CN107488630B - 自然杀伤性t细胞培养基质及自然杀伤性t细胞的扩增培养方法 - Google Patents

自然杀伤性t细胞培养基质及自然杀伤性t细胞的扩增培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种自然杀伤性T细胞培养基质及自然杀伤性T细胞的扩增培养方法，涉及细胞培养技术领域。本发明自然杀伤性T细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子IL‑2组成。在应用该细胞培养基质的自然杀伤性T细胞的扩增培养方法中，采用抗体联合细胞因子IL‑2诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，进而激活自然杀伤性T细胞。该方法可以在保证安全性的前提下，在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤性T细胞，有效缓解了现有自然杀伤性T细胞培养方法中采用异源动物血清或肿瘤细胞进行培养所带来的潜在安全性风险，以及现有自然杀伤性T细胞培养方法扩增倍数低，纯度不高难以大规模应用的问题。

Description

自然杀伤性T细胞培养基质及自然杀伤性T细胞的扩增培养 方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种自然杀伤性T细胞培养基质及自然杀伤性T细胞的扩增培养方法。
背景技术
自然杀伤性T细胞(nature killer T cells，NKT细胞)是一群细胞表面既有T细胞受体(TCR)又有NK细胞受体的淋巴细胞亚群。自然杀伤性T细胞的分布与自然杀伤性细胞分布相似，也具有组织特异性，在各组织，如肝脏、骨骼、脾脏、淋巴结、外周血、肺脏和胸腺中所占比例各不相同。自然杀伤性T细胞表面的TCR可以识别由胸腺细胞表面的CD1d分子所提呈的糖脂类抗原，并能够分泌大量细胞因子，参与机体的先天性免疫和适应性免疫。因此，自然杀伤性T细胞在抗病毒免疫、肿瘤免疫，以及自身免疫疾病中发挥着重要作用。体外实验及肿瘤动物模型的研究显示，CD3+CD56+自然杀伤性T细胞可通过发挥细胞毒效应杀伤肿瘤细胞，尤其是在血液性肿瘤中，如非霍奇金氏淋巴瘤、白血病等。CD3+CD56+自然杀伤性T细胞具有高增殖能力，高细胞杀伤毒性，广泛的肿瘤杀伤作用，对正常骨髓造血影响小的特点，因此，CD3+CD56+自然杀伤性T细胞治疗被认为是新一代过继免疫治疗的有效方法。
目前现有自然杀伤性T细胞的培养方法主要是使用含有胎牛血清及多种细胞因子混合的培养基扩增培养，或者采用肿瘤细胞与多种细胞因子刺激人源外周血单个核细胞活化增殖为自然杀伤性T细胞的方法。
但上述这些培养方法都具有一定程度的缺点，其中，采用胎牛血清进行培养的方法由于胎牛血清为动物源血清，可能会引入外源性病毒和支原体，存在一定的安全隐患；而采用肿瘤细胞进行培养的方法也存在一定的安全性问题；且上述方法培养得到的自然杀伤性T细胞扩增数量不足，自然杀伤性T细胞比例低，不能够满足临床治疗的需求。
因此，研究开发一种在保证安全性的前提下，可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤性T细胞的细胞培养基质和细胞培养方法，进而获得纯度高，细胞毒性强的自然杀伤性T细胞，变得十分的必要与紧迫。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种自然杀伤性T细胞培养基质，该培养基质使用无血清培养基对自然杀伤性T细胞进行培养避免了现有技术中应用异源动物血清或肿瘤细胞对自然杀伤性T细胞进行培养所带来的潜在安全性风险。所述培养基质能够在保证安全性的前提下，大量高效的将人源外周血单个核细胞诱导培养为自然杀伤性T细胞。
本发明的第二目的在于提供一种自然杀伤性T细胞的扩增培养方法，该方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤性T细胞，同时，该方法得到自然杀伤性T细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点，有效缓解了现有自然杀伤性T细胞培养方法中采用异源动物血清或肿瘤细胞对自然杀伤性T细胞进行培养所带来的潜在安全性风险，以及现有自然杀伤性T细胞培养方法扩增倍数低，纯度不高难以大规模应用的问题。
本发明提供的一种自然杀伤性T细胞培养基质，上述培养基质主要由以下成分组成：无血清培养基、自体血浆和细胞因子IL-2；
所述无血清培养基包括初期培养基和补液培养基。
进一步的，所述初期培养基为X-VIVO 15培养基，所述补液培养基为AIM-V培养基。
进一步的，自体血浆在自然杀伤性T细胞培养基质中的浓度为0～5％。
进一步的，上述细胞因子IL-2在自然杀伤性T细胞培养基质中的浓度为500～1500IU/mL。
更进一步的，细胞因子IL-2在自然杀伤性T细胞培养基质中的浓度为1000IU/mL。
本发明提供的一种自然杀伤性T细胞的扩增培养方法，所述方法包括：使用上述的细胞培养基质在CD16抗体包被后的细胞培养瓶中诱导培养人源外周血单个核细胞，得到自然杀伤性T细胞。
优选的，所述诱导培养具体包括以下步骤：
步骤1：使用初期培养基在抗体包被后的细胞培养瓶中诱导培养人源外周血单个核细胞10～20天；
步骤2：在步骤1培养过程中，每2～4天用补液培养基进行补液，并补加自体血浆和/或细胞因子IL-2。
进一步的，上述CD16抗体的浓度为30～80ng/mL。
更进一步的，CD16抗体的浓度为50ng/mL。
进一步的，上述诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL；
更进一步的，诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.5×106/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的自然杀伤性T细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子IL-2组成。该培养基质使用无血清培养基对自然杀伤性T细胞进行培养避免了现有技术中应用异源动物血清或肿瘤细胞对自然杀伤性T细胞进行培养所带来的潜在安全性风险。同时，IL-2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，广泛应用于促进自然杀伤性T细胞的活化和增殖。因此，该培养基质在保证安全性的前提下，可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤性T细胞。
本发明提供的自然杀伤性T细胞的扩增培养方法，该扩增培养方法中抗体联合上述细胞培养基质中的细胞因子IL-2诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，间接通过抗体激活自然杀伤性T细胞。上述方法可以在保证安全性的前提下，在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤性T细胞。同时，该方法得到自然杀伤性T细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点，有效缓解了现有自然杀伤性T细胞培养方法中采用异源动物血清或肿瘤细胞对自然杀伤性T细胞进行培养所带来的潜在安全性风险，以及现有自然杀伤性T细胞培养方法扩增倍数低，纯度不高难以大规模应用的问题。
附图说明
图1为本发明实施例4提供的自然杀伤性T细胞扩增倍数结果图；
图2为本发明实施例5提供的自然杀伤性T细胞培养流式结果图；
图3为本发明实施例6提供的自然杀伤性T细胞杀伤效果结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种自然杀伤性T细胞培养基质，上述培养基质主要由以下成分组成：无血清培养基、自体血浆和细胞因子IL-2；
所述无血清培养基包括初期培养基和补液培养基。
本发明自然杀伤性T细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子IL-2组成。该培养基质使用无血清培养基对自然杀伤性T细胞进行培养避免了现有技术中应用异源动物血清或肿瘤细胞对自然杀伤性T细胞进行培养所带来的潜在安全性风险。同时，IL-2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，广泛应用于促进自然杀伤性T细胞的活化和增殖。因此，该培养基质在保证安全性的前提下，可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤性T细胞的细胞培养基质和细胞培养方法，进而获得纯度高，细胞毒性强的自然杀伤性T细胞。
本发明中，所述初期培养基指在诱导培养开始时使用的初始培养基；所述补液培养基指在自然杀伤性T细胞培养过程中为调节细胞密度和提供营养所使用的培养基。
在本发明的一种优选实施方式中，所述初期培养基为X-VIVO 15培养基，所述补液培养基为AIM-V培养基。
在本发明的一种优选实施方式中，自体血浆在自然杀伤性T细胞培养基质中的浓度为0～5％。
在本发明的一种优选实施方式中，上述细胞因子IL-2在自然杀伤性T细胞培养基质中的浓度为500～1500IU/mL。
本发明中，IL-2细胞因子在自然杀伤性T细胞培养基质中典型但非限制性的浓度为：500IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、1000IU/mL、1100IU/mL、1200IU/mL或1500IU/mL。
在上述优选实施方式中，细胞因子IL-2在自然杀伤性T细胞培养基质中的浓度为1000IU/mL。
根据本发明的一个方面，一种自然杀伤性T细胞的扩增培养方法，所述方法包括：使用上述的细胞培养基质在CD16抗体包被后的细胞培养瓶中诱导培养人源外周血单个核细胞，得到自然杀伤性T细胞；
优选的，所述诱导培养具体包括以下步骤：
步骤1：使用初期培养基在CD16抗体包被后的细胞培养瓶中诱导培养人源外周血单个核细胞10～20天；
步骤2：在步骤1培养过程中，每2～4天用补液培养基进行补液，并补加自体血浆和/或细胞因子IL-2。
本发明自然杀伤性T细胞的扩增培养方法，该扩增培养方法中CD16抗体联合上述细胞培养基质中的细胞因子IL-2诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，间接通过抗体激活自然杀伤性T细胞。上述方法可以在保证安全性的前提下，在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤性T细胞。同时，该方法得到自然杀伤性T细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点。
在本发明的一种优选实施方式中，上述CD16抗体的浓度为30～80ng/mL。
本发明中，CD16抗体典型但非限制性的浓度为：30mg/mL、50mg/mL或80mg/mL。
在上述优选实施方式中，CD16抗体的浓度为50ng/mL。
在本发明的一种优选实施方式中，上述诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL；
本发明中，诱导培养过程中培养基质中的细胞密度典型但非限制性的为：1.0×106/mL、1.5×106/mL或2.0×106/mL。
在上述优选实施方式中，诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.5×106/mL。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1：CD16抗体抗体包被
将浓度为50ng/mL的CD16抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为37℃，孵育时间为2h，得到包被后的细胞培养瓶。
实施例2：制备自体血浆和人源外周血单个核细胞
采集外周血，将采集的外周血转移至50mL离心管中，在20℃的温度下2000rmp离心10分钟收集自体血浆；随后使用淋巴细胞分离液分离并收集人源外周血单个核细胞，将收集到的人源外周血单个核细胞用PBS缓冲液清洗三次，得到人源外周血单个核细胞；
其中，上述使用淋巴细胞分离液分离人源外周血单个核细胞的方法包括以下步骤：
1、将吸取血浆后的血液样本按照1：1的比例加入PBS，混匀；
2、将稀释后的血液样本缓慢加在淋巴细胞分离液面上，稀释后的血液样本与淋巴细胞分离液的比例为1：1；
3、离心，转速2000rpm，时间15min，慢升慢降，离心温度为20℃。
4、离心后吸取单个核细胞层细胞。
实施例3：诱导培养
步骤1：使用X-VIVO 15无血清培养基重悬实施例2得到的人源外周血单个核细胞，并将培养基中的细胞浓度调整至1.5×106/mL，随后接种至实施例1得到的包被有CD16抗体的细胞培养瓶中；
步骤2：将实施例2中得到的自体血浆加入上述步骤1细胞培养瓶中，自体血浆在自然杀伤性T细胞培养基质中的浓度为5％，并添加细胞因子IL-2(1000IU/mL)，随后进行诱导培养14天；
步骤3：在诱导培养过程中前7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，并补加自体血浆和细胞因子IL-2；在诱导培养过程中后7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，并补加细胞因子IL-2；
步骤4：在诱导培养14天时收集自然杀伤性T细胞，将收集到的自然杀伤性T细胞用PBS缓冲液清洗3次，得到自然杀伤性T细胞。
实施例4细胞扩增倍数分析
分别在培养第0天和14天取细胞计数，用台盼蓝染色后计数，计算扩增倍数及细胞活率，计数结果除以初始细胞数即为细胞扩增倍数。
结果分析：此方法可检测细胞的扩增情况，结果如下表和图1所示，人源外周血单个核细胞经14天培养后均可扩增50倍以上，能够满足临床治疗所需数量。表中自然杀伤性T细胞扩增倍数结果为重复实验数据的统计结果。
培养天数(天) 0天 14天
扩增倍数 1 77.16±10.03
实施例5细胞纯度分析
在培养第14天时取细胞，PBS缓冲液清洗3次，洗涤后调整细胞浓度为1.5×105/mL，加入流式抗体，上述流式抗体具体为CD3-PE、CD4-FITC、CD16-PEcy5、CD25-APC、CD56-FITC、NKG2D-APC荧光标记单抗10μL，随后4℃避光孵育30min，PBS洗涤1次，PBS重悬后使用流式细胞仪进行细胞表型检测，其结果如图2所示。
所述图2中A为CD3+NKG2D+细胞占比:92.02％；B为CD3+CD56+细胞占比:70.55％；C为CD3+CD16+细胞占比:74.58％；D为CD4+CD25+细胞占比:0.98％。
结果分析：结果如下表所示，细胞表型为CD3-CD56+、CD3-CD16+、CD3-NKG2D+的细胞比例均大于50％，细胞表型为CD4+CD25+的细胞比例均小于5％，表明自然杀伤性T细胞纯度高，表中流式结果为重复实验数据的统计结果。图2为其中一次实验结果图。
实施例6细胞毒性分析
取培养至14天的细胞，用RPMI1640培养基重悬细胞为1×106/mL细胞悬液备用；
使用K562细胞作为靶细胞，使用含2％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞为1×105/mL细胞悬液备用；
均按照效靶比为5：1、10：1、20：1接种细胞至96孔板中，设置效应细胞孔和靶细胞孔，每种培养方法接3个副孔，37℃，5％CO2培养24h；使用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率，结果如下表和图3所示。表中自然杀伤性T细胞杀伤效果为重复实验数据的统计结果。
结果分析：培养的NK细胞杀伤效果明显。
效靶比 5:1 10:1 20:1
杀瘤率(％) 22.62±4.79 42.42±5.69 63.94±6.03
综合上述分析可知，本发明提供的自然杀伤性T细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子IL-2组成。该培养基质使用无血清培养基对自然杀伤性T细胞进行培养避免了现有技术中应用异源动物血清或肿瘤细胞对自然杀伤性T细胞进行培养所带来的潜在安全性风险。同时，IL-2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，广泛应用于促进自然杀伤性T细胞的活化和增殖。因此，该培养基质在保证安全性的前提下，可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤性T细胞。
在应用该细胞培养基质的自然杀伤性T细胞的扩增培养方法中，CD16抗体联合上述细胞培养基质中的细胞因子IL-2诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，间接通过抗体激活自然杀伤性T细胞。上述方法可以在保证安全性的前提下，在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤性T细胞。同时，该方法得到自然杀伤性T细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点，有效缓解了现有自然杀伤性T细胞培养方法中采用异源动物血清或肿瘤细胞对自然杀伤性T细胞进行培养所带来的潜在安全性风险，以及现有自然杀伤性T细胞培养方法扩增倍数低，纯度不高难以大规模应用的问题。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.一种自然杀伤性T细胞的培养方法，其特征在于，所述方法由以下步骤组成：
步骤1：使用X-VIVO 15无血清培养基重悬人源外周血单个核细胞，并将培养基中的细胞浓度调整至1.5×106/mL，随后接种至包被有CD16抗体的细胞培养瓶中；
步骤2：将自体血浆加入上述步骤1细胞培养瓶中，自体血浆在自然杀伤性T细胞培养基质中的浓度为5％，并添加细胞因子IL-2 1000IU/mL，随后进行诱导培养14天；
步骤3：在诱导培养过程中前7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，并补加自体血浆和细胞因子IL-2；在诱导培养过程中后7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，并补加细胞因子IL-2；
步骤4：在诱导培养14天时收集自然杀伤性T细胞，将收集到的自然杀伤性T细胞用PBS缓冲液清洗3次，得到自然杀伤性T细胞。
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Expansion of cytotoxic natural killer cells using irradiated autologous peripheral blood mononuclear cells and anti-CD16 antibody;Hong-Rae Lee et al.;《SCIENTIFIC REPORTS》;20170911;第7卷;第11075页 *

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CN107488630A (zh) 2017-12-19

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