CN112451544A - 用于改善薄型子宫内膜的组合物及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体公开一种用于改善薄型子宫内膜的组合物及其制备方法、应用，该组合物是由干细胞培养上清与维生素E组成。本发明提供的用于改善薄型子宫内膜的组合物，在使用后可增强子宫内膜中VEGF和整合素β3的表达，增加子宫内膜的厚度，改善子宫容受性和血液供给。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体公开一种用于改善薄型子宫内膜的组合物及其制备方法、应用。
背景技术
薄型子宫内膜指黄体中期子宫内膜厚度≤7mm，病理特征显示为腺上皮生长缓慢，子宫动脉血流阻力高，血管生成不良和血管内皮生长因子低表达。研究显示，薄型子宫在植窗期(月经第20-24d)容受性下降，血管内皮细胞生长因子VEGF及整合素β3表达严重缺乏，影响胚胎植入和着床，是导致临床不孕不育的高发因素。
目前对于薄型子宫内膜的治疗主要有药物刺激子宫内膜增生和改善内膜血流、手术治疗等。药物治疗如口服雌激素、阿司匹林等存在服用时间长，且副作用大，治疗效果不明显；手术治疗如子宫内膜搔刮术和电针刺疗具有侵入性，增加宫腔感染几率，对顽固性的薄型内膜治疗效果不明显，且患者需要定时去医院操作，痛苦感强。
已有研究证实间充质干细胞在体内能很好的促进薄型子宫内膜修复，这种作用通过旁分泌效应实现，即细胞分泌的细胞因子参与子宫内膜修复，但这种治疗方案需要干细胞移植，对技术要求较高，且干细胞移植后，干细胞在体内分化情况难以做到监管，安全性有待考究。因此急需一种安全、易操作、有效可行的治疗方法。
发明内容
本发明提供一种用于改善薄型子宫内膜的组合物，在使用后可增强子宫内膜中VEGF和整合素β3的表达，增加子宫内膜的厚度，改善子宫容受性和血液供给。
本发明提供的用于改善薄型子宫内膜的组合物，是由干细胞培养上清与维生素E组成，所述维生素E在所述干细胞培养上清中的加入量为5-30mg/mL。
优选地，所述干细胞培养上清为间充质干细胞培养上清。
优选地，所述间充质干细胞培养上清是将含有间充质干细胞的离体样液经原代分离后在37℃、5％CO2条件下培养得到。
进一步优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、宫内膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任一种。
更优选地，所述宫内膜间充质干细胞来源于经血。
进一步优选地，所述间充质干细胞为低代次细胞。
上述用于改善薄型子宫内膜的组合物能够进一步用于制备预防或治疗薄型子宫内膜的药物。
本发明还提供一种用于改善薄型子宫内膜的生物制剂，其含有上述任一项所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物，且该组合物能够被进一步制备成药学上可接受的通过阴道灌注或宫腔内注射给药的制剂。
本发明还提供一种用于改善薄型子宫内膜的组合物的制备方法，包括以下步骤：
干细胞在培养至密度为70％-80％时，弃掉原有培养液，用磷酸盐缓冲液清洗，加入无血清培养基继续培养过夜，取细胞培养上清，离心，收集无血清培养上清，再将所述无血清培养上清浓缩至蛋白含量大于0.65mg/ml，即得所述干细胞培养上清，分装、冷冻存储备用，使用前按5-30mg/mL加入维生素E。
优选地，所述离心是在1500rpm-4000rpm下离心10min；浓缩前对所述无血清培养上清过滤除菌，且所述浓缩是经50KD超滤浓缩管离心浓缩。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的用于改善薄型子宫内膜的组合物，模拟了干细胞在体内促进子宫内膜修复过程中旁分泌的作用，规避了干细胞移植带来的潜在风险，使得有益于子宫内膜修复的细胞因子大量富集，并与Ve联合使用，Ve能够为干细胞在体内的生长分化提供营养物质，并参与干细胞的新陈代谢过程，能加强细胞因子的修复作用，更好地提高干细胞促进子宫内膜修复及增生的能力；
(2)本发明提供的用于改善薄型子宫内膜的组合物，添加的Ve具有抗氧化、清除活性氧、提高雌激素浓度、帮助内膜生长的功效；
(3)本发明提供的用于改善薄型子宫内膜的组合物，相对于目前临床的常规治疗手段，该组合物制备得到的生物制剂不含任何有害物质，可以以不同剂型、不同给药方式使用，使用更方便，患者痛苦小；
(4)本发明提供的用于改善薄型子宫内膜的组合物，经动物实验验证，在使用后可增强子宫内膜中血管内皮生长因子VEGF和整合素β3的表达，增加子宫内膜的厚度，促进内膜中微血管增生，改善子宫容受性和血液供给，提高了受孕率。
附图说明
图1是各组大鼠子宫修复90d后HE切片示意图；其中，a表示假手术组；b表示模型组；c表示维生素E组；d表示干细胞培养上清组；e表示实施例2组；
图2是各组大鼠子宫修复90d后交配功能验证示意图；其中，a表示假手术组；b表示模型组；c表示维生素E组；d表示干细胞培养上清组；e表示实施例2组。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。
需要说明的是，本发明所用干细胞采用常规市售产品，或者使用离体样本并采用常规方法分离得到。
实施例1
一种用于改善薄型子宫内膜的组合物，是由宫内膜间充质干细胞上清与维生素E组成，维生素E在宫内膜间充质干细胞培养上清中的加入量为5mg/mL；
其中，宫内膜间充质干细胞上清为低代次细胞，且来源于经血，使用经血作为原料，也可以起到废物有效利用的作用；更佳地，宫内膜间充质干细胞上清来源于薄型子宫患者的经血，来源于患者自身的宫内膜间充质干细胞上清具有更好的相容性，更加安全有效。
上述宫内膜间充质干细胞的原代分离及培养方法如下：
(1)收集妇女月经期(第2-3d)经血，加入2倍体积的PBS缓冲液混匀后，1000rpm离心5min，弃掉上清，3mlPBS缓冲液悬浮沉淀，制成细胞混悬液；
(2)预先在50ml离心管中加入Percoll分离液，将等体积细胞混悬液沿管壁轻轻加入至50ml离心管中，2000rpm离心20min；
(3)轻轻吸取白膜层，加入至含PBS缓冲液的离心管中，PBS清洗两遍后，1000rpm离心5min，弃上清，细胞培养基(含10％血清的DMEM/F12培养基)悬浮沉淀；
(4)细胞计数，按照5*106密度接种至75cm2细胞培养瓶内，37℃，5％CO2条件下培养。
干细胞上清含如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等多种与子宫内膜修复相关的细胞因子；维生素E又称生育酚，是生物膜的保护剂，在临床上应用能够促进子宫内膜的正常生长，给受精卵的着床建立良好的环境，提高微粒体上酶蛋白的合成与线粒体氧化磷酸化作用，减少化学物质的毒性，降低体内氧消耗，从而加强子宫肌营养，促进子宫发育，利于卵泡成熟与排卵，同时还可以抑制前列腺素合成，松弛子宫肌，预防流产；此外，维生素E还具有提高雌激素浓度，扩张血管的功效。Ve与干细胞上清联合使用，不但能发挥维生素E的本身功效，还能促进干细胞上清功效的发挥，更好地促进子宫内膜增生与修复。
上述用于改善薄型子宫内膜的组合物的制备方法，包括以下步骤：
干细胞在37℃、5％CO2培养箱培养至密度为70％-80％时，弃掉原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗2遍，再加入无血清培养基继续培养过夜，收集细胞培养上清，1500rpm离心，收集无血清培养上清，再将所述无血清培养上清经50KD超滤浓缩管浓缩后进行蛋白含量检测，合格后即为干细胞培养上清，之后分装、冷冻存储备用，使用前按5mg/mL加入维生素E。
上述用于改善薄型子宫内膜的组合物能够进一步被制备成凝胶制剂，具体是：在干细胞培养上清液中加入维生素E，维生素E的终浓度为5mg/mL，混匀后按质量分数计添加0.5％-0.8％卡波姆或1％-2％透明质酸钠，混匀后灌装至一次性无菌助推器中，阴道灌注使用。
实施例2
一种用于改善薄型子宫内膜的组合物，与实施例1的不同在于：维生素E在宫内膜间充质干细胞培养上清中的加入量为20mg/mL。
上述用于改善薄型子宫内膜的组合物的制备方法，包括以下步骤：
干细胞在37℃、5％CO2培养箱培养至密度为75％时，弃掉原有培养液，用磷酸盐缓冲液清洗2遍，再加入无血清培养基继续培养过夜，收集细胞培养上清，1500rpm离心，收集无血清培养上清，再将所述无血清培养上清经50KD超滤浓缩管浓缩后进行蛋白含量检测，合格后获得干细胞培养上清，之后分装、冷冻存储备用，使用前按20mg/mL加入维生素E。
上述用于改善薄型子宫内膜的组合物能够进一步被制备成注射制剂，将干细胞培养上清除菌后封装至1ml无菌西林瓶中，使用时解冻，加入维生素E，使维生素E的终浓度为20mg/mL，混匀后用1mL注射器吸取，宫腔注射使用。
实施例3
一种用于改善薄型子宫内膜的组合物，与上述实施例的不同在于：所用间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，且维生素E在脂肪间充质干细胞培养上清中的加入量为30mg/mL。
上述用于改善薄型子宫内膜的组合物的制备方法，包括以下步骤：
干细胞在37℃、5％CO2培养箱培养至密度为70％-80％时，弃掉原有培养液，用磷酸盐缓冲液清洗2遍，再加入无血清培养基继续培养过夜，收集细胞培养上清，4000rpm离心，收集无血清培养上清，再将所述无血清培养上清经50KD超滤浓缩管浓缩后进行蛋白含量检测，合格后获得干细胞培养上清，之后分装、冷冻存储备用，使用前按30mg/mL加入维生素E。
上述用于改善薄型子宫内膜的组合物能够进一步被制备成注射制剂，将干细胞培养上清除菌后封装至1ml无菌西林瓶中，使用时解冻，加入维生素E，使维生素E的终浓度为5mg/mL，混匀后用1mL注射器吸取，宫腔注射使用。
下面对本申请提供的用于改善薄型子宫内膜的组合物的效果进行说明，由于实施例1-3制备得到的组合物的效果基本相同，故以下仅以实施例2提供的组合物为例进行效果说明。
1、设备、材料、试剂
超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、高速离心机、细胞培养瓶、50ml离心管、50mL超滤浓缩管、无血清培养液、青霉素/链霉素、胰酶、生理盐水等；
以上设备、材料及试剂均为实验室常规用品，均为常规购买得到。
2、上清液收集、超滤浓缩
(1)干细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养至密度为75％时，吸除旧培养液，加入PBS清洗两遍，弃掉PBS；
(2)培养瓶中加入20ml无血清培养基，培养48h；
(3)收集无血清培养上清，2000rpm离心10min，留上清；
(4)上清液加入至无菌50mL超滤浓缩管(50KD)中，12000ⅹg离心20min，收集透过液，蛋白含量检测合格后即为干细胞培养上清，-20℃保存备用。
3、薄型子宫动物造模
选取50只SPF级，体重约250g的雌性SD大鼠，适应性饲养三天后进行造模实验。选40只大鼠进行造模，其余10只备用。术前大鼠禁食12h，麻醉后取下腹部正中纵形切口进入腹腔，分离子宫，一侧子宫近端和远端用2个血管夹夹住，用无齿镊子轻轻把子宫拉直，无菌盐水纱布保护周围组织以防无水乙醇外溢损伤；注射器针头进入宫腔，于子宫一端缓慢注入无水乙醇，保持宫腔处于充盈状态，针头停留4-5min缓慢取出，轻轻挤压残留的无水乙醇，再用生理盐水冲洗2次，松开血管夹即可，术后注意保温。备用的10只大鼠为假手术组，只打开腹腔，子宫不做任何处理。
4、薄型子宫治疗及验证
造模术后6h，将造模大鼠分为四组，每组10只，分别为造模组(薄型子宫内膜组)、维生素E组、干细胞培养上清组和实施例2组，造模组不做处理。
其中，实施例2组提供的注射剂在注射前，将步骤2得到的干细胞培养上清解冻后与维生素E混匀得到生物制剂，且维生素E的终浓度为20mg/mL，将1mL生物制剂经宫腔注射至子宫内；维生素E组注射量为1mL，且维生素E的浓度为20mg/mL；干细胞培养上清组注射计量为1mL；各组大鼠术后注意保暖。假手术组不做任何处理。
术后90天后分别取材进行HE染色，结果如图1所示，其中箭头指示内膜厚度。
由图1可知，与模型组相比，维生素E组和干细胞培养上清组大鼠子宫内膜有所增厚，实施例2组子宫内膜厚度接近假手术组，内膜中有大量血管、腺体和细胞。
采用荧光定量PCR法检测子宫内膜组织中VEGF和整合素β3的表达量，结果见表1。
表1修复后90d子宫内膜中VEGF和整合素β3表达量
由表1可知，实施例2组大鼠子宫内膜中VEGF、整合素β3的表达量均高于维生素素E组和干细胞培养上清组，远高于模型组，表明本发明所制备的生物制剂对于大鼠薄型子宫，有增加内膜厚度、促进血液循环、提高子宫容受性的作用，提示干细胞培养上清与维生素E联合使用效果优于单独使用维生素E和干细胞培养上清。
术后90天将雌鼠与雄鼠合笼，待雌鼠阴道口出现阴栓10d后，处死雌鼠，进行妊娠功能学评估，结果见图2。
由图2可知，假手术组有正常妊娠现象，胚胎正常附着，模型组大鼠子宫中未见胚胎，维生素E组和干细胞培养上清组均有胚胎附着，但只有单个胚胎附着，数量较少，而实施例2组有明显妊娠和胚胎附着，且胚胎数量与假手术组相同。提示本发明所提供的的生物制剂能够促进大鼠薄型子宫内膜再生，充足子宫内膜血供，提高子宫容受性，促进子宫妊娠功能恢复，且干细胞上清和维生素E联合使用效果优于单独使用的效果。
需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种用于改善薄型子宫内膜的组合物，其特征在于，是由干细胞培养上清与维生素E组成，且所述维生素E在所述干细胞培养上清中的加入量为5-30mg/mL。
2.根据权利要求1所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物，其特征在于，所述干细胞培养上清为间充质干细胞培养上清。
3.根据权利要求2所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞培养上清是将含有间充质干细胞的离体样液经原代分离后在37℃、5％CO2条件下培养得到。
4.根据权利要求2所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、宫内膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任一种。
5.根据权利要求4所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物，其特征在于，所述宫内膜间充质干细胞来源于经血。
6.根据权利要求2所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞为低代次细胞。
7.根据权利要求1所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物在制备预防或治疗薄型子宫内膜的药物中的应用。
8.一种用于改善薄型子宫内膜的生物制剂，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物，且该组合物能够被进一步制备成药学上可接受的通过阴道灌注或宫腔内注射给药的制剂。
9.根据权利要求1所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
干细胞培养至密度为70％-80％时，弃掉原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗后，加入无血清培养基继续培养过夜，取细胞培养上清，离心，收集无血清培养上清，再将所述无血清培养上清浓缩至蛋白含量大于0.65mg/ml，即得所述干细胞培养上清，分装、冷冻存储备用，使用前按5-30mg/mL加入维生素E。
10.根据权利要求9所述的用于改善薄型子宫内膜的组合物的制备方法，其特征在于，所述离心是在1500rpm-4000rpm下离心10min；浓缩前对所述无血清培养上清过滤除菌，且所述浓缩是经50KD超滤浓缩管离心浓缩。
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