CN113388584A - 一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法及其应用，包括如下步骤：（1）目标基因（胶原蛋白基因或各种皮肤损伤修复相关生长因子）表达载体的构建；获取或构建外泌体的胞浆运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒、目标基因mRNA包装质粒；（2）混合质粒共转染HEK293F细胞或间充质干细胞并培养；（3）促进皮肤组织修复的工程化外泌体的分离：收集上述转染后HEK293F细胞或间充质干细胞的培养液，离心过滤得到培养液中的外泌体。本发明提取分离的外泌体可以作为化妆品的成分添加到护肤品和医用产品中，外泌体中的胶原蛋白mRNA或生长因子mRNA会被递送到皮肤成纤维细胞并在其中表达成蛋白质，该种外泌体可以用于皮肤损伤和衰老皮肤的修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进皮肤组织损伤修复用工程化外泌体的制备方法及其应用。
背景技术
外泌体(Exosome)是各种细胞分泌的40-100纳米的微小囊泡物，它是一种非可溶性的微囊泡结构，是近年来发现的细胞间信号通讯的重要途径，也是是细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式。Exosome的特性主要有：(1)直径为40～100nm；(2)具有来源细胞的胞质和脂质胞膜成分；(3)密度为1.13～1.19g/ml；(4)含有其来源细胞的特异性蛋白及exosome相关蛋白如CD9、CD81、Alix、TSG等。Exosome成分主要包括：微小RNA(microRNA)，信使RNA(mRNA)，胞内蛋白和膜表面标记等，蛋白组学分析发现exosome的蛋白组成较为复杂，不同细胞来源的exosome蛋白组成亦有差异。
当皮肤遭遇创伤、紫外线灼伤或者衰老、具有皱纹时，补充胶原蛋白已被证明是有助于损伤的修复。然而，如何将高剂量胶原蛋白和表皮生长因子导入创面皮肤上并且保持高效作用是技术难题。因此，有必要提供一种稳定、高效的促进皮肤组织修复的工程化外泌体的制备方法及其应用。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供一种用于皮肤组织和衰老皮肤的修复或者紫外线灼伤后修复、烧伤后修复的促进皮肤组织修复的工程化外泌体的制备方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)目标基因表达载体的构建；获取或构建外泌体胞浆运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒、目标基因mRNA包装质粒；所述的目标基因表达载体为Ⅰ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅱ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅲ型胶原蛋白基因表达载体和各种促皮肤损伤后修复相关生长因子基因表达载体的一种或几种；所述的目标基因为胶原蛋白基因和 /或各种促皮肤损伤修复相关生长因子基因；
(2)由目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒组成的混合质粒共转染HEK293F细胞或间充质干细胞并培养；
(3)促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的分离：
收集上述转染后HEK293F细胞或间充质干细胞的培养液，过滤得到培养液中的外泌体。
为了便于描述，本发明使用的所有质粒见下表1。
表1本发明所用质粒汇总表
具体地，所述的Ⅰ型胶原蛋白基因表达载体为pGmH1:pcDNA3.1-Ⅰ型胶原蛋白基因-C/Dbox-pAbGH，Ⅱ型胶原蛋白基因表达载体为pGmH2:pcDNA3.1-Ⅱ型胶原蛋白基因 -C/Dbox-pAbGH，Ⅲ型胶原蛋白基因表达载体为pGmH3:pcDNA3.1-Ⅲ型胶原蛋白基因 -C/Dbox-pAbGH，生长因子基因表达载体为pGmH4:pcDNA3.1-生长因子基因-C/Dbox-pAbGH；所述的外泌体胞浆运送辅助质粒pGmH5:pcDNA3.1-Cx43S368A-pAbGH；所述的促外泌体分泌质粒为pGmH7:pcDNA3.1-STEAP3-p2A-SDC4-p2A-NadB-pAbGH；所述的目标基因mRNA包装质粒为pGmH6:pcDNA3.1-CD63-L7Ae-pAbGH。长期活跃的 Cx43S368A突变体是一个比野生型Cx43更有效的胞浆递送助手。而质粒pGmH7设有3 个基因STEAP3、SDC4、NadB，作为合成外部体生产助推器，这些基因的联合表达显著增加了外泌体的产生。将L7Ae(一种古细菌核糖体大亚基L7蛋白的一段多肽基序) 融合到到CD63的C末端，并在目标基因的3′-非翻译区(3′-UTR)中插入一个C/Dbox 序列，通过L7Ae和C/Dbox识别把目标核酸装载利用CD63蛋白锚定到外泌体膜上。
步骤(1)中，目标基因表达载体在构建时，直接合成目标基因且在目标基因3′-UTR区设置C/Dbox并一起插入pcDNA3.1载体中。
作为进一步的技术方案，在步骤(3)的具体过程为：收集HEK293F细胞或间充质干细胞培养液，在离心力600-700g条件下、0-4℃离心15-20分钟，取上清在离心力 11000g-12000g条件下、0-4℃离心25-30分钟，再用0.22μm滤膜过滤，取滤液在离心力150000-170000g条件下、0-4℃离心2-4小时，用4℃的PBS溶液洗涤沉淀，得到促进皮肤组织修复的工程化外泌体。采用不断提高的离心转速，去除细胞和细胞碎片，最终获得高浓度、高纯度的工程化外泌体。
进一步地，所述的促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体保藏条件为：pH值在5-7 范围内，0-4℃。
在步骤(2)中，目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒共转染HEK293F细胞或间充质干细胞后，37℃恒温培养并通入5％的CO2、4-7％的氧气，经过50-55h后，得到HEK293F细胞或间充质干细胞的培养液；共转染时，目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒的摩尔质量比为:1-2.5:0.5-1：0.8-1.2：0.5-1。
具体地，在步骤(2)中，混合质粒共转染HEK293F细胞的过程为：
1)细胞培养：在培养皿中，加入10-15mL DMEM培养基；HEK293F细胞的接种数量为2*106个/ml，悬浮培养温度控制在37℃并保持5％的CO2，在细胞数量达到1.2*107个/ml，用于细胞转染；
2)质粒DNA的稀释：用0.5ml无血清的Opti-MEM培养液稀释30μg的混合质粒；
3)在0.5ml含有上述混合质粒的Opti-MEM稀释液中加入35-50μl的LipofectamineTM LTX with PLUSTM转染试剂，使混合质粒与LipofectamineTM LTX形成稳定的复合物；
4)在培养皿中，逐滴加入0.5ml的混合质粒-LipofectamineTM LTX的复合物，摇匀；
5)将转染后的HEK293F细胞置于37℃并保持5％的CO2、4-7％的氧气的培养箱中，培养 50-55h。培养箱中，还具有88％-91％氮气。
在以上制备过程中，采用低氧(且低氧为4-7％)，本发明申请人发现相比常规氧气浓度、更低氧气浓度能够显著提高外泌体分泌数量以及外泌体中目标基因核酸的装载量。
本发明还提供前述的制备方法得到的促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体。
本发明的另一个目的是提供前述的工程化外泌体在促进皮肤组织修复、提高皮肤弹性或抑制皮肤衰老中的作用。
本发明的又一个目的是提供前述的工程化外泌体在制备促进皮肤组织修复或抑制皮肤衰老的药物或化妆品中的用途。
相对于现有技术，本发明的有益效果：提取分离的外泌体可以作为化妆品的成分添加到护肤品和医用面膜中，外泌体中的胶原蛋白mRNA或生长因子mRNA会被递送到皮肤成纤维细胞并在其中表达成蛋白质，该种外泌体可以用于皮肤损伤和衰老皮肤的修复或者紫外线灼伤后修复、灼烧后修复。本发明提取的外泌体可添加到药物中(例如以凝胶形式)，用于皮肤损伤和衰老皮肤的修复或者紫外线灼伤后修复、烧伤后修复。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的实施方式作更进一步的说明。
实施例1
目标基因表达载体的构建；获取(通过如华大基因或金斯瑞等公司合成)或构建外泌体胞浆运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒、目标基因mRNA包装质粒；所述的目标基因表达载体为Ⅰ型胶原蛋白基因表达载体(pGmH1)、Ⅱ型胶原蛋白基因表达载体 (pGmH2)、Ⅲ型胶原蛋白基因表达载体(pGmH3)和生长因子基因表达载体(pGmH4) 的一种或几种；所述的目标基因为胶原蛋白基因和/或生长因子基因；
所述的外泌体胞浆运送辅助质粒为pcDNA3.1-Cx43S368A-pAbGH(pGmH5)；所述的促外泌体分泌质粒为pLBT，即pcDNA3.1-STEAP3-p2A-SDC4-p2A-NadB-pAbGH(pGmH7)；所述的目标基因mRNA包装质粒为pcDNA3.1-CD63-L7Ae-pAbGH(pGmH6)。
目标基因表达载体在构建时，直接合成目标基因且在目标基因3′端设置C/Dbox并一起插入pcDNA3.1载体中。长期活跃的Cx43S368A突变体是一个比野生型Cx43更有效的胞浆递送助手。而pGmH7(其设有3个基因STEAP3、SDC4、NadB)作为合成外泌体生产助推器，这些基因的联合表达显著增加了外泌体的产生。将L7Ae连接到CD63 的C末端，并在目的基因的3′-非翻译区(3′-UTR)中插入一个C/Dbox，通过L7Ae 和CDbox识别把目标核酸装载到外泌体膜上。
实施例2
由目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒组成的混合质粒共转染HEK293F细胞或间充质干细胞并培养；
1)细胞培养：在培养皿中，加入10mL DMEM培养基；HEK293F细胞的接种数量为2*106个/ml，悬浮培养温度控制在37℃并保持5％的CO2，在细胞数量达到1.2*107个/ml，用于细胞转染；
2)质粒DNA的稀释：用0.5ml无血清的Opti-MEM培养液稀释30μg的混合质粒；混合质粒中，目标基因表达载体、胞浆运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒、RNA包装质粒的质量比为:1.5:0.5：0.8：0.5；
3)在0.5ml含有上述混合质粒的Opti-MEM稀释液中加入40μl的LipofectamineTMLTX with PLUSTM转染试剂，使混合质粒与LipofectamineTM LTX形成稳定的复合物；
4)在培养皿中，逐滴加入0.5ml的混合质粒-LipofectamineTM LTX的复合物，摇匀；
5)将转染后的HEK293F细胞置于37℃并保持5％的CO2、5％的氧气的培养箱中，培养50h。培养箱中，还含有90％氮气。
实施例3
外泌体分离
收集HEK293F细胞或间充质干细胞细胞培养液，在离心力700g条件下、4℃离心15分钟，取上清在离心力12000g条件下、4℃离心25分钟，再用0.22μm滤膜过滤，取滤液在离心力170000g条件下、4℃离心2小时，用4℃的PBS溶液洗涤沉淀，得到促进皮肤组织修复的工程化外泌体，保藏条件为：pH值为7，4℃。
对比例1
其外泌体制备方法与实施例1-3类似，区别仅在于不使用外泌体胞浆运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒、目标基因mRNA包装质粒，仅用目标基因表达载体转染HEK293F 细胞。
对比例2
其外泌体制备方法与实施例1-3类似，区别仅在于转染后的HEK293F细胞培养时间为30h。
针对实施例1-3制得的外泌体(其中转染细胞为HEK293F细胞，目标基因表达载体为Ⅰ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅱ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅲ型胶原蛋白基因表达载体、生长因子基因表达载体的混合物，四种基因表达载体的质量比为1:1:1:1)、对比例1制得的外泌体、对比例2制得的外泌体进行比较，得出实施例1-3制得的外泌体(即产品1)、对比例1制得的外泌体(即产品2，制备过程中所用转染细胞与基因表达载体同产品1)、对比例2制得的外泌体(即产品3，制备过程中所用转染细胞与基因表达载体同产品1)的量为5.2g、0.2g、3.6g。
实施例4工程化外泌体的用途
本发明提取分离的外泌体可以作为化妆品的成分添加到护肤品和医用面膜中，外泌体中的胶原蛋白mRNA或生长因子mRNA会被递送到皮肤成纤维细胞并在其中表达成蛋白质，该种外泌体可以用于皮肤损伤和衰老皮肤的修复或者紫外线灼伤后修复、灼烧后修复。
本发明提取的外泌体可添加到药物中(例如以凝胶形式)，用于皮肤损伤和衰老皮肤的修复或者紫外线灼伤后修复、烧伤后修复。
实施例5
添加工程化外泌体的化妆品或药品
将10份工程化外泌体(实施例1-3制得的产品1(其中转染细胞为HEK293F细胞，胶原蛋白基因表达载体为Ⅰ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅱ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅲ型胶原蛋白基因表达载体、生长因子基因表达载体的混合物，四种基因表达载体的质量比为1:1:1:1)、对比例1制得的产品2或对比例2制备的产品3)，以及5份透明质酸钠、甘油0.5份、吐温20 0.3份、去离子水10份、茉莉花提取物0.5份、乙二胺四乙酸二钠0.1份在室温条件下充分混匀，制备得到添加工程化外泌体的化妆品或药品。所述的份数为重量份数。此外，阴性对照产品中不含外泌体。阴性对照产品为产品4(组分与前述产品类似，仅少了外泌体)。
实施例6
征集浅Ⅱ度烫伤患者32名(18-35岁)，随机分成4组(每组8人)，第一组在患处均匀涂抹产品1，第二组在患处均匀涂抹产品2，第三组在患处均匀涂抹产品3，第四组为阴性对照组(在患处均匀涂抹不含外泌体的阴性对照产品4)。每天早晚各治疗一次，连续治疗7天，观察伤口的愈合时间。结果如下表2。
表2烫伤患者伤口的愈合时间
| 伤口愈合时间(天) | |
| 第一组 | 10.2 |
| 第二组 | 20.1 |
| 第三组 | 11.5 |
| 第四组 | 25.3 |
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）目标基因表达载体的构建；获取或构建外泌体胞浆运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒、目标基因mRNA包装质粒；所述的目标基因表达载体为Ⅰ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅱ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅲ型胶原蛋白基因表达载体和生长因子基因表达载体的一种或几种；所述的目标基因为胶原蛋白基因和/或各种促皮肤损伤修复相关生长因子基因；
（2）由目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒组成的混合质粒共转染HEK293F细胞或间充质干细胞并培养；
（3）促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的分离：收集上述转染后HEK293F细胞或间充质干细胞的培养液，过滤得到培养液中的外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述的Ⅰ型胶原蛋白基因表达载体为pGmH1:pcDNA3.1-Ⅰ型胶原蛋白基因-C/Dbox-pAbGH; pGmH2:Ⅱ型胶原蛋白基因表达载体为pcDNA3.1-Ⅱ型胶原蛋白基因-C/Dbox-pAbGH;pGmH3:Ⅲ型胶原蛋白基因表达载体为pcDNA3.1-Ⅲ型胶原蛋白基因-C/Dbox-pAbGH，各种促皮肤损伤修复相关生长因子基因表达载体为pGmH4:pcDNA3.1-生长因子基因-C/Dbox-pAbGH；所述的外泌体胞浆运送辅助质粒为pGmH5:pcDNA3.1- Cx43S368A-pAbGH；所述的促外泌体分泌质粒为pGmH7:pcDNA3.1-STEAP3-p2A-SDC4- p2A-NadB-pAbGH；所述的目标基因mRNA包装质粒为pGmH6:pcDNA3.1-CD63-L7Ae-pAbG。
3.根据权利要求2所述的一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，目标基因表达载体在构建时，直接合成目标基因且在目标基因3’UTR区设置一段核酸序列C/Dbox并一起插入pcDNA3.1载体中。
4.根据权利要求1所述的一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤（3）的具体过程为：收集HEK293F细胞或间充质干细胞培养液，在离心力600-700g条件下、0-4℃离心15-20分钟，取上清在离心力11000g-12000g条件下、0-4℃离心25-30分钟，再用0.22µm滤膜过滤，取滤液在离心力150000-170000g条件下、0-4℃离心2-4小时，用4℃的PBS溶液洗涤沉淀，得到促进皮肤组织修复的工程化外泌体。
5.根据权利要求1或2所述的一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，由目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒共转染HEK293F细胞或间充质干细胞后，37℃恒温培养并通入5%的CO2、4-7%的氧气，经过50-55h后，得到HEK293F细胞或间充质干细胞的培养液；共转染时，由目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒的摩尔质量比为:1-2.5:0.5-1：0.8-1.2：0.5-1。
6.根据权利要求1所述的一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，混合质粒共转染HEK293F细胞的过程为：
1）细胞培养：在培养皿中，加入10-15mL DMEM培养基；HEK293F细胞的接种数量为2*106个/ml，悬浮培养温度控制在37℃ 并保持5%的CO2，在细胞数量达到1.2*107个/ml，用于细胞转染；
2）质粒DNA的稀释：用0.5ml无血清的Opti-MEM培养液稀释30μg的混合质粒；
3）在0.5ml含有上述混合质粒的Opti-MEM稀释液中加入35-50μl的Lipofectamine™LTX with PLUS™转染试剂，使混合质粒与Lipofectamine™ LTX形成稳定的复合物；
4）在培养皿中，逐滴加入0.5ml的混合质粒-Lipofectamine™ LTX的复合物，摇匀；
5）将转染后的HEK293F细胞置于37℃ 并保持5%的CO2、4-7%的氧气的培养箱中，培养50-55h。
7.权利要求1-6任意一项制备得到的促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体。
8.权利要求7所述的工程化外泌体在促进皮肤组织修复、提高皮肤弹性或抑制皮肤衰老中的作用。
9.权利要求7所述的工程化外泌体在制备促进皮肤组织修复或抑制皮肤衰老的药物或化妆品中的用途。
10.含有权利要求7所述的工程化外泌体的化妆品或药物。
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