 2008-07-15 2008-12-24 中国人民解放军第二军医大学 一种含有细胞生长因子的间充质干细胞悬液及其用途
KR101063299B1 (ko) * 2008-09-17 2011-09-07 주식회사 에스티씨라이프 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물
CN101890050B (zh) * 2010-07-14 2012-07-04 江苏大学 脐带间质干细胞来源膜性囊泡及其应用
SG2014010706A (en) * 2010-10-18 2014-05-29 Agency Science Tech & Res Method and composition
US9446075B2 (en) * 2011-05-06 2016-09-20 Bioregenerative Sciences Compositions derived from stem cell released molecules and methods for formulation thereof
WO2013172793A1 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Agency For Science, Technology & Research Umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes
EP2877187B1 (en) * 2012-07-19 2019-06-12 Reneuron Limited Stem cell microparticles
CU24121B1 (es) * 2012-08-02 2015-08-27 Ct De Ingeniería Genética Y Biotecnología Vesículas que comprenden factor de crecimiento epidérmico y composiciones que las contienen
CN103767985A (zh) * 2012-10-22 2014-05-07 吉林省霍普金斯药物研究院有限责任公司 人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用
CN103243070B (zh) * 2013-04-25 2014-07-16 苏州佰通生物科技有限公司 一种干细胞培养基及其应用
KR20150039343A (ko) * 2013-10-02 2015-04-10 황우석 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물
US9982233B2 (en) * 2013-12-12 2018-05-29 Samsung Life Public Welfare Foundation Method for promoting generation of stem cell-derived exosome by using thrombin
CN104490931B (zh) * 2014-12-17 2018-08-21 江苏大学 人脐带间质干细胞分泌的exosome治疗皮肤损伤的应用
CN104877962A (zh) * 2015-04-15 2015-09-02 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种无血清的脂肪干细胞培养基及其制备方法
CN105200008A (zh) * 2015-10-23 2015-12-30 新乡医学院 干细胞培养基

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021122206A (ja) * 2020-02-03 2021-08-30 株式会社フルステム エクソソーム産生促進剤及びエクソソーム産生促進方法
JP7026407B2 (ja) 2020-02-03 2022-02-28 株式会社フルステム エクソソーム産生促進剤及びエクソソーム産生促進方法
KR102184428B1 (ko) * 2020-05-25 2020-11-30 주식회사 씨케이엑소젠 중배엽줄기세포 유래의 엑소좀 생산방법 및 이로부터 제조된 배양액
WO2021241798A1 (ko) * 2020-05-25 2021-12-02 주식회사 씨케이엑소젠 중배엽줄기세포 유래의 엑소좀 생산방법 및 이로부터 제조된 배양액
US11879138B2 (en) 2020-05-25 2024-01-23 Ck-Exogene Co., Ltd. Method for preparing mesenchymal stem cell-derived exosomes and culture solution produced from the same
KR20220080050A (ko) * 2020-06-05 2022-06-14 주식회사 셀파크글로벌 모유두전구세포로부터 분리된 엑소좀 및 이의 용도
WO2022119417A1 (ko) * 2020-12-04 2022-06-09 주식회사 프리모리스 리포폴리사카라이드와 리포테이코산을 활용한 항염 및 재생 기능이 강화된 고농도 줄기세포 엑소좀 생산 방법

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