CN107966525B - 一种13co2量化脉冲标记植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其步骤：向水槽内注水自来水；将标记平台放在水槽中央；将手持探头与主机的连接导线穿入标记箱侧面的安装孔中，将手持探头放在标记平台上；将标记箱敞口端扣于水槽中，水将标记箱封闭成一个密闭的用于标记植物的空间；用注射器通过标记箱侧面的硅胶塞中吸出标记箱内气体；将连接导线与主机在标记箱外连接开机运行；植物自然消耗标记箱内的CO₂，当标记箱内CO₂浓度低于100ppm时开始向标记箱内注射¹³CO₂气体；打开半导体制冷器，并向水槽内放入冰袋；采用注射器从¹³CO₂生成单元中抽取¹³CO₂气体后转移至标记箱内；实时监测标记箱内CO₂浓度；根据预先设置的时间间隔向水槽内放入冰袋；标记结束后用LI‑8100测定土壤呼吸。

Description

一种13CO2量化脉冲标记植物的方法

技术领域

本发明涉及一种植物碳同位素标记的方法，特别是关于一种在同位素示踪技术领域中应用的¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法。

背景技术

近20年来研究植物-土壤碳循环已成为植物学、土壤学、生态学等多学科交叉的热点问题。采用¹³C示踪技术是研究植物光合碳在植物中分配和转化动力学以及植物根系分泌的有机碳量输入土壤的关键手段，对于了解植物-土壤碳循环和积累以及为建立植物-土壤碳循环计算机模拟模型提供参数方面具有重要的作用。同位素示踪法是指用示踪剂(标记原子或标记化合物)研究被追踪物质在实验系统内运动、转化规律的方法，稳定性同位素示踪法具有无放射性、无污染和灵敏性高等特点，目前在生物学科各领域研究中被广泛应用于研究物质或元素在生物体内的运转规律。碳作为重要的生命元素，其在植物中的分布特点能够揭示循环过程中所包含的物理、化学、代谢、气候和环境等许多方面的信息，尤其在植物生理生态学、农作物养分吸收利用、优质种质的选育及古环境、古气候的重建等方面有很好的指示作用。由于通常只有气体状态的¹³C标记的二氧化碳才能被植物吸收和利用，而且此种碳同位素价格均很贵，在进行标记时既要保证植物正常生长，又要严格密闭防止碳同位素标记的二氧化碳外逸。且现有的脉冲式¹³CO₂量化标记植物的方法存在对植物的标记量化不准确的技术问题。因此，建立合适的植物碳同位素标记的方法是非常重要的。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其结构简单，成本低，易于制作，标记成功率高，可以对植物进行¹³CO₂的量化标记，研究光合产物在植物-土壤系统中的分配情况。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其特征在于包括以下步骤：1)设置一包括水槽、标记平台、标记箱、注射器、半导体制冷器、¹³CO₂生成单元主机以及与主机连接的手持探头构成的装置；2)将水槽放在水平地面，外围用砖块围住，向水槽内注水自来水；3)将标记平台放在水槽中央，标记平台采用木板，在木板上方盖一层塑料薄膜；4)将手持探头与主机的连接导线穿入标记箱侧面的安装孔中，连接导线一端与标记箱内的手持探头连接，将手持探头放在标记平台上，打开手持探头的气室；将标记箱敞口端扣于水槽中，水槽具有的水面高于标记箱敞口端底缘，水将标记箱封闭成一个密闭的用于标记植物的空间，标记箱敞口端底缘与水槽的内底面之间留有间隙；5)用注射器通过标记箱侧面的硅胶塞中吸出标记箱内气体，使标记箱内液面比箱外高，半小时后观察标记箱内液面是否降低，以此来检验标记箱气密性；6)将连接导线与主机在标记箱外连接，开机运行；让植物自然消耗标记箱内的CO₂，当标记箱内CO₂浓度低于100ppm时开始向标记箱内注射¹³CO₂气体；7)打开半导体制冷器，并向水槽内放入冰袋；8)采用注射器从¹³CO₂生成单元中抽取¹³CO₂气体，抽取完毕后迅速拔出注射器针头，并将针头扎入橡胶塞中；将针头上的橡胶塞拔掉，并迅速将针头扎入标记箱侧面的硅胶塞中，将¹³CO₂气体缓慢注入标记箱内；9)实时监测标记箱内CO₂浓度，严格控制标记箱内CO₂浓度使其始终维持在300-450ppm；10)根据预先设置的时间间隔向水槽内放入冰袋；11)标记结束后用LI-8100测定土壤呼吸。

进一步，所述步骤7)中，注射过程中注意观测LI-6400CO₂浓度，当标记箱内CO₂浓度达到450ppm时，停止注射，并记录¹³CO₂气体注射量。

进一步，该装置还包括硅胶、CO₂浓度监测单元和菌丝室土壤呼吸测定单元；所述标记箱采用敞口式结构，所述标记箱的敞口端扣设在所述水槽内；所述水槽内设置有自来水，所述自来水的水面高于所述标记箱敞口端底缘，所述标记箱敞口端底缘与所述水槽的内底面之间留有间隙；在所述标记箱内，位于所述水槽中央设置有所述标记平台，所述标记平台上部设置有所述菌丝室土壤呼吸测定单元；在所述标记平台上，位于所述菌丝室土壤呼吸测定单元一侧设置有所述硅胶，所述菌丝室土壤呼吸测定单元另一侧设置有所述CO₂浓度监测单元；在所述标记箱侧壁上开设有孔，所述孔内通过透明防水玻璃胶设置有所述硅胶塞，所述¹³CO₂生成单元通过所述注射器将所述¹³CO₂气体经所述硅胶塞注入所述标记箱内；所述在标记箱侧壁上还设置有所述半导体制冷器，所述半导体制冷器的制冷端位于所述标记箱内部，所述半导体制冷器的散热端位于所述标记箱外部。

进一步，所述水槽采用将PVC软质玻璃桌布四个角折起，并采用凤尾夹将四个角固定，制成长方体盒子作为水槽。

进一步，所述标记平台采用木板、泡沫板或砖块构成的平台，所述标记平台上表面设置有一层塑料薄膜。

进一步，所述在标记箱内上方设置有风扇，所述风扇与设置在所述标记平台上的充电宝连接；所述充电宝外部采用透明自封袋封住。

进一步，所述菌丝室土壤呼吸测定单元包括由透明PVC板制成的无顶盖箱体、尼龙网和呼吸环；所述尼龙网设置在所述无顶盖箱体内，将所述无顶盖箱体分隔成三室菌根花盆：根室、缓冲室和菌丝室；所述根室内和缓冲室内设置的土壤为灭菌后的沙土，所述菌丝室内设置有玻璃珠；在所述根室、菌丝室中各放置一个所述呼吸环，所述呼吸环顶部高出土壤。

进一步，所述根室与所述缓冲室之间的所述尼龙网的孔径为1mm，所述缓冲室与所述菌丝室之间的所述尼龙网的孔径为30μm。

进一步，所述CO₂浓度监测单元包括手持探头、主机和连接导线；所述手持探头设置在所述标记箱内的所述标记平台上，所述主机设置在所述标记箱外部；在所述标记箱侧面开设有安装孔，所述连接导线穿入所述安装孔中；所述连接导线一端与所述标记箱内的手持探头连接，另一端与所述标记箱外的主机连接。

进一步，所述¹³CO₂生成单元包括¹³CO₂气瓶、塑料管、气体采样袋、旋塞侧向阀和减压阀；所述¹³CO₂气瓶出口端通过所述塑料管与所述气体采样袋连接，且所述塑料管两端采用不锈钢管箍扣紧；所述气体采样袋上设置有所述旋塞侧向阀和取样帽，所述取样帽与所述气体采样袋之间设置有硅胶垫；所述¹³CO₂气瓶设置有所述减压阀。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明采用¹³CO₂气瓶、塑料管和气体采样袋构成的¹³CO₂生成单元，安全、易操作，便于控制¹³CO₂使用量。并且可以保证¹³CO₂气体的纯净度，减少杂质，提高试验精确度。2、本发明在密闭条件下用注射器缓慢注射¹³CO₂气体，可以控制¹³CO₂气体使用量，且¹³CO₂气体没有任何外逸损失。3、本发明在标记前用注射器通过标记箱侧面的T型硅胶塞中吸出标记箱内气体，使标记箱内液面比箱外高2cm左右，既可以检验标记箱气密性，还可以有效防止实验后期标机箱内气体过多，导致标记箱底部有气泡冒出，减少¹³CO₂气体损失。4、本发明采用LI-6400实时监测标记箱内CO₂浓度，可以严格控制标记箱内CO₂浓度，减少因CO₂浓度不稳定而造成的实验误差。5、本发明标记箱内使用USB风扇与充电宝连接，使空气流动，保证箱内¹³CO₂浓度均匀，提高LI-6400监测的CO₂浓度的准确性。6、本发明标记箱内安装温湿度计，有利于实时监测箱内温度和湿度。7、本发明结构简单、制作容易，操作方法简便、安全，对实验条件严格控制且实时监测，精确度高。8、本发明在标记平台上铺一块塑料薄膜可以减少水蒸发面积，有效降低标记箱内由于密闭带来的高湿度。且在标记箱内放入硅胶颗粒，可有效除湿，降低标记箱内温湿度。9、本发明采用PVC软质玻璃桌布和大号凤尾夹制成简易水槽，形状易控制，可以调节水槽内水深。使用半导体制冷器，并向水槽内放入冰袋，可有效降低标记箱内温度。10、本发明在标记箱内外均用透明防水玻璃胶密封，且采用注射器从T型硅胶塞注射¹³CO₂气体，密封性好。11、本发明采用尼龙网在花盆中隔出菌丝室，便于研究AM真菌菌丝对土壤的影响，以及测定土壤呼吸。

综上所述，本发明实用性广，不仅适合于直接对植物进行碳同位素标记，且适合于植物根系向土壤输入(分泌)的碳量以及植物光合固碳和光合产物分配等方面研究的使用。

附图说明

图1是本发明的整体结构示意图；

图2是本发明的分室培养系统结构示意图；

图3是本发明实施例中的分室培养系统结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

本发明还提供一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其包括以下步骤：

1)设置一包括标记箱1、水槽2、标记平台3、硅胶塞5、注射器6、半导体制冷器7、¹³CO₂生成单元主机以及与主机连接的手持探头构成的装置；

2)将水槽2放在水平地面，外围用砖块围住，防止水槽2侧面坍塌。向水槽2内注水自来水8，水深5cm左右即可。

3)将标记平台3放在水槽2中央，标记平台3采用木板，在木板上方盖一层塑料薄膜10。将植物、温湿度计11、风扇12、充电宝13和硅胶4放置在标记平台3上。

4)将手持探头20与主机21的连接导线22穿入标记箱1侧面的安装孔中，连接导线22一端与标记箱1内的手持探头20连接，将手持探头20放在标记平台3上，打开手持探头20的气室。将标记箱1敞口端扣于水槽2中，水槽2具有的水面高于标记箱1敞口端底缘，水将标记箱1封闭成一个密闭的用于标记植物的空间，标记箱1敞口端底缘与水槽2的内底面之间留有间隙。用防水透明玻璃胶将连接导线和标记箱的缝隙密封。

其中，手持探头20采用LI-6400手持探头。

5)用注射器6通过标记箱1侧面的硅胶塞5中吸出标记箱1内气体，使标记箱1内液面比箱外高2cm左右，半小时后观察标记箱1内液面是否降低，以此来检验标记箱1气密性。

此外，由于标记箱1内会产生温室效应，因此在标记前使标记箱1内液面比箱外高可以有效防止实验后期标记箱1内温度升高，热胀冷缩作用导致气体从标记箱1底部逸出。

6)将连接导线22与主机21在标记箱1外连接，开机运行。让植物自然消耗标记箱1内的CO₂，当标记箱1内CO₂浓度低于100ppm时开始向标记箱1内注射¹³CO₂气体。

7)打开半导体制冷器7，并向水槽2内放入适量冰袋。

8)采用注射器6从¹³CO₂生成单元中抽取100ml ¹³CO₂气体，抽取完毕后迅速拔出注射器针头，并将针头扎入橡胶塞中，以减少在运输过程中¹³CO₂气体损耗。将针头上的橡胶塞拔掉，并迅速将针头扎入标记箱1侧面的硅胶塞5中，将¹³CO₂气体缓慢注入标记箱1内。注射过程中注意观测LI-6400CO₂浓度，当标记箱1内CO₂浓度达到450ppm时，停止注射，并记录¹³CO₂气体注射量。

9)实时监测标记箱1内CO₂浓度，严格控制标记箱1内CO₂浓度使其始终维持在300-450ppm(可根据实验需要改变CO₂浓度范围)。

10)根据预先设置的时间间隔向水槽2内放入冰袋，保证水槽2内水温始终低于10℃，可有效降低标记箱1内温度。

11)标记结束后用LI-8100测定土壤呼吸。

在一个优选的实施例中，如图1所示，步骤1)中的装置还包括硅胶4、CO₂浓度监测单元和菌丝室土壤呼吸测定单元。标记箱1采用敞口式结构，标记箱1的敞口端扣设在水槽2内，水槽2长度大于标记箱1长度；且水槽2内设置有自来水8，自来水8的水面高于标记箱1敞口端底缘，以将标记箱1内封闭成一个用于标记植物的密闭空间；标记箱1敞口端底缘与水槽2的内底面之间留有间隙。在标记箱1内，位于水槽2中央设置有标记平台3，标记平台3上部设置有菌丝室土壤呼吸测定单元；在标记平台3上，位于菌丝室土壤呼吸测定单元一侧设置有硅胶4，菌丝室土壤呼吸测定单元另一侧设置有CO₂浓度监测单元。在标记箱1侧壁上开设有孔，孔内通过透明防水玻璃胶设置有硅胶塞5，将硅胶塞5与标记箱1内外接缝处都涂设有透明防水玻璃胶，以防止接缝处漏气；¹³CO₂生成单元通过注射器6将¹³CO₂气体经硅胶塞5注入标记箱1内。在标记箱1侧壁上还设置有半导体制冷器7，半导体制冷器7的制冷端位于标记箱1内部，半导体制冷器7的散热端位于标记箱1外部，这样可以有效降低标记箱1内的温度。其中，硅胶塞5采用T型硅胶塞。

在一个优选的实施例中，标记箱1采用有机玻璃板制成，长×宽×高优选为110cm×75cm×120cm，玻璃箱内外接缝处均涂设有透明防水玻璃胶，以防止接缝处漏气并加固玻璃箱。

在一个优选的实施例中，水槽2采用将PVC软质玻璃桌布四个角折起(如图1所示)，并采用凤尾夹9将四个角固定，制成长方体盒子作为水槽；并在水槽2外围用砖块围住，防止水槽2侧面坍塌。PVC软质玻璃桌布厚度优选为2mm，长×宽优选为1m×1m。向水槽2内注水自来水8，水深5cm左右即可。

在一个优选的实施例中，标记平台3采用木板、泡沫板或砖块构成的平台，标记平台3上表面设置有一层塑料薄膜10，由于水蒸气也是一种温室气体，塑料薄膜10可以减少水蒸发面积，有效降低标记箱1内湿度。其中，标记平台3厚度需大于水槽2内自来水8的深度。

在一个优选的实施例中，在标记平台3上还设置有温湿度计11，用于检测标记箱1内的温度和湿度情况。

在一个优选的实施例中，在标记箱1内还设置有风扇12，风扇12与设置在标记平台3上的充电宝13连接。风扇12向上吹风，以便将标记箱1内气体混合均匀。充电宝13外部采用透明自封袋封住，以防水蒸气冷凝造成短路。

在一个优选的实施例中，硅胶4作为干燥剂用，将硅胶4放置在纸盒中，并将纸盒放置在标记平台3上。为提高硅胶吸湿效率，纸盒内的硅胶4厚度不超过3cm。硅胶4优选为500g。

在一个优选的实施例中，如图2所示，菌丝室土壤呼吸测定单元包括尼龙网14、由透明PVC板制成的无顶盖箱体15和呼吸环16。尼龙网14设置在无顶盖箱体15内，将无顶盖箱体15分隔成三室菌根花盆：根室17、缓冲室18和菌丝室19。根室17内设置的土壤为过2mm筛灭菌后的沙土，缓冲室18内设置的土壤为粒径在0.2～2mm的灭菌沙土，菌丝室19内设置有直径为0.8～1.2mm的玻璃珠，玻璃珠用去离子水洗净后，用5％稀盐酸浸泡24小时灭菌后，用无菌水冲洗干净后使用。在根室17、菌丝室19中各放置一个呼吸环16，呼吸环16顶部比土壤高5cm；呼吸环16的尺寸优选为外径20cm，高度10cm，厚度0.7mm。

上述实施例中，透明PVC板厚度优选为4mm；无顶盖箱体15的长×宽×高优选为28cm×55cm×26cm，无顶盖箱体15内外接缝处涂设有透明防水玻璃胶，以防止接缝处渗漏并加固箱体，箱体外用牛皮纸包裹，以免透光影响根系生长。

上述各实施例中，根室17、缓冲室18和菌丝室19的长度分别优选为27cm、5cm和22cm，在根室17与缓冲室18之间的尼龙网14的孔径优选为1mm，在缓冲室18与菌丝室19之间的尼龙网14的孔径优选为30μm，用于分隔菌丝。在根室17靠近尼龙网一侧种植两株植物。

在一个优选的实施例中，CO₂浓度监测单元采用LI-6400监测，其包括手持探头20、主机21和连接导线22；手持探头20采用LI-6400手持探头。手持探头20设置在标记箱1内的标记平台3上，主机21设置在标记箱1外部。在标记箱1侧面开设有安装孔，连接导线22穿入安装孔中，并在连接导线22与标记箱1之间缝隙处采用防水透明玻璃胶密封；连接导线22一端与标记箱1内的手持探头20连接，另一端与标记箱1外的主机21连接。

在一个优选的实施例中，¹³CO₂生成单元包括¹³CO₂气瓶23、塑料管24、气体采样袋25、旋塞侧向阀26和减压阀27。¹³CO₂气瓶23出口端通过塑料管24与气体采样袋25连接，且塑料管24两端采用不锈钢管箍扣紧，防止漏气。气体采样袋25上设置有旋塞侧向阀26和取样帽，取样帽与气体采样袋25之间设置有硅胶垫；¹³CO₂气瓶23上设置有减压阀27。将气体采样袋25的旋塞侧向阀26打开，缓缓打开¹³CO₂气瓶23的减压阀27，让¹³CO₂气体进入气体采样袋25中，当气体采样袋25鼓起后先后关闭减压阀27和旋塞侧向阀26。用注射器6扎入气体采样袋25取样帽中抽取¹³CO₂气体，抽取完毕后迅速拔出注射器6的针头，并将针头扎入橡胶塞中，以减少在运输过程中¹³CO₂气体损耗。将针头拔出橡胶塞并迅速将针头扎入标记箱1侧面的硅胶塞5中，将¹³CO₂气体缓慢注入标记箱1内。

其中，气体采样袋25优选为2L气袋，注射器6优选为100ml注射器。

实施例：¹³C标记法研究玉米各器官光合产物再分配的情况

1、材料与方法：

1.1试验材料：

玉米种子：中国农科院种子公司提供的糯玉2号玉米。

供试丛枝菌根(AM)真菌菌种为摩西球囊霉(Glomus mosseae，简称G.m)BGCXJ01，由北京市农林科学研究院植物营养与资源研究所微生物室提供，经中国矿业大学(北京)微生物复垦实验室增殖培养得到，接种所用的菌剂(孢子密度为200个/10克菌剂)为含有宿主植株根段和根外菌丝体的砂土混合物。

供试基质：沙土，土壤速效磷4.95mg/kg、速效钾24.56mg/kg、有机质含量0.59g/kg、田间最大持水量为18.15％、PH值7.44、EC值840uS/cm。

1.2试验方法：

本试验设接种菌根(+M)和不接种菌根(CK)2个处理，每种处理3次重复。盆栽试验于2017年4月5日在中国矿业大学(北京)玻璃温室内进行。采用分室培养，盆规格为：28cm×55cm×26cm(长×宽×高)，如图3所示。其中根室17每盆加土量为25kg；缓冲室18每盆加土量为5kg；菌丝室19每盆放入玻璃珠22kg。种植玉米前向根室17土壤加入KH₂PO₄、NH₄NO₃、K₂SO₄营养液底肥，施肥量：P、N、K含量分别为30mgkg^-1、100mgkg^-1、150mgkg^-1。浇水至最大饱和持水量静置24h后播种。接菌处理每盆施加菌剂100g(根室)，对照处理每盆加同等质量的灭菌菌剂，采用层施方式接菌在根室17接菌。

用育苗盆培养玉米幼苗，于两叶一心时移入盆中，每盆2株。使用TC50土壤水分测定仪监测根室17土壤含水率，使土壤含水量维持在最大持水量的75％～80％内。用喷壶每日向菌丝室19盆100ml去离子水，为保证菌丝正常生长，每隔3天向菌丝室19喷100ml霍格兰氏营养液(注：喷霍格兰氏营养液时不再额外喷去离子水)。由于玉米生长中期出现缺素症状时，于2017年4月30日向各盆根室17追加KH₂PO₄、NH₄NO₃、K₂SO₄营养液，施肥量：P、N、K含量分别为15mg kg^-1、50mg kg^-1、75mg kg^-1。

1.3脉冲标记：

玉米播种第60天进行¹³C脉冲标记，脉冲标装置如图1所示。脉冲标记试验在60cm(长)×60cm(宽)×80cm(高)的标记室中进行。选择晴朗少云的天气进行标记，上午8:00将玉米置于标记室内，9:00-15:00间用注射器注射¹³CO₂(99％)，17:00打开玻璃罩，使玉米夜晚进行正常呼吸，连续标记3天。标记过程中，接菌和对照处理分别在两个完全相同的装置中进行。

1.4样品采集与分析方法：

标记结束后次日上午10:00分别收割玉米地上和地下部分，用去离子水洗净，并将玉米第6-7片叶片、8-12片叶片、茎秆、根、其他部分分装，放入烘箱内于70℃烘至恒重后，用小型粉碎机粉碎，过0.15mm筛，装袋备用。根际土壤用四分法采样，土壤样品在研钵中研磨并混匀，过2mm筛，取部分土样自然风干后备用。取10g土样于锥形瓶中，加入50ml去离子水振荡30min，收集上清液，以免土壤中水溶性有机碳流失。在上清液中滴加HCl溶液使pH<3(除去可溶性碳酸盐)，往泥浆中加入50ml 3mol/l的HCl溶液(除去土壤中碳酸盐)，于70℃反应3h后，在4500r/s离心机中离心3min，倒掉上清液，加入去离子水，以此反复清洗多次至中性，把上清液倒回，在70℃条件下烘干至恒重，研磨、过0.15mm筛，备用。

菌根侵染率采用曲利苯蓝染色法测定；菌丝密度测定采用真空泵微孔滤膜抽滤法。土壤呼吸用LI-8100测定。植物和土壤δ13值在北京植物研究所稳定性同位素实验室的DeltaplusXP质谱仪及元素分析仪上测定。

1.5数据统计与分析：

试验数据处理和作图采用Excel2010，差异显著性分析采用SAS 8.0统计软件，差异显著性水平为0.05。

2结果与分析

2.1接种AM真菌对根系侵染率、土壤菌丝密度与土壤呼吸的影响

菌根侵染率可以反应AM真菌与宿主植物的亲和程度。接菌处理根系侵染率和土壤菌丝密度均显著高于对照(如表1所示)，说明AM真菌和玉米植株形成了良好的共生关系。接菌处理根室17与缓冲室18植物根系侵染率分别为84.4％、86.7％(如表1所示)，但差异不显著。对照处理玉米根系未被植物侵染。菌丝密度代表土壤中菌丝生物量。接菌处理土壤菌丝密度为6.7m/g，对照处理土壤中没有菌丝。说明AM真菌与玉米形成良好的共生关系。接菌处理根室17和菌丝室19土壤呼吸均高于对照，其中对根室17土壤呼吸影响显著(P<0.05)。

表1接菌处理对根系侵染率和土壤菌丝密度的影响

注：表中数据为3个重复均值，同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，下同。

2.2玉米植株生长情况

由表2可知，接种丛枝菌根真菌促进玉米各部分干物质积累，显著增加了玉米干重。接菌使玉米叶片总干重提高了15.57％，差异显著(P<0.05)。其中对玉米中部叶片影响最大，菌根贡献率为25.10％，差异显著(P<0.05)。丛枝菌根真菌增加了叶片含量，增加叶面积。对照处理干叶生物量高于接菌，但差异不显著。接菌处理茎秆干重与对照处理差异不显著。接菌处理根系干重为10.95g，比对照处理增加了36％，差异显著(P<0.05)。菌丝室19菌丝生物量为117mg。接菌显著提高了玉米干重，菌根贡献率为13.06％。AM真菌侵染植物根系，促进植物根系生长，促进植物从土壤中吸收养分，从而促进玉米干物质积累。

表2接菌处理对玉米干物质积累的影响(g)

标记结果表明，接菌后玉米不同部位δ¹³C均有所提高(如表3所示)。接菌处理嫩叶和中部叶片δ¹³C分别比对照处理提高了21.15％、13.80％，差异显著(P<0.05)，说明接菌有效提高了玉米嫩叶与中部叶片固碳能力。接菌处理与对照处理老叶和茎秆中δ¹³C差异不显著。接种AM真菌对玉米根系δ¹³C影响最大，接菌处理根δ¹³C是对照的2.45倍，差异显著(P<0.05)。接菌处理菌丝δ¹³C为1138‰。对照与接菌处理土壤δ¹³C均显著低于植物体，接菌处理土壤δ¹³C显著(P<0.05)高于对照，菌根贡献率为34.51％。这是由于AM真菌在土壤中形成大量菌丝网络，土壤菌丝密度为6.7m/g，因而提高了土壤中¹³C。

表3接菌处理对玉米不同部位δ¹³C(‰)的影响

综合本实例的结果，不难看出接种AM真菌能够改善植物生长状况，促进植物生长，提高玉米光合固碳能力，促进植物将光合碳向根系和菌丝土壤中转移，对生态系统碳循环和土壤固碳有重要意义。

上述各实施例仅用于说明本发明，各部件的结构、尺寸、设置位置及形状都是可以有所变化的，在本发明技术方案的基础上，凡根据本发明原理对个别部件进行的改进和等同变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (8)

1.一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设置一包括水槽、标记平台、标记箱、注射器、半导体制冷器、¹³CO₂生成单元主机以及与主机连接的手持探头构成的装置；

2)将水槽放在水平地面，外围用砖块围住，向水槽内注水自来水；

3)将标记平台放在水槽中央，标记平台采用木板，在木板上方盖一层塑料薄膜；

4)将手持探头与主机的连接导线穿入标记箱侧面的安装孔中，连接导线一端与标记箱内的手持探头连接，将手持探头放在标记平台上，打开手持探头的气室；将标记箱敞口端扣于水槽中，水槽具有的水面高于标记箱敞口端底缘，水将标记箱封闭成一个密闭的用于标记植物的空间，标记箱敞口端底缘与水槽的内底面之间留有间隙；

5)用注射器通过标记箱侧面的硅胶塞中吸出标记箱内气体，使标记箱内液面比箱外高，半小时后观察标记箱内液面是否降低，以此来检验标记箱气密性；

6)将连接导线与主机在标记箱外连接，开机运行；让植物自然消耗标记箱内的CO₂，当标记箱内CO₂浓度低于100ppm时开始向标记箱内注射¹³CO₂气体；

7)打开半导体制冷器，并向水槽内放入冰袋；

8)采用注射器从¹³CO₂生成单元中抽取¹³CO₂气体，抽取完毕后迅速拔出注射器针头，并将针头扎入橡胶塞中；将针头上的橡胶塞拔掉，并迅速将针头扎入标记箱侧面的硅胶塞中，将¹³CO₂气体缓慢注入标记箱内；

9)实时监测标记箱内CO₂浓度，严格控制标记箱内CO₂浓度使其始终维持在300-450ppm；

10)根据预先设置的时间间隔向水槽内放入冰袋；

11)标记结束后用LI-8100测定土壤呼吸；

该装置还包括硅胶、CO₂浓度监测单元和菌丝室土壤呼吸测定单元；所述标记箱采用敞口式结构，所述标记箱的敞口端扣设在所述水槽内；所述水槽内设置有自来水，所述自来水的水面高于所述标记箱敞口端底缘，所述标记箱敞口端底缘与所述水槽的内底面之间留有间隙；在所述标记箱内，位于所述水槽中央设置有所述标记平台，所述标记平台上部设置有所述菌丝室土壤呼吸测定单元；在所述标记平台上，位于所述菌丝室土壤呼吸测定单元一侧设置有所述硅胶，所述菌丝室土壤呼吸测定单元另一侧设置有所述CO₂浓度监测单元；在所述标记箱侧壁上开设有孔，所述孔内通过透明防水玻璃胶设置有所述硅胶塞，所述¹³CO₂生成单元通过所述注射器将所述¹³CO₂气体经所述硅胶塞注入所述标记箱内；所述在标记箱侧壁上还设置有所述半导体制冷器，所述半导体制冷器的制冷端位于所述标记箱内部，所述半导体制冷器的散热端位于所述标记箱外部；

所述¹³CO₂生成单元包括¹³CO₂气瓶、塑料管、气体采样袋、旋塞侧向阀和减压阀；所述¹³CO₂气瓶出口端通过所述塑料管与所述气体采样袋连接，且所述塑料管两端采用不锈钢管箍扣紧；所述气体采样袋上设置有所述旋塞侧向阀和取样帽，所述取样帽与所述气体采样袋之间设置有硅胶垫；所述¹³CO₂气瓶设置有所述减压阀；

将气体采样袋的旋塞侧向阀打开，缓缓打开¹³CO₂气瓶的减压阀，让¹³CO₂气体进入气体采样袋中，当气体采样袋鼓起后先后关闭减压阀和旋塞侧向阀，用注射器扎入气体采样袋取样帽中抽取¹³CO₂气体，抽取完毕后迅速拔出注射器的针头，并将针头扎入橡胶塞中，以减少在运输过程中¹³CO₂气体损耗，将针头拔出橡胶塞并迅速将针头扎入标记箱侧面的硅胶塞中，将¹³CO₂气体缓慢注入标记箱内。

2.如权利要求1所述的一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其特征在于：所述步骤7)中，注射过程中注意观测LI-6400CO₂浓度，当标记箱内CO2浓度达到450ppm时，停止注射，并记录¹³CO₂气体注射量。

3.如权利要求1所述的一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其特征在于：所述水槽采用将PVC软质玻璃桌布四个角折起，并采用凤尾夹将四个角固定，制成长方体盒子作为水槽。

4.如权利要求1所述的一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其特征在于：所述标记平台采用木板、泡沫板或砖块构成的平台，所述标记平台上表面设置有一层塑料薄膜。

5.如权利要求1所述的一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其特征在于：所述在标记箱内上方设置有风扇，所述风扇与设置在所述标记平台上的充电宝连接；所述充电宝外部采用透明自封袋封住。

6.如权利要求1所述的一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其特征在于：所述菌丝室土壤呼吸测定单元包括由透明PVC板制成的无顶盖箱体、尼龙网和呼吸环；所述尼龙网设置在所述无顶盖箱体内，将所述无顶盖箱体分隔成三室菌根花盆：根室、缓冲室和菌丝室；所述根室内和缓冲室内设置的土壤为灭菌后的沙土，所述菌丝室内设置有玻璃珠；在所述根室、菌丝室中各放置一个所述呼吸环，所述呼吸环顶部高出土壤。

7.如权利要求6所述的一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其特征在于：所述根室与所述缓冲室之间的所述尼龙网的孔径为1mm，所述缓冲室与所述菌丝室之间的所述尼龙网的孔径为30μm。

8.如权利要求1所述的一种¹³CO₂量化脉冲标记植物的方法，其特征在于：所述CO₂浓度监测单元包括手持探头、主机和连接导线；所述手持探头设置在所述标记箱内的所述标记平台上，所述主机设置在所述标记箱外部；在所述标记箱侧面开设有安装孔，所述连接导线穿入所述安装孔中；所述连接导线一端与所述标记箱内的手持探头连接，另一端与所述标记箱外的主机连接。