CN107446888B - Nk细胞培养基、培养方法及二者的应用 - Google Patents

Nk细胞培养基、培养方法及二者的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种NK细胞培养基、培养方法及二者的应用，涉及细胞培养技术领域，本发明提供的一组细胞培养基，包括第一培养基、第二培养基和第三培养基，每种培养基包括无血清基础培养基和细胞因子。其中，利用无血清基础培养基可以避免引入外源性物质，降低污染风险，同时，多种细胞因子能够使NK细胞受到信号刺激，活化NK细胞，促进其大量扩增。本发明提供的细胞培养方法，简单高效、成本低、短周期内可大量扩增高质量高纯度的NK细胞，对于临床治疗至关重要。

Description

NK细胞培养基、培养方法及二者的应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种NK细胞培养基、培养方法及二者的应用。
背景技术
自然杀伤细胞(Nature Killer cells,NK)是机体固有免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，存在于淋巴器官和外周组织中，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等功能，其无需抗原预先致敏就可以直接识别，并且非特异性地杀伤肿瘤细胞，是人体防御体系的第一道屏障。
NK细胞具有以下特点：1)强大的细胞毒活性，它对刺激因素产生的应答十分迅速，而且免疫应答强度高；2)杀伤活性无需抗原刺激，也不受MHC分子的限制，病毒感染或恶性转化细胞的MHCⅠ类分子表达下降或消失，借这一机制逃避T细胞识别，但又可能使NK细胞处于失活状态，从而与T细胞应答互为补充发挥免疫防御功能。3)强大的细胞因子/趋化因子分泌功能，有助于启动和活化其他免疫细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞和内皮细胞等)的应答。
NK细胞抗肿瘤免疫的主要机制包括：1)释放包含穿孔素和颗粒酶的胞浆颗粒引起靶细胞凋亡，从而清除突变肿瘤细胞；2)死亡受体介导靶细胞凋亡，NK细胞表达至少3种TNF超家族死亡配体：Fas配体(Fas ligand,FasL)、TNF和TNF相关凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis inducing ligand,TRAIL)，通过与肿瘤细胞表面相应死亡受体结合而将其杀伤；3)细胞因子介导的杀伤作用，如INF-γ、TNF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、IL-5、IL-10、IL-13等；4)发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)主要通过其膜表面低亲和力的FcγRⅢ(CD16)介导。
NK细胞在固有免疫和适应性免疫中均发挥重要作用，被认为是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。但NK细胞是淋巴细胞中的稀有亚群，在外周血淋巴细胞中约只占10％-20％。正常人体外周血中的NK细胞含量远不能满足临床治疗的需要。因此，获得纯度高、扩增效率高、细胞毒性强的NK细胞已成为研究热点。
目前NK细胞的培养方法主要包括以下几种：
(1)使用饲养层细胞培养法，如使用病毒转染的B淋巴细胞或肿瘤细胞，以提高NK细胞扩增倍数；
(2)细胞因子刺激法，单独使用或组合使用不同细胞因子，刺激外周血单个核细胞，以获得纯度高、扩增效率高、细胞毒性强的NK细胞；
(3)免疫磁珠分选系统阴性分选法，从外周血单个核细胞中获得少量NK细胞后，应用不同细胞因子组合培养，以获得纯度高、扩增效率高、细胞毒性强的NK细胞；
(4)NK细胞分离试剂盒法，使用商品化试剂盒进行NK细胞培养。
然而，采用病毒转染的B淋巴细胞及肿瘤细胞作为饲养层细胞以提高NK细胞扩增倍数的方法，生产工艺繁琐且安全性尚待探讨；采用免疫磁珠分选系统阴性分选法进行NK细胞培养，生产成本较高；尽管目前已出现了分离纯度可达90％以上的商品化NK细胞分离试剂盒，但因高纯度的NK细胞在体外扩增效率很低，尚难满足大规模实验以及临床肿瘤免疫治疗的需求。目前大多数NK细胞培养方法均难以同时满足细胞纯度高、细胞毒性强、扩增倍数高等要求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一组细胞培养基，本发明的第二个目的在于提供一种细胞培养方法，本发明的第三个目的在于提供上述细胞培养基或细胞培养方法在培养NK细胞中的应用，以缓解现有技术中存在的NK细胞扩增倍数低，纯度不高、技术操作复杂、生产成本高的技术问题。
本发明提供了一组细胞培养基，所述细胞培养基包括：
第一培养基、第二培养基和第三培养基；
所述第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；
所述第二培养基包括第二基础培养基和第一细胞因子；
所述第三培养基包括第二基础培养基和第二细胞因子；
其中，所述第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；
所述第一基础培养基包括X-VIVO 15和AlyS505NK-AC；
所述第二基础培养基包括AIM-V；
所述第一细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-15和白细胞介素-21；
所述第二细胞因子为白细胞介素-2和白细胞介素-15。
进一步地，所述第一基础培养基中X-VIVO 15和AlyS505NK-AC的体积比为1:2-2:1。
进一步地，在所述第一培养基或第二培养基中，所述白细胞介素-2、白细胞介素-15和白细胞介素-21的终浓度依次为500-1500IU/mL、10-30ng/mL和5-15ng/mL。
进一步地，在所述第三培养基中，所述白细胞介素-2和白细胞介素-15的终浓度依次为500-1500IU/mL和10-30ng/mL。
进一步地，所述第一培养基和第二培养基还包括自体血浆。
本发明还提供了一种细胞培养方法，应用上述的细胞培养基进行培养。
进一步地，所述细胞培养方法包括：
将细胞接种于抗体包被后的培养容器中，并使用第一培养基进行培养，在第一培养阶段每隔一个补液周期补充第二培养基；在第二培养阶段每隔一个补液周期补充第三培养基；
所述第一培养阶段为接种后0-7天，所述第二培养阶段为接种后8-20天。
进一步地，所述抗体为Lymactin-NK抗体。
进一步地，所述补液周期为2-4天。
另外，本发明还提供了上述的细胞培养基或上述的细胞培养方法在培养NK细胞中的应用。
本发明提供的一组细胞培养基，包括第一培养基、第二培养基和第三培养基，每种培养基包括无血清基础培养基和细胞因子。其中，利用无血清基础培养基可以避免引入外源性物质，降低污染风险，同时，多种细胞因子能够使NK细胞受到信号刺激，活化NK细胞，促进其大量扩增。本发明提供的细胞培养方法，简单高效、成本低、短周期内可大量扩增高质量高纯度的NK细胞，对于临床治疗至关重要。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的NK细胞培养的流程图；
图2为本发明实施例2提供的NK细胞扩增倍数结果图；
图3A为本发明实施例3提供的NK细胞中CD4+CD25+细胞占比的流式结果图；
图3B为本发明实施例3提供的NK细胞中CD3-CD56+细胞占比的流式结果图；
图3C为本发明实施例3提供的NK细胞中CD3-CD16+细胞占比的流式结果图；
图3D为本发明实施例3提供的NK细胞中CD16+CD56+细胞占比的流式结果图；
图3E为本发明实施例3提供的NK细胞中CD3-NKG2D+细胞占比的流式结果图；
图4为本发明实施例4提供的NK细胞杀伤效果结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一组细胞培养基，包括：
第一培养基、第二培养基和第三培养基；
第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；
第二培养基包括第二基础培养基和第一细胞因子；
第三培养基包括第二基础培养基和第二细胞因子；
其中，第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；
第一基础培养基包括X-VIVO 15和AlyS505NK-AC；
第二基础培养基包括AIM-V；
第一细胞因子为白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素-15和(interleukin-15，IL-15)白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)；
第二细胞因子为白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)和白细胞介素-15(interleukin-15，IL-15)。
在本发明中，第一基础培养基中X-VIVO 15和AlyS505NK-AC的体积比例如可以为，但不限于1:2，3:4，1:1，4:3或2:1。
在一个优选的实施方式中，X-VIVO 15和AlyS505NK-AC的体积比1:1。
在本发明中，在第一培养基或第二培养基中，IL-2的终浓度例如可以为，但不限于500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、1000IU/mL、1100IU/mL、1200IU/mL、1300IU/mL、1400IU/mL或1500IU/mL；IL-15的终浓度例如可以为，但不限于10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL或30ng/mL；IL-21的终浓度例如可以为，但不限于5ng/mL、10ng/mL、或15ng/mL。
在一个优选的实施方式中，在第一培养基或第二培养基中，IL-2、IL-15和IL-21的终浓度依次为1000IU/mL、20ng/mL和10ng/mL。
在本发明中，在第三培养基中，IL-2的终浓度例如可以为，但不限于500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、1000IU/mL、1100IU/mL、1200IU/mL、1300IU/mL、1400IU/mL或1500IU/mL；IL-15的终浓度例如可以为，但不限于10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL或30ng/mL。
在一个优选的实施方式中，在第三培养基中，IL-2和IL-15的终浓度依次为1000IU/mL和20ng/mL。
在本发明中，第一培养基和第二培养基还包括自体血浆。
其中，第一培养基与第二培养基中，自体血浆的浓度为0-5％，例如可以为，但不限于0，1％，2％，3％，4％或5％。
在一个优选的实施方式中，自体血浆的浓度为5％。
本发明提供的细胞培养基，利用无血清基础培养基可以避免引入外源性物质，降低污染风险，同时，多种细胞因子能够使NK细胞受到信号刺激，活化NK细胞，促进其大量扩增。
本发明还提供了一种细胞培养方法，应用上述的细胞培养基进行培养。
在本发明中，细胞培养方法包括：
将细胞接种于抗体包被后的培养容器中，并使用第一培养基进行培养，在第一培养阶段每隔一个补液周期补充第二培养基；在第二培养阶段每隔一个补液周期补充第三培养基；
其中，第一培养阶段为接种后0-7天，第二培养阶段为接种后8-20天。
在本发明中，接种的细胞为外周血单个核细胞。
在一个优选的实施方式中，接种的细胞为人源外周血单个核细胞。
在本发明中，抗体为Lymactin-NK抗体，培养容器为细胞培养瓶。
其中，Lymactin-NK抗体的包被浓度为0.3-0.9mg/mL，例如可以为，但不限于0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL或0.9mg/mL；Lymactin-NK抗体的包被温度为25-37℃，例如可以为，但不限于25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃或37℃；Lymactin-NK抗体的孵育时间为1.5-2.5h，例如可以为，但不限于1.5h、2h或2.5h。
在一个优选的实施方式中，Lymactin-NK抗体的包被浓度为0.6mg/mL；Lymactin-NK抗体的包被温度为37℃；Lymactin-NK抗体的孵育时间为2h。
在本发明中，细胞培养周期为10-20天，例如可以为，但不限于10天、12天、14天、16天、18天或20天。
补液周期为2-4天，例如可以为，但不限于2天、3天或4天。
在一个优选的实施方式中，补液周期为3天。
在本发明中，在第一培养阶段，用第一培养基重悬外周血单个核细胞，并调整细胞浓度至1.0-2.0×106/mL，每隔3天，用第二培养基进行补液，并调整细胞浓度至1.0-2.0×106/mL，至第一培养阶段结束。在第二培养阶段，每隔3天，用第三培养基进行补液，并调整细胞浓度至1.0-2.0×106/mL，至第二培养阶段结束。
其中，细胞浓度例如可以为，但不限于1.0×106/mL、1.5×106/mL或2.0×106/mL。
在一个优选的实施方式中，细胞浓度为1.5×106/mL。
另外，本发明还提供了上述的细胞培养基或上述的细胞培养方法在培养NK细胞中的应用。
本发明提供的细胞培养方法，简单高效、成本低、短周期内可大量扩增高质量高纯度的NK细胞，对于临床治疗至关重要。
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1NK细胞的培养
利用本发明提供的细胞培养基及细胞培养方法对NK细胞进行培养，培养流程如图1所示，包括如下步骤：
步骤(a)：将浓度为0.6mg/mL的Lymactin-NK抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为37℃，孵育时间为2h；
步骤(b)：采集人源外周血，将采集的外周血转移至50mL离心管中，于20℃温度下2000rmp，10min离心收集血浆备用；使用淋巴细胞分离液(corning)分离并收集外周血单个核细胞，收集后的单个核细胞用PBS清洗三次并计数，备用；
其中，使用淋巴细胞分离液分离并收集外周血单个核细胞的方法为：1、将吸取血浆后的血液样本按照1：1的比例加入PBS，混匀；2、将稀释后的血液样本缓慢加在淋巴细胞分离液面上，稀释后的血液样本与淋巴细胞分离液的比例为1：1；3、离心，转速2000rpm，时间15min，慢升慢降，离心温度为20℃。4、离心后吸取单个核细胞层细胞。
步骤(c)：取包被好的细胞培养瓶，弃去包被液，使用无血清第一基础培养基(X-VIVO 15:AlyS505NK-AC＝1:1)重悬步骤(b)提供的外周血单个核细胞，调整细胞浓度至1.5×106/mL，并接种至包被好的细胞培养瓶中；
步骤(d)：加入5％自体血浆至培养瓶中，添加第一细胞因子：IL-2(1000IU/mL)，IL-15(20ng/mL)和IL-21(10ng/mL)；
步骤(e)：细胞培养每3天进行补液，根据细胞增殖情况，使用无血清第二基础培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，补加5％自体血浆及第一细胞因子：IL-2(1000IU/mL)，IL-15(20ng/mL)，IL-21(10ng/mL)；
步骤(f)：细胞培养至第7天后，每3天进行补液，根据细胞增殖情况，使用无血清第二基础培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，补加第二细胞因子IL-2(1000IU/mL)、IL-15(20ng/mL)；
步骤(g)：细胞培养至第14天，收集细胞，PBS清洗3次，进行细胞质量检验，合格后获得大量扩增的活率高、纯度高、细胞毒性强的NK细胞，用于细胞治疗或者冻存。
实施例2细胞扩增倍数分析
分别在培养第0天、12天、14天取细胞计数，用台盼蓝染色后计数，计算扩增倍数及细胞活率，计数结果除以初始细胞数即为细胞扩增倍数。
结果分析：此方法可检测细胞的扩增情况，结果如表1和图2所示，从结果中可以看出，外周血单个核细胞经14天培养后均可扩增100倍以上，能够满足临床治疗所需数量。表1NK细胞扩增倍数结果为重复实验数据的统计结果。
表1NK细胞扩增倍数结果
培养天数(天) 0天 12天 14天
扩增倍数 1 87.33±8.83 153.09±13.35
实施例3细胞纯度分析
在培养第14天时取细胞，PBS清洗3次，洗涤后调整细胞浓度为1.5×105/mL，加入流式抗体(CD3-PE、CD4-FITC、CD16-PEcy5、CD25-APC、CD56-FITC、NKG2D-APC荧光标记单抗10μL)，4℃避光孵育30min，PBS洗涤1次，PBS重悬后使用流式细胞仪进行细胞表型检测。
结果分析：结果如表2和图3A、3B、3C、3D和3E所示，从结果中可以看出，细胞表型为CD3-CD56+、CD3-CD16+、CD3-NKG2D+、CD16+CD56+的细胞比例均大于70％，其中，CD3-CD56+细胞占比：79.98％，CD3-CD16+细胞占比：79.49％，CD16+CD56+细胞占比：85.40％，CD3-NKG2D+细胞占比：82.47％。细胞表型为CD4+CD25+的细胞比例均小于10％，为8.08％。表明本发明实施例1提供的NK细胞纯度高。表2流式结果为重复实验数据的统计结果，图3A、3B、3C、3D和3E为其中一次实验结果图。
表2 NK细胞流式结果
细胞表型 CD3-CD56+ CD3-CD16+ CD3-NKG2D+ CD16+CD56+ CD4+CD25+
占比(％) 75.32±4.68 75.96±3.66 79.21±3.13 85.18±0.76 6.71±1.23
实施例4细胞毒性分析
取培养至14天的细胞，用RPMI1640培养基重悬细胞为1×106/mL细胞悬液备用；
使用K562细胞作为靶细胞，使用含2％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞为1×105/mL细胞悬液备用；
均按照效靶比为1：1、5：1、10：1接种细胞至96孔板中，设置效应细胞孔和靶细胞孔，每种培养方法接3个副孔，37℃，5％CO2培养24h；使用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率，结果如表3和图4所示。从结果中可以看出，本发明实施例1提供的NK细胞杀伤效果明显。表3NK细胞杀伤效果为重复实验数据的统计结果。
表3 NK细胞杀伤效果
效靶比 1：1 5：1 10：1
杀瘤率(％) 20.47±4.80 65.08±6.95 80.91±4.27
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，所述NK细胞的培养方法为如下步骤：
(a)：将浓度为0.6mg/mL的Lymactin-NK抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为37℃，孵育时间为2h；
(b)：采集人源外周血，将采集的外周血转移至50mL离心管中，于20℃温度下2000rmp，10min离心收集血浆备用；使用淋巴细胞分离液分离并收集外周血单个核细胞，收集后的单个核细胞用PBS清洗三次并计数，备用；
(c)：取包被好的细胞培养瓶，弃去包被液，使用无血清第一基础培养基重悬步骤(b)提供的外周血单个核细胞，调整细胞浓度至1.5×106/mL，并接种至包被好的细胞培养瓶中；
(d)：加入5％自体血浆至培养瓶中，添加第一细胞因子；
(e)：细胞培养每3天进行补液，使用无血清第二基础培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，补加5％自体血浆及第一细胞因子；
(f)：细胞培养至第7天后，每3天进行补液，使用无血清第二基础培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，补加第二细胞因子；
(g)：细胞培养至第14天，收集细胞，PBS清洗3次，得到NK细胞；
其中，所述第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；
所述第一基础培养基为X-VIVO 15和AlyS505NK-AC；
所述第二基础培养基为AIM-V；
所述第一细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-15和白细胞介素-21；
所述第一细胞因子的加入量为白细胞介素-2 1000IU/mL、白细胞介素-15 20ng/mL和白细胞介素-21 10ng/mL；
所述第二细胞因子为白细胞介素-2和白细胞介素-15；
所述第二细胞因子的加入量为白细胞介素-2 1000IU/mL和白细胞介素-15 20ng/mL。
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