CN111269884A - 一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111269884A
CN111269884A CN202010122965.3A CN202010122965A CN111269884A CN 111269884 A CN111269884 A CN 111269884A CN 202010122965 A CN202010122965 A CN 202010122965A CN 111269884 A CN111269884 A CN 111269884A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
exosome
umbilical cord
cord mesenchymal
supernatant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010122965.3A
Other languages
English (en)
Inventor
杨永利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shaanxi Zhongyan Institute Of Regenerative Medicine Co Ltd
Original Assignee
Shaanxi Zhongyan Institute Of Regenerative Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shaanxi Zhongyan Institute Of Regenerative Medicine Co Ltd filed Critical Shaanxi Zhongyan Institute Of Regenerative Medicine Co Ltd
Priority to CN202010122965.3A priority Critical patent/CN111269884A/zh
Publication of CN111269884A publication Critical patent/CN111269884A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种干细胞复合外泌体的制备方法，具体为脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备方法，包括如下步骤：S1、脐带间充质干细胞外泌体的制备；S2、宫内膜干细胞外泌体的制备；S3、脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备：将脐带间充质干细胞外泌体和宫内膜干细胞外泌体混合，加入保护剂，低温冷冻干燥处理，得到干细胞外泌体冻干粉。本发明方法制备的脐带间充质干细胞与子宫内膜干细胞外泌体复合生长因子对于解决女性生殖健康问题，具有无痛苦，不开刀，不手术，无副作用，结合医院检测，在家便可使用，安全高效。

Description

一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及领域，具体为一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用。
背景技术
人流、刮宫等妇科手术给女性子宫内膜损伤带来了巨大的伤害，导致越来越多的人不孕不育，妇科疾病频发。干细胞在组织修复与再生医疗方面扮演者重要的角色，已被应用于妇科疾病治疗中。研究表明，干细胞所发挥的组织修复与再生功能主要是由其旁分泌作用而实现的，而外泌体是其中一种重要的旁分泌因子，如何快速制备高活性外泌体并应用于妇科疾病的治疗相关报道甚少。
脐带间充质干细胞通过释放大量的外泌体来构建一个稳态的组织修复的微环境，从而消除炎症反应，促进伤口愈合，修复组织病变。然而，外泌体活性成分应用前的有效保存一直是难以解决的问题，并且单一细胞来源的外泌体修复作用远不及复合外泌体的修复治疗作用。子宫内膜干细胞是子宫内膜再生和修复的种子细胞，宫内膜干细胞能够一定程度上治疗和修复子宫内膜损伤。由于脐带组织与子宫内膜取材方便且不受道德及法律问题的限制，使子宫内膜干细胞联合脐带间充质干细胞在妇科疾病的治疗方面有着广泛的应用前景。
但现有相关报道技术中，还没有能够将脐带间充质干细胞来源外泌体联合宫内膜干细胞外泌体应用到妇科疾病治疗、组织病变修复中。
鉴于此，本发明提供了一种脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备技术，该干细胞外泌体纯度高，保存时间长，安全高效，对于子宫内膜损伤修复、骨关节病变修复、皮肤再生修复有显著的靶向治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种干细胞复合外泌体的制备方法，具体为脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备方法，包括如下步骤：
S1、脐带间充质干细胞外泌体的制备：
1)从细胞库中选取P3-P6的脐带间充质干细胞复苏，进行饥饿培养；
2)收取细胞培养上清液，离心处理后，进行过滤，加入聚乙二醇进行孵育；
3)孵育后，离心处理，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入聚乙二醇，进行再次孵育，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得脐带间充质干细胞外泌体；
S2、宫内膜干细胞外泌体的制备：
1)从细胞库中选取人源P3-P6的子宫内膜干细胞复苏，进行饥饿培养；
2)回收全部培养上清液，进行过滤，离心处理后，收集离心上清液；对收集的离心上清液进行二次离心处理；
3)离心后，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入聚乙二醇，再次孵育，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得宫内膜干细胞外泌体；
S3、脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备：
将脐带间充质干细胞外泌体和宫内膜干细胞外泌体混合，得到复合干细胞外泌体浓缩液，向复合干细胞外泌体浓缩液中加入保护剂，低温冷冻干燥处理，得到干细胞外泌体冻干粉，即为脐带间充质干细胞与子宫内膜干细胞外泌体复合生长因子。
优选的，所述步骤S1中脐带间充质干细胞外泌体的具体制备方法为：
1)从细胞库中选取P3-P6的脐带间充质干细胞复苏，将细胞以2×105/cm2的密度接种至无血清的DMEM培养基中；细胞接种完成，放于CO2培养箱内，温度37℃，CO2体积比浓度5％，在饱和湿度下培养；培养16-24h后，以生理盐水清洗细胞2次，去除未贴壁细胞，用复方电解质溶液进行饥饿培养12-24h；
2)收取细胞培养上清液，将上清液在3500-5000g的离心力条件下离心处理6-8min，除去沉淀，取离心后上清液备用；用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤上清液，加入终浓度为10％的聚乙二醇，混匀，4℃孵育10-16h；
3)孵育后，离心处理，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为8％的聚乙二醇，再次孵育30min，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得脐带间充质干细胞外泌体，分装成3-5ml/支，-80℃保存。
优选的，所述步骤S2中宫内膜干细胞外泌体的具体制备方法为：
1)从细胞库中选取人源P3-P6的子宫内膜干细胞复苏，复苏后细胞生长状态良好，微生物检测必须为阴性，按照6×104/cm2的初始密度将细胞接种于无血清的细胞工厂培养体系中；细胞接种完成，放于CO2培养箱内，CO2体积比浓度5％，温度37℃，在饱和湿度下培养；接种培养16-24h后，细胞融合率达到80-90％左右，细胞生长状态良好，吸弃培养上清液，用生理盐水清洗细胞2-3次，然后，加入复方电解质溶液，放入CO2培养箱中饥饿培养24-30h；
2)回收全部培养上清液，以0.22um孔径的滤膜过滤，过滤后的培养上清液在3500-5000g的离心力条件下离心处理10-15min，收集离心上清液；在20000-50000g的离心力条件下对收集的离心上清液继续离心处理20-40min；
3)离心后轻轻取出离心管，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为8％的聚乙二醇，再次孵育30min，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得宫内膜干细胞外泌体，分装成3-5ml/支，-80℃保存。
优选的，所述步骤S1中脐带间充质干细胞外泌体制剂中外泌体浓度以蛋白浓度计为0.4-0.7mg/ml。
优选的，所述步骤S2中宫内膜干细胞外泌体制剂中外泌体浓度以蛋白浓度计为0.3-0.6mg/ml。
优选的，所述步骤S3中脐带间充质干细胞外泌体与宫内膜干细胞外泌体按照3-5:1的比例混合。
优选的，所述步骤S3中向复合外泌体浓缩液中加入的保护剂指的是6-10％的保湿剂和5-10％的透皮吸收促进剂。
优选的，所述步骤S1和S2中的质量安全评价包括：外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验。
优选的，所述步骤S3中低温冷冻干燥条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为20-34h。
一种干细胞复合外泌体的应用，将上述任一所述方法制备的干细胞外泌体复合生长因子用于子宫内膜损伤修复、骨关节病变修复、皮肤再生修复、逆转卵巢早衰以及组织病变治疗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：与传统的生殖健康产品相比的优势如下：制备完成的脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体，对于人流、刮宫等子宫内膜损伤、卵巢早衰治疗效果显著，本发明对于解决女性生殖健康问题具有无痛苦，不开刀，不手术，无副作用，结合医院检测，在家便可使用，安全高效。复合外泌体的修复治疗作用远高于单一细胞来源外泌体，是传统干细胞活性因子效果的几十倍。脐带组织与子宫内膜取材方便且不受道德及法律问题的限制，来源可追溯，安全无副作用，便于产业化应用。制成冻干粉后保存时间长，便于携带，使用方便。
附图说明
图1为一种干细胞复合外泌体的制备方法的流程示意图；
图2为一种干细胞复合外泌体的制备方法中脐带间充质干细胞外泌体的制备流程示意图；
图3为一种干细胞复合外泌体的制备方法中宫内膜干细胞外泌体的制备流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：一种干细胞复合外泌体的制备方法，具体为脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备方法，包括如下步骤：
S1、脐带间充质干细胞外泌体的制备：
1)从细胞库中选取P3-P6的脐带间充质干细胞复苏，进行饥饿培养；
2)收取细胞培养上清液，离心处理后，进行过滤，加入聚乙二醇进行孵育；
3)孵育后，离心处理，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入聚乙二醇，进行再次孵育，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得脐带间充质干细胞外泌体；
S2、宫内膜干细胞外泌体的制备：
1)从细胞库中选取人源P3-P6的子宫内膜干细胞复苏，进行饥饿培养；
2)回收全部培养上清液，进行过滤，离心处理后，收集离心上清液；对收集的离心上清液进行二次离心处理；
3)离心后，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入聚乙二醇，再次孵育，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得宫内膜干细胞外泌体；
S3、脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备：
将脐带间充质干细胞外泌体和宫内膜干细胞外泌体混合，得到复合干细胞外泌体浓缩液，向复合干细胞外泌体浓缩液中加入保护剂，低温冷冻干燥处理，得到干细胞外泌体冻干粉，即为脐带间充质干细胞与子宫内膜干细胞外泌体复合生长因子。
其中，所述步骤S1中脐带间充质干细胞外泌体的具体制备方法为：
1)从细胞库中选取P3-P6的脐带间充质干细胞复苏，将细胞以2×105/cm2的密度接种至无血清的DMEM培养基中；细胞接种完成，放于CO2培养箱内，温度37℃，CO2体积比浓度5％，在饱和湿度下培养；培养16-24h后，以生理盐水清洗细胞2次，去除未贴壁细胞，用复方电解质溶液进行饥饿培养12-24h；
2)收取细胞培养上清液，将上清液在3500-5000g的离心力条件下离心处理6-8min，除去沉淀，取离心后上清液备用；用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤上清液，加入终浓度为10％的聚乙二醇，混匀，4℃孵育10-16h；
3)孵育后，离心处理，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为8％的聚乙二醇，再次孵育30min，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得脐带间充质干细胞外泌体，分装成3-5ml/支，-80℃保存。
其中，所述步骤S2中宫内膜干细胞外泌体的具体制备方法为：
1)从细胞库中选取人源P3-P6的子宫内膜干细胞复苏，复苏后细胞生长状态良好，微生物检测必须为阴性，按照6×104/cm2的初始密度将细胞接种于无血清的细胞工厂培养体系中；细胞接种完成，放于CO2培养箱内，CO2体积比浓度5％，温度37℃，在饱和湿度下培养；接种培养16-24h后，细胞融合率达到80-90％左右，细胞生长状态良好，吸弃培养上清液，用生理盐水清洗细胞2-3次，然后，加入复方电解质溶液，放入CO2培养箱中饥饿培养24-30h；
2)回收全部培养上清液，以0.22um孔径的滤膜过滤，过滤后的培养上清液在3500-5000g的离心力条件下离心处理10-15min，收集离心上清液；在20000-50000g的离心力条件下对收集的离心上清液继续离心处理20-40min；
3)离心后轻轻取出离心管，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为8％的聚乙二醇，再次孵育30min，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得宫内膜干细胞外泌体，分装成3-5ml/支，-80℃保存。
其中，所述步骤S1中脐带间充质干细胞外泌体制剂中外泌体浓度以蛋白浓度计为0.4-0.7mg/ml。所述步骤S2中宫内膜干细胞外泌体制剂中外泌体浓度以蛋白浓度计为0.3-0.6mg/ml。
所述步骤S1和S2中的质量安全评价包括：外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验。
所述步骤S3中脐带间充质干细胞外泌体与宫内膜干细胞外泌体按照3-5:1的比例混合。所述步骤S3中向复合外泌体浓缩液中加入的保护剂指的是6-10％的保湿剂和5-10％的透皮吸收促进剂。所述步骤S3中低温冷冻干燥条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为20-34h。
一种干细胞复合外泌体的应用，将上述任一所述方法制备的干细胞外泌体复合生长因子用于子宫内膜损伤修复、骨关节病变修复、皮肤再生修复、逆转卵巢早衰以及组织病变治疗。
实施案例1：
患者李某，36岁，人工流产并刮宫后子宫内膜厚度为7mm，临床诊断为子宫内膜薄。
患者通过一次性医用给药器给予脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体治疗八次，每次子宫内部注入产品5ml，每周治疗一次。两个月后(月经后4天)，子宫内膜厚度达到8.8mm，子宫内膜损伤得到有效治疗，子宫内膜薄也在逐步恢复。
实施案例2：
患者张某，42岁，皮肤屏障功能受损，皮肤干涩，皱纹明显，有明显色素沉积，容易出现干裂毛囊炎等症状。临床诊断为皮肤屏障功能受损，敏感性肌肤。
患者给予脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体治疗六次，每次用水光针导入产品3ml，每周治疗一次，一个半月之后，客户皮肤水润有弹性，炎症显著改善，皱纹明显减少，色斑也淡了，客户非常满意，治疗效果理想。
实施案例3：
患者孙某，34岁，有离婚史，内分泌失调，例假不规律，有宫颈糜烂，子宫内膜厚度低于8mm，临床诊断为卵巢早衰、子宫内膜薄。
患者给予脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体治疗十二次，每次子宫内部注入产品5ml，每周治疗一次。三个月后(月经后6天)，子宫内膜厚度达到9.2mm，卵巢功能提升，例假开始变的规律，内分泌问题也得到缓解。
实施案例4：
患者王某，32岁，结婚6年2次怀孕均未能保住胎儿，经医院检测，子宫内膜厚度低于8mm，临床诊断为子宫内膜薄。
患者给予脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体治疗十二次，每次子宫内部注入产品5ml，每周治疗一次。三个月后(月经后6天)，子宫内膜厚度达到8.8mm，患者在医生的指导下，定期检查，1年后顺利诞下健康宝宝。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种干细胞复合外泌体的制备方法，具体为脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、脐带间充质干细胞外泌体的制备：
1)从细胞库中选取P3-P6的脐带间充质干细胞复苏，进行饥饿培养；
2)收取细胞培养上清液，离心处理后，进行过滤，加入聚乙二醇进行孵育；
3)孵育后，离心处理，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入聚乙二醇，进行再次孵育，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得脐带间充质干细胞外泌体；
S2、宫内膜干细胞外泌体的制备：
1)从细胞库中选取人源P3-P6的子宫内膜干细胞复苏，进行饥饿培养；
2)回收全部培养上清液，进行过滤，离心处理后，收集离心上清液；对收集的离心上清液进行二次离心处理；
3)离心后，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入聚乙二醇，再次孵育，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得宫内膜干细胞外泌体；
S3、脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备：
将脐带间充质干细胞外泌体和宫内膜干细胞外泌体混合，得到复合干细胞外泌体浓缩液，向复合干细胞外泌体浓缩液中加入保护剂，低温冷冻干燥处理，得到干细胞外泌体冻干粉，即为脐带间充质干细胞与子宫内膜干细胞外泌体复合生长因子。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中脐带间充质干细胞外泌体的具体制备方法为：
1)从细胞库中选取P3-P6的脐带间充质干细胞复苏，将细胞以2×105/cm2的密度接种至无血清的DMEM培养基中；细胞接种完成，放于CO2培养箱内，温度37℃，CO2体积比浓度5％，在饱和湿度下培养；培养16-24h后，以生理盐水清洗细胞2次，去除未贴壁细胞，用复方电解质溶液进行饥饿培养12-24h；
2)收取细胞培养上清液，将上清液在3500-5000g的离心力条件下离心处理6-8min，除去沉淀，取离心后上清液备用；用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤上清液，加入终浓度为10％的聚乙二醇，混匀，4℃孵育10-16h；
3)孵育后，离心处理，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为8％的聚乙二醇，再次孵育30min，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得脐带间充质干细胞外泌体，分装成3-5ml/支，-80℃保存。
3.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中宫内膜干细胞外泌体的具体制备方法为：
1)从细胞库中选取人源P3-P6的子宫内膜干细胞复苏，复苏后细胞生长状态良好，微生物检测必须为阴性，按照6×104/cm2的初始密度将细胞接种于无血清的细胞工厂培养体系中；细胞接种完成，放于CO2培养箱内，CO2体积比浓度5％，温度37℃，在饱和湿度下培养；接种培养16-24h后，细胞融合率达到80-90％左右，细胞生长状态良好，吸弃培养上清液，用生理盐水清洗细胞2-3次，然后，加入复方电解质溶液，放入CO2培养箱中饥饿培养24-30h；
2)回收全部培养上清液，以0.22um孔径的滤膜过滤，过滤后的培养上清液在3500-5000g的离心力条件下离心处理10-15min，收集离心上清液；在20000-50000g的离心力条件下对收集的离心上清液继续离心处理20-40min；
3)离心后轻轻取出离心管，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为8％的聚乙二醇，再次孵育30min，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得宫内膜干细胞外泌体，分装成3-5ml/支，-80℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中脐带间充质干细胞外泌体制剂中外泌体浓度以蛋白浓度计为0.4-0.7mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中宫内膜干细胞外泌体制剂中外泌体浓度以蛋白浓度计为0.3-0.6mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中脐带间充质干细胞外泌体与宫内膜干细胞外泌体按照3-5:1的比例混合。
7.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中向复合外泌体浓缩液中加入的保护剂指的是6-10％的保湿剂和5-10％的透皮吸收促进剂。
8.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1和S2中的质量安全评价包括：外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验。
9.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中低温冷冻干燥条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为20-34h。
10.一种干细胞复合外泌体的应用，其特征在于：将权利要求1-9任一所述方法制备的干细胞外泌体复合生长因子用于子宫内膜损伤修复、骨关节病变修复、皮肤再生修复、逆转卵巢早衰以及组织病变治疗。
CN202010122965.3A 2020-02-27 2020-02-27 一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用 Pending CN111269884A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010122965.3A CN111269884A (zh) 2020-02-27 2020-02-27 一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010122965.3A CN111269884A (zh) 2020-02-27 2020-02-27 一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111269884A true CN111269884A (zh) 2020-06-12

Family

ID=70995430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010122965.3A Pending CN111269884A (zh) 2020-02-27 2020-02-27 一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111269884A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112451544A (zh) * 2020-12-08 2021-03-09 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 用于改善薄型子宫内膜的组合物及其制备方法、应用
CN113143968A (zh) * 2021-04-22 2021-07-23 广州四叶草健康科技有限公司 一种神经干细胞外泌体鼻腔喷剂及其制备方法
CN113244272A (zh) * 2021-06-18 2021-08-13 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 用于改善卵巢早衰的组合物及其制备方法和应用
CN113755445A (zh) * 2021-07-26 2021-12-07 蓝海细胞(北京)生物科技有限公司 一种用于皮肤修复的细胞外泌体的制备方法
CN114134040A (zh) * 2022-02-08 2022-03-04 美亚宜彬生物科技(北京)有限公司 一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂制备系统
CN114703130A (zh) * 2022-03-28 2022-07-05 宁夏医科大学总医院 一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用
CN115227721A (zh) * 2022-08-24 2022-10-25 兰州大学第一医院 一种干细胞外泌体在制备治疗脱发产品中的应用
CN115337325A (zh) * 2022-09-05 2022-11-15 北京苁昇生物科技有限公司 一种干细胞外泌体眼用衍生物及干细胞外泌体的制备方法
CN117801091A (zh) * 2023-12-28 2024-04-02 广东圆康再生医学科技开发有限公司 一种子宫内膜干细胞在子宫内膜修复中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109893543A (zh) * 2018-04-04 2019-06-18 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及外泌体的联合制剂、制备方法与给药方法
CN109908180A (zh) * 2018-04-04 2019-06-21 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 用于治疗子宫内膜损伤的子宫内膜干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂及其制备方法与给药方法
CN110548001A (zh) * 2019-09-06 2019-12-10 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 一种含脐带间充质干细胞外泌体的修复抗衰护肤品
CN110638834A (zh) * 2019-10-29 2020-01-03 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109893543A (zh) * 2018-04-04 2019-06-18 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及外泌体的联合制剂、制备方法与给药方法
CN109908180A (zh) * 2018-04-04 2019-06-21 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 用于治疗子宫内膜损伤的子宫内膜干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂及其制备方法与给药方法
CN110548001A (zh) * 2019-09-06 2019-12-10 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 一种含脐带间充质干细胞外泌体的修复抗衰护肤品
CN110638834A (zh) * 2019-10-29 2020-01-03 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112451544A (zh) * 2020-12-08 2021-03-09 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 用于改善薄型子宫内膜的组合物及其制备方法、应用
CN113143968B (zh) * 2021-04-22 2023-08-01 广州四叶草健康科技有限公司 一种神经干细胞外泌体鼻腔喷剂及其制备方法
CN113143968A (zh) * 2021-04-22 2021-07-23 广州四叶草健康科技有限公司 一种神经干细胞外泌体鼻腔喷剂及其制备方法
CN113244272A (zh) * 2021-06-18 2021-08-13 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 用于改善卵巢早衰的组合物及其制备方法和应用
CN113244272B (zh) * 2021-06-18 2024-05-17 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 用于改善卵巢早衰的组合物及其制备方法和应用
CN113755445A (zh) * 2021-07-26 2021-12-07 蓝海细胞(北京)生物科技有限公司 一种用于皮肤修复的细胞外泌体的制备方法
CN114134040B (zh) * 2022-02-08 2022-05-27 美亚宜彬生物科技(北京)有限公司 一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂制备系统
CN114134040A (zh) * 2022-02-08 2022-03-04 美亚宜彬生物科技(北京)有限公司 一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂制备系统
CN114703130A (zh) * 2022-03-28 2022-07-05 宁夏医科大学总医院 一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用
CN115227721A (zh) * 2022-08-24 2022-10-25 兰州大学第一医院 一种干细胞外泌体在制备治疗脱发产品中的应用
CN115337325A (zh) * 2022-09-05 2022-11-15 北京苁昇生物科技有限公司 一种干细胞外泌体眼用衍生物及干细胞外泌体的制备方法
CN117801091A (zh) * 2023-12-28 2024-04-02 广东圆康再生医学科技开发有限公司 一种子宫内膜干细胞在子宫内膜修复中的应用
CN117801091B (zh) * 2023-12-28 2024-05-31 广东圆康再生医学科技开发有限公司 一种子宫内膜干细胞在子宫内膜修复中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111269884A (zh) 一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用
CN107158035A (zh) 含有高浓度人间充质干细胞外泌体提取物的治疗褥疮外用凝胶及其制备方法
ES2490715T3 (es) Composiciones que comprenden células fetales no diferenciadas para el tratamiento de trastornos cutáneos
CN109908180A (zh) 用于治疗子宫内膜损伤的子宫内膜干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂及其制备方法与给药方法
CN112263713A (zh) 负载人脐带间充质干细胞的纤维蛋白水凝胶支架及其应用
CN111632075A (zh) 一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂及其制备方法
CN113648273B (zh) 一种利于面部皮肤修复术后恢复的舒缓面膜及其制备方法
CN109893542A (zh) 用于治疗勃起功能障碍的干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂及其制备方法与给药方法
CN108524601A (zh) 一种含有多效因子的阴道凝胶及其制备方法
CN108619086A (zh) 一种治疗组织损伤的细胞凝胶制剂及其用途和所用的保持冻存细胞活性的凝胶溶液
CN114425033B (zh) 一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶及其制备方法
CN105597088A (zh) 一种制剂、其制备方法及其应用
CN109700998A (zh) 一种复方肌肤损伤再生修复剂及其制备方法
CN115770195B (zh) 一种稳定的祛痘组合物及其制备方法
CN104606667B (zh) 重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶
CN111686206A (zh) 一种保湿修复细菌纤维素面膜及其制备方法
CN115120708A (zh) 一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶
CN104667262B (zh) 重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液
CN112972368A (zh) 一种促进肛肠术后创面愈合的药物组合物及其制备方法
CN105168629A (zh) 一种治疗气滞血瘀型褥疮的中药凝胶剂
CN111166794A (zh) 一种治疗妇科疾病的中药组合物
CN113842398B (zh) 一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶、给药方法和应用
CN111840103B (zh) 一种用于腋下的长效膜剂及其制备方法
CN110559468B (zh) 含人成纤维细胞调节培养液医用敷料贴及制备方法和应用
CN114681488A (zh) 一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200612