CN114085811B - 一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法 - Google Patents
一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114085811B CN114085811B CN202110495856.0A CN202110495856A CN114085811B CN 114085811 B CN114085811 B CN 114085811B CN 202110495856 A CN202110495856 A CN 202110495856A CN 114085811 B CN114085811 B CN 114085811B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- stem cells
- mesenchymal stem
- cell
- exosomes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 68
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 64
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 210000000754 myometrium Anatomy 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 96
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 29
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 28
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 claims description 24
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 claims description 24
- 230000002632 myometrial effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 17
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 15
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 8
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 8
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 4
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 claims description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 18
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 12
- 102000049556 Jagged-1 Human genes 0.000 abstract description 7
- 101000994439 Danio rerio Protein jagged-1a Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000005913 Notch signaling pathway Effects 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 102000001759 Notch1 Receptor Human genes 0.000 description 4
- 108010029755 Notch1 Receptor Proteins 0.000 description 4
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101000836492 Dictyostelium discoideum ALG-2 interacting protein X Proteins 0.000 description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001134621 Homo sapiens Programmed cell death 6-interacting protein Proteins 0.000 description 2
- 101000843556 Homo sapiens Transcription factor HES-1 Proteins 0.000 description 2
- 102400000552 Notch 1 intracellular domain Human genes 0.000 description 2
- 101800001628 Notch 1 intracellular domain Proteins 0.000 description 2
- 102100033344 Programmed cell death 6-interacting protein Human genes 0.000 description 2
- 102100030798 Transcription factor HES-1 Human genes 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 108700003486 Jagged-1 Proteins 0.000 description 1
- 108700037966 Protein jagged-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000005168 endometrial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000000603 stem cell niche Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0661—Smooth muscle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1347—Smooth muscle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法，包括将分离分选后的子宫内膜间充质干细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，贴壁生长16～30小时；经PBS洗涤后，加入子宫肌层细胞来源的外泌体进行共培养，便可得到大量扩增的子宫内膜间充质干细胞。本发明提供的方法采用干细胞生态位子宫肌层细胞来源的外泌体富集Notch信号通路配体Jagged1，且具有良好的生物相容性及生物活性，能够最大限度的模拟干细胞在人体内的真实生长情况，与子宫内膜间充质干细胞体外共培养后有效促进干细胞增殖的同时能够维持其干性。因此，本发明提供的方法改良了干细胞体外培养，对提高子宫内膜间充质干细胞的临床应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法。
背景技术
近年来，研究表明人类子宫内膜中存在一定数量的间充质干细胞，子宫内膜间充质干细胞。这些干细胞具有自我更新，高度增殖和克隆形成能力，从而在月经周期后子宫内膜的再生中起重要作用，是治疗宫腔黏连和修复受损子宫内膜的理想的干细胞来源，也为临床上治疗阿舍曼综合症引起的不孕症患者提供了新的希望。因此，对子宫内膜间充质干细胞进行扩增培养对于目前相关疾病的治疗或者治疗方案的研究具有重要的意义。
目前的研究主要是通过CD140b和CD146的共表达或者单一的表面标记抗体SUSD2来分离鉴定子宫内膜间充质干细胞。但是干细胞一旦离开自身的生长环境，在体外培养过程中会很快分化失去干性，从而限制了其在临床上的应用。目前，大部分研究采用化学药物来维持干细胞体外培养的干性。但是化学药物由于是人工合成，对细胞存在一定的毒性，不能完美模拟干细胞在体内的正常生理状态，因此需要寻找一种能够有效维持干细胞体外培养的干性的生物方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法，包括将分离分选后的子宫内膜间充质干细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，贴壁生长16～30小时；经PBS洗涤后，加入子宫肌层细胞来源的外泌体进行共培养，便可得到大量扩增的子宫内膜间充质干细胞。
进一步地，上述子宫内膜间充质干细胞是通过磁珠分离得到的CD140b+
CD146+子宫内膜间充质干细胞。
进一步，上述共培养的时间为5～10天；优选为7天。
进一步地，子宫内膜间充质干细胞的分离方法包括如下步骤：
(1)将子宫内膜组织切成小块，用含有III型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的PBS溶液进行重悬，消化后筛分；
(2)在重悬细胞液中加入Ficoll-Paque，通过离心法去除细胞悬液中红细胞、细胞碎片和细胞团块；
(3)将得到的上述细胞液与抗CD45抗体包被的磁珠进行培养来去除白细胞；
(4)利用抗上皮细胞标记CD368抗体的磁珠对内膜基质细胞进行阴性选择；将新鲜纯化的基质细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，在37℃潮湿的CO2培养箱中培养7-14天。
进一步地，用两次独立的磁珠分选方法对通过上述分离方法分离得到的子宫内膜间充质干细胞进行分离得到CD140b+CD146+子宫内膜间充质干细胞。
进一步地，上述两次独立的磁珠分选方法具体包括如下步骤：
(1)将子宫内膜基质细胞与藻红蛋白偶联的抗CD140b抗体进行孵育，然后将得到的细胞与抗小鼠IgG的磁珠抗体进行孵育，利用具有磁场的柱子分离收集CD140b+细胞，并在培养基中培养7～10天；
(2)用胰蛋白酶消化扩增的CD140b+细胞，并与抗CD146的磁珠抗体进行孵育，利用具有磁场的柱子分离收集CD140b+CD146+细胞。
进一步地，子宫肌层细胞来源的外泌体的获取方法包括如下步骤：
(1)子宫肌层细胞的分离：将子宫肌层组织切成小块，用含有III型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的PBS溶液进行重悬，然后消化过滤；将过滤得到的单细胞悬液接种到的培养皿中，用含有10％胎牛血清的DMEMF/F12生长培养基进行培养；
(2)子宫肌层细胞外泌体的分离：对细胞密度达到70-85％的子宫肌层细胞进行消化，对消化得到的子宫肌层细胞悬浮液采用完全培养基进行扩增培养；在第四天将完全培养基换成不含胎牛血清的DMEM/F12培养基培养48小时，收集外泌体。
进一步地，上述外泌体的收集方法包括如下步骤：
步骤1，收集细胞上清液，常温离心去除死细胞；
步骤2，收集离心所得的细胞上清液，离心去除细胞碎片；
步骤3，收集离心所得的细胞上清液，离心；
步骤4，弃上清，用PBS重悬所分离的外泌体，离心，所得的沉淀物即为外泌体。
进一步地，上述步骤1中离心所采用的参数为2000g，30分钟；上述步骤2 中离心所采用的参数为4℃，1.6×105g，离心30分钟；上述步骤3中离心所采用的的参数为4℃，1.2×106g，离心80分钟；上述步骤4中离心所采用的的参数为 4℃，1.2×106g，离心80分钟。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的方法采用干细胞生态位子宫肌层细胞来源的外泌体富集Notch 信号通路配体Jagged1，且具有良好的生物相容性及生物活性，能够最大限度的模拟干细胞在人体内的真实生长情况，与子宫内膜间充质干细胞体外共培养后有效促进干细胞增殖的同时能够维持其干性。因此，本发明提供的方法改良了干细胞体外培养，对提高子宫内膜间充质干细胞的临床应用具有重要意义。
附图说明
图1显示了本发明一实施例中分离子宫内膜间充质干细胞的流程图；
图2显示了本发明一实施例中分离分选出来的子宫内膜间充质干细胞的 CD140b和CD146的表达情况；
图3显示了本发明一实施例中分离的子宫内膜间充质干细胞培养15天后形成的大克隆(图A)和小克隆(图B)的形态；
图4显示了本发明一实施例中分离的子宫肌层细胞中肌层特异性蛋白 a-SMA(图A)以及MyoD1(图B)的表达情况；
图5显示了本发明一实施例中分离子宫肌层细胞外泌体的流程图；
图6为本发明一实施例中子宫肌层细胞来源的外泌体的蛋白免疫印迹鉴定结果和外泌体粒径大小结果；其中，图6A显示了外泌体表达外泌体特异性蛋白 Alix、CD63、CD81和GM130的情况；图6B显示了子宫肌层外泌体的平均粒径大小；图6C显示了子宫肌层外泌体包含Notch信号通路的特异性配体Jagged1；
图7显示了本发明一实施例中经子宫肌层细胞来源的外泌体处理后的子宫内膜间充质干细胞的干性维持、克隆形成情况及增殖结果；其中，图A显示了子宫肌层来源的外泌体能够有效促进子宫内膜间充质干细胞维持其干性；图B 子宫肌层来源的外泌体能够有效增加子宫内膜间充质干细胞的克隆形成能力；图 C通过增殖实验显示了子宫肌层来源的外泌体能够有效促进子宫内膜间充质干细胞的增殖能力；
图8显示了本发明一实施例中分离得到的子宫内膜间充质干细胞Notch1受体的表达情况；其中，图A为免疫荧光实验结果，图B为子宫内膜间充质干细胞Notch1受体表达的定量结果；
图9显示了本发明一实施例中经子宫肌层细胞来源的外泌体处理后的子宫内膜间充质干细胞中Notch信号通路的表达情况；其中，图A为蛋白免疫印迹结果，图B～D分别为Notch信号通路相关蛋白NICD、HEY-2和HES-1的相对定量结果。
具体实施方式
本发明提供的方法利用肌层细胞外泌体传递Jagged-1并促进子宫内膜间充质干细胞体外扩增，可以维持维持子宫内膜间充质干细胞的干性。具体地，该方法包括将分离分选后的子宫内膜间充质干细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，贴壁生长16～30小时；经PBS洗涤后，加入子宫肌层细胞来源的外泌体进行共培养，便可得到大量扩增的子宫内膜间充质干细胞。
在本发明一优选的实施方式中，上述子宫内膜间充质干细胞是通过磁珠分离得到的CD140b+CD146+子宫内膜间充质干细胞。
在本发明一优选的实施方式中，上述共培养的时间为5～10天；优选为7天。
在本发明一优选的实施方式中，子宫内膜间充质干细胞的分离方法包括如下步骤：
(1)将子宫内膜组织切成小块，用含有III型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的PBS溶液进行重悬，消化后筛分；
(2)在重悬细胞液中加入Ficoll-Paque，通过离心法去除细胞悬液中红细胞、细胞碎片和细胞团块；
(3)将得到的上述细胞液与抗CD45抗体包被的磁珠进行培养来去除白细胞；
(4)利用抗上皮细胞标记CD368抗体的磁珠对内膜基质细胞进行阴性选择；将新鲜纯化的基质细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，在37℃潮湿的CO2培养箱中培养7-14天。
在本发明一优选的实施方式中，用两次独立的磁珠分选方法对通过上述分离方法分离得到的子宫内膜间充质干细胞进行分离得到CD140b+CD146+子宫内膜间充质干细胞。
在本发明一优选的实施方式中，上述两次独立的磁珠分选方法具体包括如下步骤：
(1)将子宫内膜基质细胞与藻红蛋白偶联的抗CD140b抗体进行孵育，然后将得到的细胞与抗小鼠IgG的磁珠抗体进行孵育，利用具有磁场的柱子分离收集CD140b+细胞，并在培养基中培养7～10天；
(2)用胰蛋白酶消化扩增的CD140b+细胞，并与抗CD146的磁珠抗体进行孵育，利用具有磁场的柱子分离收集CD140b+CD146+细胞。
在本发明一优选的实施方式中，子宫肌层细胞来源的外泌体的获取方法包括如下步骤：
(1)子宫肌层细胞的分离：将子宫肌层组织切成小块，用含有III型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的PBS溶液进行重悬，然后消化过滤；将过滤得到的单细胞悬液接种到的培养皿中，用含有10％胎牛血清的DMEMF/F12生长培养基进行培养；
(2)子宫肌层细胞外泌体的分离：对细胞密度达到70-85％的子宫肌层细胞进行消化，对消化得到的子宫肌层细胞悬浮液采用完全培养基进行扩增培养；在第四天将完全培养基换成不含胎牛血清的DMEM/F12培养基培养48小时，收集外泌体。
在本发明一优选的实施方式中，上述外泌体的收集方法包括如下步骤：
步骤1，收集细胞上清液，常温离心去除死细胞；
步骤2，收集离心所得的细胞上清液，离心去除细胞碎片；
步骤3，收集离心所得的细胞上清液，离心；
步骤4，弃上清，用PBS重悬所分离的外泌体，离心，所得的沉淀物即为外泌体。
在本发明一优选的实施方式中，上述步骤1中离心所采用的参数为2000g， 30分钟；上述步骤2中离心所采用的参数为4℃，1.6×105g，离心30分钟；上述步骤3中离心所采用的的参数为4℃，1.2×106g，离心80分钟；上述步骤4中离心所采用的的参数为4℃，1.2×106g，离心80分钟。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施提供了子宫内膜间充质干细胞的分离方法并对分离的干细胞进行鉴定，具体的实验方法和结果如下：
1.1子宫内膜间充质干细胞的分离
将子宫内膜组织切成1mm3的小块，用含有III型胶原酶(300μg/ml)和I 型脱氧核糖核酸酶(40μg/ml)的PBS溶液进行重悬，放置在37℃水浴锅中进行震荡消化。经过两轮消化后，用40μm滤网将分散的细胞进行筛分。然后在重悬细胞液中加入Ficoll-Paque，通过离心法去除细胞悬液中红细胞，细胞碎片和细胞团块。将得到的上述细胞液与抗CD45抗体包被的磁珠进行培养来去除白细胞。利用抗上皮细胞标记CD368抗体的磁珠对内膜基质细胞进行阴性选择。将新鲜纯化的基质细胞接种到预先用纤连蛋白(1mg/ml)处理过的100mm培养皿上，在37℃潮湿的CO2培养箱中培养7～14天。
如图1所示，用两次独立的磁珠分选方法来分离得到子宫内膜间充质干细胞(CD140b+CD146+细胞)：将子宫内膜基质细胞与藻红蛋白偶联的抗CD140b 抗体在4℃孵育45分钟；然后将得到的细胞与抗小鼠IgG的磁珠抗体在4℃孵育15分钟；利用具有磁场的柱子分离收集CD140b+细胞，并在培养基中培养7～10 天。细胞在扩增过程中会与磁珠抗体进行分离。然后用胰蛋白酶消化扩增的 CD140b+细胞，并与抗CD146的磁珠抗体在4℃孵育15分钟；利用具有磁场的柱子分离收集CD140b+CD146+子宫内膜间充质干细胞。
1.2细胞的鉴定
将上述分离方法得到的细胞经荧光染色鉴定高度表达CD140b和CD146(见图2)，并且具有形成不同大小克隆的能力(见图3)。这些克隆具有自我更新能力，可以进行多次传代。
综上，本实例提供的方法分离得到的细胞是具有间充质干细胞特性的子宫内膜间充质干细胞。
实施例2
本实施例制备来源于子宫肌层细胞的外泌体，具体的方法和鉴定结果如下：
2.1子宫肌层细胞的分离及鉴定
将子宫肌层组织切成1mm3的小块，用含有III型胶原酶(300μg/ml)和I 型脱氧核糖核酸酶(40μg/ml)的PBS溶液进行重悬，放置在37℃的水浴锅中进行震荡消化3小时。用100μm筛网对所得的细胞悬液进行过滤。将过滤得到的单细胞悬液接种到100mm的培养皿中，用含有10％胎牛血清的DMEMF/F12 生长培养基进行培养。
该方法分离得到的细胞经荧光染色鉴定表达肌层细胞特异性抗体a-SMA，并且不表达MyoD1(见图4)，证实该细胞为子宫内膜肌层细胞。
2.2子宫肌层细胞外泌体的分离鉴定及所包载的蛋白测定
当分离得到的子宫肌层细胞扩增到达到约80％时，用胰蛋白酶进行消化传代。将消化得到子宫肌层细胞悬浮液按1×106个细胞密度接种到T75细胞培养瓶中，用完全培养基培养扩增4天。在第四天将完全培养基换成不含胎牛血清的 DMEM/F12培养基培养48小时，按以下方法收集子宫肌层细胞分泌的外泌体(见图5)。
步骤1，收集细胞上清液，常温下2000g离心30分钟，去除死细胞。
步骤2，收集离心所得的细胞上清液，4℃，1.6×105g离心30分钟，去除细胞碎片。
步骤3，收集离心所得的细胞上清液，4℃，1.2×106g离心80分钟，所得的沉淀物即为外泌体。
步骤4，弃上清，用6毫升的无菌PBS重悬外泌体，4℃，1.2×106g离心80 分钟。
步骤5，弃上清，用100微升的无菌PBS重悬外泌体，用BCA蛋白测定试剂盒测定所分离的外泌体的浓度。分离得到的外泌体可以长期保存于-80℃。
经蛋白免疫印迹验证，该方法分离得到的外泌体表达外泌体特异性蛋白Alix、CD63和CD81，不表达GM130(见图6A)，纳米粒子分析仪检测结果显示所分离的外泌体的平均粒径为129.6nm(见图6B)，证实通过该高速离心法得到的沉淀物为子宫肌层外泌体。同时蛋白免疫印迹表明子宫肌层外泌体包含 Notch信号通路的特异性配体Jagged1(见图6C)。
实施例3
本实施例采用子宫肌层外泌体体外扩增宫间充质干细胞并对其进行鉴定，具体的方法和结果如下：
将实施例1分离的CD140b+CD146+子宫内膜间充质干细胞按4000个/cm2的细胞密度接种到预先用纤连蛋白(1mg/ml)处理过的100mm培养皿上，贴壁生长24小时；然后经PBS洗涤一次后，加入实施例2分离的子宫肌层细胞来源的外泌体(10μg/ml)共培养7天。在第7天，用胰蛋白酶对体外扩增培养的子宫内膜间充质干细胞进行消化。将所得细胞悬浮液进行染色后用流式细胞仪检测CD140b+CD146+子宫内膜间充质干细胞的百分比，用增殖试剂盒检测子宫内膜间充质干细胞的增殖情况，用蛋白免疫印迹验证子宫内膜间充质干细胞的信号通路表达情况。
流式细胞仪检测证实经子宫肌层来源的外泌体处理的子宫内膜间充质干细胞中CD140b+CD146+比例与对照组相比显著升高(见图7A)，同时其克隆形成能力显著升高(见图7B)；增殖实验表明子宫肌层来源的外泌体能够有效促进子宫内膜间充质干细胞的增殖能力(见图7C)。
以上实验证明干细胞生态位的子宫肌层细胞来源的外泌体能够在体外培养中显著促进子宫内膜间充质干细胞的增殖，同时有效保持其干性，为子宫内膜干细胞的体外扩增提供了新思路。
同时免疫荧光实验表明磁珠分离得到的CD140b+CD146+子宫内膜间充质干细胞高度表达Notch信号通路受体Notch 1(见图8)，蛋白免疫印迹证实子宫肌层细胞来源的外泌体表达Notch信号通路配体Jagged1(见图6C)。将分离得到的外泌体与子宫内膜间充质干细胞在体外共培养7天后，通过蛋白免疫印迹证实子宫内膜间充质干细胞中Notch信号通路相关蛋白NICD、HEY-2和HES-1 显著升高(见图9)，说明子宫肌层来源的外泌体通过运载Notch信号通路配体 Jagged1和子宫内膜间充质干细胞的表面Notch1受体结合后，激活Notch信号通路来促进子宫内膜干细胞的增殖和干性维持。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (6)
1.一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，包括将通过磁珠分离得到的CD140b+CD146+子宫内膜间充质干细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，贴壁生长16～30小时；经PBS洗涤后，加入子宫肌层细胞来源的外泌体进行共培养，所述共培养的时间为5～10天，便可得到大量扩增的子宫内膜间充质干细胞；
所述子宫肌层细胞来源的外泌体的获取方法包括如下步骤：
(1)子宫肌层细胞的分离：将子宫肌层组织切成小块，用含有III型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的PBS溶液进行重悬，然后消化过滤；将过滤得到的单细胞悬液接种到的培养皿中，用含有10％胎牛血清的DMEMF/F12生长培养基进行培养；
(2)子宫肌层细胞外泌体的分离：对细胞密度达到70-85％的子宫肌层细胞进行消化，对消化得到的子宫肌层细胞悬浮液采用完全培养基进行扩增培养；在第四天将完全培养基换成不含胎牛血清的DMEM/F12培养基培养48小时，收集外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，子宫内膜间充质干细胞的分离方法包括如下步骤：
(1)将子宫内膜组织切成小块，用含有III型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的PBS溶液进行重悬，消化后筛分；
(2)在重悬细胞液中加入Ficoll-Paque，通过离心法去除细胞悬液中红细胞、细胞碎片和细胞团块；
(3)将得到的上述细胞液与抗CD45抗体包被的磁珠进行培养来去除白细胞；
(4)利用抗上皮细胞标记CD368抗体的磁珠对内膜基质细胞进行阴性选择；将新鲜纯化的基质细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，在37℃潮湿的CO2培养箱中培养7-14天。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用两次独立的磁珠分选方法对通过所述分离方法分离得到的子宫内膜间充质干细胞进行分离得到CD140b+CD146+子宫内膜间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述两次独立的磁珠分选方法具体包括如下步骤：
(1)将子宫内膜基质细胞与藻红蛋白偶联的抗CD140b抗体进行孵育，然后将得到的细胞与抗小鼠IgG的磁珠抗体进行孵育，利用具有磁场的柱子分离收集CD140b+细胞，并在培养基中培养7～10天；
(2)用胰蛋白酶消化扩增的CD140b+细胞，并与抗CD146的磁珠抗体进行孵育，利用具有磁场的柱子分离收集CD140b+CD146+细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外泌体的收集方法包括如下步骤：
步骤1，收集细胞上清液，常温离心去除死细胞；
步骤2，收集离心所得的细胞上清液，离心去除细胞碎片；
步骤3，收集离心所得的细胞上清液，离心；
步骤4，弃上清，用PBS重悬所分离的外泌体，离心，所得的沉淀物即为外泌体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1中离心所采用的参数为2000g，30分钟；所述步骤2中离心所采用的参数为4℃，1.6×105g，离心30分钟；所述步骤3中离心所采用的的参数为4℃，1.2×106g，离心80分钟；所述步骤4中离心所采用的的参数为4℃，1.2×106g，离心80分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110495856.0A CN114085811B (zh) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | 一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110495856.0A CN114085811B (zh) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | 一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114085811A CN114085811A (zh) | 2022-02-25 |
| CN114085811B true CN114085811B (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=80295955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110495856.0A Active CN114085811B (zh) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | 一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114085811B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108815189A (zh) * | 2018-09-27 | 2018-11-16 | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 | 一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂 |
| CN109943533A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-28 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE525460T1 (de) * | 2005-07-20 | 2011-10-15 | Seoul Nat Univ Ind Foundation | Verfahren zur kultivierung und vermehrung hämatopoetischer stammzellen und vorläuferzellen unter verwendung menschlicher endometriumzellen |
-
2021
- 2021-05-07 CN CN202110495856.0A patent/CN114085811B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108815189A (zh) * | 2018-09-27 | 2018-11-16 | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 | 一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂 |
| CN109943533A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-28 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Endometrial and Menstrual Blood Mesenchymal Stem/Stromal Cells: Biological Properties and Clinical Application;Mahmood Bozorgmehr et al.;Frontiers in Cell and Developmental Biology;20200709;第8卷;1-27 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114085811A (zh) | 2022-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5965436A (en) | Method of isolating mesenchymal stem cells associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes | |
| WO1998020731A9 (en) | Msc-megakaryocyte precursor composition and method of isolating mscs associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes | |
| ES2285779T3 (es) | Celulas madre mesenquimatosas humanas de sangre periferica. | |
| WO2018223830A1 (zh) | 一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法、使用方法 | |
| CN114591905B (zh) | 一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法与应用 | |
| US8647678B2 (en) | Anti-inflammatory macrophages and uses thereof | |
| SG192459A1 (en) | Identification and isolation of multipotent cells from non-osteochondral mesenchymal tissue | |
| EP1904624A1 (en) | Method for culturingand proliferating hematopoietic stem cells and progenitor cells using human endometrial cells | |
| JP2009528841A (ja) | 脂肪組織から内皮細胞を抽出する方法 | |
| US20220395537A1 (en) | Methods of stem cell culture for obtaining products, and implementations thereof | |
| Romrell et al. | Isolation and separation of highly enriched fractions of viable mouse gastric parietal cells by velocity sedimentation. | |
| KR20090131677A (ko) | 신규한 줄기세포주, 이의 이용 및 배양 방법 | |
| CN113993527A (zh) | 包含间充质细胞的细胞群、包含其的医药组合物及其制造方法 | |
| CN113583952B (zh) | 一种提高干细胞外泌体产量的培养液 | |
| CN108486039B (zh) | 小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法 | |
| CN114085811B (zh) | 一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法 | |
| CN115475181A (zh) | 羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途 | |
| WO2021197459A1 (zh) | 从人经血中获得宫内膜间充质干细胞的方法 | |
| CN115369073A (zh) | 表皮干细胞外泌体的制备方法 | |
| CN109609463B (zh) | 一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法 | |
| CN113151153A (zh) | 一种小鼠腹膜血管周细胞的纯化方法和鉴定方法 | |
| CN112159790A (zh) | 从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法 | |
| CN114525248B (zh) | 一种制备经血源性间充质干细胞的方法 | |
| Jiang et al. | Hypoxic ADSCs-derived EVs Promote the Proliferation and Chondrogenic Differentiation of Cartilage Stem/progenitor Cells | |
| RU2505602C1 (ru) | Способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего из образцов миокарда |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |