CN112159790A - 从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法 - Google Patents

从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，包括预处理步骤和获取步骤，所述获取步骤利用两种不同配基的免疫磁珠对围产期组织细胞进行标记和纯化，先利用第一免疫磁珠进行标记，通过表达阳性来识别出非多能血管祖细胞，除去杂质细胞，得到较高浓度的含有多能血管祖细胞的细胞群，再通过第二免疫磁珠对除杂后的围产期组织细胞进行标记，通过表达阳性来识别进而获取得到多能血管祖细胞。本发明制得的多能血管祖细胞既具有同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，又与骨髓间充质干细胞具有相同的中胚层细胞分化功能，还具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，并且可以保持细胞形态与扩增能力。

Description

从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医学研究领域，具体涉及一种从围产期组织中纯化获取多能血管祖细胞的方法。
背景技术
围产期组织是指怀孕28周到婴儿出生这一段时间所产生的与胎儿发育相关的附属器官组织，主要包括脐血、脐带和胎盘。胎儿足月娩出后的围产期组织具有实足年龄小，基因突变率低，通常是作为生物废物丢弃，可以在对胎儿和母亲没有任何风险的情况下获取，获取途径不会对人体造成伤害等优点。围产期组织因为含有多种干细胞和特定组织祖细胞亚群，且资源丰富，扩增能力强，不会引起伦理问题等众多优势，成为了再生医学研究领域关注的焦点。所以，围产期组织以其充足的供应，便捷的来源，以及最小程度的道德与法律的纷争成为了获取干细胞的良好来源。
多能血管祖细胞是一类具有自我更新、自我复制能力和多分化潜能的血管相关组织来源细胞，既具有骨髓间充质干细胞特性和功能同时又具有向心血管细胞分化能力与心血管细胞支持能力，并具有高度的增殖潜能和中胚层细胞分化能力。这类细胞主要分布于骨髓和围产期组织中，通常与血管周细胞和血管干细胞的功能和特性相似。
免疫磁珠是一种大小均一，表面配有特定化学基团的磁性微球。从结构上来说，分为三部分，中心部分由磁性物质构成，如γ-Fe2O3、Fe3O4和MeFe2O3，使磁性微球在磁场作用下能被磁场吸引，从而快速聚集；中间层由聚苯乙烯、聚乙烯亚胺或聚丙烯酸等高分子材料包裹，保证磁性的密封性良好，不出现漏磁现象；同时，根据不同用途可制成不同粒度大小，又因制备材料和方法不同，可使其表现具有疏水或亲水、非极性或极性、带正电荷或带负电荷等不同的物理性质，还可以添加颜料、染料、荧光物质、放射性标记以及磁性氧化铁等，以适用于各种检测和分离目的。微球表面还配有特定的化学基团，通常为抗原、抗体或凝集素等免疫配基，配基具有生物专一性的特点，能通过共价结合抗体蛋白上的氨基或羧基基团。
免疫磁性分离技术(immunomagnetic separation IMS)是近年来国内外研究的一种新的免疫学技术，能够从大量外周血中筛选出带有特异性标记的细胞，其基本原理是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，形成细胞-抗原-抗体-磁珠免疫复合物，该复合物在外加磁场的作用下发生力学移动，将含有靶抗原的目标细胞与其他细胞分离，从而达到特异性分离细胞的目的。由于免疫磁珠富集法具有固相化试剂特有的优点和免疫学反应高度专一性的特点，在三十余年的发展中，已较为成熟的应用于分离及浓缩特定细胞、微生物、蛋白质和核酸片段等肉眼难以观察或样品中含量不高的物质，其应用随着各个科学领域的发展而日趋全面和深入。目前该项技术在细胞分离及微生物学检测等方面均取得了较大的进展。随着抗体技术的发展，免疫磁珠富集技术已成为细胞分选和蛋白质组学研究的重要技术支持和临床及细胞产品纯化的主要手段。目前，基于免疫磁性原理富集或同时检测CTCs的技术主要有CellSearch系统、免疫磁性细胞分选仪(magnetriccell sorting,MACS)、AdnaTest癌细胞检测系统和莱尔系统等。其中CellSearch检测系统已经被美国FDA批准用于检测乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者外周血的CTCs。该系统利用EpCAM抗体结合表达EpCAM的肿瘤细胞，然后用免疫磁珠来覆盖抗EpCAM抗体，最后在磁场的作用下对CTCs进行分离。
近年来，国内外学者对于免疫磁珠分离技术在细胞分离上的应用进行了大量的试验研究，专利文献CN100469870C（专利名称：人羊膜组织神经干细胞分离纯化的方法）公开了利用CD133抗体免疫磁珠从人羊膜组织中分离纯化神经干细胞的方法。专利文献CN103194424A（专利名称：一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法）公开了利用免疫磁珠分选纯化出定型内胚层细胞，再进一步诱导使其分化为胰腺前体细胞，最终得到较高淀粉酶分泌能力的胰腺组织样细胞的方法。专利文献CN102344909B（专利名称：一种分离人精原干细胞的方法）利用免疫磁珠细胞分离技术，分别通过GPR125阳性表达和GFRA1阳性表达分选得到精原干细胞。目前尚未见用免疫磁珠分离技术通过阴性表达富集目标细胞群，再利用阳性表达进一步纯化得到多能血管祖细胞的纯化速度快、重复性好的方法。
发明内容
针对现有技术的缺点和局限，本发明提供一种从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，包括预处理步骤和获取步骤。所述预处理步骤是指对围产期组织进行处理以制得围产期组织细胞混悬液。所述获取步骤包括：步骤A. 向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠以对经预处理的围产期组织细胞进行标记，富集，获取含有阴性表达的细胞亚群混悬液；其中，所述第一免疫磁珠为CD31免疫磁珠；步骤B. 向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠以对步骤A所得的细胞亚群进行标记，富集，获取阳性表达的细胞亚群混悬液；其中，所述第二免疫磁珠为CD146免疫磁珠。
本发明利用两种不同的免疫磁珠，通过第一免疫磁珠CD31对围产期组织细胞进行标记，通过表达阳性来识别出非多能血管祖细胞，进而通过富集步骤使血管祖细胞富集（可简称为“阴性除杂”），得到较高浓度的含有多能血管祖细胞的细胞亚群，再通过第二免疫磁珠CD146对除杂后的围产期组织细胞进行标记，通过表达阳性来识别出多能血管祖细胞（可简称为“阳性纯化”），以便通过富集步骤获取纯化的多能血管祖细胞。
用本发明提供的上述方法获取的多能血管祖细胞是一类兼具两种细胞特性的细胞亚群：既具有骨髓间充质干细胞所有功能和形态特征，同时具有类似血管周细胞的促进心血管系统修复的功能，并且具有良好的扩增潜力。本领域技术人员可以以获得本发明纯化得到的多能血管祖细胞为目标，选择第一免疫磁珠进行阴性除杂，去除非血管祖细胞，再通过与第一免疫磁珠不同的第二免疫磁珠标记并利用富集手段获得本发明的多能血管祖细胞。申请人经过大量试验总结获知，当所述第一免疫磁珠为CD31免疫磁珠并且所述第二免疫磁珠为CD146免疫磁珠时，通过“CD31免疫磁珠阴性除杂和CD146免疫磁珠阳性纯化”可以得到纯度高于90%的上述多能血管祖细胞。所得多能血管祖细胞经流式细胞术分析证明其同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，并通过成脂、成骨和成软骨的分化试验证明其与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能；通过平滑肌分化与血管组织工程试验证明其具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能。
在本发明非限制性的实施方式中，当所述第二免疫磁珠为NG2免疫磁珠时，其与第一免疫磁珠CD31进行搭配组合，即“CD31免疫磁珠阴性除杂和NG2免疫磁珠阳性纯化”具有与“CD31免疫磁珠阴性除杂和CD146免疫磁珠阳性纯化”基本类似的结果。因此在本发明非限制性的优选实施方式中，所述第二免疫磁珠为CD146和NG2免疫磁珠组成的任一比例的混合免疫磁珠。
由于第一免疫磁珠与不同的非血管祖细胞的结合能力不同，可以通过增加第一免疫磁珠的使用量来提高非多能血管祖细胞（杂质细胞）的标记数量，但由于细胞数量有限，过多的第一免疫磁珠也不再对标记非多能血管祖细胞起到标记作用，进而对后续富集也不能起到帮助作用，对此，在本发明非限制性的实施方式中，申请人经过大量试验总结获知：第一免疫磁珠的用量为每1000万细胞使用15-30μL时，既能有效标记杂质细胞满足后续富集环节，又未过量的加入第一免疫磁珠导致剩余而浪费。具体围产期组织的细胞数量可以通过每cm³含有约20000个细胞来进行估算。
在本发明非限制性的实施方式中，所述围产期组织细胞混悬液包括PBS缓冲体系，所述PBS缓冲体系含有EDTA。因为申请人经过大量试验总结获知，当步骤A所述PBS缓冲体系含有EDTA时可减少细胞的成团和贴壁现象，进而有利于细胞与免疫磁珠更充分的复合，有利于步骤A更有效的去除杂质细胞（非多能血管祖细胞）。在本发明非限制性的优选实施方式中，所述EDTA的浓度为1-6 mmol /L。
在本发明非限制性的实施方式中，在向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠之前，加入Fc受体阻断剂。因为申请人经过大量试验总结获知：加入Fc受体阻断剂可以防止复合在免疫磁珠上的抗体通过Fc与其他受体细胞结合，进而提高免疫磁珠标记的专属性，以更有利于准确地去除杂质细胞。在本发明非限制性的优选实施方式中，所述Fc受体阻断剂的加入量为：每1000万细胞加入20μL Fc受体阻断剂。
在本发明非限制性的优选实施方式中，向围产期组织细胞混悬液中加入适量的EDTA和Fc受体阻断剂，既从细胞角度减少贴壁细胞的数量，进而使细胞与免疫磁珠更充分的复合，又从免疫磁珠角度提高其与细胞复合的专属性和准确性，从两个方面提高步骤A的除杂效果和步骤B的纯化效果。
在本发明非限制性的实施方式中，步骤A所述“使第一免疫磁珠对经预处理的围产期组织细胞进行标记”具体是指：步骤A所述“向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠以对经预处理的围产期组织细胞进行标记”包括：向围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠后摇匀，使围产期组织细胞与第一免疫磁珠复合，形成第一复合体，制得第一复合体混悬液；步骤A所述“富集”包括：使第一复合体混悬液通过磁场，以使第一复合体被磁力吸引；步骤A所述“获取表达阴性的细胞亚群混悬液”包括：弃去被磁力吸引的第一复合体，获取通过磁场后的细胞混悬液。在本发明非限制性的优选实施方式中，步骤A所述富集使用的是在市销售的磁性分离器，例如：美天旎公司生产的分离器。
在本发明非限制性的实施方式中，步骤B所述“向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠以对步骤A所得的细胞亚群进行标记”包括：向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠后摇匀，使步骤A制得的细胞亚群混悬液中的细胞与第二免疫磁珠复合形成第二复合体，制得第二复合体混悬液；步骤B所述“富集”包括：使第二复合体混悬液通过磁场，以使第二复合体被磁力吸引；步骤B所述“获取表达阳性的细胞亚群混悬液”包括：脱离磁场，获取被磁力吸引的第二复合体，用PBS冲洗，即得所述多能血管祖细胞。在本发明非限制性的优选实施方式中，步骤B所述富集使用的磁场是在市销售的磁性分离器，例如：美天旎公司生产的分离器。
在本发明非限制性的实施方式中，所述围产期组织细胞混悬液的温度为2-8℃，在本发明非限制性的优选实施方式中，所述步骤A制得的细胞亚群混悬液的温度和步骤B所述表达阳性的细胞亚群混悬液的温度也为2-8℃；从混悬效果考虑，混悬液温度越高，细胞越容易达到均匀分散的状态，从细胞活性及操作便利考虑，温度高则细胞代谢快，后续筛选温度骤然降低也将影响细胞活性，对此，申请人经过大量试验总结获知，当混悬液温度为2-8℃时可以兼顾细胞活性、操作便利及混悬效果。
在本发明非限制性的实施方式中，无论是预处理步骤制得的混悬液中的围产期组织细胞混悬液，还是步骤A获取的经第一免疫磁珠标记为阴性的细胞亚群混悬液，以及步骤B获取的经第二免疫磁珠标记为阳性的第二复合体混悬液，在加入免疫磁珠并摇匀后，给予细胞和免疫磁珠以充分的时间用于复合无疑对除杂和分离都是有益的，申请人经过大量试验总结获知，在向围产期组织细胞中加入免疫磁珠并摇匀后，细胞和免疫磁珠二者于筛选液中静置15min，可使细胞与免疫磁珠充分复合，进而有利于第一免疫磁珠阴性除杂和第二免疫磁珠阳性纯化。
在本发明非限制性的实施方式中，所述围产期组织细胞与免疫磁珠的复合，除了需要合适的复合时间，合适的筛选温度也将对复合的效果和复合所需的时间有一定的影响，为综合考虑复合所需时间及混悬液的温度，申请人经过大量试验总结获知，当筛选液温度为4℃，在筛选液中静置15min即可使围产期组织细胞与免疫磁珠充分复合，进而更有利于第一免疫磁珠阴性除杂和第二免疫磁珠阳性纯化。
在本发明非限制性的实施方式中，所述筛选液的温度为2-8℃。围产期组织细胞与免疫磁珠的复合，除了需要合适的复合时间，由于围产期组织细胞及免疫磁珠均具有活性，因此合适的筛选温度也将对复合的效果和复合所需的时间有一定的影响，综合考虑复合所需时间及筛选液的温度，申请人经过大量试验总结获知，当筛选液温度为4℃，在筛选液中静置15min即可使围产期组织细胞与免疫磁珠充分复合，进而有利于第一免疫磁珠阴性除杂和第二免疫磁珠阳性纯化。
在本发明非限制性的实施方式中，所述预处理步骤包括洗涤、切碎和消化，所述洗涤是指先用75％的乙醇进行漂洗，再用含有抗生素的PBS缓冲液进行洗涤，所述切碎是指将洗涤后的围产期组织切碎至满足用生物酶对围产期组织细胞进行消化的要求；所述消化是指用生物酶对围产期组织细胞外基质进行消化处理，使细胞彼此独立分开，使细胞相对均匀的分散在混悬液中；所述洗涤、切碎和消化的基本方法属于本领域的现有技术，本领域技术人员可以根据现有技术知识完成洗涤、切碎和消化，制成围产期组织细胞混悬液。在本发明非限制性的优选实施方式中，申请人经过大量试验总结获知，所述洗涤如用75％的乙醇漂洗1分钟，如所述抗生素浓度为1％（v / v），所述切碎如将洗涤后的围产期组织切至平均体积为1.0 mm³；所述消化如用1 mg/ml 的I型胶原酶将切碎的围产期组织在37℃的环境下连续振荡1小时消化成彼此独立分开的细胞，制成每1mL筛选液含有10-20万围产期组织细胞的混悬液，则得到的混悬液能使围产期组织细胞相对均匀且密度合适，进而有利于后续使用第一免疫磁珠阴性除杂和第二免疫磁珠阳性纯化。
本发明提供的技术方案使用两种不同的免疫磁珠，先通过第一免疫磁珠CD31对围产期组织细胞进行标记，通过表达阳性来识别出非多能血管祖细胞，进而利用富集步骤使目标血管祖细胞富集，得到较高浓度的含有多能血管祖细胞的细胞亚群，再通过第二免疫磁珠CD146对未与第一免疫磁珠复合的细胞进行标记，通过表达阳性来识别出目标多能血管祖细胞，使多能血管祖细胞进一步得到纯化，进而得到纯度更高的、兼具两种细胞特性的细胞亚群，其既具有骨髓间充质干细胞所有功能和形态特征，同时具有类似血管周细胞的促进心血管系统修复的功能，并且具有良好的扩增潜力。作为本发明非限制性的优选实施方式，申请人经过大量试验总结获知，当所述第一免疫磁珠为CD31免疫磁珠时，通过本发明提供的技术方案可以得到纯度高于90%的多能血管祖细胞。
本发明提供的技术方案利用两种不同的免疫磁珠，通过第一免疫磁珠CD31对围产期组织细胞进行标记，通过表达阳性来识别出非多能血管祖细胞，进而利用富集步骤使目标血管祖细胞富集，得到较高浓度的含有多能血管祖细胞的细胞亚群，再通过第二免疫磁珠CD146对未与第一免疫磁珠复合的细胞进行标记，通过表达阳性来识别出目标多能血管祖细胞，最后利用富集步骤获取纯度高于90%的上述多能血管祖细胞。所得多能血管祖细胞经流式细胞术分析证明其同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，并通过成脂、成骨和成软骨的分化试验证明其与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能；通过平滑肌分化与血管组织工程试验证明其具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，以及良好的体外扩增能力。
附图说明
附图1 本发明提供的从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法流程图
附图2 本发明实施例7制备的多能血管祖细胞进行流式细胞术分析结果的染色照片
附图3本发明实施例6制备的多能血管祖细胞进行脂肪分化试验的染色照片
附图4本发明实施例5制备的多能血管祖细胞进行成骨分化试验的染色照片
附图5 本发明实施例4制备的多能血管祖细胞进行软骨分化试验的染色照片
附图6 本发明实施例5制备的多能血管祖细胞进行成熟心血管细胞分化试验的染色照片
附图7 本发明实施例6制备的多能血管祖细胞进行体外血管组织工程试验的染色照片
附图8 本发明实施例6制备的多能血管祖细胞进行体外扩增试验的结果图表。
具体实施方式
为了准确的表述和说明本发明提供的技术方案，在发明内容之前先对本发明使用的技术术语进行解释如下。
本发明所述“围产期组织”包括围产期脐带、脐血和胎盘。本发明所述“脐带细胞”“脐血细胞”和“胎盘细胞”是通过细胞所存在的部位而定义的，所述“脐带细胞”是指足月胎儿或新生儿与胎盘之间的联结组织中所含有的全部细胞，所述“胎盘细胞”是指围产期胎盘所含有的全部细胞。
本发明所述“复合”是指细胞表面抗原与连接有磁珠的特异性单抗相结合的过程。
本发明所述“复合体”是指免疫磁珠与细胞经过复合而形成的复合物。
本发明所述“复合体混悬液”是指含有复合体和围产期组织细胞的混悬液。
本发明所述“富集”是指从众多围产期组织细胞中提高多能血管祖细胞浓度（逐步纯化）的过程，具体是指：利用免疫磁珠（复合物）通过磁场被磁力吸引的特性以使。
本发明所述“细胞亚群”是指在细胞纯化过程中，表达特定细胞表面抗原的细胞群的子集。
本发明所述“多能血管祖细胞（MVPC）”是一类兼具两种细胞特性的细胞亚群，其既具有同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，又与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能，还具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，并且具有良好的扩增能力。
下面结合附图对本发明非限制性的实施方式进一步说明。需要声明的是，下述具体实施方式仅为举例说明，不应理解为对本发明技术方案的限定。
实施例1
本实施例示例了从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，包括预处理步骤和获取步骤，所述预处理步骤是指对围产期组织进行处理以制得围产期组织细胞混悬液，所述获取步骤包括：步骤A. 向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠以对经预处理的围产期组织细胞进行标记，富集，获取含有阴性表达的细胞亚群混悬液；其中，所述第一免疫磁珠为CD31免疫磁珠；步骤B. 向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠以对步骤A所得的细胞亚群进行标记，富集，获取阳性表达的细胞亚群混悬液；其中，所述第二免疫磁珠为CD146免疫磁珠；所述CD31免疫磁珠和CD146免疫磁珠均购于美天旎公司生产的市售免疫磁珠。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可以在付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，其中，围产期组织可选择胎盘、脐血、脐带或它们的混合组织，进而利用本发明提供的方法进行纯化，得到多能血管祖细胞。本实施例使用两种不同的免疫磁珠，先通过第一免疫磁珠CD31对围产期组织细胞进行标记，通过表达阳性来识别出非多能血管祖细胞，进而利用富集步骤使目标血管祖细胞富集，得到较高浓度的含有多能血管祖细胞的细胞亚群，再通过第二免疫磁珠CD146对未与第一免疫磁珠复合的细胞进行标记，通过表达阳性来识别出目标多能血管祖细胞，使多能血管祖细胞进一步得到纯化，最后利用富集步骤获取纯度高于90%的具有同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，又与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能，还具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，并且具有良好扩增能力的多能血管祖细胞。
实施例2
本实施例示例了从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，围产期组织选用脐带，第一免疫磁珠选用美天旎公司生产的CD31免疫磁珠。具体为：取脐带1cm分离得到脐带细胞，置于含有EDTA的PBS缓冲体系中，按每1000万细胞加入20μL CD31免疫磁珠的比例加入后摇匀，以使脐带细胞与CD31免疫磁珠复合；再使含有“脐带细胞-CD31免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，使“脐带细胞-CD31免疫磁珠复合体”被磁力吸引，未与CD31免疫磁珠复合的脐带细胞存在于混悬液中而流出；向流出的混悬液中加入与CD31免疫磁珠用量相同的NG2免疫磁珠后摇匀，以使未与CD31免疫磁珠复合的脐带细胞与NG2免疫磁珠复合；与上述富集办法相同，使含有“脐带细胞-NG2免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，以使“脐带细胞-NG2免疫磁珠复合体”被磁力吸引，此时未与NG2免疫磁珠复合的其他脐带细胞存在于混悬液中而流出，弃去；最后去掉磁场，取被磁力吸引的“脐带细胞-NG2免疫磁珠复合体”用PBS缓冲液进行冲洗，即得目标多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到多能血管祖细胞。
实施例3
本实施例示例了从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，围产期组织选用脐带，第一免疫磁珠选用美天旎公司生产的CD31免疫磁珠。具体为：取脐带1cm先用75％的乙醇漂洗1分钟，再用含有1％（v / v）青霉素的PBS缓冲液洗涤3次；将洗涤后的脐带切至平均体积为1.0 mm³；加入1 mg/ml 的A型胶原酶（Roche）将切碎的脐带在37℃的环境下连续消化1.5小时，过100um孔径滤网后制成每1mL含有10-20万胎盘细胞的混悬液，按每1000万细胞加入含有1mmol/L EDTA的20μL CD31免疫磁珠的比例加入后摇匀，以使脐带细胞与CD31免疫磁珠复合；再使含有“脐带细胞-CD31免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，使“脐带细胞-CD31免疫磁珠复合体”被磁力吸引，未与CD31免疫磁珠复合的脐带细胞存在于混悬液中而流出；向流出的混悬液中加入与CD31免疫磁珠用量相同的CD146免疫磁珠后摇匀，以使未与CD31免疫磁珠复合的脐带细胞与CD146免疫磁珠复合；与上述富集办法相同，使含有“脐带细胞-CD146免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，以使“脐带细胞-CD146免疫磁珠复合体”被磁力吸引，此时未与CD146免疫磁珠复合的其他脐带细胞存在于混悬液中而流出，弃去；最后去掉磁场，取被磁力吸引的“脐带细胞-CD146免疫磁珠复合体”用PBS缓冲液进行冲洗，即得目标多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到多能血管祖细胞。
实施例4
本实施例示例了从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，围产期组织选用胎盘；第一免疫磁珠选用美天旎公司生产的CD31免疫磁珠。具体为：取胎盘1cm³，先用75％的乙醇漂洗1分钟，再用含有1％（v / v）青霉素的PBS缓冲液洗涤3次；将洗涤后的胎盘切至平均体积为1.0 mm³；加入1 mg/ml 的I型胶原酶（Roche）将切碎的胎盘在37℃的环境下连续振荡消化1.5小时，过100um孔径滤网后制成每1mL含有10-20万胎盘细胞的混悬液，按每1000万细胞加入含有1mmol/L EDTA的30μL Fc受体阻断剂和30μL CD31免疫磁珠的比例加入后摇匀，以使胎盘细胞与CD31免疫磁珠复合；再使含有“胎盘细胞-CD31免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，使“胎盘细胞-CD31免疫磁珠复合体”被磁力吸引，未与CD31免疫磁珠复合的胎盘细胞存在于混悬液中而流出；向流出液中加入与CD31免疫磁珠用量相同的CD146免疫磁珠后摇匀，以使未与CD31免疫磁珠复合的胎盘细胞与CD146免疫磁珠复合；与上述富集办法相同，再使含有“胎盘细胞-CD146免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，使“胎盘细胞-CD146免疫磁珠复合体”被磁力吸引，未与CD146免疫磁珠复合的其他胎盘细胞存在于混悬液中而流出；最后去掉磁场，取被磁力吸引的“胎盘细胞-CD146免疫磁珠复合体”用PBS缓冲液进行冲洗，即得目标多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员均可在不付出创造性劳动的情况下选择本领域通常使用的试剂、材料和参数进行实施，进而得到兼具骨髓间充质干细胞和血管周细胞两种细胞特性的多能血管祖细胞。
实施例5
本实施例示例了从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，围产期组织选用脐带，第一免疫磁珠选用美天旎公司生产的CD31免疫磁珠。具体为：取脐带1cm先用75％的乙醇漂洗1分钟，再用含有1％（v / v）青霉素的PBS缓冲液洗涤3次；将洗涤后的脐带切至平均体积为1.0 mm³；加入1 mg/ml 的I型胶原酶将切碎的脐带在37℃的环境下连续振荡消化2小时，过70um孔径滤网后制成每1mL含有10-20万脐带细胞的混悬液，按每1000万细胞加入含有2mmol /l EDTA的20μL Fc受体阻断剂和20μL CD31免疫磁珠的比例先后加入后摇匀，以使脐带细胞与CD31免疫磁珠复合；再使含有“脐带细胞- CD31免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，使“脐带细胞- CD31免疫磁珠复合体”被磁力吸引，未与CD31免疫磁珠复合的脐带细胞存在于混悬液中而流出；向流出的混悬液中加入与CD31免疫磁珠用量相同的NG2免疫磁珠后摇匀，以使未与CD31免疫磁珠复合的脐带细胞与NG2免疫磁珠复合；与上述富集办法相同，使含有“脐带细胞-NG2免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，以使“脐带细胞-NG2免疫磁珠复合体”被磁力吸引，此时未与NG2免疫磁珠复合的其他脐带细胞存在于混悬液中而流出，弃去；最后去掉磁场，取被磁力吸引的“脐带细胞-NG2免疫磁珠复合体”用PBS缓冲液进行冲洗，即得目标多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到多能血管祖细胞。
实施例6
本实施例示例了从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，围产期组织选用脐带，第一免疫磁珠选用美天旎公司生产的CD31免疫磁珠。具体为：取脐带1cm先用75％的乙醇漂洗1分钟，再用含有1％（v / v）青霉素的PBS缓冲液洗涤3次；将洗涤后的脐带切至平均体积为1.0 mm³，然后用1 mg/ml 的I型胶原酶将切碎的脐带在37℃的环境下连续振荡1小时，制成每1mL含有10-20万脐带细胞的混悬液，按每1000万细胞加入含EDTA浓度为1 mmol/L的20μL Fc受体阻断剂，然后加入30μL CD31免疫磁珠后摇匀，以使脐带细胞与CD31免疫磁珠复合；再使含有“脐带细胞-CD31免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，使“脐带细胞-CD31免疫磁珠复合体”被磁力吸引，未与CD31免疫磁珠复合的脐带细胞存在于混悬液中而流出；向流出液中加入与CD31免疫磁珠用量相同的CD146免疫磁珠后摇匀，以使未与CD31免疫磁珠复合的脐带细胞与CD146免疫磁珠复合；与上述富集办法相同，再使含有“脐带细胞-CD146免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，使“脐带细胞-CD146免疫磁珠复合体”被磁力吸引，未与CD146免疫磁珠复合的其他脐带细胞存在于混悬液中而流出；最后去掉磁场，取被磁力吸引的“脐带细胞-CD146免疫磁珠复合体”用PBS缓冲液2mL进行冲洗，即得目标多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到多能血管祖细胞。
实施例7
本实施例示例了从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，围产期组织选用胎盘，第一免疫磁珠选用美天旎公司生产的CD31免疫磁珠。具体为取胎盘3cm³，先用75％的乙醇漂洗1分钟，再用含有1％（v / v）青霉素的PBS缓冲液洗涤3次；将洗涤后的胎盘组织切至平均体积为1.0 mm³；然后用1 mg/ml 的Ⅱ型胶原酶将切碎的胎盘在37℃的环境下连续振荡2小时，制成每1mL含有10-20万胎盘细胞的混悬液，在6℃温度下，向胎盘细胞混悬液中加入EDTA和Fc受体阻断剂，其中，EDTA的加入后的浓度为5mmol/L；Fc受体阻断剂的加入量为：每1000万细胞加入20μL Fc受体阻断剂，然后加入30μL CD31免疫磁珠后摇匀，于2℃温度下静置15min，以使胎盘细胞与CD31免疫磁珠充分复合；再使含有“胎盘细胞-CD31免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，使“胎盘细胞-CD31免疫磁珠复合体”被磁力吸引，未与CD31免疫磁珠复合的胎盘细胞存在于混悬液中而流出；向流出液中加入与CD31免疫磁珠用量相同的CD146免疫磁珠后摇匀，于2℃温度下静置15min，以使未与CD31免疫磁珠复合的胎盘细胞与CD146免疫磁珠充分复合；与上述富集办法相同，使含有“胎盘细胞-CD146免疫磁珠复合体”的混悬液流动通过美天旎公司生产的在市销售的磁性分离器，以使“胎盘细胞-CD146免疫磁珠复合体”被磁力吸引，未与CD146免疫磁珠复合的胎盘细胞存在于混悬液中而流出；最后去掉磁场，取被磁力吸引的“胎盘细胞-CD146免疫磁珠复合体”用PBS缓冲液3ml进行冲洗，即得多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到多能血管祖细胞。
实施例8
取实施例7制备的多能血管祖细胞进行流式细胞术分析，结果本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的表型。
平行试验组A：样品（细胞）取自实施例7制备的多能血管祖细胞在1000rpm下离心5分钟，获取多能血管祖细胞，重悬于含有2%FBS 的PBS（抗体培养液）后制成200万细胞/ml细胞悬液。
平行试验组B：样品（细胞）取骨髓来源的骨髓间充质干细胞（MSC）制成含2%FBS的PBS（抗体培养液）的200万细胞/ml细胞悬液。
本研究中使用的所有FACS抗体及其同型对照都是小鼠抗人抗体。
实验过程：取平行试验组A细胞和平行试验组B细胞进行以下平行实验操作。
将收获的细胞重新悬浮于封闭溶液中，所述封闭溶液为含有2％FBS（Hyclone）的PBS缓冲液，使细胞浓度为2×106个细胞/ mL。在冰上孵育30分钟，用PBS洗涤，在将细胞重悬于FACS缓冲液中，在PBS中包含0.5％的牛血清白蛋白（BSA，Sigam），并以1×105个细胞/25μL的密度分装到FACS管中，然后将荧光标记偶联的抗体添加到FACS管中，在避光条件下于4°C孵育30分钟。然后用2 mL PBS洗涤细胞2次，最后将其重悬于400ul FACS缓冲液中以进行流式细胞术分析。
为了排除数据采集中的死亡细胞，在将样品（细胞）通过BD FACS Canto-F60细胞分选仪（BD Biosciences，产自美国）分析之前，向每个FACS管中加入1μL碘化丙锭。根据FSC大小值清除碎片，然后通过排除吸收PI染色的死细胞来选择活细胞。阳性阈值由同种Isotype IgG界定，并据此产生相应抗体的比较检测结果。数据由FLOWJO（美国Tree Star公司）分析。详见由GraphPad Prism（GraphPad Software，Inc. USA）生成的附图2。
表1 流式抗体列表
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实验结果：附图2 流式细胞检测结果显示多能血管祖细胞与骨髓间充质干细胞同等表达骨髓间充质干细胞表面抗原CD73，CD90，CD105，更高表达CD146和NG2，表达率超过90%，接近100%，但不表达CD34和CD45。t-test (n=3) P=0.8365。结果显示：本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的表型，高表达率说明多能血管祖细胞的纯度超过90%，接近100%。
实施例9
取实施例6制备的多能血管祖细胞分别进行脂肪形成、成骨形成和软骨形成的分化试验，以骨髓来源的骨髓间充质干细胞（MSC）作为阳性对照，进而证实用本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞与骨髓间充质干细胞具有相同的分化功能。
9.1脂肪形成
取实施例6制备的多能血管祖细胞在1000rpm下离心5分钟，获取多能血管祖细胞重悬于α-MEM基础培养基以37000个细胞/孔的密度接种在24孔板中；当细胞扩增至70％以上汇合时，将培养基更换为成脂诱导培养基，此成脂分化培养基为含有10uL / mL成脂补充剂（R＆D Systems）的α-MEM基础培养基。
阴性对照在无成脂补充剂（R＆D Systems）的α-MEM基础培养基下培养，含有最低必需培养基Eagle（Sigma）补充了10％（v / v）FBS（Hyclone），1％（v / v）青链霉素-链霉素和1％（v / v））glutamax（Sigma）。
每3天更换一次培养基，持续7-21天。为了检测由脂肪细胞产生的脂滴，将样品细胞用PBS洗涤，在室温下固定在4％多聚甲醛中10分钟，然后用PBS洗涤。样品用新鲜制备的油红O工作溶液染色30分钟，该溶液含有0.3％（w / v）油红O（Fluka，Sigma），60％异丙醇（Fisher science）和40％dH2O，然后在60％中洗涤一次异丙醇。图像由Primo Ver TM倒置显微镜（德国卡尔·蔡西斯）使用AxioVison显微镜软件拍摄。详见附图3。
附图3显示：本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞（MVPC）与骨髓间充质干细胞（BMMSC）在成脂诱导培养基中培养14天后，经油红染色后均显示有大量的脂滴形成（图3-A为MVPC，图3-B为BMMSC，图3-C和图3-D为相应基础培养基对照组），同时基础培养基中的对照组无脂滴形成（放大倍数10倍）。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）与BMMSC具有相似的成脂分化能力。
9.2成骨形成
取实施例6制备的多能血管祖细胞，以7400个细胞/孔的密度接种在24孔板中。48小时后，换为成骨诱导培养基，该培养基含有以50μl/ ml的剂量添加了促成骨补充剂（R＆DSystems）的αMEM基础培养基。阴性对照在无添加剂的αMEM基础培养基下培养。每3天更换一次介质，持续14-21天。然后将细胞用PBS洗涤，在4℃的70％（v / v）乙醇（Fisher science）溶液中固定1小时，然后用含有40mM茜素红（Fluka，Sigma）dH2O染色细胞外钙结节沉淀物。用PBS清洗至少5次后，使用AxioVison显微镜软件通过Primo Vert™倒置显微镜（德国卡尔·蔡司）拍摄图像。详见附图4。
附图4显示：本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞（MVPC）与骨髓间充质干细胞（BMMSC）在成骨诱导培养基中培养14天后，经茜红染色后均显示有大量的钙沉积结节形成（图4-A为MVPC，图4-B为BMMSC，图4-C和图4-D为相应基础培养基对照组），同时基础培养基中的对照组无钙结节形成（放大倍数10倍）。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）与BMMSC具有相似的成骨分化能力。
9.3软骨形成
取实施例6制备的多能血管祖细胞，300000个细胞在15ml离心管和0.5ml软骨诱导培养基中沉淀，其中包含高葡萄糖DMEM（HG-DMEM，Sigma）补充1％（v / v）青链霉素-链霉素，1mM丙酮酸钠（Sigma Aldrich），1％（v / v）谷氨酰胺，1％（v / v）胰岛素，转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS，Invitrogen），10ng / mlTGF-β3（R＆D系统），50μg/ ml抗坏血酸-2-磷酸（Sigma）将Aldrich）和100nM地塞米松（Sigma Aldrich）缓慢加入每个试管中。每3天更换一次介质，持续21天。在第21天收获沉淀物，并首先在蒸馏水中洗涤，然后在Alcian blue溶液中染色，该溶液在室温下在dH2O中含有1％（w / v）Alcian blue，3％乙酸（Sigma），时间为30分钟。将沉淀在流动的自来水中洗涤2分钟。
然后将沉淀包埋并冷冻在OCT中，并在低温恒温器内将切片切成8um厚。图像由Primo Vert™倒置显微镜（德国卡尔·蔡西斯）使用AxioVison显微镜软件拍摄。详见附图5。
附图5显示：本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞（MVPC）与骨髓间充质干细胞（BMMSC）在软骨诱导培养基中培养21天后，经阿尔新蓝染色后均显示有大量细胞外酸性多糖（糖胺聚糖）基质形成，图5-A为MVPC，图5-B为BMMSC，图5-C和图5-D为相应基础培养基对照组，同时基础培养基中的对照组体积明显缩小，无酸性多糖基质产生（放大倍数4倍）。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）与BMMSC具有相似的软骨分化能力。本实施例通过脂肪形成、成骨形成和软骨形成的分化试验显示了本发明实施例制得的多能血管祖细胞与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能。
实施例10
取实施例5制备的多能血管祖细胞（MVPC）分别进行成熟心血管细胞分化试验，以证实用本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞具有促进心血管系统修复的功能。MVPC在促血管平滑肌细胞分化诱导培养基中培养8-10天后，用4%多聚甲醛固定，使用鼠抗人心血管平滑肌细胞特异性抗原，alpha-SMA，Calponin，Myosin Heave Chain(MHC) 进行免疫组化染色，显示分化后的细胞表型。
表2 免疫组化抗体表
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附图6显示：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）在平滑肌分化培养基中培养8-10天后，免疫组化染色显示分化后的细胞表达心血管平滑肌细胞特异性抗原，alpha-SMA，Calponin，Myosin Heaves Chain（MHC），放大倍数10倍。结果表明：多能血管祖细胞（MVPC）在适当诱导条件下能够生成成熟心血管细胞。
实施例11
取实施例6制备的多能血管祖细胞（MVPC）分别进行体外血管组织工程试验，以证实用本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞有心血管修复能力。收获的MVPCs种植在去细胞化猪小肠内膜（来源于中国陕西艾尔肤组织工程有限公司），经过14天的培养形成类血管的管状结构。经钙黄绿素AM，乙均二聚体1（LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit，Invitrogen）染色显示组织表面存在大量活性细胞，H&E染色（C），DAPI和免疫荧光（D）侧剖面染色后显示多层细胞均匀分布于支架材料表面，形成类似血管组织结构。
附图7显示：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）通过组织工程试验，经钙黄绿素AM，乙均二聚体1（LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit，Invitrogen）染色显示组织表面存在大量活性细胞（图7-C），DAPI和免疫荧光（图7-D）测剖面染色后显示多层细胞巨婴分布于支架材料表面，形成类似血管组织（图7-A）。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）具有良好的扩增能力，经免疫组织化学分析显示工程化多能血管祖细胞（MVPC）结合支架材料能够生成类血管组织。
实施例12
取实施例6制备的多能血管祖细胞（MVPC）进行体外扩增试验，以证实用本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞有良好的扩增能力。收获的第一代MVPCs种植在T25培养瓶中培养，当细胞达到80%融合度时进行传代。收获的细胞按照相同细胞密度继续传代的同时进行台盼蓝染色以测算死亡与活细胞比例。测试至第10代细胞后统计各代细胞数，并计算每一代细胞增长倍数和活细胞比例，并最终推算出以20万P1代细胞开始扩增至P10代可以获得1.64x1014细胞量。
附图8显示：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）显示每一代活细胞率均超过95%，细胞增长倍数呈指数级增长。结果表明本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）具有良好的扩增能力。
以上实施例8-12选用部分实施例制得的多能血管祖细胞作为代表进行了流式细胞术、成脂分化试验、成骨分化试验、软骨分化试验、成熟心血管细胞分化试验和体外血管组织工程试验等试验表明本发明部分实施例制得的多能血管祖细胞具有相应的分化潜力和扩增能力，需要说明的是，申请人利用本发明提供的包括实施例1-7的方法制得的多能血管祖细胞在进行上述实验后得到了几乎相同的实验结果。
以上所述仅为本发明具体实施方式中较佳实施例，并非对本发明保护的技术方案的限定，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术方案范围内，对本发明的技术方案的发明构思进行等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，包括预处理步骤和获取步骤，所述预处理步骤是指对围产期组织进行处理以制得围产期组织细胞混悬液，其特征在于，所述获取步骤包括：
步骤A. 向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠以对经预处理的围产期组织细胞进行标记，富集，获取含有阴性表达的细胞亚群混悬液；其中，所述第一免疫磁珠为CD31免疫磁珠；
步骤B. 向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠以对步骤A所得的细胞亚群进行标记，富集，获取阳性表达的细胞亚群混悬液；其中，所述第二免疫磁珠为CD146免疫磁珠。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述第二免疫磁珠替换为NG2免疫磁珠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述围产期组织细胞混悬液包括PBS缓冲体系，所述PBS缓冲体系含有EDTA，所述EDTA的浓度为1-6 mmol /L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述第一免疫磁珠的加入量为每1000万细胞加入15-30μL第一免疫磁珠；所述第二免疫磁珠的用量与第一免疫磁珠的用量相同。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠之前加入Fc受体阻断剂，所述Fc受体阻断剂的加入量为：每1000万细胞加入20μL Fc受体阻断剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤A所述“向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠以对经预处理的围产期组织细胞进行标记”包括：向围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠后摇匀，使围产期组织细胞与第一免疫磁珠复合，形成第一复合体，制得第一复合体混悬液；
步骤A所述“富集”包括：使第一复合体混悬液通过磁场，以使第一复合体被磁力吸引；
步骤A所述“获取表达阴性的细胞亚群混悬液”包括：弃去被磁力吸引的第一复合体，获取通过磁场后的细胞混悬液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤B所述“向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠以对步骤A所得的细胞亚群进行标记”包括：向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠后摇匀，使步骤A制得的细胞亚群混悬液中的细胞与第二免疫磁珠复合形成第二复合体，制得第二复合体混悬液；
步骤B所述“富集”包括：使第二复合体混悬液通过磁场，以使第二复合体被磁力吸引；
步骤B所述“获取表达阳性的细胞亚群混悬液”包括：脱离磁场，获取被磁力吸引的第二复合体，用PBS冲洗，即得所述多能血管祖细胞。
8.根据权利要求6-7中任一所述的方法，其特征在于：所述围产期组织细胞混悬液和/或第一复合体混悬液和/或第二复合体混悬液的温度为2-8℃。
9.根据权利要求6-7中任一所述的方法，其特征在于：在所述摇匀之后静置15min。
10.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述预处理步骤包括洗涤、切碎和消化，所述洗涤是指先用乙醇进行漂洗，再用含有抗生素的PBS缓冲液进行洗涤；所述切碎包括：将围产期组织切至平均体积为1.0 mm³；所述消化包括：用生物酶将切碎的围产期组织消化成彼此独立分开的单个细胞，形成每1ml含有10-20万围产期组织细胞的混悬液。
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