CN104707140A

CN104707140A - 治疗骨关节炎的组合物

Info

Publication number: CN104707140A
Application number: CN201310687585.4A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Xing Yao Pty Ltd
Current assignee: Xing Yao Pty Ltd
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-06-17

Abstract

本发明提供了一种治疗动物骨关节炎的组合物，具体地，本发明提供了一种用于治疗动物骨关节炎的生物制品，及用所述制品制成的制剂。所述的制品采用脂肪多能细胞组分、支架材料结合其他组分制成，具有见效快，治疗效果好，用量少等特征。

Description

治疗骨关节炎的组合物

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，具体涉及一种治疗骨关节炎的生物制品及其制备方法。

背景技术

骨性关节炎是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，发病率高，在老年人口中十分常见，60岁以上的人群中患病率可达50%，75岁以上的人群中则达80%。骨关节炎患者的关节疼痛常使患者难以忍受，患者发病后致残率高。现有的治疗骨关节炎的药物能在一定程度上延缓病程、改善患者症状，缓解患者疼痛，但不能逆转病理过程，不能根治骨关节炎，且大部分药物副作用明显。而外科手术治疗主要通过关节镜(窥镜)、开放手术或人工关节置换，虽然能暂时缓解疼痛，但长远效果（>10年）并不理想。干细胞等细胞治疗法是目前最有希望彻底解决骨关节炎治疗的新方法。

骨关节炎常发生软骨缺损，但软骨的自身修复能力有限，通常可以将软骨修复作为骨关节炎治疗的最重要评价指标。近十年来，干细胞移植治疗骨关节炎已有大量研究报道。干细胞注入骨关节炎关节后，能发挥免疫调节作用，炎症反应调节作用，减少疼痛；分泌抗凋亡因子和抗纤维化因子抑制病情进展；分泌TGF-β、BMP-4等因子，促进内源性干细胞软骨修复；还能分化为软骨细胞帮助修复软骨。

目前骨关节炎的干细胞治疗研究大多采用骨髓来源的间充质干细胞，脂肪多能细胞治疗骨关节炎也已有大量文献报道，临床前研究和临床研究显示骨髓间充质干细胞和脂肪多能干细胞都有可能改善病情，并有增加软骨含量报道，但离完全恢复关节还有一定距离。骨髓间充质干细胞获取需穿刺骨髓，对供体造成较大伤害，相比而言从脂肪获取多能细胞更具优势，1）取材对人体损伤小；2）脂肪中具CFU-F形成能力的多能细胞含量高于1%，而骨髓中小于0.001%；3）脂肪来源丰富，多能细胞的含量多；4）脂肪来源细胞增殖能力较骨髓间充质干细胞强。因此脂肪多能干细胞治疗骨关节炎更具优势。

基质血管成分含有脂肪多能细胞，并含有多种其他类型细胞，最早是采用酶消化方法从脂肪组织获得，可经过提取纯化分离出出脂肪多能干细胞。基质血管成分对骨关节炎治疗也具有治疗效果，并且基质血管成分从分离到移植2-3小时，能减少移植时间，且价格便宜，还能减少细胞培养中的风险，但是含有的脂肪多能细胞含量少。同时基质血管成分中含有CD34+CD31-和CD34+CD31+的多能细胞，具有较强的促进血管再生能力，而经培养后的脂肪多能细胞CD34+表达减少或消失。

富含血小板的血浆(PRP)能分泌多种促进软骨恢复细胞因子，但在治疗骨关节炎领域，PRP的作用存在争议，有研究报道其对软骨修复产生负面效果。另外，由于PRP的主要成分为血小板和有核细胞，它们在关节腔或病变部位所停留和存活的时间关系到治疗效果。

高分子材料，譬如玻尿酸钠和胶原蛋白等不但可以作为支架和润滑剂减缓疼痛，也可作为支架保留水分、细胞、以及其它有效成分，还可以起到延长这些有效成分在病变部位存留的时间，增强治疗效果。

综上所述，本领域尚缺乏一种成分优化，杂质含量少，有效成分含量高的的治疗骨关节炎的液态制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种成分优化，杂质含量少，有效成分含量高的治疗骨关节炎的液态组合物。

本发明的第一方面，提供了一种治疗动物骨关节炎的组合物，所述的组合物包括以下组分：

a.任选的脂肪多能细胞组分；和/或

软骨前体细胞组分；

b.支架材料；

c.抗炎药物；和

d.药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物为液态组合物。

在另一优选例中，所述的组合物是注射剂。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体是注射用载体。

在另一优选例中，所述的骨关节炎选自下组：膝骨关节炎、髋骨关节炎、踝骨关节炎。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是现制的或预制的。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是自体脂肪多能细胞组分或异体脂肪多能细胞组分。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分选自下组：从基质血管成分中纯化的脂肪多能细胞、经培养扩增的脂肪多能细胞，或其组合。

在另一优选例中，所述的经培养扩增的脂肪多能细胞是在无血清培养基或含血清的培养基中进行扩增的。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是即时制备或冻存复苏的。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分还可含有选自下组的细胞：脂肪细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞、肥大细胞、神经细胞、脂肪前体细胞、淋巴细胞、血液细胞、基质细胞、巨噬细胞，或其组合。

在另一优选例中，在所述脂肪多能细胞组分中，脂肪多能细胞含量占总细胞量的0.5～100%，较佳地为1～100%，更佳地为10～100%。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是自体的或同种异体的。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分具有软骨分化潜能。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分中还含有细胞因子。

在另一优选例中，所述的软骨前体细胞组分是自体的或同种异体的。

在另一优选例中，所述的软骨前体细胞组分具有软骨分化潜能。

在另一优选例中，所述的软骨前体细胞组分中还含有细胞因子。

在另一优选例中，所述的细胞因子选自下组：TGF-β、PDGF、VEGF、IL-1、IL-6、TNF、IRAP、CTGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合。

在另一优选例中，所述脂肪多能细胞组分在所述组合物中的浓度为1×10³-5×10⁸/mL，较佳地为1×10⁴-1×10⁸/mL，更佳地为1×10⁵-1×10⁷/mL。

在另一优选例中，所述脂肪多能细胞组分在组合物中的浓度为10³-10⁸/mL，较佳地为10⁴-10⁷/mL，更佳地为10⁵-10⁷/mL。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞，和/或CD45-CD13+CD36+CD73+细胞富集的脂肪多能细胞组分。

在另一优选例中，所述的软骨前体细胞组分是CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞，和/或CD45-CD13+CD36+CD73+细胞富集的含软骨前体细胞组分。

在另一优选例中，所述的CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞和/或CD45-CD13+CD36+CD73+细胞富集指所述的CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞和/或CD45-CD13+CD36+CD73+细胞的含量占组分中细胞总量的15-100%。

在另一优选例中，所述的“CD45-CD235a-CD31-CD34+”细胞指含有CD34细胞因子而不含有CD45、CD235a和CD31细胞因子。

在另一优选例中，所述的组合物还包括选自下组的一种或多种成分：富含血小板的血浆和/或脂肪干细胞培养上清液、维生素B12、维生素C。

在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆选自下组：活化后的PRP，未活化PRP液体、PRP凝胶，或其组合。

在另一优选例中，所述富含血小板的血浆中，血小板浓度范围为0.5×10⁶-1.5×10¹⁰/mL，且所述血浆中白细胞和红细胞的总浓度为≤1×10⁶/mL。

在另一优选例中，所述富含血小板的血浆中，血小板浓度范围为5×10⁷-5×10⁸/mL。

在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液中含有细胞因子。

在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液中含有选自下组的细胞因子：TGF-β、HGF、TGF-1、PDGF、VEGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合。

在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液是灭活的脂肪干细胞培养上清液。

在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液中不含细胞。

在另一优选例中，所述的支架材料选自下组：玻尿酸钠、胶原蛋白、多糖，或其组合。

在另一优选例中，所述的多糖选自下组：透明质酸、透明质酸衍生物、右旋糖苷、褐藻酸、壳多糖，或其组合。

在另一优选例中，所述的支架材料是玻尿酸钠与胶原蛋白的组合。

在另一优选例中，所述的玻尿酸钠与胶原蛋白先进行预混合。

在另一优选例中，所述的抗炎药物选自下组：糖皮质激素类抗炎药、美洛昔康、罗贝考昔，或其组合。

在另一优选例中，所述脂肪多能细胞组分和/或软骨前体细胞在组合物中的总重量比为5-95重量份，以组合物的总重量计；和/或

所述的支架材料在组合物中的重量比为5-95重量份，较佳地为10-90重量份，以组合物的总重量计；和/或

所述抗炎药物的重量比为10-95重量份，以组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述富含血小板的血浆和/或脂肪干细胞培养上清液的总重量比为0.1-10重量份，以组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述维生素C的重量比为0.001-10重量份，较佳地为0.01-5重量份，以组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述维生素B12的重量比为0.001-10重量份，较佳地为0.01-5重量份，以组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的动物选自下组：灵长类动物、犬科动物、马科动物、兔科动物。

本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述组合物的制法，所述方法包括步骤：将各组分混合，制成组合物。

本发明的第三方面，提供了一种用于治疗动物骨关节炎的制剂，所述制剂包含如本发明第一方面所述的组合物作为有效成分。

在另一优选例中，所述的制剂是注射剂。

在另一优选例中，所述的制剂用于对需要的对象的患病关节进行注射。

在另一优选例中，所述的注射是关节内注射。

在另一优选例中，所述制剂中，

所述的脂肪多能细胞和/或软骨前体细胞的总浓度为10⁴-10⁸/mL；

血小板的浓度为5×10⁷-5×10⁸/mL；

白细胞的浓度为≤5×10⁵mL；

红细胞的浓度为≤5×10⁵mL；且

所述制剂的体积为0.1-15mL；且

所述血浆中还包括选自下组的生长因子：TGF-β、PDGF、VEGF、IL-1、IL-6、TNF、IRAP、CTGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合；和/或

所述的脂肪干细胞培养上清液中还包括选自下组的生长因子：TGF-β、HGF、IL-10、TGF-1、PDGF、VEGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合；和/或

所述的脂肪多能细胞组分和/或软骨前体细胞组分中还包括细胞因子，且所述的细胞因子选自下组：TGF-β、TIMPs、VEGF、HGF、PGE2、IGF-1、MIP-1a、IL-6、IDO、GM-CSF、IL-1RA、IL-12p40、IL-10、IL-13，或其组合；和/或

所述的脂肪多能细胞组分表达的表面标志选自下组：CD90、CD34、CD10、CD36、CDCD45、CD105、CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、CD73、CD13、CD63、CD166、CD31、CD106、CD71，或其组合；和/或。

在另一优选例中，所述制剂的体积为0.5-5ml。

在另一优选例中，所述制剂的体积为0.1-1mL。

在另一优选例中，所述制剂的体积为2-15mL。

本发明的第四方面，提供了一种治疗动物骨关节炎的试剂组合或试剂盒，包括：

a.任选的脂肪多能细胞组分；和/或

软骨前体细胞组分；

b.支架材料；

c.抗炎药物；

和d.说明书，所述的说明书中记载了使用方案；

和任选的选自下组的一个或多个组分：

富含血小板的血浆(PRP)、脂肪干细胞培养上清液、维生素B12、抗炎药物、说明书；和维生素C。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞是自体的或异体的。

在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞是现制的。

在另一优选例中，所述的使用方案包括：将组分a、b和c混合，用于对患有骨关节炎对象进行治疗。

本发明还提供了一种治疗动物骨关节炎的方法，所述方法包括：对治疗对象施用有效量的如本发明第一方面所述的组合物，或对治疗对象施用有效量的如本发明第三方面所述的制剂，或对治疗对象施用有效量的如本发明第四方面所述的试剂组合或试剂盒。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是本发明实施例2中治疗关节软骨修复状况的对照图。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，采用脂肪多能细胞组分和/或软骨前体细胞组分与支架材料、抗炎药物一同制成生物制品组合物，对骨关节炎患者进行治疗，得到了意想不到的治疗效果。且当所述的生物制品被制成或用作关节注射剂时，只需注射少量的液体，即可达到非常好的治疗效果。基于上述发现，发明人完成了本发明。

骨性关节炎

骨关节炎是一种慢性关节疾病，它的主要改变是关节软骨面的退行性变和继发性的骨质增生，表现在关节疼痛和活动不灵活，X线表现关节间隙变窄，软骨下骨质致密，骨小梁断裂，有硬化和囊性变；关节边缘有唇样增生；后期骨端变形，关节面凹凸不平；关节内软骨剥落，骨质碎裂进入关节，形成关节内游离体。

在本发明中，所述的骨关节炎可以是任选自下组的骨关节炎：膝骨关节炎、脊柱骨关节炎、髋骨关节炎、踝关节炎、或其组合。本发明所述的骨性关节炎优选为膝骨关节炎、髋骨关节炎。

脂肪

脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源，脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得脂肪组织，包括(但不限于)抽吸、手术分离等方法。

在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。

基质血管成分

基质血管成分含有脂肪多能细胞，并含有多种其他类型细胞，最早是采用酶消化方法从脂肪组织获得，可经过提取纯化分离出出脂肪多能干细胞。基质血管成分对骨关节炎治疗也具有治疗效果，并且基质血管成分从分离到移植1-2小时，能减少移植时间，且价格便宜，还能减少细胞培养中的风险。同时基质血管成分中含有CD34+CD31-和CD34+CD31+的多能细胞，具有较强的促进血管再生能力，有明显的促进机体作用。

脂肪多能细胞组分

脂肪多能细胞治疗骨关节炎已见报道，从脂肪获取多能细胞，相较于传统的方法更为简便，来源广，且脂肪中具CFU-F形成能力的多能细胞含量高，增殖能力强。

基质血管成分(SVF)对骨关节炎具有治疗效果，并且基质血管成分从分离到移植1-2小时，能减少移植时间，且价格便宜，还能减少细胞培养中的风险，同时基质血管成分中含有CD34+CD31-和CD34+CD31+的多能细胞，具有较强的促进血管再生能力。在本发明中，所述的脂肪多能细胞可以是原代脂肪多能细胞或传代脂肪多能细胞。

在本发明中，将基质血管成分与纯化的或培养扩增的脂肪多能细胞联用，从而改善上述两者各自的缺陷，提高血管再生能力，改善效果更明显。

优选地，所述的脂肪多能细胞表达的表面标志选自下组：CD90、CD34、CD10、CD36、CDCD45、CD105、CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、HLA-ABC、CD73、CD13、CD63、CD166、CD31、CD106、CD71，或其组合；和/或

所述的脂肪多能细胞不表达的表面标志选自下组：CD133、CD146、CD14、CD117、CD11b、CD79α、CD19、HLA-DR，或其组合。

所述的脂肪多能细胞组分的来源没有特别限制，可以是自体脂肪多能细胞组分或异体脂肪多能细胞组分。

所述的脂肪多能细胞可以是预制的或现制的，如，可以在治疗前或治疗中从治疗对象体内抽取并进行纯化或培养扩增，也可以用异体来源的脂肪多能细胞制成一商品化试剂，用于进行治疗。

脂肪干细胞培养上清液

本发明的组合物中，优选地还可添加脂肪干细胞培养上清液，用于提供细胞因子。其中，一种优选的所述的脂肪干细胞培养上清液中含有选自下组的细胞因子：TGF-β、HGF、TGF-1、PDGF、VEGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合。

富含血小板的血浆(PRP)

富含血小板的血浆能分泌多种促进软骨恢复细胞因子，但也有研究报道其对软骨修复产生负面效果。在治疗骨关节炎方面，PRP的效果尚存在争议。

目前，富含血小板血浆制备差异性巨大，所含单核细胞量从10⁶/ML到10¹⁰/ML，目前缺少对它的最佳含量范围的报道研究。

本发明采用了分离去除白细胞和红细胞的富含血小板的血浆，意外地得到了更佳的治疗效果。优选地，本发明采用的PRP中，血小板的浓度为5×10⁷-5×10⁸/mL，白细胞浓度为≤5×10⁵mL，红细胞的浓度为≤5×10⁵mL。

在本发明中，优选的所述血浆中还包括选自下组的生长因子：TGF-β、PDGF、VEGF、IL-1、IL-6、TNF、IRAP、CTGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合。

在本发明中，所述的富含血小板的血浆可以是预制的或现制的，如，可以在治疗前或治疗中从治疗对象体内抽取并纯化。

治疗骨关节炎的组合物

本发明提供了一种治疗动物骨关节炎的组合物，所述的组合物包括以下组分：

a.脂肪多能细胞组分；和/或

软骨前体细胞组分；

b.支架材料；

c.抗炎药物；和

d.药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物为液态组合物。

在另一优选例中，所述的组合物是注射剂。

在另一优选例中，所述脂肪多能细胞组分和/或软骨前体细胞组分在所述组合物中的总浓度为1×10³-5×10⁸/mL，较佳地为1×10⁴-1×10⁸/mL，更佳地为1×10⁵-1×10⁷/mL。

在另一优选例中，所述脂肪多能细胞组分和/或软骨前体细胞组分在组合物中的总浓度为10³-10⁸/mL，较佳地为10⁴-10⁷/mL，更佳地为10⁵-10⁷/mL。

在另一优选例中，所述的软骨前体细胞组分是CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞，和/或CD45-CD13+CD36+CD73+细胞富集的软骨前体细胞组分。

所述的组合物还可以任选地包括其他组分，如在另一优选例中，还包括选自下组的一种或多种成分：富含血小板的血浆；和/或脂肪干细胞培养上清液、维生素B12、维生素C。

在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液中含有选自下组的细胞因子：TGF-β、HGF、IGF-1、VEGF、TGF-1、PDGF、VEGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合。

在本发明中，优选的抗炎药物选自下组：糖皮质激素类抗炎药、美洛昔康、罗贝考昔，或其组合。

在另一优选例中，所述脂肪多能细胞组分和/或软骨前体细胞组分在组合物中的总重量比为5-95重量份，以组合物的总重量计；和/或

在另一优选例中，所述富含血小板的血浆的重量比为0.1-10重量份，以组合物的总重量计。

在本发明中，所述的动物种类没有特别限制，较佳地为哺乳类动物，更佳地选自下组：灵长类动物、犬科动物、马科动物、兔科动物。

所述的组合物可以制备成制剂形式，如注射剂、针剂等，用于对治疗对象的患病关节进行注射，较佳地，对患者的患病关节进行关节内注射。

在本发明的一个优选实施例中，所述制剂中，

血小板的浓度为5×10⁷-5×10⁸/mL；

白细胞的浓度为≤5×10⁵mL；

红细胞的浓度为≤5×10⁵mL；且

所述制剂的体积为0.1-15mL；且

所述的脂肪多能细胞组分中还包括细胞因子，且所述的细胞因子选自下组：TGF-β、TIMPs、VEGF、HGF、PGE2、IGF-1、MIP-1a、IL-6、IDO、GM-CSF、IL-1RA、IL-12p40、IL-10、IL-13，或其组合；和/或

所述的软骨前体细胞组分中还包括细胞因子，且所述的细胞因子选自下组：TGF-β、TIMPs、VEGF、HGF、PGE2、IGF-1、MIP-1a、IL-6、IDO、GM-CSF、IL-1RA、IL-12p40、IL-10、IL-13，或其组合；和/或

所述的脂肪多能细胞组分表达的表面标志选自下组：CD90、CD34、CD10、CD36、CDCD45、CD105、CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、CD73、CD13、CD63、CD166、CD31、CD106、CD71，或其组合。

优选地，所述制剂的体积可以根据患病部位的体积，病情严重程度等因素而改变，如在本发明的一个优选例当中，大型犬膝关节的制剂施用量为1-3mL；在另一优选例中，赛马髋关节的施用量为10-15ml。

药学上可接受的载体

在本发明中，可将组合物与可药用赋形剂、稀释剂等的混合物以非口服形式，如注射剂的形式给药。该药物组合物优选含有重量比为0.01%-99%的本发明的组合物作为活性成分，更优选含有重量比为0.1%-90%的活性成分。

上述制剂可通过常规制药方法制备。可用的药用辅剂的例子包括稀释剂和注射液用溶剂(例如水、乙醇和甘油等)。

本发明的主要优点包括：

1.本发明采用支架材料与PRP、脂肪干细胞培养上清液和脂肪干细胞组分互相组合，从而延长了这些有效成分在病变部位存留的时间，增强了治疗效果。

2.本发明的制剂能够有效地保留患处的水分、细胞、以及其它有效成分，具有更佳治疗效果。

3.本发明的制剂添加了抗炎药物，从而能够在治疗的同时减缓治疗对象关节疼痛。

4.本发明的制剂添加了维生素成分，能够有效改善软骨的生长。

5.相较现有技术而言，本发明的制剂所需的注射体积更小，注射后不会对患者关节造成负担，具有更佳治疗效果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：

制备治疗骨关节炎的生物制品

一、从脂肪组织分离脂肪多能细胞组分

1.分离基质血管成分

从患者供脂部抽取脂肪组织30-50ml，脂肪组织经800g×5分钟离心，取离心后的上层脂肪用含0.075％胶原酶的PBS消化45分钟，离心，弃上层液，DMEM重悬下层混合的细胞沉淀。反复洗涤3次去除胶原酶。同时收集抽吸液500ml，800g×5分钟离心，弃上层液，吹打，加生理盐水200ml震荡30秒，加入22.2ml10×PBS恢复等张，离心，重悬，共3次。将两部分重悬液混合，100目滤网过滤。使用血球计数板测定细胞浓度，离心重悬于DMEM，调整细胞浓度为3×10⁷个/ML。

2.分离纯化血管基质成分中的脂肪多能细胞

分离的血管基质成分细胞重悬于FACS缓冲液(含1%BSA和0.05%叠氮化钠的PBS)，调整细胞至10⁵个细胞，加入抗体，混匀后冰上孵育。根据表达细胞表面标记水平，使用FACSvantage^TM(Becton Dickinson)分选CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞和CD34+CD31+细胞。加入DMEM调整细胞浓度为3×10⁷个/ML。

3.培养扩增脂肪多能细胞

将获得的基质血管成分细胞离心，重悬于无血清培养基中，调整细胞浓度至3×10⁵个/cm²，接种至T75培养瓶中培养，细胞增殖至融合度达80%后进行细胞传代。P3代细胞融合至80%时，使用胰蛋白酶消化细胞，离心后重悬于DMEM，调整细胞浓度为3×10⁷个/ML。

4.混合几种含多能细胞成分

取血管基质成分细胞0.5ML、纯化的脂肪多能细胞0.5ML和培养的脂肪多能细胞0.5ML在离心管中进行混合,共1.5ML。流式检测混合液CD45-CD235a-CD31-CD34+和CD45-CD13+CD36+CD73+多能细胞含量，多能细胞终浓度是2.1×10⁷个/ML。

5.流式表面标志测定

取混合后的多能细胞样品，将5×10⁶的细胞放入1.5ml离心管中3000r/分钟离心5分钟，弃上清。加入FACS缓冲液100微升悬浮细胞。加入封闭细胞表面Fc受体0.5微升（0.5mg/ml），水浴3分钟。加入荧光抗体1微升（0.5mg/ml），水浴30分钟。加入FACS缓冲液350微升，轻轻混匀，3000r/分钟，离心5分钟，弃上清，重复洗涤2次。取100微升l仪器缓冲液加入获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，在BD流式细胞仪上进行仪器检测和分析。

检测得混合的多能细胞表达的表面标志为：CD90、CD34、CD10、CD36、CD45、CD73、CD13、CD31、CD106、CD71，不表达的表面标志为：CD133、CD14、CD79α、CD19、HLA-DR。

6.软骨分化能力检测

取混合后的多能细胞样品接种至24孔板，融合至80%，更换成软骨诱导液（10ng/mL TGF、10mmol/mL地塞米松、50mg/mL维生素C、高糖DMEM配制成），每3天换液1次，诱导11天，对照组使用。诱导培养时培养孔内预先放置盖玻片，使细胞贴盖玻片生长，至11天时取出细胞爬片，体积分数10%甲醛固定1小时，PBS冲洗15分钟，蒸馏水冲洗1次，滴加10g/L阿新蓝染色，染色3小时，加入95%乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。

检测得多能细胞能分化为软骨细胞，对照组分化实验结果为阴性。

二、分离富含血小板的血浆

抽取患者20ML外周血，摇匀，置入离心管中，进行两次离心。第一次离心速度1500转/分钟，离10分钟。离心后分为上层的血浆和下层的红细胞两层。弃去位于离心管下部的红细胞，吸取全部血浆至另一离心管。使用去白细胞滤器过滤血浆，去除白细胞。将过滤的血浆进行第二次离心，速度3000转/分钟，离心10分钟，血浆分为上层的乏血小板血浆和下层的富含血小板的血浆，取下层富含血小板的血浆。

采用pocH-100i血细胞分析仪（日本Sysmex公司）检测分离的富含血小板中血小板含量9.7×10⁷个/ML，白细胞含量1.1×10⁵个/ML，红细胞含量4.3×10⁵个/ML。

三、ELISA检测多能细胞培养上清液和富含血小板的血浆中细胞因子表达

取混合后的多能细胞样品按10⁵个/cm2接种至培养皿中，贴壁培养36小时后取培养上清，用ELISA法检测TGF-β、HGF、IGF-1、VEGF表达。

富血小板的血浆按体积比1∶9加入激活剂(500U凝血酶冻干粉溶于1mL10%氯化钙中)，激活富血小板血浆，室温静置24小时后，4000转/分钟，离心15分钟提取萃取液，用ELISA法检测细胞因子的表达。

检测结果显示：多能细胞培养上清液表达TGF-β、HGF、IGF-1、VEGF，富含血小板的血浆中细胞因子表达TGF-β、PDGF、VEGF、EGF、IGF、BFGF。

四、混合多能细胞组分、富含血小板的血浆、透明质酸、缓冲液

使用前分开保存，使用时多能细胞组分1.5ML，PRP0.5ML，透明质酸0.5ML，10%的氯化钙缓冲液0.5ML。共3ML，加入后轻微振荡5分钟。

五、生物制品的冻存复苏

生物制品中多能干细胞组分加入10%DMSO，在程序降温仪中降温，保存于-196℃液氮中，使用时在37℃水浴中快速复苏，复苏后细胞活率>90%。富含血小板的血浆加入5%的DMSO，放入-80℃冰箱中保存，使用时常温复温。透明质酸和10%的氯化钙缓冲液在4摄氏度中保存，使用时常温复温。

实施例2：

生物制品的制备及用于治疗兔骨关节炎的实验

一、生物制品制备：

1）分离兔皮肤下脂肪10ML，使用酶消化法获得基质血管成分，调整细胞浓度为1×10⁷个/ML。培养扩增的脂肪多能细胞，调整细胞浓度为1×10⁷个/ML。取0.1ML基质血管成分和0.1ML扩增的脂肪多能细胞混合，流式检测混合液CD45-CD235a-CD31-CD34+和CD45-CD13+CD36+CD73+多能细胞含量。多能细胞终浓度是6.5×10⁶个/ML。

2）抽取兔股动脉血液10ML，第一次离心速度1500转/分钟，离心10分钟，吸取上层血浆至另一离心管。离心分离富含血小板的血浆，每次速度3000转/分钟，离心10分钟，去除上层含白细胞和红细胞液体，取下层富含血小板的血浆，重悬于生理盐水中，重复离心3次。采用pocH-100i血细胞分析仪（日本Sysmex公司）检测分离的富含血小板血浆中血小板含量5×10⁷个/ML，白细胞含量5×10⁴个/ML，红细胞含量1.2×10⁵个/ML。

3）取脂肪多能细胞组分0.2ML，富含血小板的血浆0.05ML，透明质酸0.04ML，10%的氯化钙缓冲液0.01ML，轻微振荡混匀后共0.3ML。

二、兔骨关节炎造模

选用健康成年新西兰大耳白兔，体重4到5千克。将兔后左膝关节进行前交叉韧带切断术与内侧半月板切除术联合造模，右膝作为对照侧，手术6周后，病理评价骨关节炎造模效果。

三、兔骨关节炎治疗

在评价造模成功后第4周，在超声引导下使用注射器向患骨关节炎的关节处注射0.3ml生物制品，缓慢推注。

四、治疗效果评价

在接受治疗后第10周，进行检测：

1）关节病理观察

关节去除远端股骨和胫骨平台后，用10%甲醛固定，样本脱钙后，石蜡包埋后切片，进行HE染色。结果如图1所示，正常膝关节软骨表层完好，软骨细胞正常；对照组未治疗的膝关节软骨表层明显破坏，剥脱现象明显，表层软骨空泡样变性，成熟软骨细胞柱状线消失，结构破坏明显；经细胞治疗后的软骨，破坏的软骨表层恢复完好，软骨正常未发生空泡样变性，成熟软骨细胞柱状线恢复。

2）Mankin评分

关节去除远端股骨和胫骨平台后，用10%甲醛固定，样本脱钙后，石蜡包埋后切片，进行HE染色、甲苯胺蓝和番红O染色。采用Mankin评分法对关节进行评分，结果如表1所示。

表1Mankin评分结果

正常对照组	治疗组	模型对照组
			0.3	1.5	5.5

3）取关节液，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、MMP-13等炎性因子表达。治疗后关节液内TNF-α含量检测如表2所示。

表2ELISA法检测结果

	正常对照组	治疗组	模型对照组
				第1天	30	30	30
第20天	30	100	100
				第40天	30	35	105

4）将兔关节进行核磁共振成像MRI观察，检测关节恢复状况及软骨体积。治疗10周后关节软骨总量变化如表3所示。

表3软骨含量

正常对照组	治疗组	模型对照组
			10	9	4

实施例3：

生物制品的制备及用于骨关节炎患者的治疗

一、生物制品制备：

1）分离患者皮下脂肪30ML，使用酶消化法获得基质血管成分，接种基质血管成分至T75培养瓶，扩增培养脂肪多能细胞，生长至融合度80%，酶消化获得细胞，调整细胞浓度为5×10⁷个/ML。取0.1ML基质血管成分和0.1ML扩增的脂肪多能细胞混合，流式检测混合液中CD45-CD235a-CD31-CD34+和CD45-CD13+CD36+CD73+多能细胞含量。多能细胞终浓度是4.97×10⁷个/ML。

2）抽取人外周血20ML，第一次离心速度1500r/min，离心10分钟，吸取上层血浆至另一离心管。离心分离富含血小板的血浆，每次速度3000r/min，离心10分钟，去除上层含白细胞和红细胞液体，取下层富含血小板的血浆，重悬于生理盐水中，重复离心3次。采用pocH-100i血细胞分析仪（日本Sysmex公司）检测分离的富含血小板血浆中血小板含量5×10⁸个/ML，白细胞含量9×10⁴个/ML，红细胞含量4×10⁵个/ML。

3）取脂肪多能细胞组分1ML，富含血小板的血浆1ML，透明质酸1ML轻微振荡混匀后共3ML。

二、生物制品用于膝骨关节炎患者的治疗

膝骨关节炎患者20名，分为2组。组1患者在超声引导下缓慢注射3ml生物制品到患骨关节炎的关节腔；组2患者接受注射的生物制品用透明质酸增加体积至8ML，在超声引导下缓慢注射到患骨关节炎的关节。术后在2、5、10、18、52周随访。

三、治疗效果评价

生物制品注射到骨关节炎的关节腔内，3ml体积的生物制品在注射过程中，患者反映的酸胀感和疼痛感低于8ml体积的生物制品。

1.膝骨关节炎疼痛缓解评分

疼痛缓解评分如表4所示，症状缓解评分如表5所示。

表4疼痛缓解评分

	3ml	8ml
			第0周	35	35
第2周	39	37
			第5周	45	43
第10周	48	46
			第18周	50	47
第52周	51	48

表5症状缓解评分

	3ml	8ml
			第0周	31	31
第2周	36	35
			第5周	39	34
第10周	41	38
			第18周	43	40
第52周	47	44

结果显示，体积为3ml的生物制品对疼痛和症状缓解效果优于体积8ml的生物制品。

2.超声测定软骨厚度（mm，n=10）

表6.超声测定软骨厚度

n=10

超声测定结果显示，体积为3ml的生物制品软骨恢复效果优于体积为8ml的生物制品。

实施例4：

富含血小板的血浆采用去除白细胞和红细胞操作后用于骨关节炎治疗

一、富含血小板的血浆分离及减少白细胞和红细胞含量操作

抽取狗股动脉血液12ML，第一次离心速度1500r/min，离心10分钟，吸取上层血浆至另一离心管。使用去白细胞滤器过滤血浆，去除白细胞。离心分离富含血小板的血浆，每次速度3000r/min，离心10分钟，去除上层含白细胞和红细胞液体，取下层富含血小板的血浆，重悬于生理盐水中，重复离心3次。采用pocH-100i血细胞分析仪（日本Sysmex公司）检测分离的富含血小板血浆中血小板含量3×10⁸个/ML，白细胞含量3×10³个/ML，红细胞含量7×10⁴个/ML。

未进行去除红细胞和白细胞操作的富含血小板的血浆中血小板含量2.8×10⁸个/ML，白细胞含量1×10⁶个/ML，红细胞含量5×10⁶个/ML。

二、富含血小板的血浆用于狗骨关节炎患者的治疗

狗后左膝关节进行前交叉韧带切断术与内侧半月板切除术联合造模。患骨关节炎的模型狗分成两组，每组10只。组1的狗在超声引导下缓慢注射0.5ml去除红细胞和白细胞的富含血小板的血浆至骨关节炎关节；组2的狗在超声引导下缓慢注射0.5ml未去除红细胞和白细胞的富含血小板的血浆至骨关节炎关节，术后在30、60和90天随访。

三、治疗效果评价

1.总体评分

对狗治疗后跛行、活动受限、功能障碍进行测评，结果显示，治疗组的总体状况较对照组有明显改善（总评分）。其中，跛行状况改善明显，行走中的跛行30天后即出现明显改善（P<0.05），至60天出现进一步改善并持续至90天；而跳跃中的跛行改善更为明显，30天左右即出现显著改善（P<0.01），并一直保持至90天左右。关节的活动度改善也相当明显，30天左右就出现显著改善（P<0.01），且一直至实验结束均未为出现反复。将治疗组和对照组的总体评分进行比较，结果如表7所示。

表7ELISA法检测结果

	PRP	PRP－WBC－RBC
			第30天	19	29
第60天	25	39
			第90天	27	37

本发明提供的生物制品组合物在移植治疗骨关节炎和动物实验治疗中，软骨有明显恢复，与对照组相比有差异显著，恢复情况与正常组相近。治疗组新生血管情况优于对照组；治疗后关节液炎症因子显著下调，与正常值无显著差异。临床病人接收治疗，疼痛不适感弱，膝关节功能恢复良好，评分显著高于对照组。结果显示，本发明提供的组合物能够非常有效地治疗骨关节炎。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种治疗动物骨关节炎的组合物，其特征在于，包括以下组分：

a.任选的脂肪多能细胞组分；和/或

软骨前体细胞组分；

b.支架材料；

c.抗炎药物；和

d.药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括选自下组的一种或多种成分：富含血小板的血浆和/或脂肪干细胞培养上清液、维生素B12、维生素C。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的支架材料选自下组：玻尿酸钠、胶原蛋白、多糖，或其组合。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的抗炎药物选自下组：糖皮质激素类抗炎药、美洛昔康、罗贝考昔，或其组合。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脂肪多能细胞组分和/或软骨前体细胞在组合物中的总重量比为5-95重量份，以组合物的总重量计；和/或

6.如权利要求1-5任一所述的组合物，其特征在于，所述的动物选自下组：灵长类动物、犬科动物、马科动物、兔科动物。

7.如权利要求1-6任一所述组合物的制法，其特征在于，所述方法包括步骤：将各组分混合，制成组合物。

8.一种用于治疗动物骨关节炎的制剂，其特征在于，所述制剂包含如权利要求1-6所述的组合物作为有效成分。

9.如权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述制剂中，

血小板的浓度为5×10⁷-5×10⁸/mL；

白细胞的浓度为≤5×10⁵mL；

红细胞的浓度为≤5×10⁵mL；且

所述制剂的体积为0.1-15mL；且

10.一种治疗动物骨关节炎的试剂组合或试剂盒，其特征在于，包括：

a.任选的脂肪多能细胞组分；和/或

软骨前体细胞组分；

b.支架材料；

c.抗炎药物；

和d.说明书，所述的说明书中记载了使用方案；

和任选的选自下组的一个或多个组分：