CN105219731A - 一种卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，本发明公开了一种卵巢癌干细胞疫苗及其的制备方法和用途。肿瘤干细胞对放疗、化疗不敏感，是肿瘤转移、复发的根源。针对肿瘤干细胞的主动免疫治疗，消灭肿瘤的“种子”细胞即肿瘤干细胞，只有这样方能取得较理想的疗效。本发明中CD117+CD44+卵巢癌干细胞疫苗在动物实验中能够提高血清IFN-γ水平，下调TGF-β的表达，增强NK细胞活性，显著降低CD117+CD44+卵巢癌干细胞数量，抑制肿瘤的生长。

Description

一种卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及分子生物学和基因工程。

背景技术

上皮性卵巢癌(epithelialovariancancer，EOC)约占卵巢癌的90％，是女性生殖器常见肿瘤，其发病率在妇科恶性肿瘤中仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，但死亡率却占各类妇科肿瘤的首位。关于卵巢癌的发生机制，有报道认为是由于排卵后的炎症和/或损伤修复，以及在修复过程中所产生的干细胞异常增殖，但是目前尚无定论。因此，探明卵巢癌发生的起因，针对病因进行有针对性治疗，尤其抑制EOC的生长和转移，进而清除EOC以及EOC肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)，才能从根本上治愈卵巢癌。

目前针对卵巢癌的常规治疗是手术切除，辅以顺铂/紫杉醇化疗，该治疗方案在原发卵巢癌患者的完全缓解率可达70％，然而大部分患者在18个月内复发，残存的癌细胞对化疗药转为耐受型细胞，现有的治疗方案尚不能达到有效缓解的治疗效果。可见，卵巢癌已成为女性恶性肿瘤中的“无声杀手”，对妇女生命造成严重威胁。

干细胞是一类具有自我复制、更新功能和多向分化潜能的原始未分化细胞，分为胚胎干细胞、生殖干细胞和成体干细胞。而CSCs是指肿瘤组织中具有高致瘤性、自我更新及分化能力等干细胞性质的癌细胞亚群，是形成不同分化程度的肿瘤细胞和肿瘤不断增殖的根源。CSCs学说主要为肿瘤细胞间存在异质性，其中一小群具有自我更新、无限增殖能力和不定分化潜能，是肿瘤形成的起始细胞并维持肿瘤的生长；CSCs对放疗、化疗不敏感，可能是肿瘤转移、复发的根源。针对CSCs的靶向治疗，消灭肿瘤的“种子”细胞即CSCs，只有这样方能取得较理想的疗效。

用CSCs制备成以肿瘤干细胞(TSC)瘤苗可以诱导针对CSCs的特异性抗肿瘤免疫应答。有研究者应用乙醛脱氢酶(ALDH)作为TSC标记，从小鼠黑色素瘤D5细胞系和鳞癌SCC7细胞系中分选出富含TSC的细胞群，制备成细胞裂解物，负载DCs后，作为肿瘤疫苗，分别免疫相应的C57BL/6小鼠和C3H小鼠。相较应用未经分选的全细胞裂解物负载DCs作为肿瘤疫苗接种的小鼠，前一方法在两种肿瘤模型中均诱导出了更为明显的肿瘤特异性体液和细胞免疫反应，并且其脾细胞产生的IFN-γ和GM-CSF较后一方案更高。还有学者研发出CD133特异性表位疫苗，CD133是多形性胶质母细胞瘤TSC的分子标志，该分子的两个HLA限制性表位ILSAFSVYV(CD133-405)和YLQWIEFSI(CD133-753)能结合HLA-A*0201分子。以CD133-405或CD133-753短肽负载DCs作为肿瘤疫苗，诱导产生的特异性CD8+CTL能够识别并裂解CD133+HLA-A*0201(+)的多形性胶质母细胞瘤TSC。该项研究成果支持应用CD133特异性表位疫苗靶向TSC，用以防治多形性胶质母细胞瘤。

本发明以CD117及CD44为EOCCSCs的特异性标记筛选出CSCs进行卵巢癌干细胞疫苗研究。因CD117是由c-kit原癌基因编码的跨膜蛋白受体，其配体为干细胞生长因子(stemcellgrowthfactor，SCF)。SCF是重要的造血生长因子，SCF-CD117相互作用可刺激造血干/祖细胞的增殖和分化，对肿瘤细胞可能有刺激生长作用。CD44分子是一种细胞表面的跨膜糖蛋白，属于黏附分子，广泛分布于造血系统、上皮系统、内皮系统和中胚层来源的细胞上。研究表明，CD44与肿瘤的增殖、迁移、侵袭和肿瘤相关的血管生成密切相关，并且CD44基因是CSCs表型的重要标志物之一。CD44分为两类：仅由组成型外显子编码而成，称为标准型CD44，广泛存在于各组织内，与透明质酸结合，参与细胞及细胞与基质间的黏附作用过程，对肿瘤侵袭转移发挥重要作用；由含有v区变异型外显子编码而成CD44分子，称变异型CD44，CD44变构体表达水平的变化与肿瘤细胞侵袭转移密切相关。CD44蛋白参与细胞间的黏附、淋巴细胞的活化、介导淋巴细胞归巢或再循环及细胞的运动、细胞内外的信号传导及凋亡等生理过程。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法。

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，

(1)获取准备卵巢癌细胞，进行传代培养，以10％胎牛血清的RPMI1640为培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养。细胞长至一定密度，胰酶消化吹散后，继续传代培养；

(2)取免疫磁珠分选MACS缓冲液悬浮卵巢癌细胞；每1×10⁷～1×10⁸卵巢癌细胞，加入100μlFcR阻断剂，混匀后4℃孵育30min；

(3)每1×10⁷～1×10⁸细卵巢癌胞，加入CD44+磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4℃孵育一段时间，之后加PBS洗涤后离心，弃上清，将细胞沉淀重复PBS洗涤2-4次；

(4)取免疫磁珠分选MACS用缓冲液悬浮卵巢癌细胞，

(5)把分离柱放入磁场中，加入缓冲液平衡分离柱后；加入步骤(4)的细胞悬液，稍后加入缓冲液冲洗收集阴性细胞(CD44-卵巢癌细胞)；

(6)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞(CD44+卵巢癌细胞)；

(7)取免疫磁珠分选MACS用缓冲液悬浮分选步骤(6)得到的CD44+卵巢癌细胞，过夜培养48h；

(8)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入100μlFcR阻断剂，混匀后4℃孵育30min；

(9)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入CD117+磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4℃孵育一段时间，之后加PBS洗涤后离心，弃上清，将细胞沉淀重复PBS洗涤2-4次；

(10)取免疫磁珠分选MACS用缓冲液悬浮卵巢癌细胞；

(11)把分离柱放入磁场中，加入缓冲液平衡分离柱后；加入细胞悬液，稍后加入缓冲液冲洗收集阴性细胞(CD117-卵巢癌细胞)；

(12)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞；

(13)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞CD117+卵巢癌细胞，即为CD117+CD44+卵巢癌细胞；

(14)培养至细胞状态稳定，48h内制备卵巢癌干细胞疫苗。

根据本发明的优选技术方案，所述步骤(14)具体如下：将CD117+CD44+卵巢癌干细胞用MIT，2μg/ml处理20-30h，灭活后作为卵巢癌干细胞疫苗。

根据本发明的优选技术方案，所述步骤(14)具体如下：将CD117+CD44+卵巢癌干细胞用50μg/ml丝裂霉素C处理10-15h，灭活后作为卵巢癌干细胞疫苗。

根据本发明的优选技术方案，所述步骤(14)具体如下：将CD117+CD44+卵巢癌干细胞用放射线灭活后作为卵巢癌干细胞疫苗。

根据本发明的优选技术方案，所述的卵巢癌干细胞来自人。

根据本发明的优选技术方案，所述的卵巢癌干细胞选自SKOV3细胞系或HO8910细胞系。

本发明的第二方面提供一种前述方法制备得到的卵巢癌干细胞疫苗。

根据本发明的优选技术方案，所述的卵巢癌干细胞来自人。

根据本发明的优选技术方案，所述的卵巢癌干细胞系选自SKOV3细胞系或HO8910细胞系。

本发明的第三方面提供一种前述卵巢癌干细胞疫苗在制备治疗卵巢癌症药物中的应用。

优选地，卵巢癌干细胞疫苗在制备治疗上皮性卵巢癌症药物中的应用。

本发明的卵巢癌细胞来源包括：手术切除来源的自体肿瘤组织、切检的自体肿瘤转移淋巴结、粗针穿刺活检来源的自体肿瘤组织、癌性腹水中的肿瘤细胞。卵巢癌干细胞来源还包括来源于异体的卵巢癌细胞系和/或细胞株。

本发明中CD117+CD44+卵巢癌干细胞疫苗在动物实验中能够提高血清IFN-γ水平，下调TGF-β的表达，增强NK细胞活性，显著降低CD117+CD44+卵巢癌干细胞数量，抑制肿瘤的生长。本发明中CD117+CD44+SKOV3细胞少量细胞致瘤实验及无血清培养成球实验结果，说明CD117+CD44+SKOV3细胞具有CSCs的高致瘤性、自我更新及分化能力特性。

附图说明

图1是裸鼠卵巢癌模型中的CD117+CD44+干细胞疫苗的活性对比。图1A为不同疫苗组小鼠接种SKOV3致瘤后47天后麻醉处死检测各组肿瘤大体标本，最长径线≥20mm；图1B为裸鼠致瘤后，各组肿瘤体积变化情况；图1C为各组裸鼠接种SKOV3细胞后，无瘤生存时间曲线。其中，四组为干细胞疫苗组、非干细胞疫苗组、SKOV3细胞疫苗组、PBS对照组。

图2显示裸鼠免疫接种SKOV3细胞后，麻醉处死前获取裸鼠外周血，血清中IFN-γ、TGF-β含量检测情况。其中，图2A为检测各组裸鼠血清中IFN-γ含量：CSCvaccine组相较于non-CSCvaccine组(p<0.05)、SKOV3细胞组(p<0.01)和PBS组(p<0.001)具有明显差异，差异有统计学意义；图2B为各组裸鼠血清中TGF-β含量：CSCvaccine组相较于non-CSCvaccine组(p<0.05)、SKOV3细胞组(p<0.01)和PBS组(p<0.001)具有明显差异，差异有统计学意义。

图3NK细胞毒性实验：裸鼠麻醉处死后取脾获得脾细胞悬液标记CFSE作为效应细胞，YAC-1作为靶细胞，在效靶比25:1条件下检测CFSE阴性细胞群中7-AAD阳性细胞，即为被NK细胞毒性杀伤的细胞。图3A为不同疫苗组被NK细胞毒性杀伤的YAC-1细胞流式细胞峰图；图3B为不同疫苗组被NK细胞毒性杀伤的YAC-1细胞柱状图，CSCvaccine组相较于non-CSCvaccine组(p<0.05)、SKOV3细胞组(p<0.01)和PBS组(p<0.001)具有明显差异，差异有统计学意义。

图4为不同疫苗免疫小鼠瘤组织细胞中CD44+CD117+CSC比例检测。图4A为.流式细胞散点图；control组为小鼠肿瘤细胞未染色的空白对照，CD44+CD117+细胞比例0.217％；CD44+CD117+CSC疫苗组肿瘤细胞中CD44+CD117+细胞比例1.55％；non-CD44+CD117+CSC疫苗组肿瘤细胞中CD44+CD117+细胞比例2.43％；SKOV3细胞疫苗组肿瘤细胞中CD44+CD117+细胞比例2.69％；PBS组肿瘤细胞中CD44+CD117+细胞比例12.7％；图4B为.柱状分析图，统计发现CD44+CD117+CSC疫苗组的肿瘤细胞中CD44+CD117+细胞比例，与control组(p<0.01)、non-CD44+CD117+CSC疫苗组(p<0.05)、SKOV3细胞疫苗组(p<0.01)、PBS组(p<0.001)均有差异，且差异具有统计学意义。

图5为不同疫苗免疫小鼠瘤组织细胞中ALDHhigh比例检测。图5A为流式细胞散点图；左侧纵列是同组加入ALDH抑制剂DEAB的阴性对照，R1为ALDH活性高表达区域，右侧纵列是未加抑制剂的阳性组，R2为ALDH活性高表达区域。各组ALDHhigh比例为同组R2-R1数值；CD44+CD117+CSC疫苗组0.58％；non-CD44+CD117+CSC疫苗组1.48％；SKOV3细胞疫苗组1.60％；PBS组10.4％；

图5B为柱状分析图；统计发现CD44+CD117+CSC疫苗组的肿瘤细胞中ALDHhigh细胞比例，与non-CD44+CD117+CSC疫苗组(p<0.05)、SKOV3细胞疫苗组(p<0.01)、PBS组(p<0.001)均有差异，且差异具有统计学意义。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体应用要求的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。材料和仪器

CD117+磁珠标记的直标单克隆抗体，德国美天旎公司；CD44+磁珠标记的直标单克隆抗体，德国美天旎公司；

人上皮卵巢癌细胞株SKOV3和上皮卵巢癌细胞株HO8910细胞系购于上海细胞所。

BALB/c裸鼠(5-6周龄)购自扬州大学动物中心，许可号码：SCXK。

流式细胞仪，美国BD公司。

实施例1卵巢癌细胞的制备

a、无菌获取肿瘤组织后，用含双抗的PBS清洗肿瘤组织，剔除坏死组织、结缔组织、血管、脂肪等，用剪刀将肿瘤组织剪碎成1mm³的组织块，加胶原酶、DNA酶，消化酶解，过滤、制备单细胞悬液；

b、应用免疫磁珠分离出成纤维细胞；

c、经阴选液置培养瓶中，待细胞贴壁后，去除悬浮细胞，更换新鲜培养液，传代培养。

实施例2卵巢癌干细胞CD117⁺CD44⁺的制备

细胞培养及免疫磁珠分选

1.将人EOCSKOV3细胞以10％胎牛血清的RPMI1640为培养基，37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，细胞长至一定密度，胰酶消化吹散后，继续传代培养。

2.CD44+SKOV3细胞的免疫磁珠分选(magneticactivatedcellsorting，MACS)

(1)取300μlMACS用的缓冲液悬浮SKOV3细胞；

(2)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入100μlFcR阻断剂，混匀后4℃孵育30min；

(3)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入100μlCD44+磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4℃孵育30min，之后加PBS至1mL，1000rmp离心8min留取细胞沉淀；

(4)加入PBS(含EDTA)液至1mL，1000rmp离心8min，洗涤细胞一次，弃上清，去除多余抗体，此步骤重复一次；

(5)取300μlMACS用的缓冲液悬浮SKOV3细胞，进入下一步；

(6)把分离柱放入磁场中，加入500μl缓冲液，平衡分离柱；

(7)加入细胞悬液，稍后加入1500μl缓冲液冲洗收集阴性细胞(CD44-SKOV3细胞)；

(8)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用1mL缓冲液匀速冲洗，必要时要用泵加压，收集阳性细胞(CD44+SKOV3细胞)。

3.CD117+CD44+SKOV3细胞的免疫磁珠分选MACS

(1)取300μlMACS用的缓冲液悬浮分选后过夜培养48hCD44+SKOV3细胞；

(2)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入100μlFcR阻断剂，混匀后4℃孵育30min；

(3)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入100μlCD117+磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4℃孵育30min，之后加PBS至1mL，1000rmp离心8min留取细胞沉淀；

(4)加入PBS(含EDTA)液至1mL，1000rmp离心8min，洗涤细胞一次，弃上清，去除多余抗体，此步骤重复一次；

(5)取300μlMACS用的缓冲液悬浮SKOV3细胞，进入下一步；

(6)把分离柱放入磁场中，加入500μl缓冲液，平衡分离柱；

(7)加入细胞悬液，稍后加入1500μl缓冲液冲洗收集阴性细胞(CD117-SKOV3细胞)；

(8)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用1mL缓冲液匀速冲洗，必要时要用泵加压，收集阳性细胞(CD117+SKOV3细胞)，即为CD117+CD44+SKOV3细胞。继续培养，待细胞状态稳定，48h内用于CSCs实验。

实施例3CD117+CD44+SKOV3细胞形态观察及表面标志检测

倒置显微镜下，连续动态观察细胞生长状况，取体外培养CD117+CD44+SKOV3细胞1×10⁶个，分别用CD117-PE和CD44-FITC单克隆抗体标记细胞，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中孵育30min，PBS洗去多余抗体，FCM检测CD117+CD44+SKOV3表面标志。

实施例4

流式细胞术(FCM)检测分选的EOCCD44⁺CD117⁺细胞表面CD44和CD117分子表达

(1)800rpm离心5min收集1×10⁶MASC分选的经过72h无血清干细胞培养液培养的CD44+CD117+细胞及常规培养的SKOV3细胞；

(2)PBS800rpm离心5min洗涤3次，100μLPBS重悬；5μLFcR封闭液封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min；

(3)每100μL反应体系先后加入0.5μgFITC标记的CD44+单克隆抗体和5μLPE标记的CD117+单克隆抗体，4℃孵育30min；用PBS洗涤3次，每次3min，重悬于400μLPBS中；FCM检测。设未加单抗的细胞为阴性对照。

实施例5裸鼠免疫建立流程

采用Balb/c裸鼠体内实验评价CSC疫苗效力。取12只雌性Balb/c裸鼠，5-6周龄，体重16-18g，随机分成四组，每组三只，分别为SKOV3CD117+CD44+CSC组，SKOV3non-CD117+CD44+CSC组，SKOV3细胞组和PBS组。裸鼠分别右侧腹皮下注射用100ug/ml丝裂霉素C灭活的上述细胞疫苗(5×10⁴)免疫三次，每两次免疫间隔14天。所有免疫后的鼠在末次细胞疫苗免疫10天后皮下注射5×10⁶SKOV3细胞致瘤。每间隔五天检测每只小鼠的肿瘤形成情况，测量其最长径线和最短径线，并观察每只小鼠的无瘤生存期。同时监测每只小鼠免疫后的一般健康状况，如总体行为、饮食情况、体重变化和毛发色泽。当肿瘤最长径线≥20mm，小鼠予以安乐死，终止实验。细胞疫苗免疫建立和体内致瘤实验重复两次。

实施例6酶联免疫吸附试验(ELISA)

在麻醉处死前获取各组小鼠新鲜血液。根据商品化ELISA试剂盒(eBioscience,SanJose,CA,USA)说明书检测血浆中γ-干扰素(IFN-γ)和转化生长因子-β(TGF-β)。简言之，血浆样品1:10稀释后，每细胞因子被特异性初始抗体捕获，再由生物标记的二抗检测。酶标仪(Bio-RadLabs,Hercules,CA,USA)分别450nm、570nm波长下读板。样品和标准品均有三个复孔，试剂检测IFN-γandTGF-β的敏感度为0.1单位/ml。试剂盒适用于检测细胞培养上清和血清样品中的细胞因子。

实施例7NK细胞毒性试验

试验的最后，从免疫小鼠中获取脾脏组织。5×10⁶脾细胞采用浓度为0.5mM的5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；20μg/ml)37℃孵育20min。脾细胞用含5％FBS的PBS洗两次以去除多余CFSE。CFSE标记的脾细胞作为效应细胞接种在含有固定数量的YAC-1靶细胞的96孔板中，以效靶比为25:1接种。接着流式细胞仪检测CFSE/7-ADD细胞毒性。

实施例8肿瘤组织中CD44+CD117+CSC细胞群分析

实验结束时，卵巢癌组织从不同疫苗免疫的小鼠肿瘤中获得，制成细胞悬液，流式细胞仪检测CD44+CD117+CSC细胞群。换言之，2×10⁵的肿瘤细胞悬浮在PBS中，标记anti-Human/MouseCD44的异硫氰酸荧光素(FITC)抗体(eBioscience,CA,USA)1:100稀释，anti-HumanCD117的藻红蛋白(PE)抗体(eBioscience,CA,USA)1:20稀释进行免疫荧光检测。干细胞培养基里同样数目的细胞用BeckmanCoulterCellQuestsoftware软件分析流式细胞的结果。

实施例9细胞ALDH1活性分析

细胞ALDH1活性分析采用商品化的ALDEFLUOR试剂盒(StemCellTechnologies,Durham,NC,USA)，根据说明书操作。简言之，不同疫苗免疫的小鼠肿瘤中获得新鲜的卵巢癌组织，从中获取细胞悬浮在含有ALDH底物(BAAA,1mol/lper1×10⁶cells)的ALDEFLUOR缓冲液，37℃孵育45min，每份细胞样本再加入50mmol/l二乙氨基苯甲醛(DEAB)——ALDH的特异性抑制剂作为阴性对照。为了清除移植瘤中鼠源细胞的影响，我们使用anti-H2Kd抗体(BDbiosciences,1/200,30min冰上)，并标记带有PE的荧光二抗(Jacksonlabs,1/250,30min冰上)。通过阴性对照建立流式分选门。为操作可行，ALDEFLUOR标记的细胞用DEAB处理，并单独标记二抗。流式细胞仪分析数据(BD,USA)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，

(1)获取准备卵巢癌细胞，进行传代培养，以10％胎牛血清的RPMI1640为培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养，细胞长至一定密度，胰酶消化吹散后，继续传代培养；

(2)取免疫磁珠分选MACS缓冲液悬浮卵巢癌细胞；每1×10⁷～1×10⁸卵巢癌细胞，加入100μlFcR阻断剂，混匀后4℃孵育30min；

(3)每1×10⁷～1×10⁸细卵巢癌细胞，加入CD44+磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4℃孵育20min，之后加PBS洗涤后离心，弃上清，将细胞沉淀重复PBS洗涤2-4次；

(4)取免疫磁珠分选MACS用缓冲液悬浮卵巢癌细胞；

(5)把分离柱放入磁场中，加入缓冲液平衡分离柱后；加入步骤(4)的细胞悬液，稍后加入缓冲液冲洗收集阴性细胞-CD44-卵巢癌细胞；

(6)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞-CD44+卵巢癌细胞；

(7)取免疫磁珠分选MACS用缓冲液悬浮分选步骤(6)得到的CD44+卵巢癌细胞，过夜培养48h；

(8)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入100μlFcR阻断剂，混匀后4℃孵育30min；

(9)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入CD117+磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4℃孵育一段时间，之后加PBS洗涤后离心，弃上清，将细胞沉淀重复PBS洗涤2-4次；

(10)取免疫磁珠分选MACS用缓冲液悬浮卵巢癌细胞；

(11)把分离柱放入磁场中，加入缓冲液平衡分离柱后；加入细胞悬液，稍后加入缓冲液冲洗收集阴性细胞-CD117-卵巢癌细胞；

(12)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞；

(13)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞CD117+卵巢癌细胞，即为CD117+CD44+卵巢癌细胞；

(14)培养至细胞状态稳定，48h内制备卵巢癌干细胞疫苗。

2.权利要求书1所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法,其特征在于，所述步骤(1)的获取准备卵巢癌细胞包括以下步骤：

(a)无菌获取肿瘤组织后，用含双抗的PBS清洗肿瘤组织，剔除坏死组织、结缔组织、血管、脂肪等，用剪刀将肿瘤组织剪碎成1mm³的组织块，加胶原酶、DNA酶，消化酶解，过滤、制备单细胞悬液；

(b)应用免疫磁珠分离出成纤维细胞；

(c)经阴选液置培养瓶中，待细胞贴壁后，去除悬浮细胞，更换新鲜培养液，传代培养。

3.根据权利要求1所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(14)具体如下：将CD117+CD44+卵巢癌干细胞用米托蒽醌MIT，2μg/ml处理20-30h，灭活后作为卵巢癌干细胞疫苗。

4.根据权利要求1所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(14)具体如下：将CD117+CD44+卵巢癌干细胞用50μg/ml丝裂霉素C处理10-15h，灭活后作为卵巢癌干细胞疫苗。

5.根据权利要求1所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(14)具体如下：将CD117+CD44+卵巢癌干细胞用放射线灭活后作为卵巢癌干细胞疫苗。

6.根据权利要求1所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述的卵巢癌干细胞选自人的SKOV3细胞系和HO8910细胞系。

7.根据权利要求1或2所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，其中所述卵巢癌细胞来源包括：手术切除来源的自体肿瘤组织、切检的自体肿瘤转移淋巴结、粗针穿刺活检来源的自体肿瘤组织、癌性腹水中的肿瘤细胞，还包括来源于异体的卵巢癌细胞系或细胞株。

8.一种权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的卵巢癌干细胞疫苗。

9.根据权利要求8所述的卵巢癌干细胞疫苗，其特征在于，所述的卵巢癌干细胞来自人的SKOV3细胞系或HO8910细胞系。

10.一种权利要求8-9任一项所述的卵巢癌干细胞疫苗在制备治疗卵巢癌症药物中的应用。