CN104789527B - 一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法及其试剂盒产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法，其中包括如下特征：来自于癌症患者自身的外周血单个核细胞，在重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC‑I类链相关分子A共同作用下激活了自然杀伤细胞增殖，并增强了自然杀伤细胞杀伤潜能；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的试剂盒，可用于临床大量获得自然杀伤细胞并进行抗肿瘤和抗病毒的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸡尾酒式制备自体自然杀伤细胞的方法，其中包括如下特征：其中包括如下特征：来自于癌症患者自身的外周血单个核细胞，在重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A共同作用下激活自然杀伤细胞增殖，并增强自然杀伤细胞杀伤潜能；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的试剂盒，可在体外大量增殖获得自然杀伤细胞并具有杀伤活性，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural Killer cells，NK)主要表达CD16+/CD56+表型，是先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫及清除非己细胞的第一道防线。与T淋巴细胞不同，NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞。NK细胞功能的发挥由其细胞表面活化性受体和抑制性受体所传递的信号共同决定，但在癌症患者体内肿瘤细胞通过机体炎症分子抑制NK细胞表面活化性受体表达，表达抑制性受体从而逃避NK细胞杀伤。因而，激活NK细胞高表达活化性受体而活化其杀伤活性就至关重要了，NK细胞对黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等肿瘤治疗有明显疗效。
NK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量NK细胞有限和培养时间过长。传统使用的白介素2激活生长倍数有限，端粒长度缩短，培养时间过长引起了NK细胞杀伤功能低下。目前，临床治疗用的NK细胞培养技术也有采用基因工程化和病毒转染的滋养细胞与NK细胞共培养后，激活NK细胞增殖和活化其杀伤功能。
本发明提供了NK细胞鸡尾酒式培养方法，即在含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A共同作用下大量扩增NK细胞，30ml外周血来源单个核细胞培养至21天细胞增殖到30×109以上，增殖倍数达到1000倍以上，NK细胞杀瘤活性在14-16天达到最佳，培养过程中不需要基因工程化的滋养层细胞，简单快速，为患者临床治疗大大节约了时间，并发挥出最好的抗肿瘤作用，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且可以大大降低细胞培养成本。
发明内容
本发明针对能更好地从癌症患者自体的单个核细胞扩增获得NK细胞，逆转患者体内NK细胞免疫抑制而增强其杀伤活性。本发明通过前期研究实验发现鸡尾酒式培养方法，即在含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子共同作用下诱导激活产生NK细胞，培养至21天细胞增殖倍数达到1000倍以上，所述NK细胞经流式细胞仪检测后CD56+/CD16+表型均大于80％，CD3+细胞低于10％，并具有很强杀伤活性。
NK细胞发育依赖于白介素15(Interleukin-15，IL-15)，并促使组织中休眠的NK细胞达到效应阶段，具有促进淋巴细胞和NK细胞增殖和增强它们生物活性的功能；IL-18、IL-21、IL-12、IL-7和MHC-I类链相关分子A是与其受体结合后可以显著诱导了NK细胞的产生，调节NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞杀伤活性对肿瘤完全排斥，这些细胞因子联合作用对活化前的NK细胞功能是有效的诱导剂，并协同IL-15促进骨髓前体细胞增殖和NK细胞增殖、分化和细胞毒活性，使其能杀死NK敏感的和NK抗性的肿瘤细胞。本发明通过发挥这些细胞因子的协同作用机制，激活NK细胞增殖和增强其杀伤活性，抑制NK细胞中调节性T淋巴细胞的增殖和产生，延长NK细胞端粒酶活性，可产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。
本发明涉及体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法，其中包括如下特征：来自于癌症患者30ml外周血的单个核细胞，在含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子(优选同时含有上述细胞因子)共同作用下激活自然杀伤细胞大量增殖，培养到21天细胞增殖倍数达到1000倍以上，并增强自然杀伤细胞的杀伤活性。
本发明所述的鸡尾酒式培养体系，为细胞培养基中含有1ng-500ng/ml重组人白介素15、1ng-500ng/ml重组人白介素18、1ng-500ng/ml重组人白介素21、1ng-500ng/ml重组人白介素12、1ng-500ng/ml重组人白介素7以及1ng-500ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子。鸡尾酒式培养体系优选为细胞培养基中含有10ng-50ng/ml重组人白介素15、10ng-50ng/ml重组人白介素18、10ng-50ng/ml重组人白介素21、10ng-50ng/ml重组人白介素12、10ng-50ng/ml重组人白介素7以及10ng-50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子。
本发明所述制备自体杀伤细胞鸡尾酒式培养方法为：采集癌症患者30ml外周血，经淋巴细胞分离液密度梯度离心获得单个核细胞，将其在32ml的细胞培养基(含有5％自体血浆、50ng/ml重组人白介素15、20ng/ml重组人白介素18、20ng/ml重组人白介素21、20ng/ml重组人白介素12、20ng/ml重组人白介素7和50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子)中，加入到细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养5天以上。
鸡尾酒式激活培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吹打后，吸取至新的细胞培养瓶中，并补充10-20mL新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL重组人白介素2)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；将NK细胞转移到细胞培养袋中，并继续补充一倍体积的新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL重组人白介素2)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到21天，使得细胞数达到30×109以上。
所述鸡尾酒式培养试剂，优选地，外周血单个核细胞在24孔细胞培养板、12孔细胞培养板或6孔细胞培养板中连续培养5天以上，诱导激活NK细胞。
自然杀伤细胞优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血。NK细胞临床治疗中采取1个疗程4-8次的回输治疗，即每周采集外周血1次，应用于1次NK细胞的回输，共完成1个疗程的4-8次的治疗。
本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI 1640培养基加入50-500活性单位/mL重组人白介素2和10％(体积比)自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如RPMI1640、CellGro@SCGM、Tex@MACS、KOHJIN@GT-T502、X-VIVO和GT-H551等，含有500活性单位/mL重组人白介素2，该低浓度白介素2可促进NK细胞的增殖，维持NK细胞长期生长。
本发明还提供了鸡尾酒式制备自体自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)200ml淋巴细胞分离液；
(2)500ml淋巴细胞无血清培养基；
(3)鸡尾酒式培养试剂：重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子；优选，10ng-50ng/ml重组人白介素15、10ng-50ng/ml重组人白介素18、10ng-50ng/ml重组人白介素21、10ng-50ng/ml重组人白介素12、10ng-50ng/ml重组人白介素7以及10ng-50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子；更优选，同时含有上述细胞因子；
(4)50-500活性单位/mL重组人白介素2；
(5)100ml生理盐水；
(6)使用说明书；
所述鸡尾酒式培养试剂，优选地，外周血单个核细胞在24孔细胞培养板、12孔细胞培养板或6孔细胞培养板中连续培养5天以上，诱导激活NK细胞。
本发明还提供了上述方法及其试剂盒制备NK细胞，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的临床免疫治疗。
附图说明
图1表示本发明实施例一中鸡尾酒式培养NK细胞体外增殖倍数变化曲线图；
图2表示流式细胞仪检测本发明实施例一中鸡尾酒式培养NK细胞表型结果图；
图3表示本发明实施例一鸡尾酒式培养获得的NK细胞对肾细胞癌(RCC925)和脑胶质瘤(U87MG)体外杀伤毒性结果图；
图4表示本发明制备的NK细胞对荷肝癌SCID裸鼠模型治疗完之后肿瘤大小变化曲线图。
具体实施方式
本发明发现通过鸡尾酒式培养的制备方法，即在含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子共同作用下能激活自然杀伤细胞大量增殖，并增强其杀伤活性；来源于患者30ml自体外周血单个核细胞，鸡尾酒式培养NK细胞至21天细胞增殖倍数达到1000倍以上，NK细胞数达到30×109以上满足临床治疗需要，并扩增后的NK细胞端粒酶活性增强，端粒长度增长，保持一个年轻状态的杀伤活性。
对本发明涉及的一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法进行具体说明。本发明涉及采用含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子(优选同时含有上述细胞因子)共同作用扩增激活自然杀伤细胞，使得NK细胞大量扩增，获得具有抗肿瘤作用的NK细胞。
本发明涉及一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其特征在于，使用含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子共同作用，扩增激活自然杀伤细胞，使自然杀伤细胞得以大量增殖。
本发明所述鸡尾酒式培养体系，优选为细胞培养基中含有1ng-500ng/ml重组人白介素15、1ng-500ng/ml重组人白介素18、1ng-500ng/ml重组人白介素21、1ng-500ng/ml重组人白介素12、1ng-500ng/ml重组人白介素7以及1ng-500ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子。鸡尾酒式培养体系优选为细胞培养基中含有10ng-50ng/ml重组人白介素15、10ng-50ng/ml重组人白介素18、10ng-50ng/ml重组人白介素21、10ng-50ng/ml重组人白介素12、10ng-50ng/ml重组人白介素7以及10ng-50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子。
自然杀伤细胞优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血。
本发明所述制备自体杀伤细胞鸡尾酒式培养方法为：采集癌症患者30ml外周血，经淋巴细胞分离液密度梯度离心获得单个核细胞，将其在32ml的细胞培养基(含有5％自体血浆、50ng/ml重组人白介素15、20ng/ml重组人白介素18、20ng/ml重组人白介素21、20ng/ml重组人白介素12、20ng/ml重组人白介素7和50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子)中，加入到细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养5天以上。
鸡尾酒式激活培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吹打后，吸取至新的细胞培养瓶中，并补充10-20mL新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL重组人白介素2)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；将NK细胞转移到细胞培养袋中，并继续补充一倍体积的新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL重组人白介素2)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到21天，使得细胞数达到30×109以上。
所述鸡尾酒式培养试剂，优选地，外周血单个核细胞在24孔细胞培养板、12孔细胞培养板或6孔细胞培养板中连续培养5天以上，诱导激活NK细胞。
本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI 1640培养基加入50-500活性单位/mL重组人白介素2和10％(体积比)自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如RPMI1640、CellGro@SCGM、Tex@MACS、KOHJIN@GT-T502、X-VIVO和GT-H551等，含有500活性单位/mL重组人白介素2。
本发明还提供了鸡尾酒式制备自体自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)200ml淋巴细胞分离液；
(2)500ml淋巴细胞无血清培养基；
(3)鸡尾酒式培养试剂：重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子；优选，10ng-50ng/ml重组人白介素15、10ng-50ng/ml重组人白介素18、10ng-50ng/ml重组人白介素21、10ng-50ng/ml重组人白介素12、10ng-50ng/ml重组人白介素7以及10ng-50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子；更优选同时含有上述细胞因子；
(4)50-500活性单位/mL重组人白介素2；
(5)100ml生理盐水；
(6)使用说明书；
其中，所述使用说明书如上所述的方法。
所述鸡尾酒式培养试剂，优选地，外周血单个核细胞在24孔细胞培养板、12孔细胞培养板或6孔细胞培养板中连续培养5天以上，诱导激活NK细胞。
作为本发明NK细胞扩增培养中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞培养袋，可例举，为75cm2细胞培养瓶、175cm2细胞培养瓶、250mL细胞培养袋等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选细胞培养袋。
本发明的制造方法中对NK细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50％小牛血清、40％细胞培养液和10％二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为NK细胞培养液。
在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于0容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5％(体积比)。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。
本发明的自体NK细胞增殖的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37℃、5％CO2等条件下培养。还可以实施如下等操作：间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。
本发明还提供NK细胞在临床应用中多次的抗肿瘤治疗，NK细胞临床治疗中采取1个疗程4-8次的回输治疗，即每周采集外周血1次，应用于1次NK细胞的回输，共完成1个疗程的4-8次的治疗，将更好地在生物体内发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述NK细胞还具有如下优点，多次NK细胞治疗将更好地引发NK细胞直接杀瘤活性和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，并分泌细胞因子发挥调节免疫和造血作用，产生高效、长期地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提高和生存期的延长。
以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
实施例一
鸡尾酒式培养自体自然杀伤细胞
采集肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和脑胶质母细胞瘤患者30ml外周血(与其签署知情同意书)，经淋巴细胞分离液密度梯度离心获得36×106单个核细胞，用1.6ml自体血浆重悬后，加入32ml的CellGro@SCGM细胞培养基(含有50ng/ml重组人白介素15、20ng/ml重组人白介素18、20ng/ml重组人白介素21和50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A)，混匀后加入到12孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养5天以上。
鸡尾酒式激活培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吹打后，吸取至新的细胞培养瓶中，并补充20mL新鲜细胞培养基(含500活性单位/mL重组人白介素2)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；将NK细胞转移到细胞培养袋中，并继续补充一倍体积的新鲜细胞培养基(含500活性单位/mL重组人白介素2)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到21天，使得细胞数达到30×109以上。
取10ul NK细胞液用1×PBS(pH7.4)稀释10倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率均达到98％以上。图1结果显示，随着NK细胞体外培养时间增加，扩增倍数也不断增加，五名癌症患者NK细胞培养到21天，细胞扩增倍数均高于1000倍，每位患者的NK细胞数均高于30×109。
取苔盼兰染色计数后的0.6×106NK细胞，分三组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD8单抗、20μL PE标记鼠抗人CD56单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD16单抗；第二组分别添加20μL FITC标记鼠抗人CD3单抗、20μL PE标记鼠抗人CD4单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD25单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1。置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)检测。图2结果显示，肾细胞癌患者鸡尾酒式培养的NK细胞表型为CD56+/CD16+细胞为90.82％，而CD3+细胞为9.95％、CD3+/CD8+细胞为6.68％和CD4+/CD25+细胞为4.12％，表明自体外周血单个核细胞经鸡尾酒式激活培养后获得NK细胞CD56+/CD16+含量很高。
其他四位癌症患者的外周血单个核细胞经鸡尾酒式培养获得的NK细胞，同样流式细胞仪检测后CD56+/CD16+表型均大于80％，CD3+细胞低于10％。
实施例二
鸡尾酒式培养自体自然杀伤细胞的试剂盒
(1)200ml淋巴细胞分离液；
(2)500ml淋巴细胞无血清培养基；
(3)鸡尾酒式培养试剂：10ng-50ng/ml重组人白介素15、10ng-50ng/ml重组人白介素18、10ng-50ng/ml重组人白介素21、10ng-50ng/ml重组人白介素12、10ng-50ng/ml重组人白介素7以及10ng-50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子；
(4)50-500活性单位/mL重组人白介素2；
(5)100ml生理盐水；
(6)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括实施例1所述的方法。
分装后进行包装，得到鸡尾酒式培养自体自然杀伤细胞的试剂盒。
实施例三
NK细胞体外杀瘤试验
选择相应的肾细胞癌(RCC925)和脑胶质瘤(U87MG)作为靶细胞，靶细胞用RPMI1640(含10％小牛血清)重悬到2×105的浓度，以每孔2×104个标记的靶细胞(0.1mL)添加到96孔板的孔中。
根据细胞免疫学杂志报道的共表达4-1BBL和鼠MICA的工程化K562细胞联合可溶性IL-21增殖NK细胞培养(Bo Jiang，Xuan Wu，Xi-ning Li，et al.Expansion of NK cellsby engineered K562cells co-expressing 4-1BBL and mMICA，combined with solubleIL-21.Cellular Immunology 290(2014)：10-20)中的现有技术，制备NK细胞作为对比例。
将实施例一中制备的NK细胞和现有技术制备的NK细胞作为效应细胞，分别以2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1和40∶1的效靶比加入对应的孔中，在37℃孵育4小时。孵育后，用通过CytoTox 96非放射性细胞毒性试剂盒检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放分析的(美国Promega公司)。效应细胞和靶细胞比例为2.5∶1，5∶1，10∶1，20∶1与40∶1，依据下面公式进行计算细胞毒性活性的。
图3显示了由实施例一获得的NK细胞，对肾细胞癌(RCC925)和脑胶质瘤(U87MG)产生抗肿瘤免疫应答，随着效靶比不断提高，对肿瘤细胞产生的CTL应答也特异升高。并且由本发明制备的NK细胞毒性活性与现有技术制备的NK细胞无明显差异，均具有很强杀伤肿瘤细胞的活性。
实施例五
NK细胞体内杀瘤实验中的作用
肝癌细胞系SMMC-7721建立荷肝癌瘤鼠模型，随机分为A、B和C3组，每组6只：A组为使用实施例一制备的NK细胞治疗组；B组为现有技术制备的NK细胞治疗组；C组为同体积生理盐水空白组。A、B和C3组在第0天荷瘤鼠模型尾静静注射1×106个/kg NK细胞，各1mL，间隔7天后再同样剂量免疫3次。注射后分别于7、14、21、28、35d计算鼠模型荷瘤大小，C组于相同时间点在皮下注射1mL生理盐水并计算鼠模型荷瘤大小。
治疗完之后分别于7d、14d、21d、28d和35d拉颈处死，取肝癌细胞系SMMC-7721SCID裸鼠模型肿瘤组织，计算鼠模型荷瘤大小(mm3，)。图4中荷肝癌SCID裸鼠模型治疗完之后肿瘤大小变化曲线，结果显示空白组和治疗组A与治疗组B相比，治疗组A与治疗组B中肝癌肿瘤大小大大缩少，明显地抑制肝癌的生长，因而有关实施例一所得NK细胞引发了良好的体内杀瘤活性，与现行技术制备的NK细胞的杀伤活性无差异。
Claims (6)
1.一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：来自于癌症患者30ml外周血的单个核细胞，在10ng-50ng/ml重组人白介素15、10ng-50ng/ml重组人白介素18、10ng-50ng/ml重组人白介素21、10ng-50ng/ml重组人白介素12、10ng-50ng/ml重组人白介素7以及10ng-50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A六种细胞因子协同作用下激活自然杀伤细胞大量增殖，培养到21天细胞增殖倍数达到1000倍以上，所述自然杀伤细胞细胞经流式细胞仪检测后CD56+/CD16+表型均大于80％，CD3+细胞低于10％，并增强自然杀伤细胞的杀伤活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备自体杀伤细胞鸡尾酒式培养方法为：采集癌症患者30ml外周血，经淋巴细胞分离液密度梯度离心获得单个核细胞，将其在32ml的细胞培养基中，加入到细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养5天以上；其中，所述细胞培养基含有5％自体血浆、50ng/ml重组人白介素15、20ng/ml重组人白介素18、20ng/ml重组人白介素21、20ng/ml重组人白介素12、20ng/ml重组人白介素7和50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A六种细胞因子；
鸡尾酒式激活培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吹打后，吸取至新的细胞培养瓶中，并补充10-20mL新鲜细胞培养基；在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；将自然杀伤细胞转移到细胞培养袋中，并继续补充一倍体积的新鲜细胞培养基；在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到21天，使得细胞数达到30×109以上；所述新鲜细胞培养基含50-500活性单位/mL重组人白介素2。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基加入50-500活性单位/mL重组人白介素2和体积比为10％的自体血清或胎牛血清；其含有500活性单位/mL重组人白介素2。
4.一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：分别采集肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和脑胶质母细胞瘤患者30ml外周血，经淋巴细胞分离液密度梯度离心获得36×106单个核细胞，用1.6ml自体血浆重悬后，加入32ml的CellGro@SCGM细胞培养基，混匀后加入到12孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养5天以上；所述CellGro@SCGM细胞培养基含有50ng/ml重组人白介素15、20ng/ml重组人白介素18、20ng/ml重组人白介素21和50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A；
鸡尾酒式激活培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吹打后，吸取至新的细胞培养瓶中，并补充20mL新鲜细胞培养基，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；将自然杀伤细胞细胞转移到细胞培养袋中，并继续补充一倍体积的新鲜细胞培养基，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到21天，使得细胞数达到30×109以上；所述新鲜细胞培养基含500活性单位/mL重组人白介素2；
取10ul自然杀伤细胞液用1×PBS稀释10倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率均达到98％以上；上述癌症患者的自然杀伤细胞培养到21天，细胞扩增倍数均高于1000倍，自然杀伤细胞数均高于30×109；
取苔盼兰染色计数后的0.6×106自然杀伤细胞，分三组，第一组分别添加到有20μLFITC标记鼠抗人CD8单抗、20μL PE标记鼠抗人CD56单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD16单抗；第二组分别添加20μL FITC标记鼠抗人CD3单抗、20μL PE标记鼠抗人CD4单抗和20μLPerCP标记鼠抗人CD25单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μLPE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur流式细胞仪检测；肾细胞癌患者鸡尾酒式培养的自然杀伤细胞表型为CD56+/CD16+细胞为90.82％，而CD3+细胞为9.95％、CD3+/CD8+细胞为6.68％和CD4+/CD25+细胞为4.12％；其他四位癌症患者的外周血单个核细胞经鸡尾酒式培养获得的自然杀伤细胞，同样流式细胞仪检测后CD56+/CD16+表型均大于80％，CD3+细胞低于10％。
5.一种鸡尾酒式制备自体自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)200ml淋巴细胞分离液；
(2)500ml淋巴细胞无血清培养基；
(3)鸡尾酒式培养试剂：10ng-50ng/ml重组人白介素15、10ng-50ng/ml重组人白介素18、10ng-50ng/ml重组人白介素21、10ng-50ng/ml重组人白介素12、10ng-50ng/ml重组人白介素7以及10ng-50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子A六种细胞因子；
(4)50-500活性单位/mL重组人白介素2；
(5)100ml生理盐水；
(6)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括权利要求1-4任一项所述的方法。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述鸡尾酒式培养试剂，自然杀伤细胞在24孔细胞培养板、12孔细胞培养板或6孔细胞培养板中连续培养5天以上。
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