CN112007049A - 一种用于治疗膝骨关节炎的干细胞外泌体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗膝骨关节炎的干细胞外泌体组合物，该组合物主要成分是干细胞来源的外泌体，配合透明质酸或PRP联合用来治疗膝骨关节炎的组合物，组合物更佳稳定，可有效治疗膝骨关节炎。

Description

一种用于治疗膝骨关节炎的干细胞外泌体组合物
技术领域
本发明涉及一种用于治疗膝骨关节炎的干细胞外泌体组合物，属于细胞工程领域。
背景技术
膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一种常见的慢性关节疾病，又叫做退行性关节炎，以关节软骨原发性或者是继发性退行性病变以及骨质增生为特征。中老年人常见，主要侵害膝关节软骨、骨和滑膜组织。病发期间患者会出现关节疼痛、肿胀、变形，严重时可以出现膝关节畸形。流行病学数据显示，国内的骨关节炎发病率约为10％，大约有1.5亿的的患病人群基数，其中约50％为膝骨关节炎患者。随着世界范围内人口老龄化，膝关节骨关节炎的发病率逐年增高。目前，临床上治疗膝骨关节炎患者的方法较多，主要分为非手术治疗和手术治疗两类。非手术治疗以口服非甾体类抗炎药、膝关节腔内注射药物和康复锻炼为主，手术治疗以膝关节腔持续冲洗与清理术、全膝关节置换术、膝关节单踝置换术等为主。虽能缓解近期疼痛改善症状，但远期效果不佳。因此，有效的预防和治疗KOA成为改善中老年人生活质量的关键所在。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在特定条件下可分化为肝细胞、胰岛样细胞、骨细胞、心肌细胞等，其不表达MHCII类分子，不表达或低表达MHCI类分子，异基因移植时不会发生明显的免疫排斥反应。因此，MSCs已成为细胞替代治疗中的主要选择细胞，被广泛应用于多种疾病如糖尿病、肝硬化、红斑狼疮、肝衰竭、下肢缺血性疾病等的治疗。同时，MSCs还具有免疫调节、抑制炎症反应、组织修复的功能，因而为膝骨关节炎的治疗提供了全新的前景。但是直接使用单一的间充质干细胞关节腔注射治疗膝骨关节炎，发现单一细胞容易流失，局部微环境也影响细胞发挥作用。因此。需要探索一种新的更稳定的干细胞来源的因子或产品，来更好地发挥疗效。
外泌体，是由细胞分泌的包含了复杂RNA和蛋白质的微小囊泡，直径在30-150nm，具有脂质双层膜结构。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“Exosome”。人体几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体。外泌体的功能取决于其来源的细胞类型，其在机体免疫应答、细胞分化、细胞通讯和组织稳态等方面发挥重要作用，在组织再生、创伤医学、精准诊断、精准治疗等方面具有良好的临床应用前景。有研究表明干细胞来源的外泌体与靶细胞通过膜融合或者内吞作用后将生物活性物质转运至靶细胞，介导细胞间通讯并影响靶细胞功能，还具有抑制炎症反应、免疫调节、血管生成、参与组织修复的功能。与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。目前发现间充质干细胞是分泌外泌体能力最强的细胞，其可通过特定的信号轴来调控外泌体的释放。但是目前临床研究都是选用的常规二维培养的间充质干细胞，膝骨关节炎内部处于缺氧的环境，因此可以探讨低氧环境下间充质干细胞的外泌体对膝骨关节炎的治疗作用。
PRP(Platelet Rich Plasma)即富血小板血浆，是全血经过离心、分离而得到的血小板浓缩制品。PRP中的血小板，通过氯化钙和凝血酶激活剂后，其α颗粒能够释放出大量细胞生长因子，包括转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等，它们可促进血管生长、修复细胞、生成新生组织、控制炎症、促进肌肉再生等。一般认为，PRP中的血小板浓度应达到外周血血小板浓度的4倍以上，而含有的生长因子浓度也应在3倍以上。PRP来源于自体血液，无免疫排斥和疾病传播风险，安全可靠，目前已被成功地应用于促进创伤愈合以及骨再生等医疗领域，例如牙周组织再生、口腔种植、整形外科、急性创伤以及组织工程等。因此，PRP在未来人体组织再生、修复等领域将有很好的应用前景。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种用于治疗膝骨关节炎的干细胞外泌体组合物，该组合物主要成分是干细胞来源的外泌体，和透明质酸或PRP联合用来治疗膝骨关节炎的组合物，组合物更加稳定，可有效治疗膝骨关节炎。
一种用于治疗膝骨关节炎的干细胞外泌体组合物，包括干细胞外泌体和药物载体；
所述药物载体是自体富血小板血浆(PRP)、注射用生理盐水、透明质酸中的一种。
进一步的，上述干细胞外泌体在干细胞外泌体组合物中的终浓度为0.3-3mg/mL。
进一步的，上述自体富血小板血浆(PRP)的制备方法：抽取患者自体外周血经两步离心法分离得到自体富血小板血浆。
进一步的，所述干细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：
1)利用新生儿脐带组织分离获得脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)获得的脐带间充质干细胞放于低氧环境中传代培养，获得低氧状态下培养的P3代脐带间充质干细胞；
3)将步骤2)中获得P3代脐带间充质干细胞经过消化后接种到No-exo-FBS完全培养基中放入低氧环境中继续传代获得P4代脐带间充质干细胞；
4)收集P4代脐带间充质干细胞的外泌体，即可获得干细胞外泌体。
进一步的，上述步骤2)和步骤3)中所述的低氧环境指氮气浓度为90-94％，二氧化碳浓度为5％，氧气浓度为1-5％的环境。
进一步的，上述步骤3)中所述的No-exo-FBS完全培养基的制备方法为：取去除外泌体的胎牛血清加入α-MEM培养基中，即可获得No-exo-FBS完全培养基；所述去除外泌体的胎牛血清的添加量为No-exo-FBS完全培养基总质量的10％。
有益效果：
(1)本发明提供的干细胞来源的外泌体组合物可有效治疗膝骨关节炎，外泌体更稳定，更容易质控，和透明质酸或PRP联合效果优于单纯的干细胞或透明质酸、PRP治疗。
(2)本发明采用的药物载体为自体富血小板血浆PRP，来源于供者自身，无免疫排斥反应，同时富含多种细胞因子，可促进干细胞外泌体发挥作用。
(3)本发明采用的脐带间充质干细胞为低氧条件下培养的细胞，模拟膝骨关节炎患者体内缺氧的环境，关节软骨是一种无血管组织，它的营养和氧气均由扩散而来，有研究发现关节表面的氧分压为6％-10％，而骨关节深处的氧分压为1％-6％。缺氧条件下培养的干细胞再植入膝关节，可以更好地存活，进而发挥组织修复和免疫调节作用。
(4)将干细胞外泌体组合物灌装到预灌装针中，使用时直接将塞子换成针头，可避免二次操作带来的污染。
附图说明
图1组织块贴壁法培养的脐带间充质干细胞。
图2传代培养的脐带间充质干细胞。
图3常氧和低氧条件下培养的脐带间充质干细胞形态。
图4流式细胞仪检测低氧下培养的脐带间充质干细胞的表面标志物。
图5透射电镜检测低氧下培养的脐带间充质干细胞外泌体的形态。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。
实施例1脐带间充质干细胞的分离培养
1、组织采集和运输：无菌条件下采集健康新生儿脐带组织，置于脐带组织采集管中，4℃运输，2h送至实验室进行下一步处理。
2、原代培养：将采集管表面用75％酒精消毒后，传入超净工作台。将脐带组织取出，置于无菌不锈钢碗中，加入含双抗的生理盐水冲洗组织6次，去除血渍和羊膜，去除两根动脉和一根静脉，分离出华通胶组织。用眼科剪将华通胶剪成1mm3小块，均匀铺到T75细胞培养瓶中，放置到37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。2h后添加培养基，继续放到培养箱培养。3d后半换液，以后每隔3d换液，第8天发现有细胞从组织周围爬出来(图1中的A)，第12天细胞融合度达到80％(图1中的B)，可以进行细胞传代。吸弃培养基，加入PBS洗两遍，加入2mL胰蛋白酶消化细胞1min，显微镜下观察细胞皱缩变圆，加入新鲜培养基终止消化，血球计数板计数，按照8000万/cm2的密度传代，记为P1。
3、传代培养和细胞鉴定：细胞融合度达到80％进行传代，吸弃培养基，加入PBS洗两遍，加入2mL胰蛋白酶消化细胞1min，显微镜下观察细胞皱缩变圆，加入新鲜培养基终止消化，血球计数板计数，按照8000万/cm2的密度传代。倒置显微镜下观察细胞形态特征，脐带间充质干细胞为形态均一的梭形细胞，培养到第二天时呈平行排列或旋涡状生长(图2中的A)，培养到第三天时密度增加时细胞变细长(图2中的B)。
实施例2低氧环境下培养脐带间充质干细胞
收获实施例1中培养到P2的脐带间充质干细胞。
细胞融合度达到80％进行传代，吸弃培养基，加入PBS洗两遍，加入2mL胰蛋白酶消化细胞1min，显微镜下观察细胞皱缩变圆，加入新鲜培养基终止消化，血球计数板计数，按照8000万/cm2的密度传代，接种T150瓶。
将细胞分为两组，分别置于常氧培养箱和三气培养箱(氧气浓度为5％)中继续培养。显微镜下观察两组细胞形态差异，发现低氧环境下细胞较常氧环境下较小(如图3中的A)，细胞增殖较快(如图3中的B)。
流式细胞仪检测细胞表面标志物和细胞纯度：收集8×106的P3代缺氧条件下培养的脐带间充质干细胞悬液于50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液，加入50mL PBS洗两次，离心弃上清，保留细胞，加PBS重悬细胞，分装100μl/EP管，加入10μlPE标记的CD34，CD45，CD44，CD70，CD90，CD105和同型对照，混匀后37℃避光孵育30min。1000rpm离心5min，弃上清，PBS洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，弃上清，沉淀用200μl PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测。结果如图4所示，脐带间充质干细胞高表达CD44，CD70，CD90，CD105(＞95％)，低表达CD34，CD45(＜2％)。
实施例3干细胞外泌体的提取和鉴定
选取实施例2中传代的P3代细胞进行传代，收取P4代细胞进行外泌体的提取和鉴定。
1、胎牛血清(FBS)去除外泌体：使用超高速离心机，100,000g，4℃，离心8-12h，去除FBS中含有的外泌体，离心后取上清于4℃保存备用，标记为No-exo-FBS。
2、配制培养基：吸取No-exo-FBS到50ml离心管中，加入α-MEM配制含10％No-exo-FBS的完全培养基。
3、消化收获低氧状态下培养的P3细胞，使用No-exo-FBS完全培养基接种细胞，记为P4，放置于三气培养箱(氧气浓度为5％)中继续培养。
4、培养48h后，收取细胞上清液。
5、台式冷冻离心机300g，4℃离心10min，去除细胞碎片。
6、2000g，4℃离心10min去除完整细胞和死细胞，取上清液。
7、10,000g，4℃离心30min进一步去除细胞碎片，取所有上清液到一新的50ml离心管中。
8、0.22μm滤器过滤该上清液，去除大于200nm的粒子，收集上清于新的离心管中，分装到超速离心管中。
9、超高速离心机100,000g，4℃，离心2-4h。
10、弃掉上清液，加入生理盐水溶解沉淀。
11、用BCA试剂盒检测蛋白浓度，300mL培养基上清液最后用2mL生理盐水重悬，蛋白浓度为3mg/mL。分装，0.2mL/管，保存于-80℃。透射电镜检测外泌体形态，外泌体大小形态较为均一，呈椭圆形囊泡，直径为50-150nm(如图5)。取少量做细菌真菌、内毒素、支原体检测，结果均为阴性。
实施例4自体PRP的制备
1、抽血：采用健康自愿者，无传染性疾病，无血液系统疾病，静脉血血小板计数大于100 000/μl，采血前3个月未服用阿司匹林等影响血小板功能的药物，血常规检查正常。签署知情同意书，同意采血用于本实验。于无菌状态下用含枸橼酸钠抗凝剂负压采血管采集供者外周静脉血30mL。
2、两步法：将30mL全血用一次性无菌移液管转移到50mL离心管中，首先低速100×g，20℃，离心10min，收集全部血浆层、白膜层移至另一新的50mL离心管中，混匀；然后高速400×g，20℃，离心10min，进一步浓缩PRP和分离贫血小板血浆组分，弃去上清液的3/4，剩余1/4摇匀后既为PRP。抽取部分做细菌真菌、内毒素、支原体检测，结果均为阴性。
实施例5组合物的制备方法1
从-80℃提前拿出1支实施例3中分装的外泌体，置于4℃解冻；
实施例4中获得的自体PRP，吸取1.8mL加入到无菌冻存管中，加入1支(0.2mL，3mg/mL)外泌体，混匀，即为含0.3mg/mL干细胞外泌体组合物。
实施例6组合物的制备方法2
从-80℃提前拿出2支实施例3中分装的外泌体，置于4℃解冻；
取1瓶0.9％注射用生理盐水，吸取1.6mL加入到无菌冻存管中，加入2支(0.4mL，3mg/mL)外泌体，混匀，即为含0.6mg/mL干细胞外泌体组合物。
实施例7干细胞外泌体组合物治疗膝骨关节炎的疗效观察
纳入标准：1、根据2007年中华医学会骨科学分会修订的标准，确诊为膝骨关节炎患者；2、30～75岁，男女不限；3、膝关节疼痛明显，伴静息痛，严重影响关节功能；4、经正规药物及非药物治疗，效果不佳；5、无心、肝、肾等脏器功能不全；6、自愿并能够在术后一年内回来进行随访。
排除标准：1、类风湿关节炎和其他炎症性关节炎；2、妊娠期或者哺乳期妇女；3、局部或全身感染；4、严重半月板损伤；5、6个月内接受过关节内注射药物者、关节镜手术或关节灌洗手术者；6、拒绝签署知情同意书。
治疗方案：选取12例入组患者随机分为2组，每组6例：对照组，5次透明质酸钠注射组，每周1次，5次为1个疗程；实验组，2次干细胞外泌体组合物注射组，每周一次。
结果：两组患者均完成1个疗程治疗，均随访6个月，无严重不良反应发生。注射后24h内3例(18.75％)出现注射部位疼痛、轻度肿胀，疼痛一般持续2-12h，24h后完全消失。如表1和表2所示，实验组患者治疗后3个月、6个月美国膝关节协会(AKS)评分优于治疗前(p<0.05)，治疗后3个月视觉疼痛模拟评分(VAS)优于治疗前(p<0.05)，6个月随访期间患者无膝关节疼痛复发。
表1 治疗前后VAS评分比较
Figure BDA0002692252740000062
Figure BDA0002692252740000061
注：与治疗前相比，p＜0.05.
表2 治疗前后AKS评分比较
Figure BDA0002692252740000071
Figure BDA0002692252740000072
注：与治疗前相比，p＜0.05.

Claims (7)

1.一种用于治疗膝骨关节炎的干细胞外泌体组合物，包括干细胞外泌体和药物载体；
所述药物载体是自体富血小板血浆、注射用生理盐水、透明质酸中的一种。
2.如权利要求1所述的干细胞外泌体组合物，其特征在于，所述干细胞外泌体在干细胞外泌体组合物中的终浓度为0.3-3mg/mL。
3.如权利要求1所述的干细胞外泌体组合物，其特征在于，自体富血小板血浆的制备方法：抽取患者自体外周血经两步离心法分离得到自体富血小板血浆。
4.如权利要求1所述的干细胞外泌体组合物，其特征在于，所述的干细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：
1)利用新生儿脐带组织分离获得脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)获得的脐带间充质干细胞放于低氧环境中传代培养，获得低氧状态下培养的P3代脐带间充质干细胞；
3)将步骤2)中获得P3代脐带间充质干细胞经过消化后接种到No-exo-FBS完全培养基中放入低氧环境中继续传代获得P4代脐带间充质干细胞；
4)收集P4代脐带间充质干细胞的外泌体，即可获得干细胞外泌体。
5.如权利要求4所述的干细胞外泌体组合物，其特征在于，步骤2)和步骤3)中所述的低氧环境指氮气浓度为90-94％，二氧化碳浓度为5％，氧气浓度为1-5％的环境。
6.如权利要求4所述的干细胞外泌体组合物，其特征在于，步骤3)中所述的No-exo-FBS完全培养基的制备方法为：取去除外泌体的胎牛血清加入α-MEM培养基中，即可获得No-exo-FBS完全培养基。
7.如权利要求6所述的干细胞外泌体组合物，其特征在于，所述去除外泌体的胎牛血清的添加量为No-exo-FBS完全培养基总质量的10％。
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