CN108451982A

CN108451982A - 干细胞外泌体在促进血管化及血管新生中的应用

Info

Publication number: CN108451982A
Application number: CN201810426540.4A
Authority: CN
Inventors: 章云童; 方硕; 夏琰; 谢杨; 祝玮烨; 唐炜雅; 郝滋晨
Original assignee: Shanghai Changhai Hospital
Current assignee: Shanghai Changhai Hospital
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2018-08-28

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是间充质干细胞来源的外泌体在制备促进血管化或诱导血管新生药物中的应用。本发明通过梯度离心、过滤及超速离心后的外泌体纯度很高，产品易于制备及贮藏，安全系数高，易于吸收，给药途径广泛，具有靶向性，能够使得血管内皮细胞聚集，血管新生，进而重建微循环增加血流灌注，并且不会引起其他功能的缺失，具有广泛的应用前景。

Description

干细胞外泌体在促进血管化及血管新生中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是干细胞外泌体在促进血管化及血管新生中的应用。主要涉及基于干细胞外泌体促进受损部位或移植物周围血管化而使得缺血组织或器官得到修复或存活的用途。

背景技术

在许多病损的情况下，机体丧失了新生血管的能力导致由于血供不足引起组织缺血，纤维化甚至坏死。比如外伤骨折后断端骨不连；自体脂肪移植后脂肪液化坏死，自身外周动脉病变造成肢体缺血坏疽等。基底部的血管再生是愈合过程中一个至关重要的阶段，随着新生血管形成使损伤基底部的血供增加，能够给损伤组织及移植物提供充足的氧、营养支持和生长因子并可以带走产生的代谢产物。因此血管化是损伤组织恢复功能或存活的必要条件。

血管新生主要包括以下过程：①胶原酶、尿激酶型纤溶酶原激活物参与下的毛细血管后静脉基底膜和基质的降解。②内皮细胞在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、uPA等趋化因子的作用下发生迁移进入血管周围基质。③血管内皮细胞增殖，在芽生或套叠的基础上形成管腔)。④管腔相互融合形成三维管襻和网状结构。⑤血管周细胞进一步构建血管结构，血管周围基膜的形成。其中血管内皮细胞的迁移、增殖和管腔形成是组织损伤中的血管新生和微循环重建的关键环节。脂肪移植后的血管化与缺血组织的治疗性新血管形成有许多的相似之处。移植48h后，供体组织开始与受区血管床建立新的血液循环，新生血管长入可以抑制脂肪细胞凋亡，促进其增殖生长，如血管化不及时或不充分都会导致供体组织发生坏死。然而目前口服药物治疗由缺血引起的病损因其存在全身分布无法控制，药物代谢等因素并不被普遍推广。而单纯利用重组细胞因子存在着半衰期过短、局部因子易被代谢所流失而不能在局部形成有效浓度等问题。

随着近年来有关干细胞的研究越来越深入，它被看作是血管内皮周围的组织中一类既可以作为血管的支持细胞也可以起到帮助稳定内皮网状结构的细胞。然而干细胞存在细胞来源匮乏，二次创伤，细胞筛选耗时费力等限制，此外间充质干细胞属于成人体细胞，传代后增殖分化潜能明显下降，与其提取、制备等成本相比效果并不显著，使得其推广陷入瓶颈。这就要求人们从新的视角，寻找一种可以替代干细胞治疗的新生物质，以便为改良优化干细胞的治疗策略提供新靶点。外泌体(exosome)作为干细胞旁分泌的主力军，是由细胞分泌的大小约为50-150nm，密度在1.13-1.21g/ml的膜性囊泡，与质膜融合后，以胞吐形式释放入胞外环境中。其成分较复杂，表面含有其来源和功能密切相关的蛋白质和脂质成分，内部包裹了供体细胞来源的多种核酸、蛋白质等生物活性物质。2013年，美国、德国3位科学家凭借外泌体运输机制和调节作用的发现，荣获诺贝尔生理学或医学奖。当外泌体和靶细胞接触后，外泌体及其携带的生物分子以胞吞的形式被接收，在靶细胞中得以释放并发挥作用。外泌体的脂质双分子膜不仅可以保护活性物质在细胞外环境中不被降解或稀释，还可以利用膜表面的特异配体，识别特定细胞并定向聚集，与受体细胞高效率结合，纳米级的体积使得外泌体可以随着血液或其他体液无障碍地通过生物屏障，远距离抵达并作用于各种靶细胞。

发明内容

本发明首次对干细胞外泌(MSC-Exo)的核酸成分进行高通量测序，发现miR-21丰度突出。而后对与干细胞外泌体共培养的血管内皮细胞进行检测，发现其中miR-21表达显著增高，证明有大量miR-21经外泌体转运至血管内皮细胞中。经Western Blot检测发现HIF-1α、VEGF等血管化相关蛋白量均显著增高，印证了外泌体中的miR-21在血管内皮细胞中具有促血管化作用。并通过等量的干细胞做对照，发现干细胞的外泌体可以发挥“干细胞样”的促血管化作用，改变受损组织周围微环境，促进血管新生，间接实现缺血部位的修复或存活。将干细胞的外泌体直接移植到抑制血管新生的环境如缺血性创面等成为一种有潜力的治疗方法。并且相比较干细胞本身，其外泌体具备精准高效的靶向作用机制、易于收集保存、结构稳定不易降解老化、规避不良分化而致的肿瘤形成等优势使得外泌体在缺血性病损治疗中具备极高的商品化潜能和转化应用前景。

经实验表明，间充质干细胞在移植后仅有少部分细胞分化替代为受损组织，然而组织内血管新生因子却有明显增加，血流灌注显著增强。因此推测出干细胞可能是通过旁分泌的外泌体发挥了“干细胞样”的作用来改变受损组织周围微环境，促进血管新生和微循环重建，进而起到组织修复作用。

为解决缺血组织器官血流供给不利，以及干细胞治疗的弊端，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞来源的外泌体，其制备方法，及其在促进血管化及血管新生中的应用。

本发明的第一方面，提供一种间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，所述的间充质干细胞来源于人骨髓、人脂肪或人脐带。优选来源于人脐带。

进一步的，所述的制备方法具体包括以下步骤：

A、选用脐带来源的间充质干细胞进行分离培养与传代：取新鲜脐带，经PBS反复冲洗后，浸泡于含有1％青链霉素的低糖培养基(L-DMEM)约5分钟，剪成直径约1.5mm大小的组织块；用10％胎牛血清的L-DMEM，5％CO₂、37℃饱和湿度培养；待7-10日后可见间充质干细胞爬出组织，去除组织块后以0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养。

B、间充质干细胞来源的外泌体的抽提制备：

a)将人脐带间充质干细胞培养基加入间充质干细胞中，48h-72h后收取培养上清液(可将上清液暂时冻存于-80℃冰箱，待收集到一定数量(约＞150ml)抽提其中的干细胞外泌体)；所述的人脐带间充质干细胞培养基配方优选为：含有质量百分比5％UltraGRO(达科为公司)和质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基(gibco公司)；

b)将上清液于4℃300×g，10min离心除去细胞碎片；4℃2000×g，10min离心去除死细胞等杂质；0.22μm无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质；4℃100000×g，120min超速离心得到外泌体沉淀，去除上清液后加入约200ulPBS洗涤一遍；再次4℃100000×g，120min超速离心，弃去上清液，加入100ulPBS可得到浓度较纯的间充质干细胞来源的外泌体；分装后于-80℃冰箱保存。

制备完成后可通过透射电镜和Nanosight检测得到的外泌体的形态大小，并以Western Blot检测外泌体的标志性蛋白CD63、CD81的表达情况。

本发明的第二方面，提供采用上述方法制备得到的间充质干细胞来源的外泌体。

进一步的，所述的采用上述方法制备得到的间充质干细胞来源的外泌体的储存液以及工作液：采用BCA蛋白定量试剂盒检测抽提后外泌体的浓度，每个分装管中浓度控制在2000μg/ml，即为外泌体的储存浓度。将其可长期冻存于-80℃冰箱。设立时间节点7天、21天、30天、60天、90天、120天，150天，经qRT-PCR检测其中生物学活性物质，发现其中的蛋白质在第120天时仍处在高位表达，而于150天骤降。鉴定出干细胞外泌体的储存液保质期为4个月。外泌体的工作浓度较优的应以无菌PBS将储存液稀释为200μg/ml。此时工作液应尽快使用，不宜反复冻融。

本发明的第三方面，提供上述间充质干细胞来源的外泌体的组合物，包括间充质干细胞来源的外泌体和稀释液，所述的稀释液为水凝胶或PBS，所述的组合物中间充质干细胞来源的外泌体的浓度为200μg/ml；所述的间充质干细胞来源于人骨髓、人脂肪或人脐带。

进一步的，所述的组合物包括所有骨髓、脐带、脂肪等干细胞来源的外泌体与各种选自由胞外基质组分、生长因子、激素、血管生成因子、凝结因子、细胞因子、趋化因子、酶、神经递质、维生素、碳水化合物、离子、铁螯合剂、脂肪酸、抗生素和氨基酸组成的组中的一种或多种生物因子的组合物。

本发明的第四方面，提供上述间充质干细胞来源的外泌体、及其组合物，在制备促进血管化或诱导血管新生药物中的应用。

进一步的，所述的药物以间充质干细胞来源的外泌体或其组合物为唯一活性成份，或活性成份中包含间充质干细胞来源的外泌体或其组合物。所述的药物的给药方式为外敷或注射。

进一步的，所述的间充质干细胞来源的外泌体在缺血组织中促进血管重建，即可以促血管生成。由于干细胞外泌体其中包含了多种促血管新生因子、mRNA和miRNA，尤其是miR-21，实验证明其可以结合PTEN的3’UTR，抑制PTEN蛋白表达从而增强了HIF-1α与VGEF诱导血管内皮细胞(HUEVs)增殖，迁移的能力，并且外泌体能将其内容物靶向传递至受损所需要血管重建的区域，实现促血管化作用。

进一步的，所述的间充质干细胞来源的外泌体促进缺血组织周围血管化。主要是通过MSC可以分化成肌成纤维细胞、周皮细胞以及内皮细胞。创伤后的组织损伤和炎症反应特别是局部组织缺氧能够加速MSC的自我更新和促血管生成活性因子的释放，例如VEGF、碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素等。间充质干细胞作为细胞治疗手段广泛运用于临床实践。它的领域涵盖了器官组织的缺损修复，作为细胞治疗免疫调节治疗药物和缺血组织修复。除了其多向分化潜能，一个强大的分泌能力已被提议作为主要机制组织修复。除了细胞因子/趋化因子的分泌，骨髓间充质干细胞也显示线粒体转移和微泡能力强(外来)对损伤的反应和后续的推广分泌组织再生。移植的干细胞来源的心肌细胞(CMC)是不可能的对缺血器官的奇妙改良的主要贡献者。因此，提出了一种新的机制，注入骨髓间充质干细胞可能释放营养因子，有助于心肌保护缺血性的损害。

创面基底部的血管再生是一般性创面伤口愈合过程中一个至关重要的阶段，随着肉芽组织增加及新生血管形成使创面基底部的血供增加，为创面愈合提供所需要的氧气和营养物质。创面愈合过程中大量的生长因子促使内皮细胞穿过创面真皮层在新生的组织形成管腔。同时，内源性MSC聚集在创面基底部促进内皮细胞的迁移。近年来，MSC分化成内皮细胞的能力成为研究的热点，将MSC直接移植到抑制血管新生的环境如缺血性创面等成为一种有潜力的治疗方法。研究表明将脂肪MSC应用到皮肤创面后，可以大量分泌血管源性生成因子如VEGF、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子B等加速创面新生肉芽组织生长及血管新生，从而增加血管密度，提高全厚皮肤移植的成活率。

VEGF和Ang是两种最重要的促血管生成因子，在血管的再生中二者协同发挥作用，VEGF作用于血管形成的早期，促进原始血管网的形成，而Ang则作用于随后的血管改建、塑形，促进形成成熟且有空间结构的血管网。当VEGF的作用存在时，Ang可增加毛细血管管径、重建基膜、促内皮细胞增生与迁移，刺激新生血管出芽，而当VEGF的作用受抑制时Ang则加速内皮细胞死亡及血管退行性变。

本发明还考察了外泌体的工作浓度：

步骤1：将外泌体储存液于4℃冰箱彻底融解，按100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的工作浓度配成工作液。

步骤2：将人血管内皮细胞(HUEVs)按每孔1×10⁵接种于六孔板后，加入不同浓度干细胞外泌体的工作液，即步骤1中所述，并设立PBS空白对照，HEK293T-Exo阴性对照组，于37℃、5％CO₂饱和湿度二氧化碳培养箱中共同培养2天。

步骤3：收集细胞，通过qRT-PCR、Western Blot检测HIF-1α、VEGFA等血管相关蛋白。

步骤4：用经步骤2处理后的血管内皮细胞进行成管实验、划痕实验，观察各个工作浓度下对血管新生的密度以及速度的影响。结果显示。工作浓度为200μg/ml的干细胞外泌体可以发挥与干细胞组相类似的促进血管内皮细胞增殖，管腔形成的作用，并且HIF-1α与VGEF的表达量也与之相似。而400μg/ml浓度与200μg/ml浓度未有明显差别。说明干细胞的外泌体其工作浓度控制在200μg/ml即可。此工作浓度所用的溶液可以为PBS、水凝胶等。

本发明的第五方面，提供上述间充质干细胞来源的外泌体、及其组合物，在制备治疗缺血性病损药物中的应用。所述的缺血性病损可以为缺血性骨不连等。所述的间充质干细胞来源的外泌体通过促进血管化或诱导血管新生，使病损组织恢复或存活。

本发明的第六方面，提供上述间充质干细胞来源的外泌体、及其组合物，在制备用于脂肪移植后提高脂肪颗粒在受区存活率的药物中的应用，所述的间充质干细胞来源的外泌体通过促进血管新生，提高脂肪颗粒的存活率。

由于脂肪移植后脂肪颗粒需尽早与受区血管床建立新的血液循环，如血管化不及时或不充分都会导致脂肪颗粒发生液化坏死，因此干细胞外泌体加入至脂肪颗粒后一同移植入受区，可以促进新生血管长入，提高脂肪颗粒的存活率。

脂肪移植后的血管化与缺血组织的治疗性新血管形成有许多的相似之处。缺血组织的治疗性新血管形成在近年取得了很大的进展，使之能够更深入地认识血管的发生和形成过程以及各种促血管生长因子的作用，从而促进了移植脂肪组织血管化的快速发展。目前，将促血管生成生长因子应用到缺血组织的治疗性新血管形成中是最为常用的方法。

脂肪移植后充足的组织灌流为组织的存活提供氧和营养并带走代谢产物，所以是其存活的必要条件。由于血管再生是细胞因子启动的调控过程，将促血管生成生长因子应用到局部是目前最为常用的方法。单纯利用重组因子存在着半衰期过短、局部因子易被代谢所流失而不能在局部形成有效浓度等问题。利用基因转染技术将基因整合进宿主细胞既可以维持较长时间的因子分泌，宿主细胞分泌的蛋白也可进行自我反馈调控，同时还防止了排异反应的发生。刘宇兰等用携带VEGF的裸质粒直接在移植脂肪内注射，可在移植物内表达具有生物活性的VEGF，从而促进微血管的形成，减少脂肪吸收率，提高远期效果。

在本发明的一个优选实施方式中，具体可参见实施例3，用于移植的脂肪细胞数量的范围为每1ml约10000到约10000000个脂肪细胞。“脂肪颗粒存活率”指的是脂肪细胞移植后，其保持生存和完整性的能力。优选地，移植后，脂肪颗粒存活几天、几周、几个月或几年。

步骤1)将经过常规吸脂抽取出的脂肪颗粒进行生理盐水冲洗、过滤后置于1ml注射器；

步骤2)将工作浓度为200μg/ml的干细胞外泌体与脂肪颗粒混匀采用1ml注射器于裸鼠皮下进行多点注射，每个注射点约200μl。并设立空白对照组，干细胞阳性对照组；

步骤3)脂肪移植术后观察：①3个月后移植脂肪组织存活率：完整取出移植物，对其进行湿重测定，计算存活率。②纤维化及坏死程度的测定：采用Gundersen于1998年提出的“点计数”测量方法。采用网格测试系统，包括20条线及100个交点，测量每张切片的互不重复、随机选择的10个200倍视野(随机取两位观测者进行测量，计数10个视野的纤维化及囊腔的数目)，将各组移植物测量得到的点个数进行纤维化及坏死程度的比较。③于移植后第3日处死一批裸鼠进行移植脂肪切片染色，观察血管标志蛋白CD31的阳性情况：将石蜡切片用二甲苯脱蜡，乙醇逐级脱水。3％过氧化氢封闭内源性过氧化氢酶10min，PBS冲洗3遍，每遍5min；1：20正常山羊血清封闭20min；小鼠抗人CD31一抗(1μg/ml)4℃湿盒中过夜，PBS冲洗3遍；山羊抗小鼠IgG FITC孵育45min，PBS冲洗3遍，荧光倒置显微镜观察。具体可参见实施例3。

血管的形成可分为血管发生(vasculogenesis)和血管形成(angiogenesis)两种形成方式。胚胎期从中胚层分化而来的血管母细胞和血细胞前体相互集合形成血岛，由血管母细胞分化为血管内皮细胞，形成原始的血管网，此过程称为血管发生。而由已经存在的原始血管网发出血管并形成新血管的过程称为血管形成。

一些研究表明干细胞的外泌体可以供类似的疗效细胞，用于组织修复，甚至在抗癌治疗，这表明发展以干细胞外泌体作为治疗手段的创新可能减少细胞移植有关的困难和风险。

血管重建是影响脂肪移植后存活率的关键因素。促进血管重建药物实验研究的成功将推动今后脂肪移植研究的进步。但是很多的研究证实可以促进移植脂肪存活的药物仅限于实验研究，血管因子的应用虽然显示出它们的有效性，但是也有其不足之处。如在肿瘤和糖尿病等代谢异常的情况下，应用血管因子技术再血管化可能会使病情恶化。另外新生血管形成后需要有效因子的维持，同时作为复杂的调节过程，联合应用各种因子综合其各方面的长处可能更为有效。

本发明优点在于：

1、产品易于制备及贮藏。通过梯度离心、过滤及超速离心后的外泌体纯度很高并且可以储存于-80℃冰箱至少6个月依然保持活性以及功能；

2、安全系数高，易于吸收。通过超速离心，摒弃了普通细胞提取产品可能含有的有毒的细胞因子，以及其本身不具有免疫原性，避免了干细胞本身潜在的致瘤隐患。外泌体通过细胞内吞作用摄入细胞，可以避免一些大分子生物因子(如蛋白质，RNA)被细胞的磷脂双分子膜所阻挡，不容易被细胞吸收的问题；

3、具有靶向性。干细胞外泌体其中包含了多种促血管新生因子、mRNA和miRNA，尤其是miR-21，可以调控缺损组织周围血管化相关HIF-1α、VEGF蛋白，使得血管内皮细胞聚集，血管新生，进而重建微循环增加血流灌注。并且不会引起其他功能的缺失；

4、给药途径广泛。除肠道给药以外本发明可以通过组合物的形式以外敷，皮下注射，甚至对组织器官缺血区域直接注射，或与脂肪颗粒混匀后移植入受区，皆不影响外泌体活性及作用。

附图说明

图1：A是按实施例1步骤抽提的外泌体电镜图；B是外泌体Western Blot鉴定图。

图2：是按实施例1步骤抽提的外泌体进入靶细胞的荧光显微镜图。

图3：A是成管实验，以检验间充质干细胞来源的外泌体对血管内皮细胞的形成血管的能力；B是划痕实验，以检验间充质干细胞来源的外泌体对血管内皮细胞的增殖迁移能力的影响。

图4：A为实施例2中的μCT血管成像；B为骨组织周围免疫组化血管标记物CD31的分布，均表明间充质干细胞来源的外泌体可以促进骨不连断端周围新生血管的形成。

图5：为实施例3中的游离移植脂肪组织观察结果3个月后移植脂肪组织存活率：A、B、C 3组脂肪组织湿重分别为(95.97±5.51)mg、(63.42±5.12)mg、(67.64±5.09)mg，C组移植脂肪组织湿重与B组相似(P＞0.05)，但湿重均低于C组(P＜0.05)。

uMSC-exo：脐带间充质干细胞来源外泌体；uMSC：脐带间充质干细胞；HEK293-Exo：HEK293细胞来源外泌体；UEFS：去外泌体上清液；PBS：磷酸缓冲盐溶液。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下面结合实施案例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不仅限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照工具书(著[美]J.莎姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：脐带间充质干细胞来源的外泌体的抽提与鉴定：

1.脐带间充质干细胞的获得：

脐带来自长海医院妇产科。原代培养得到间充质干细胞。获取脐带后将其装在含有无菌PBS或者DMEM培养基的无菌培养皿或瓶内，尽快操作。经磷酸盐缓冲液反复冲洗后，浸泡于含有青链霉素的L-DMEM(青链霉素浓度均为100IU/ml)约5分钟，剪成直径约1.5mm大小的组织块；含10％胎牛血清L-DMEM营养液，5％CO₂、37℃饱和湿度培养；待7-10日后可见间充质干细胞爬出组织，移去组织块后以0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养。取传代在3-6代的细胞进行后续操作。

2.干细胞来源的外泌体的抽提：

其中所述的为抽提外泌体做准备的人脐带间充质干细胞培养基，配方为：含有质量百分比5％UltraGRO(达科为公司)和质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基(GIBCO公司)。将该培养基加入2-6代的间充质干细胞中，48h-72h后收取培养上清液，可将上清液暂时冻存于-80℃冰箱，待收集到一定数量(约＞150ml)抽提其中的干细胞外泌体；本实验抽提外泌体步骤为：将上清液于4℃300×g，10min离心除去细胞碎片；4℃2000×g，10min离心去除死细胞等杂质；0.22μm无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质；4℃100000×g，120min超速离心得到外泌体沉淀，去除上清液后加入约200ulPBS洗涤一遍；再次4℃100000×g，120min超速离心，弃去上清液，加入100ulPBS可得到浓度较纯的间充质干细胞来源的外泌体。分装后于-80℃冰箱保存。

3.干细胞来源的外泌体的鉴定：

1)电镜观察外泌体的基本形态：取人脐带间充质干细胞外泌体20μl与等量2％的磷钨酸钠水溶液混合，制成混悬液后，用吸管递加至铜网膜上，室温放置5min后，用滤纸吸取多余的水分，将铜圈放在烤灯下烘干，置于透射电镜下拍照，如图1A所示外泌体的囊泡状结构。

2)Western Blot检测外泌体的特异性蛋白CD81、CD63：用试剂盒提取外泌体蛋白，经BCA法检测蛋白含量后上样。经过电泳、转膜等程序后，浸没于5％BSA封闭液中室温缓慢摇荡两小时。孵育CD81、CD63一抗4℃过夜。随后根据一抗来源选择合适的二抗，按相应比例稀释(1:1000～1:10000)，室温轻摇两小时。TBS洗涤后，使用ECL发光试剂显色。结果如图1B所示外泌体特异性标志物CD81、CD63表达可见。

3)PKH67染色检测外泌体进入靶细胞的情况：PKH67荧光染料试剂盒购自于Sigma公司，根据说明书首先将外泌体稀释于500μl的C液中，并加入2μlPKH67染料并共孵育5分钟。加入胎牛血清终止反应。最后以DMEM冲洗两遍去除多余染料。将带荧光的外泌体加入血管内皮细胞。12小时后以PBS冲洗三遍。采用Hoechst33342染核后在荧光显微镜下观察。如图2所示，干细胞外泌体可以进入靶细胞并富集于细胞核的周围。

实施例2：脐带间充质干细来源的外泌体对缺血性骨不连的作用：

1.建立小鼠缺血性骨不连模型，模型参考文献(J Orthop Res 2007；25(1)：51-61)。并设立uMSCs-Exo组(实验组)；uMSC组(阳性对照组)；HEK293T-Exo组(阴性对照组)；PBS组(空白对照组)。

2.分别于第1、7日同等剂量(200μg/ml)以1ml注射器注射入大鼠骨不连局部。于注射后第7、14、21、31日根据需要取样本。

1)通过μCT血管三维重建检测血管体积(Vessel Volume,VV)，比较骨痂周围微血管新生与分布情况。具体步骤如下：大鼠处死后，于左颈动脉逆行插入20G导管并于右颈静脉做一小切口。用肝素盐水(100U/mL)注射入管内直至从右颈静脉流出的血水为粉色，即说明全身循环血液基本清除。然后以150mmHg压力通过导管灌注10％福尔马林持续约5分钟，遂用肝素盐水冲洗5分钟，最后灌注5毫升白色硅橡胶微球MICROFIL MV 112(Flow Tech；Carver,MA)。在室温下固化1小时，离取待测下肢，福尔马林溶液保存1天后测量。如图,4A所示，干细胞外泌体组比阴性对照组微血管体积明显增多，与干细胞组的微血管形成体积基本一致，说明外泌体有着干细胞一致的特性，可以发挥促血管新生的作用。

2)第14日通过对血管内皮细胞标志性蛋白CD31免疫组化染色，比较不同处理条件对骨不连血管新生的影响，结果如图4B，发现外泌体组CD31分布密集，说明在外泌体的干预下，新生血管增多进而可以促进骨的再生。

实施例3：脐带间充质干细胞来源的外泌体对游离脂肪移植后脂肪颗粒血管化的作用：

1.脂肪颗粒的提取与分组：脂肪颗粒取自第二军医大学附属长海医院整形外科22～35岁女性患者腹部抽脂手术10例，排除了冠心病、高血压病、糖尿病、传染病等。手术前与患者谈话并征得其同意获取脂肪组织进行实验。将抽脂后的脂肪组织或颗粒用离心机低速离心(200×g)5分钟后取下层黄色脂肪悬液。脂肪体积的计算方法为：将冲洗、离心后的层黄色脂肪悬液(内包含大块脂肪组织)放入标记好液面的5ml注射器中，修剪脂肪块，使液面恰好上升，即获得0.3ml体积的脂肪组织，0.3ml脂肪组织湿重约为270mg。分为三组，A组为干细胞外泌体的储存液按工作浓度200μg/ml与0.3ml的脂肪组织混匀后的脂肪悬液；B组为HEK293细胞来源外泌体与0.3ml的脂肪组织悬液(阴性对照)；C组为PBS与0.3ml的脂肪组织悬液(空白对照)。

2.脂肪移植模型建立：取雌性4～6周裸鼠(第二军医大学动物实验中心提供)18只，体重15～18g，裸鼠以2％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉，用注射器将A、B、C 3组移植物分别随机注入每只裸鼠背部皮下。术后均饲养于第二军医大学动物中心。

3.脂肪移植术后观察：①3个月后移植脂肪组织存活率：完整取出移植物，对其进行湿重测定，计算存活率。如图5所示，3个月后移植脂肪组织存活率：A、B、C 3组脂肪组织湿重分别为(95.97±5.51)mg、(63.42±5.12)mg、(67.64±5.09)mg，C组移植脂肪组织湿重与B组相似(P＞0.05)，但湿重均低于C组(P＜0.05)。②纤维化及坏死程度的测定：采用Gundersen于1998年提出的“点计数”测量方法。采用网格测试系统，包括20条线及100个交点，测量每张切片的互不重复、随机选择的10个200倍视野(随机取两位观测者进行测量，计数10个视野的纤维化及囊腔的数目)，将各组移植物测量得到的点个数进行纤维化及坏死程度的比较。③于移植后第3日处死一批裸鼠进行移植脂肪切片染色，观察血管标志蛋白CD31的阳性情况：将石蜡切片用二甲苯脱蜡，乙醇逐级脱水。3％过氧化氢封闭内源性过氧化氢酶10min，PBS冲洗3遍，每遍5min；1：20正常山羊血清封闭20min；小鼠抗人CD31一抗(1μg/ml)4℃湿盒中过夜，PBS冲洗3遍；山羊抗小鼠IgG FITC孵育45min，PBS冲洗3遍，荧光倒置显微镜观察。可见小鼠抗人CD31及山羊抗小鼠IgG-FITC标记显示出绿色荧光的血管环。图像叠加证实，干细胞外泌体在体内能够促进新生血管形成，CD31阳性率明显高于空白对照组，促进了游离移植脂肪组织的血管形成。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.间充质干细胞来源的外泌体在制备促进血管化或诱导血管新生药物中的应用。

2.间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗缺血性病损药物中的应用，所述的间充质干细胞来源的外泌体通过促进血管化或诱导血管新生，使病损组织恢复或存活。

3.间充质干细胞来源的外泌体在制备用于脂肪移植后提高脂肪颗粒在受区存活率的药物中的应用，所述的间充质干细胞来源的外泌体通过促进血管新生，提高脂肪颗粒的存活率。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的间充质干细胞来源于人骨髓、人脂肪或人脐带。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法包括以下步骤：

A、选用脐带来源的间充质干细胞进行分离培养与传代；

B、间充质干细胞来源的外泌体的抽提制备：

a)将人脐带间充质干细胞培养基加入间充质干细胞中，48h-72h后收取培养上清液；所述的培养基配方为：含有质量百分比5％UltraGRO和质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基；

6.一种间充质干细胞来源的外泌体的组合物，其特征在于，包括间充质干细胞来源的外泌体和稀释液，所述的稀释液为水凝胶或PBS，所述的组合物中间充质干细胞来源的外泌体的浓度为200μg/ml；所述的间充质干细胞来源于人骨髓、人脂肪或人脐带。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法包括以下步骤：

A、选用脐带来源的间充质干细胞进行分离培养与传代；

B、间充质干细胞来源的外泌体的抽提制备：

8.根据权利要求6或7所述的组合物在制备促进血管化或诱导血管新生药物中的应用。

9.根据权利要求6或7所述的组合物在制备治疗缺血性病损药物中的应用。

10.根据权利要求6或7所述的组合物在制备用于脂肪移植后提高脂肪颗粒在受区存活率的药物中的应用。