CN109943533A - 一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用，属于生物工程技术领域，所述制备方法包括以下步骤：1)将脂肪干细胞与电转染工作液混合，得到混合液，将所述混合液与CTF1质粒混合，得到预转染物；2)将所述步骤1)得到的预转染物进行电击，得到转染CTF1基因的脂肪干细胞；3)将所述步骤2)得到的转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培养后，收集脂肪干细胞外泌体。采用本发明提供的方法制备得到的脂肪干细胞外泌体可显著促进子宫内膜微血管内皮细胞增殖。

Description

一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其 应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞及其应用。

背景技术

血管新生为胚胎附着部位的子宫内膜建立了丰富的血液循环，为胚胎植入提供了物质基础。子宫内膜下血流越丰富，子宫内膜容受性越好，越利于胚胎着床。通过干预子宫内膜血管新生过程增加内膜血供，改善子宫内膜容受性，是提高胚胎种植率的重要手段。阿司匹林被认为可增加子宫及卵巢血流灌注，从而提高胚胎种植率及临床妊娠率而被广泛应用于临床，然而其疗效仍存在争议，近年来亦有研究发现阿司匹林并不能提高临床妊娠率、活产率,及减少流产率等，且患者孕期服用阿司匹林有引起出血等不良反应。近年来研究还发现枸橼酸西地那非片能降低子宫内膜血流阻力，使子宫内膜血管计数增加，从而改善子宫内膜血流灌注，促进子宫内膜生长，有利于胚胎着床，提高临床妊娠率。然而临床应用枸橼酸西地那非片可出现头痛、面色潮红、消化不良、鼻塞和视觉功能异常等不良反应，且尚无临床证据证明其是否对胎儿造成不利影响，而且使用枸橼酸西地那非片的患者仍有一部分疗效不满意。因此寻找一种效果可靠、副作用小的改善子宫内膜血流，提高子宫内膜容受性的治疗方法仍是临床应用急迫需要研究的热点问题之一。

间充质干细胞具有强大增殖及多向分化能力、免疫调节、促进血管新生等潜能。其中脂肪组织来源的干细胞具有自我更新能力及多向分化潜能，相比于其他来源的干细胞具有来源广泛、取材方便、损伤小、增殖速度快、免疫原性低、表型稳定等优点，而日益受到学者们的广泛关注和重视。脂肪干细胞分泌的因子可促进微血管内皮细胞的增殖、细胞迁移和血管新生以及增加血管数量。然而多项临床前瞻性研究发现干细胞移植远期临床效果欠佳。其中脂肪干细胞移植效率低下、存活率低等问题是制约临床干细胞移植应用的瓶颈。研究显示通过静脉注射途径少于5％的MSC能到达损伤部位，大部分的干细胞在给药后的几个小时内凋亡，即使到达靶组织的MSC中只有少量长期停留在损伤部位。另外研究发现MSC移植可能存在微血管栓塞、体内成瘤等安全问题亦限制其临床应用。近来脂肪干细胞分泌的膜性微囊泡外泌体引起了学者们的广泛关注和重视，成为干细胞研究领域的热点。脂肪干细胞外泌体可以模拟间充质干细胞生物学功能，发挥其促进血管新生、改善缺血组织的血流灌注、组织修复、免疫调节等作用。而且外泌体不具备细胞核结构，在宿主体内不能扩增，无异倍体性的风险，脂肪干细胞外泌体能够穿过质膜，并且发生免疫排斥的可能性更小，在临床应用过程中具有较好的安全性，且不会像脂肪干细胞那样容易堵塞微血管，突破了脂肪干细胞治疗存在的较多问题，具有更广阔的临床应用前景。

脂肪干细胞外泌体的促血管新生作用受其所在体内/体外所处微环境的影响，炎症及低氧条件能调控外泌体的合成和包装，影响其促血管生成作用。在研究工作中发现脂肪干细胞外泌体对促进子宫内膜微血管内皮细胞增殖作用较弱，因此如何增强体外获取的脂肪干细胞外泌体促血管新生作用是需要解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用，采用本发明的制备方法制备得到的脂肪干细胞外泌体提高了子宫内膜微血管内皮细胞增殖。

本发明提供了一种制备脂肪干细胞外泌体的方法，包括以下步骤：

1)将脂肪干细胞与电转染工作液混合，得到混合液，将所述混合液与CTF1质粒混合，得到预转染物；

2)将所述步骤1)得到的预转染物进行电击，得到转染CTF1基因的脂肪干细胞；

3)将所述步骤2)得到的转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培养后，收集脂肪干细胞外泌体。

优选的，所述脂肪干细胞的数量与电转染工作液的体积比为(1～3×10⁵)个:(90～110)μl。

优选的，所述混合液的体积与CTF1质粒的质量比为(90～110)μl:(8～12)μg。

优选的，所述收集脂肪干细胞外泌体的方法包括：

将所述转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培后，收集培养的上清液，将所述上清液依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为脂肪干细胞外泌体；

所述第一离心的离心力为380～420xg；

所述第二离心的离心力为1800～2200xg；

所述第三离心的离心力为100000～140000xg。

优选的，所述第一离心和第二离心的温度独立的为1～5℃；

所述第一离心和第二离心的时间独立的为8～12min。

优选的，所述第三离心的温度为1～5℃。

优选的，所述第三离心的时间为12～18min。

本发明还提供了一种脂肪干细胞外泌体，所述脂肪干细胞外泌体由包括上述技术方案所述的制备方法制备得到。

本发明还提供了上述技术方案所述的脂肪干细胞外泌体在制备提高子宫内膜微血管内皮细胞增殖的药物中的应用。

优选的，所述药物还包括脂肪干细胞外泌体在医学上可接受的辅料。

本发明提供了一种制备脂肪干细胞外泌体的方法，包括以下步骤：1)将脂肪干细胞与电转染工作液混合，得到混合液，将所述混合液与CTF1质粒混合，得到预转染物；2)将所述步骤1)得到的预转染物进行电击，得到转染CTF1基因的脂肪干细胞；3)将所述步骤2)得到的转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培养后，收集脂肪干细胞外泌体。在本发明中，CTF1通过信号转导与转录激活因子信号通路介导增加脂肪干细胞植入损伤部位的效率并降低脂肪干细胞的丢失及死亡。此外，CTF1通过ADMA/DDAH/NO及IL-6/JAK/STAT3等信号通路调控血管内皮细胞内VEGF以及NO的表达水平，干预血管内皮细胞的增殖及迁移过程，从而促进血管新生。本发明通过核转染的方法使脂肪干细胞过表达CTF1，转染了CTF1的脂肪干细胞外泌体能明显提高子宫内膜血管内皮细胞的增殖。

附图说明

图1为荧光显微镜下GFP-脂肪干细胞；

图2为使用流式细胞仪检测脂肪干细胞的细胞表型；

图3为脂肪干细胞进行体外诱导分化结果；

图4为CTF1转染脂肪干细胞及流式细胞仪检测CTF1转染效率；

图5为从脂肪干细胞以及转染CTF1的脂肪干细胞培养基中提取相应的外泌体结果；

图6为转染CTF1基因脂肪干细胞外泌体显著促进子宫内膜血管内皮细胞增值的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种制备脂肪干细胞外泌体的方法，包括以下步骤：

1)将脂肪干细胞与电转染工作液混合，得到混合液，将所述混合液与CTF1质粒混合，得到预转染物；

2)将所述步骤1)得到的预转染物进行电击，得到转染CTF1基因的脂肪干细胞；

3)将所述步骤2)得到的转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培养后，收集脂肪干细胞外泌体。

本发明将脂肪干细胞与电转染工作液混合，得到混合液，将所述混合液与CTF1质粒混合，得到预转染物。

本发明对所述脂肪干细胞的来源没有特殊限定，采用常规脂肪干细胞的分离方法得到即可。

在本发明中，所述脂肪干细胞的数量与电转染工作液的体积比优选为(1～3×10⁵)个:(90～110)μl，更优选为(1.5～2.5×10⁵)个:100μl。在本发明中，所述脂肪干细胞优选经PBS缓冲液洗涤后再与电转染工作液混合。本发明对所述电转染工作液没有特殊限定，采用本领域常规选用的电转染工作液即可。

在本发明中，所述混合液的体积与CTF1质粒的质量比优选为(90～110)μl:(8～12)μg，更优选为100μl:10μg。在本发明中，所述CTF1质粒由地址为中国上海的上海生物工程技术有限公司合成。

本发明将得到的预转染物进行电击，得到转染CTF1基因的脂肪干细胞。

本发明对所述电击的方法没有特殊限定，采用常规电击的方法即可。在本发明具体实施方式中，优选采用德国Amaxa公司的NucleofectorTM核转染仪相应程序(A20、S18、T20)分别进行电击。

本发明将得到的转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培养后，收集脂肪干细胞外泌体。

在本发明中，所述收集脂肪干细胞外泌体的方法优选包括：

将所述转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培后，收集培养的上清液，将所述上清液依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为脂肪干细胞外泌体；所述第一离心的离心力为380～420xg；所述第二离心的离心力为1800～2200xg；所述第三离心的离心力为100000～140000xg。

本发明对所述收集培养的上清液的收集方法没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，所述第一离心的离心力为380～420xg，优选为400xg；所述第一离心的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述第一离心的温度优选为1～5℃，更优选为4℃。在本发明中，所述第一离心能够除去细胞碎片。

在本发明中，所述第二离心的离心力为1800～2200xg，优选为2000xg；所述第二离心的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述第二离心的温度优选为1～5℃，更优选为4℃。在本发明中，所述第二离心能够除去死细胞。

在本发明中，所述第三离心的离心力为100000～140000xg，优选为120000xg；所述第三离心的时间优选为12～18min，更优选为15min；所述第三离心的温度优选为1～5℃，更优选为4℃。

本发明优选在第二离心后进行无菌滤膜过滤后再进行第三离心，所述无菌滤膜的孔径优选为0.22μm。在本发明中，所述过滤能够除去杂质。

本发明还提供了一种脂肪干细胞外泌体，所述脂肪干细胞外泌体由包括上述技术方案所述的制备方法制备得到。

本发明还提供了上述技术方案所述的脂肪干细胞外泌体在制备提高子宫内膜微血管内皮细胞增殖的药物中的应用。

在本发明中，所述药物还包括脂肪干细胞外泌体在医学上可接受的辅料。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1、脂肪干细胞的分离与鉴定：脂肪组织为上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科在无菌条件下通过抽脂获得的腹部或大腿脂肪废弃物，对脂肪组织进行1500rpm离心5分钟，弃掉上层油脂和下层血性细胞层，取中间脂肪层，使用PBS清洗脂肪3～5次，直到清洗液清澈；最后一次清洗所得混合物进行1500rpm离心5分钟，吸取脂肪，记录脂肪体积；得脂肪按照1:1使用消化酶进行消化，37℃恒温摇床150～280rpm消化20～60分钟；消化结束后，2000rpm离心5分钟，弃掉上层油脂层及消化后的脂肪层，留下层干细胞沉淀及少量的消化液，加入等体积的FBS进行终止；终止后混合物进行1500rpm离心5分钟，收集脂肪干细胞，使用PBS重悬，1500rpm清洗2遍，去除前期使用的双抗和FBS；所得细胞计数。

2、获得转染CTF1的脂肪干细胞：获得脂肪干细胞并精确计数1×10⁶个后，PBS洗涤细胞2次，1500rpm离心10分钟后，用100微升电转染工作液将脂肪干细胞沉淀重悬，加入10微克CTF1质粒(上海生物工程技术有限公司合成，中国上海)，置于2mm电击杯中，选用德国Amaxa公司的NucleofectorTM核转染仪相应程序(A20、S18、T20)分别进行电击，完成后将已经转染外源基因CTF1的脂肪干细胞转移到1.4ml的37℃预热干细胞培养基中，细胞转染后2～4小时就能检测到转染CTF1基因的表达。

3、收集转染CTF1基因的脂肪干细胞的培养上清液于4℃、400xg,离心10min，转移上清、除去细胞碎片；4℃、2000xg,离心10min，转移上清、除去死细胞；使用0.22微米的无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质；4℃、120000xg，超速离心150min沉淀外泌体，去除上清液后加入500微升PBS收集底部外泌体沉淀，最后再使用0.22微米的无菌滤膜过滤，以便获得高纯度且安全的稳定转染CTF1基因的脂肪肝细胞外泌体。

结果：

1)采用上述方法已经成功从人大腿、腹部脂肪组织中分离培养大量脂肪干细胞，结果见图1。

从图1中可以得出，免疫荧光染色发现90％GFP-脂肪干细胞表达干细胞转录调控因子SOX2、细胞外基质层黏连蛋白laminin和纤维连接蛋白fibronectin。然而GFP-ADSC不表达内皮细胞粘附分子CD31。

2)使用流式细胞仪检测脂肪干细胞的细胞表型，结果见图2。

从图2中可以得出，GFP-脂肪干细胞高表达表面抗原CD90和CD105，不表达CD11b,CD31,CD34,CD83和CD133。且相应的同型对照抗体表达为阴性。

3)将脂肪干细胞进行体外诱导分化，来鉴定脂肪干细胞，结果见图3。

从图3中可以得出，成脂细胞诱导油红染色，可见红色脂滴形成；B:成骨细胞诱导茜素红染色，可见红色的钙结节。

4)将CTF1基因转染进脂肪干细胞，结果见图4，从图4中可以得出，流式细胞仪结果显示转染CTF1基因前的脂肪干细胞CTF1表达为阴性，而转染CTF1基因后显示CTF1表达为77％。

5)从脂肪干细胞以及转染CTF1的脂肪干细胞培养基中提取相应的外泌体，结果见图5，从图5中可以得出，图5a为电镜扫描下CTF1脂肪干细胞外泌体的形态，图5b免疫印迹试验结果显示转染CTF1基因的脂肪干细胞外泌体高表达外泌体特异标志物CD63以及CTF1蛋白。

6)脂肪干细胞外泌体(ADSC-Exo)促进子宫内膜微血管内皮细胞增殖能力较弱，转染CTF1基因后的脂肪干细胞外泌体(C-ADSC-Exo)可显著促进子宫内膜微血管内皮细胞增殖，结果见图6。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的方法得到的脂肪干细胞外泌体可显著促进子宫内膜微血管内皮细胞增殖。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种制备脂肪干细胞外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将脂肪干细胞与电转染工作液混合，得到混合液，将所述混合液与CTF1质粒混合，得到预转染物；

2)将所述步骤1)得到的预转染物进行电击，得到转染CTF1基因的脂肪干细胞；

3)将所述步骤2)得到的转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培养后，收集脂肪干细胞外泌体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的数量与电转染工作液的体积比为(1～3×10⁵)个:(90～110)μl。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合液的体积与CTF1质粒的质量比为(90～110)μl:(8～12)μg。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述收集脂肪干细胞外泌体的方法包括：

将所述转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培后，收集培养的上清液，将所述上清液依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为脂肪干细胞外泌体；

所述第一离心的离心力为380～420xg；

所述第二离心的离心力为1800～2200xg；

所述第三离心的离心力为100000～140000xg。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一离心和第二离心的温度独立的为1～5℃；

所述第一离心和第二离心的时间独立的为8～12min。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第三离心的温度为1～5℃。

7.根据权利要求4或6所述的制备方法，其特征在于，所述第三离心的时间为12～18min。

8.一种脂肪干细胞外泌体，所述脂肪干细胞外泌体由包括权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到。

9.权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到的脂肪干细胞外泌体或权利要求8所述的脂肪干细胞外泌体在制备提高子宫内膜微血管内皮细胞增殖的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物还包括脂肪干细胞外泌体在医学上可接受的辅料。