CN110283786A - 一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，步骤如下：a.取新鲜人外周血，利用梯度离心方法获得单个核细胞；b.在体外培养基中，预刺激单个核细胞；c.扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；d.培养3‑4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；e.进一步纯化NK/NKT细胞。本发明操作简单，获得富含高杀伤活性的NKT细胞的NK细胞群体，该群体不含杂质细胞，避免了杂质细胞导致的免疫原性，临床应用副作用较小。同时具有取材容易来源广泛、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，比较适宜肿瘤患者的辅助治疗。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体是一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法。
背景技术
肿瘤免疫治疗是一种新型的肿瘤治疗模式，它运用细胞因子诱导、抗原诱导、基因改造等多种方法激活免疫细胞，通过这些细胞的激活从而达到肿瘤治疗的目的。肿瘤免疫治疗在恶性肿瘤治疗方面取得了很大的成效，已成为继手术、放疗、化疗三大治疗手段之后的第四种肿瘤治疗方法。从20世纪90年代开始，随着对机体免疫系统的深入了解，肿瘤免疫治疗取得飞速进展，如免疫检验抗体、肿瘤疫苗和嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)等都在肿瘤治疗领域展现出很好的应用前景。肿瘤免疫治疗的核心是激活肿瘤患者T淋巴细胞(简称T细胞)的抗肿瘤反应，以提高其对肿瘤细胞的杀灭功能。T细胞对肿瘤细胞有明确的靶向性和特异性，能通过识别并聚集到肿瘤抗原表达的部位而产生长程免疫应答反应，直接抑制和杀伤肿瘤细胞。自然杀伤性T细胞（nature killer T cell，NKT）是一群同时表达T细胞表面标志（CD3）和NK细胞表面标志（CD56）的特殊T细胞群体。NKT细胞通过TCR识别CD1d/脂抗原后，迅速分泌细胞因子，包括IL-4、IL-10和IFN-r等，同时NKT细胞也可以分泌NK细胞特有的穿孔素或通过Fas/FasL杀伤靶细胞。NKT细胞因不需活化即具有细胞毒作用，且抗瘤谱较广而被广泛研究，体外实验证实NKT细胞对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。然而由于体内NKT的数量很低，限制了NKT细胞在临床中的应用。研究表明，NKT细胞表面有抑制性受体及活化性受体，通过调节其受体的表达可影响NKT细胞的杀伤活性。因此，如何提高NKT细胞体外扩增效率以及杀伤活性，提高NKT细胞对肿瘤细胞表面抗原的识别，成为解决过继免疫治疗效果的关键问题。
肿瘤患者及肿瘤术后患者体内免疫细胞的数量及活性都发生了一定的改变。肿瘤的发生、发展及转移与免疫细胞的抗肿瘤免疫功能被抑制有密切的联系。因此，通过扩增免疫细胞数量、提高免疫细胞活性，可以增强其抗肿瘤效果。NKT细胞作为机体固有免疫系统中重要的组成部分，在肿瘤免疫方面发挥重要作用。目前，NKT细胞体外诱导激活以及扩增方法尚不成熟，使得NKT细胞过继免疫治疗在临床上运用具有很大的局限性。为了更好地将NKT细胞肿瘤免疫治疗用于临床，进一步改善肿瘤患者免疫抑制的状态，在进一步研究NKT细胞抗肿瘤的机制的同时，还要了解肿瘤患者免疫抑制的机理及增强NKT细胞活性的方法，从根本上解决肿瘤患者免疫抑制的问题，为细胞免疫治疗的临床运用提供可靠的理论依据，从而为肿瘤的免疫治疗提供有效的方法。
虽然以NK细胞为基础的机体固有免疫疗法在恶性肿瘤的治疗中取得了很大进展，但如何实现同时激活T细胞免疫应答和激活机体固有免疫应答的治疗方法知之甚少。NKT细胞具备了T细胞免疫活性及NK细胞细胞毒性的双重特性。然而，NKT细胞体内含量极低，体外不易扩增获得，这大大限制了NKT细胞的临床应用。因此，在未来肿瘤免疫疗法的研究中，需要探索体外扩增NKT细胞的新实验方法，找到具有更好的抗肿瘤活性的NKT细胞，提高NKT细胞的靶向性来改善肿瘤患者的预后，延长生存时间，提高生活质量，达到更好的治疗癌症的目的。
发明内容
本发明就是为了解决现有技术的不足，提供一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，包括以下步骤：
a.取新鲜人外周血，利用梯度离心方法获得单个核细胞；
b.在体外培养基中，预刺激单个核细胞；
c.扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；
d.培养3-4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；
e.进一步纯化NK/NKT细胞。
进一步的，一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，包括以下步骤：
a.取新鲜人外周血，加入羟乙基淀粉，室温放置1-1.5h，留取上清液；
将上清液加入到与上清液等体积的淋巴细胞分离液中，离心1800rpm，30℃，15-20分钟；上清液为血清，中间层为淋巴细胞层，分别留取上清液和中间层；
b.向淋巴细胞中加入PBS混匀，1800rpm 离心10-15分钟，收集沉淀，用NK/NKT细胞培养基重悬，计数；
将上述细胞平分为两份，一份加入NK/NKT细胞培养基，另一份加入含4-1BB-L因子的NK/NKT细胞培养基；细胞接种于NK细胞包被液包被过的培养瓶中，37℃，5%CO2，孵育培养；
c. 扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；
d.培养3-4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；
e. 进一步纯化NK/NKT细胞。
进一步的，步骤a中外周血与羟乙基淀粉的比例为5:1。
进一步的，步骤b中NK/NKT细胞培养基的配置方法为向细胞培养基中加入细胞激活剂和自体血清，配置成含5%自体血清的培养基，过滤后待使用；所述细胞培养基与细胞激活剂的加入比例为1000:1。
进一步的，所述自体血清为步骤a中加入淋巴细胞分离液后，离心获得的上清液。
进一步的，所获得的自然杀伤性T细胞同时具备CD45抗原表位，CD56抗原表位，CD3抗原表位；NK细胞表面同时具备CD45抗原表位，CD56抗原表位，不具备CD3抗原表位。获得的细胞群体中CD56+细胞含量大于98%，CD3+CD56+细胞含量大于14%。
进一步的，所获得的自然杀伤性T细胞具有强烈的杀伤肿瘤细胞能力。
进一步的，所获得的自然杀伤性T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种高杀伤力的自然杀伤性T细胞，所述自然杀伤性T细胞由上述任一所述的高效体外扩增培养方法获得。
一种高杀伤力的自然杀伤性T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，其所述自然杀伤性T细胞由上述任一所述的高效体外扩增培养方法获得。
本发明获得了如下的有益效果。
本发明方法具有原料取材容易，制备方法简单易行，生产效率高的特点，且培养获得的NKT细胞具有效应细胞纯度高，免疫源性低，杀伤肿瘤细胞能力强等优点，在抗击肿瘤方面具有较大潜能和应用价值。
附图说明
图1是本发明体外培养外周血0周流式检测外周血中各类细胞扩增情况图；
图2是本发明体外培养外周血1周流式检测外周血中各类细胞扩增情况图；
图3是本发明体外培养外周血2周流式检测外周血中各类细胞扩增情况图；
图4是本发明体外培养外周血3周流式检测外周血中各类细胞扩增情况图；
图5是本发明5ml外周血体外培养0-3周NKT细胞扩增情况图；
图6是本发明NK/NKT细胞杀伤白血病细胞效率图；
图7是本发明流式检测NK/NKT细胞杀伤白血病细胞效率图；
图8是本发明NK/NKT细胞杀伤白血病细胞情况图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：获得人外周血白细胞
取5ml新鲜人外周血，加入羟乙基淀粉（外周血：羟乙基淀粉=5:1），室温放置1h。取上清（白细胞层），除去下层红细胞。
在离心管中加入与上清等体积的淋巴细胞分离液，将上清小心转移至分离液之上（轻柔操作避免打破交界液面）；离心1800rpm，30℃，15分钟；离心后溶液分层，上清为血清，吸取后转移至新离心管（备用）；中间为白膜层（即淋巴细胞层），吸取后转移至新离心管中。
实施例2：预激活淋巴细胞
配置NK/NKT细胞培养基：细胞培养基（达科为，货号DKW37-NKP001，主要成分：氨基酸，葡萄糖，叶酸，酚红等），按比例加入细胞激活剂（达科为，货号DKW37-NKP001，培养基1L:细胞激活剂1ml），同时加入自体血清（实施例1），配置成含5%自体血清的培养基，过滤后待使用。
向淋巴细胞（实施例1）中加入PBS混匀，1800 rpm 离心10分钟，收集沉淀，用配好的NK/NKT细胞培养基重悬白膜细胞，计数，约5ml新鲜外周血总共可以获得6.2×106白细胞。
将上述白细胞6.2×106个，平分为两份，一份加入2ml 5%自体血清的培养基，另一份加入2ml含4-1BB-L因子的5%自体血清的培养基，细胞浓度为1.5×106/ml。细胞接种于NK细胞包被液（达科为，货号DKW37-NKP001）包被过的培养瓶中，37℃，5%CO2，孵育培养。
实施例3：测定外周血中NK细胞以及NKT细胞浓度
取上述1×105白细胞，加入50ul PBS混匀，加入1ul Antibody-human CD45（APC-Cy7），Antibody-CD56(PE-CY7)，Antibody-CD16(PE)（购自BD公司）混匀,室温孵育30分钟后，用PBS清洗一次，300ul PBS重悬，流式分析仪检测各类细胞比例。
取上述1×105白细胞，加入50ul PBS混匀，加入1ul Antibody-human CD45（APC-Cy7），Antibody-CD33(Percp-cy5.5)，Antibody-CD3(APC)，Antibody-CD19(FITC)（购自BD公司）混匀,室温孵育30分钟后，用PBS清洗一次，300ul PBS重悬，流式分析仪检测各类细胞比例。
表1 5ml外周血中各类细胞情况
备注：CD45为白细胞表面标志物，CD56/CD16为NK细胞表面标志物,CD33为髓系细胞表面标志物，CD3位T细胞表面标志物，CD19位B细胞表面标志物。
实施例4：培养一周后，扩大培养
收集培养瓶内细胞至15ml离心管，1200 rpm 离心10分钟，收集沉淀，去除死细胞。用配好的PBS重悬细胞，计数。
取2×105白细胞，加入50ul PBS混匀，加入1ul Antibody-human CD45（APC-Cy7），Antibody-CD56(PE-CY7)，Antibody-CD16(PE)混匀,室温孵育30分钟后，用PBS清洗一次，300ul PBS重悬，流式分析仪检测各类细胞比例。
取2×105白细胞，加入50ul PBS混匀，加入1ul Antibody-human CD45（APC-Cy7），Antibody-CD33(Percp-cy5.5)，Antibody-CD3(APC)，Antibody-CD19(FITC)混匀,室温孵育30分钟后，用PBS清洗一次，300ul PBS重悬，流式分析仪检测各类细胞比例。
细胞分别用NKT细胞培养基和含有4-1BB-L的NKT细胞培养基重悬，细胞浓度为1×106/ml，接种于T75培养瓶中，37℃，5%CO2，孵育培养。
实施例5：培养两周后，继续扩大培养
收集培养瓶内细胞至50ml离心管，1200 rpm 离心10分钟，收集沉淀，去除死细胞。用配好的PBS重悬细胞，计数。
取2×105白细胞，加入50ul PBS混匀，加入1ul Antibody-human CD45（APC-Cy7），Antibody-CD56(PE-CY7)，Antibody-CD16(PE)混匀,室温孵育30分钟后，用PBS清洗一次，300ul PBS重悬，流式分析仪检测各类细胞比例。
取2×105白细胞，加入50ul PBS混匀，加入1ul Antibody-human CD45（APC-Cy7），Antibody-CD33(Percp-cy5.5)，Antibody-CD3(APC)，Antibody-CD19(FITC)混匀,室温孵育30分钟后，用PBS清洗一次，300ul PBS重悬，流式分析仪检测各类细胞比例。
细胞分别用NKT细胞培养基和含有4-1BB-L的NKT细胞培养基重悬，细胞浓度为1×106/ml，接种于T175培养瓶中，37℃，5%CO2，孵育培养。
实施例6：培养三周后，再次扩大培养
收集培养瓶内细胞至50ml离心管，1200 rpm 离心10分钟，收集沉淀，去除死细胞。用配好的PBS重悬细胞，计数。
取2×105白细胞，加入50ul PBS混匀，加入1ul Antibody-human CD45（APC-Cy7），Antibody-CD56(PE-CY7)，Antibody-CD16(PE)混匀,室温孵育30分钟后，用PBS清洗一次，300ul PBS重悬，流式分析仪检测各类细胞比例。
取2×105白细胞，加入50ul PBS混匀，加入1ul Antibody-human CD45（APC-Cy7），Antibody-CD33(Percp-cy5.5)，Antibody-CD3(APC)，Antibody-CD19(FITC)混匀,室温孵育30分钟后，用PBS清洗一次，300ul PBS重悬，流式分析仪检测各类细胞比例。
细胞用PBS重悬，待用。
表2 体外培养1-3周，5ml外周血中各类细胞扩增情况（%）
表3 体外培养1-3周，5ml外周血中各类细胞扩增情况（106个）
实施例7：获得高纯度NK细胞
每107细胞加入90ul PBS混匀，加入10ul CD56 Micro Beads（购自BD公司），混匀，4–8℃，15min。每107细胞加入1-2ml PBS，1500rpm，4℃离心5min,弃上清，用PBS重悬。将LS柱子（购自MACS公司）安装到磁铁上，加入3ml PBS，重力作用自然流尽。将细胞液加入到柱子中，用3ml PBS洗脱三次。利用LS柱子活塞，推出结合在磁珠上的细胞，为纯化的CD56+NK细胞。使用无血清细胞冻存液冻存于液氮中。
实施例8：富含NKT细胞的细胞群体功能检测
NK细胞杀伤肿瘤细胞效率检测：取1×106 NK细胞群，与1×106髓系白血病细胞K562细胞（来自ATCC）共孵育，过夜。次日取混合细胞群，1500rpm，4℃离心5min,弃上清，用500ulPBS重悬细胞。加1ul Antibody human CD45（APC-Cy7），Antibody-CD56(PE-CY7)，4℃孵育30min。用PBS清洗一次，去除上清，300ul PBS重悬，流式分析仪检测NK/NKT与K562细胞比例，连续检测4天（图6、图7为NK/NKT细胞杀伤白血病细胞效率）。实验结果表明，体外培养外周血获得的NK/NKT细胞对髓系白血病细胞有强杀伤能力，髓系白血病细胞比例急速下降。
吞噬肿瘤细胞检测：取1×106 NK细胞群，4℃离心5min，弃上清，用50ul PBS重悬细胞。加5ul Antibody human CD56（PE-CY7），37℃孵育30min，用PBS清洗一次，去除上清，用3ml细胞培养基重悬。取1×106 髓系白血病K562细胞，4℃离心5min，弃上清，用50ul PBS重悬细胞。加5ul CESE染料(活细胞染料，购自STEM CELL公司)，37℃孵育30min，用PBS清洗三次，去除上清。把K562细胞加入NK细胞中，构成混合细胞群体。37℃共同孵育1h。在显微镜下动态监测6小时，记录细胞行为（图8中箭头指向白血病细胞）。实验结果表明，获得的自然杀伤性T细胞对髓系白血病细胞有强杀伤能力，NK/NKT细胞与髓系白血病细胞共培养，6小时后髓系白血病细胞几乎全部萎缩，崩解，最终死亡。
Claims (10)
1.一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.取新鲜人外周血，利用梯度离心方法获得单个核细胞；
b.在体外培养基中，预刺激单个核细胞；
c.扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；
d.培养3-4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；
e.进一步纯化NK/NKT细胞。
2.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.取新鲜人外周血，加入羟乙基淀粉，室温放置1-1.5h，留取上清液；
将上清液加入到与上清液等体积的淋巴细胞分离液中，离心1800rpm，30℃，15-20分钟；上清液为血清，中间层为淋巴细胞层，分别留取上清液和中间层；
b.向淋巴细胞中加入PBS混匀，1800rpm 离心10-15分钟，收集沉淀，用NK/NKT细胞培养基重悬，计数；
将上述细胞平分为两份，一份加入NK/NKT细胞培养基，另一份加入含4-1BB-L因子的NK/NKT细胞培养基；细胞接种于NK细胞包被液包被过的培养瓶中，37℃，5%CO2，孵育培养；
c. 扩大培养外周血来源的单个核细胞，检测各类细胞比例，判断目的NK/NKT细胞扩增效率和活力；
d.培养3-4周后，检测目的NK/NKT细胞占细胞群体的比例，检测细胞杀伤效率；
e. 进一步纯化NK/NKT细胞。
3.根据权利要求2所述的一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：步骤a中外周血与羟乙基淀粉的比例为5:1。
4.根据权利要求2所述的一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：步骤b中NK/NKT细胞培养基的配置方法为向细胞培养基中加入细胞激活剂和自体血清，配置成含5%自体血清的培养基，过滤后待使用；所述细胞培养基与细胞激活剂的加入比例为1000:1。
5.根据权利要求4所述的一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：所述自体血清为步骤a中加入淋巴细胞分离液后，离心获得的上清液。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：所获得的自然杀伤性T细胞同时具备CD45抗原表位，CD56抗原表位，CD3抗原表位；获得的细胞群体中CD56+细胞含量大于98%，CD3+CD56+细胞含量大于14%。
7.根据权利要求1-5任一所述的一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：所获得的自然杀伤性T细胞具有强烈的杀伤肿瘤细胞能力。
8.根据权利要求1-5任一所述的一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性T细胞的方法，其特征在于：所获得的自然杀伤性T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种高杀伤力的自然杀伤性T细胞，其特征在于：所述自然杀伤性T细胞由权利要求1-5任一所述的高效体外扩增培养方法获得。
10.一种高杀伤力的自然杀伤性T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述自然杀伤性T细胞由权利要求1-5任一所述的高效体外扩增培养方法获得。
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