CN111000868B - 低氧处理的干细胞外泌体在制备用于治疗脊髓损伤的药物或支架材料中的应用 - Google Patents

低氧处理的干细胞外泌体在制备用于治疗脊髓损伤的药物或支架材料中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低氧处理的干细胞外泌体在制备用于治疗脊髓损伤的药物或支架材料中的应用，所述低氧处理的干细胞外泌体的制备方法包括步骤：(1)对干细胞进行低氧刺激处理，改变干细胞所产生的外泌体；所述低氧刺激处理的条件为：氧气体积百分比1％～5％，二氧化碳体积百分比2％～8％，温度30～37℃；(2)收集处理后干细胞的培养上清液，将所述培养上清液冷冻离心得到所述的干细胞外泌体。

Description

低氧处理的干细胞外泌体在制备用于治疗脊髓损伤的药物或 支架材料中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种低氧处理的干细胞外泌体在制备用于治疗脊髓损伤的药物或支架材料中的应用。
背景技术
脊髓是维持人体正常生理活动的重要神经组织，然而由于外伤等导致的脊髓损伤一直威胁着人类的正常生活。更为严重的是，神经系统自我修复能力较弱，脊髓损伤的病程会十分漫长甚至伴随患者一生。过去的几十年中，中国的脊髓损伤发病率急剧上升，在所有外伤发生中占比0.74％，其中绝大部分损伤发生于交通事故和高空掉落。严重的损伤通常会导致患者下肢瘫痪，损伤部位上移会造成高位截瘫甚至死亡，极大地影响患者生活质量，同时会消耗大量人力物力，为患者家属和社会造成负担。因此，开发安全、有效、可治愈的脊髓损伤治疗手段迫在眉睫。
干细胞具有自我更新、多向分化等特点，在科研中广泛使用，更有部分研究已进展到临床阶段。干细胞现多用于再生医学领域的研究，如骨再生、缺血性损伤修复、神经修复等。多数观点认为干细胞的促进再生作用主要依赖于旁观者效应而非分化潜能，即干细胞通过分泌多肽、蛋白、基因或其它物质的作用来影响受体细胞的生理状态。外泌体这种由细胞产生的囊泡被认为是干细胞促进再生的重要途径之一。外泌体的内部包含丰富物质，如DNA、mRNA、miRNA、蛋白质等，肩负着细胞间信息交流、物质运输等重要作用。其粒径较小，介于40nm到150nm之间，容易透过身体的各种屏障；质膜衍生的磷脂双分子层结构使其在体内稳定存在并进行长循环；细胞来源使其拥有较低的免疫原性。以上诸多特征使得外泌体成为优秀的治疗手段，提纯干细胞的外泌体更有望实现组织损伤的高效修复。
在脊髓损伤部位会形成缺氧的微环境，而干细胞具有向缺氧、炎症等损伤部位的天然趋向性并且能够根据损伤部位的情况分泌相应的物质进行调节，改善损伤部位的微环境。但过于恶劣的微环境会降低移植干细胞的活性，阻碍其发挥组织修复功能。作为不具有细胞活性的囊泡，外泌体不会受到微环境的影响。不仅如此，外泌体还是细胞与外界沟通的途径之一，可以根据细胞所处环境的改变发生相应的变化。因此，模拟损伤部位的缺氧微环境处理干细胞并收集外泌体，可以获得“一石二鸟”的效果，既避免了损伤部位对干细胞活性的严重影响，又能够获得干细胞针对缺氧而分泌的响应性物质。
综上，低氧处理的干细胞外泌体对脊髓损伤的治疗具有较好的应用前景和研究意义。
发明内容
针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种低氧处理的干细胞外泌体在制备用于治疗脊髓损伤的药物或支架材料中的应用。
低氧处理的干细胞外泌体在制备用于治疗脊髓损伤的药物或支架材料中的应用，所述低氧处理的干细胞外泌体的制备方法包括步骤：
(1)对干细胞进行低氧刺激处理，改变干细胞所产生的外泌体；
所述低氧刺激处理的条件为：氧气体积百分比1％～5％，二氧化碳体积百分比2％～8％，温度30～37℃；
(2)收集处理后干细胞的培养上清液，将所述培养上清液冷冻离心得到所述的干细胞外泌体。
本发明将干细胞在低氧条件下进行培养，促进其外泌体对脊髓损伤组织的修复能力。经低氧刺激后，干细胞增殖没有受到显著性影响，仍保持分泌外泌体的能力，外泌体轮廓清晰、完整。
低氧条件处理时，若氧气浓度过低，则干细胞过度缺氧发生死亡，无法分离合适的外泌体；若氧气浓度过高，则无法达到低氧处理的效果。所以本发明限定氧气体积百分比1％～5％。
所述低氧刺激处理的时间优选为5min～72h。考虑到培养时间不足则无法收集获得一定量的外泌体；若低氧条件下培养时间过久，则影响干细胞活性，或由于干细胞大量增殖产生接触抑制从而分泌出不良产物，甚至发生细胞死亡，影响外泌体的纯度和外泌体内容物。因此，所述低氧刺激处理的时间进一步优选为6～24h。
作为优选，在步骤(1)前，先对干细胞进行初步处理；
所述初步处理的条件为：干细胞传代后置于正常条件下培养6～72h，并于所述低氧刺激处理前更换新的培养基；
所述正常条件为：氧气体积百分比19％～21％，二氧化碳体积百分比4.5％～5.5％，温度36～37℃；
所述培养基为间充质干细胞完全培养基。
干细胞传代后先置于正常孵箱中培养一段时间，保证干细胞能够贴壁并增殖到对数生长期。若不置于正常孵箱中培养或培养时间过短，则干细胞活性受到影响，外泌体分泌量降低；若正常孵箱中放置时间过久，则该阶段产生常氧状态外泌体而非低氧外泌体。作为优选，干细胞传代后置于正常条件下培养6～48h。
作为优选，所述间充质干细胞完全培养基添加已除外泌体的血清，所述血清与所述间充质干细胞完全培养基的体积百分比不大于20％。所述已除外泌体的血清可通过离心、弃去沉淀取上清液的方式得到。
作为优选，步骤(2)中，所述冷冻离心的条件为：离心力不小于100000g，离心时间3～4h，温度0～4℃。
本发明制备方法得到的干细胞外泌体可用于脊髓损伤后的埋植治疗及尾静脉注射治疗。
本发明所述的支架材料可以是生物支架材料。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：
(1)本发明方法无需其它试剂，仅通过低氧条件下培养便可制得；
(2)低氧处理不会显著影响干细胞的活性，所产生的外泌体仍保持完整；
(3)本制备方法简单，易于控制；
(4)制得的干细胞外泌体在脊髓损伤中的修复效果优于普通外泌体，证明所述外泌体具有良好的应用前景和研究价值。
附图说明
图1为经低氧处理的干细胞外泌体治疗的脊髓损伤大鼠的体重变化图；
图2为经低氧处理的干细胞外泌体治疗的脊髓损伤大鼠运动功能评分图；
图3为假手术组大鼠和经低氧处理的干细胞外泌体治疗大鼠的主要器官H&E染色结果，图中标尺：100μm。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1、低氧处理的干细胞外泌体的制备方法：
利用超速冷冻离心机去除血清中的外泌体，离心条件为：离心力为100,000g，离心时间为3h，温度为4℃；
用间充质干细胞培养基(按照体积百分比添加10％不含外泌体的血清)重悬干细胞，接种于培养瓶中，置于孵箱中正常培养48h，培养条件为：氧气浓度为20％，二氧化碳浓度为5％，温度为37℃；
正常培养结束后，更换新的培养基并将干细胞转移到低氧箱中继续培养24h，低氧箱的低氧条件为：氧气浓度为1％，二氧化碳浓度为5％，温度为37℃；
收集低氧处理后的干细胞培养液，利用超速冷冻离心机提取外泌体，离心条件为：离心力为100,000g，离心时间为3h，温度为4℃。
2、透明质酸(HA)水凝胶支架的制备方法：
在HA的分子链上分别接枝醛基和氨基，并通过席夫碱缩合反应制备水凝胶支架。
称取分子量为2.3MDa的HA 500mg溶于150mL超纯水中。称取NaIO4 134mg溶于13.4mL水中，并在避光条件下逐滴加入HA水溶液，搅拌反应2d。加入600μL乙二醇，继续搅拌1h。透析3d后冻干即得醛基修饰的HA。
称取分子量为1.3MDa的HA 270mg溶于150mL超纯水中，加入己二酸二酰肼(ADH)4.644g搅拌均匀。将0.96g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.675g 1-羟基苯并三氮唑溶于10mL二甲基亚砜和水的1:1混合溶液中，并逐滴加入HA溶液中，维持pH 6.8搅拌4h。调节pH至7.0终止反应，透析3d后冻干即得氨基修饰的HA。
将醛基修饰的HA溶于PBS缓冲液使其浓度为10mg/mL。另取适量PPFLMLLKGSTR多肽溶于400μL二甲基亚砜中，与1mL醛基修饰的HA溶液搅拌2h。透析1d后冻干即得肽修饰的HA。
将氨基修饰的HA溶解于PBS缓冲液配制成12mg/mL的溶液，将肽修饰的HA溶解于PBS缓冲液配制成20mg/mL的溶液，将二者等体积混合后静置即可成胶。
3、动物实验：
(1)脊髓损伤(SCI)模型的建立：
选择体重在220～250g的雌性SD大鼠进行SCI模型建立手术；
用1％戊巴比妥钠麻醉大鼠，将麻醉后的大鼠背部毛发剃除，找到脊椎T9-T10段并以此为中心，用手术刀上下各切开2cm暴露脊椎背板，分离T9-T10段脊椎两侧肌肉。
将游离肌肉组织的脊椎切开，使脊髓暴露并剪断。将含有100μg蛋白量的低氧处理后干细胞外泌体的30μL PBS悬液利用微量移液器注入制得的水凝胶支架中并移植到脊髓损伤处。缝合伤口，涂抹碘酊以免感染。
对照组剪断脊髓后不做任何治疗处理；空白支架组在剪断脊髓后移植空白的水凝胶支架；注射外泌体组在造模同时将普通外泌体经尾静脉注射；外泌体-支架组为将普通外泌体分散于支架后移植到脊髓损伤处；低氧外泌体-支架组为将低氧处理后的干细胞外泌体分散于支架后移植到脊髓损伤处；假手术组仅打开椎板不损伤脊髓组织。
(2)以造模当天为第0天，分别于第7、14、21、28天对大鼠进行Basso BeattieBresnahan(BBB)测试和评分，用于估计大鼠神经恢复情况。
如图1所示，经过低氧处理后的干细胞外泌体治疗后的大鼠能够基本保持稳定的体重增长，未见体重持续或大幅骤降的现象，暗示了低氧处理的干细胞外泌体对于脊髓损伤大鼠具有稳定机体生理活动的作用。
如图2所示，在所有实验组别中，低氧处理后的干细胞外泌体-支架组治疗实现了最佳的运动功能恢复效果，并且促进了脊髓损伤大鼠运动功能在早期的快速恢复。
造模28天后，处死大鼠取主要脏器进行苏木精-伊红染色(H&E染色)，对低氧处理的干细胞外泌体的安全性进行考察。
如图3所示，对经过低氧处理干细胞外泌体治疗的大鼠全身组织，包括心脏、肝脏、脾脏和肺组织的H&E染色观察，皆未见外泌体治疗对全身组织的毒性作用，进一步说明了该策略的安全性。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种低氧处理的干细胞外泌体在制备用于治疗脊髓损伤的支架材料中的应用，其特征在于，所述低氧处理的干细胞外泌体的制备方法包括步骤：
(1)对干细胞进行低氧刺激处理，改变干细胞所产生的外泌体；
所述低氧刺激处理的条件为：氧气体积百分比1％～5％，二氧化碳体积百分比2％～8％，温度30～37℃；
(2)收集处理后干细胞的培养上清液，将所述培养上清液冷冻离心得到所述的干细胞外泌体；
所述支架材料包括透明质酸水凝胶支架，所述透明质酸水凝胶支架的制备方法：称取分子量为2.3MDa的透明质酸500mg溶于150mL超纯水中，称取NaIO4 134mg溶于13.4mL水中，并在避光条件下逐滴加入透明质酸水溶液，搅拌反应2d，加入600μL乙二醇，继续搅拌1h，透析3d后冻干即得醛基修饰的透明质酸；
称取分子量为1.3MDa的透明质酸270mg溶于150mL超纯水中，加入己二酸二酰肼4.644g搅拌均匀，将0.96g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.675g 1-羟基苯并三氮唑溶于10mL二甲基亚砜和水的1:1混合溶液中，并逐滴加入透明质酸溶液中，维持pH 6.8搅拌4h，调节pH至7.0终止反应，透析3d后冻干即得氨基修饰的透明质酸；
将醛基修饰的透明质酸溶于PBS缓冲液使其浓度为10mg/mL，另取适量PPFLMLLKGSTR多肽溶于400μL二甲基亚砜中，与1mL醛基修饰的透明质酸溶液搅拌2h，透析1d后冻干即得肽修饰的透明质酸；
将氨基修饰的透明质酸溶解于PBS缓冲液配制成12mg/mL的溶液，将肽修饰的透明质酸溶解于PBS缓冲液配制成20mg/mL的溶液，将二者等体积混合后静置即可成胶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述低氧刺激处理的时间为5min～72h。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述低氧刺激处理的时间为6～24h。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤(1)前，先对干细胞进行初步处理；
所述初步处理的条件为：干细胞传代后置于正常条件下培养6～72h，并于所述低氧刺激处理前更换新的培养基；
所述正常条件为：氧气体积百分比19％～21％，二氧化碳体积百分比4.5％～5.5％，温度36～37℃；
所述培养基为间充质干细胞完全培养基。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞完全培养基添加已除外泌体的血清，所述血清与所述间充质干细胞完全培养基的体积百分比不大于20％。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，干细胞传代后置于正常条件下培养6～48h。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冷冻离心的条件为：离心力不小于100000g，离心时间3～4h，温度0～4℃。
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