CN102719402B - Hla-a0201限制性抗hpv抗原特异性ctl的制备方法 - Google Patents

Hla-a0201限制性抗hpv抗原特异性ctl的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102719402B
CN102719402B CN201210233136.8A CN201210233136A CN102719402B CN 102719402 B CN102719402 B CN 102719402B CN 201210233136 A CN201210233136 A CN 201210233136A CN 102719402 B CN102719402 B CN 102719402B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ctl
cell
target
rhil
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201210233136.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102719402A (zh
Inventor
时宏珍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Kang Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201210233136.8A priority Critical patent/CN102719402B/zh
Publication of CN102719402A publication Critical patent/CN102719402A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102719402B publication Critical patent/CN102719402B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了HLA-A0201限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备方法。该方法通过单采收集外周单个核细胞，富集、纯化CD8+T淋巴细胞；用负载HLA-A0201限制性HPV抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，并用rhIL-2和rhIL-7联合促进T细胞生长；采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL；采用固相包被的抗人CD3单抗和IL-2刺激目标CTL的生长；加入γ射线辐照后的自体PBMC增强目标CTL的活化；加入rhIL-15培育扩增，收集鉴定。本方法制备的目标CTL具备高纯度，高增殖能力，高杀伤活性，高比例CTL-CM，可用于肿瘤等免疫治疗。

Description

HLA-A0201限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术开发与应用研究领域，涉及HLA-A0201限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备方法。
背景技术
一、HPV感染与宫颈癌
宫颈癌是全球妇女中发病率占第3位的恶性肿瘤，全球每年约有50万新发宫颈癌患者，并有将近27.4万患者死于该病。大量研究表明，宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）的持续性感染密切相关。目前已分离出100余型HPV-DNA，其中30多种与宫颈病变有关。根据其致病能力的大小分为低危型和高危型，而高危型主要导致宫颈癌的发生，以HPV16/18型多见，其编码的E6、E7癌蛋白是宫颈上皮恶性转化中的关键性蛋白。
目前针对HPV-16的VLP疫苗已经开发成功并通过FDA认可，正式投入临床使用，但对已经感染HPV和患有宫颈癌的妇女作用是甚微的。对于宫颈癌患者而言，免疫治疗的关键在于诱发有效的HPV特异CTL，从而有效抑制肿瘤的发展并清除已感染或已恶变的上皮细胞。因此构建针对HPV抗原特异性的CTL将是治疗宫颈癌的有效方法。
二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展
上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIH Rosenberg教授为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注（3×1010-11），另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2（IL-2）（10万IU/kg，q8h），因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素γ（IFN-γ）、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体（Mouse anti-Human CD3mAb）共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）。
树突状细胞（DCs）是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞（APC），其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子（MHC I类和MHCⅡ类分子），免疫共刺激分子（CD80、CD83、CD86、CD40等）。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8（IL-8）、干扰素α（IFN-α）、白细胞介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等，增强机体非特异性免疫应答（天然免疫），故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者Ralph Steinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。而研究已经证实CTL是免疫系统控制和清除HBV感染的中心环节，其反应低下或出于“exhausted”状态与感染慢性化直接相关，因此直接向患者体内回输体外扩增的功能正常的特异性CTL的过继免疫治疗可以起到清除HBV感染的细胞的作用。
三、CTL作用机理
1、机体T细胞免疫反应过程
机体存在庞大的T细胞库，通过其表面表达不同的T细胞受体（TCR）特异识别不同的外部抗原分子（细菌、病毒和肿瘤抗原多肽），被活化为具有杀灭靶细胞的CTL，清除细菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复发。CTL免疫应答大致分四个阶段：
（1）抗原识别：APC通过表面受体识别并捕获抗原（细菌、病毒、肿瘤细胞）；
（2）抗原加工与递呈：抗原经APC消化、裂解成多肽分子，后者与APC胞内丰富的MHC-Ⅰ类或Ⅱ类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表面；
（3）T细胞激活（双信号学说）：APC与T细胞相遇，T细胞通过自身TCR识别APC递呈的MHC-I/II-多肽复合物，其中CD8+T细胞识别MHC-I-多肽复合物，CD4+T细胞识别MHC-II-多肽复合物，T细胞接受了抗原的刺激信号（第一信号）加上免疫共刺激信号（第二信号）开始活化，具有细胞毒性作用即CTL；
（4）靶细胞杀灭：活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原表达细胞后进行杀伤和清除。
但，已发现肿瘤患者体内存在大量免疫抑制因子，影响CTL的有效活化和增殖，数量甚少，不足以与迅速增殖的肿瘤抗衡。若能在体外制备大量抗原特异性CTL并回输给患者，可直接、快速杀伤肿瘤细胞起到治疗作用，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀灭，将可以防止肿瘤的复发和转移。
2、CTL表型与功能差异
根据CTL表面分子的表达种类可分为两型：中央记忆型CTL（CTL-CM）和效应记忆型CTL（CTL-EM）。
Klebanoff等研究发现：表型分析为CD3+CD45RO+CD62L+CCR7+的CTL-CM具有更强的抗肿瘤能力；Johnson等比较了MART-1 TCR基因修饰的CTL-CM和CTL-EM，结果发现前者消退恶性黑色素瘤细胞的能力是后者的10倍。Berger等研究结果还显示CTL-CM输注后较表型为CD3+CD45RO+CD62L-CCR7-的CTL-EM在体内能存活更长的时间。
3、CTL技术开发现状
综合国内、国外CTL体外制备技术可归类为三种方法与来源：
（1）肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）体外扩增法
从肿瘤患者肿瘤组织中分离TIL，加入白细胞介素-2(IL-2)培养，克隆稀释法筛选肿瘤抗原阳性的T细胞克隆，再加入鼠抗人CD3单克隆抗体和IL-2进行扩增培养获得。
Li等选择HLA-A201阳性的Ⅳ期恶性黑色素瘤患者，将其肿瘤组织制备成单细胞悬液后，加入IL-2培养，5周后筛选扩增细胞中CD8+T+MART-1+的阳性T细胞克隆，再加入鼠抗人CD3单克隆抗体和辐照后的PBMC饲养细胞扩增培养，次日加入IL-2，再培养12天可获得CTLs，能对负载MART-1多肽的T2细胞株特异性识别和杀伤。
（2）TCR基因修饰法
TCR是T细胞识别抗原、介导免疫应答的关键分子，包括α、β、γ、δ四条链，由二硫键连接成α/β和γ/δ两种异二聚体，其中α/β+T细胞占外周血T细胞的90-95％，是主要的免疫效应细胞。TCR基因修饰即通过外源质粒转染自体T淋巴细胞，导入能识别特异性抗原多肽的TCR基因，挑选阳性克隆，在体外扩增培养获得CTL。较为常用的质粒有逆转录病毒质粒或慢病毒质粒。
Morgan等采用抗CD3+CD28+磁珠激活CD8+T细胞，应用慢病毒质粒转染修饰MART-1或gp100特异性的TCR基因，采用鼠抗人CD3单克隆抗体和IL-2培养体系制备CTLs，在12天能扩增培养至109个细胞，用于15例HLA-A2+的黑色素瘤患者的治疗，结果显示有2例患者出现了明显的临床疗效，1例52岁男性患者的腋窝转移病灶消失，肝转移病灶缩小了89％，无病生存期为21个月；1例30岁男性患者，肺部转移病灶消失，无病生存期为20个月。
Perro等采用白细胞介素-15（IL-15）和白细胞介素-21（IL-21）细胞因子组合促进TCR基因转染非增殖的T细胞，可以维持T细胞高表达CD62L和CD28。
（3）体外抗原致敏法
用人工APC（Artificial APC），或抗原（蛋白质，多肽，或全细胞）体外反复刺激T细胞，获得抗原特异性CTL。
浙江大学的发明专利（专利号：CN102168066A）体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法即采用该方法。将MHC-Ⅰ-Ig和抗CD28mAb包被磁珠构建人工APC，抗原表位肽负载APC后，体外致敏3-4周，再以磁珠吸附分离抗原特异性CTL，Tetramer染色鉴定。
上述三种方法的缺陷：
（1）TIL体外扩增法
①需要获得患者的新鲜肿瘤组织作为CTL来源，仅限于可手术的患者，且肿瘤组织来源有限；
②TIL分离，CTL克隆的获取与鉴定方法复杂，肿瘤组织中各种细胞成分较多，较复杂，分离细胞的时间长，一般都需要1个月以上；
③TIL中混有CD4+CD25+Treg亚群，其会抑制CTL扩增效率；
④由于体外分离扩增时间长，增加了污染的机会。
（2）TCR基因修饰法
①外源性质粒（逆转录病毒或慢病毒等）的引入，给临床应用带来一定的风险；
②内源性TCR干扰，导入的TCR基因可能并不能导入预期的位点，而与内源性的TCR发生错排，其能识别抗原不是预期设计的，且是未知的，存在很大的风险。
（3）体外人工APC负载抗原致敏法
①引入外源物质：人工APC，制备的CTL是否有人工APC残留仍是疑问；
②人工APC体外致敏CTL的周期较长，需要3-4周，获得CTL还需要扩增培养后才能满足临床治疗的需要，因此体外培养的周期长，污染的几率较大。
目前还没有文献报导过制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的HLA-A201限制性抗原特异性CTL的制备方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的HLA-A201限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备方法。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
HLA-A0201限制性抗原特异性CTL制备方法，该方法包括下列步骤：
a.第一步CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化方法：
用自动单个核细胞采集仪（单采仪）采集外周单个核细胞（PBMC）作为细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从PBMC中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞。
b.目标CTL诱导与第一轮扩增：
用负载HLA-A0201限制性HPV抗原多肽的成熟树突状细胞（mDC）刺激CD8+T淋巴细胞，不仅提供给T细胞活化的第一信号（抗原），同时DC提供给T细胞活化必须的第二信号（免疫共刺激分子CD40、CD80、CD83等）；同时加入rhIL-2和rhIL-7两种细胞因子联合促进T细胞生长，抑制活化诱导的细胞凋亡反应（AICD），延长活化细胞的生存周期。
c.目标CTL纯化方法：
在第一轮用负载抗原的mDC刺激并扩增目标CTL数量后，采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术再一次纯化目标CTL（目标CTL是指表达识别HPV抗原多肽TCR的CD8+T，即Tetramer+CD8+T淋巴细胞），即选择Tetramer+CD8+T，剔除非特异性扩增的T细胞，以减少其对目标CTL增殖的影响。
d.目标CTL的第二轮扩增：
采用固相包被的anti-human-CD3mAb和IL-2刺激目标CTL的生长与增殖；再加入经γ射线辐照的自体PBMC增强对目标CTL的活化；加入rhIL-15一方面可以促进记忆性T细胞的增殖，另一方面可抑制细胞的凋亡。
e.第二轮扩增后目标CTL表型鉴定：
采用流式细胞术对已制备的目标CTL进行表型分析，根据其表达的分子谱不同将其分为中心记忆性CTL（CTL-CM：CD8+CD45RO+CD62L+CCR7+）和效应性CTL（CTL-EM：CD8+CD45RO+CD62L-CCR7-）。
所述的制备方法，步骤b中的HPV抗原多肽长度为9-15个氨基酸，优选序列如SEQ IDNO.1所示的HPV抗原多肽。
所述的制备方法，步骤b中负载目标抗原的自体成熟DC是通过下列方法制备得到的：PBMC贴壁后加入rhGM-CSF、rhIFNα、灭活的混合正常人AB血清和RPMI1640培养基培养三天，收获的DC再加入目标抗原孵育即得。
所述的制备方法，步骤c中用于目标CTL扩增的γ射线辐照的自体PBMC是通过下列方法制备得到的：留取部分单采获得的PBMC，经30-50GY的γ射线辐照后保存；保存液：含20％（V/V）DMSO和20％（V/V）正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度：-80℃超低温保存。
所述的制备方法，步骤d中用于目标CTL扩增的CD3单抗克隆抗体（anti-human-CD3mAb）是如下操作的：将CD3单抗固相包被于用于扩增细胞的容器表面，CD3mAb可与多个CTL表面的CD3分子结合，促进CTL细胞克隆的形成，促进细胞接触，快速进入增殖周期。
所述的制备方法，各步骤中刺激分子或细胞的用量分别为：
a.目标CTL第一轮扩增每次加入量：rhIL-2终浓度为500-1750IU/ml，rhIL-7终浓度为50-75ng/ml，DC与起始T细胞数量比为1∶5。
b.目标CTL第二轮扩增：rhIL-2终浓度为200-500IU/ml，rhIL-15终浓度为100-250ng/ml，CD3单克隆抗体包被浓度为1.0-2.5μg/ml，γ射线辐照的PBMC与起始CTL数量比为2∶1。
所述的制备方法，各步骤操作后细胞数量与表型特征见表1。
表1
Figure BDA00001855867000061
以下是对本发明制备方法的主要步骤的更为详细的说明：
1、CTL前体细胞纯化与富集方法：
通常采用外周PBMC作为CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞的来源，PBMC中含有CD4阳性T淋巴细胞（CD4+T）、CD8阳性T淋巴细胞（CD8+T）、B淋巴细胞、单核细胞（Mo）、自然杀伤细胞（NK）等多种细胞成份，其中CD8+T起始数量直接影响目标CTL的最终产量。
采用单采法一次性可采集大量外周PBMC，获得大量起始细胞，多余PBMC可辐照或冻存，用于多次CTL制备和应用，且方法操作简便。
采用临床级磁珠阴性选择法从PBMC中纯化CD8+T，剔除CD4+T、B、NK细胞，减少其快速扩增对CD8+T扩增生长的干扰。通过磁珠阴性选择法可将CD8+T的纯度提高2-4倍（提高至平均90％以上），见附图1。
2、目标CTL诱导与第一轮扩增：
本发明专利采用三天成熟DC制备方法，DC制备简捷、时间短，其形态、表型与常规7-10天DC比较无明显差异，见附图2。
本发明利用负载HLA-A0201限制性抗HPV抗原的自体成熟DC，给予CD8+T活化的第一信号；同时DC富含免疫共刺激分子，给予CD8+T活化的第二信号，保证CD8+T在双信号作用下高效地被诱导分化成目标CTL。联合rhIL-2和rhIL-7对CD8＋T进行扩增优于单一因子（IL-2）的作用，IL-7促进记忆性T细胞克隆的增殖，抑制因长时间IL-2活化T细胞后导致的AICD反应，延长T细胞生存周期。
3、目标CTL纯化与富集方法：
在第一轮诱导扩增后，CD8+T细胞中目标CTL即表达识别抗原肽TCR的CD8+T只占部分比例，且比例不高，大量是非特异扩增的CD8+T，无识别、清除靶细胞的作用。本发明采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术分离、纯化目标CTL，再一次富集能识别靶抗原的CTL，这些CTL才具备杀伤靶细胞的能力。
纯化后目标CTL的纯度达95％以上。而常规报导的几种方法大多采用有限稀释法，基因导入法等方法，时间花费较长，操作复杂，特异性相对较低。见附图3。
4、目标CTL第二轮扩增：
对T细胞扩增多采用液相的鼠抗人CD3/CD28单克隆抗体和IL-2组合进行扩增。本发明采用固相鼠抗人CD3单克隆抗体包被技术，联合经γ射线辐照的自体PBMC和rhIL-15作为刺激T细胞增殖的多重信号。固相CD3-mAb可促进T细胞克隆形成，加快细胞生长；IL-15使CTL具有抗凋亡，促进记忆T细胞生长的能力；PBMC表面表达大量共刺激分子并分泌多种细胞因子提供CTL良好的生长环境，且经γ射线辐照后不会增殖而干扰CTL的生长，从而保证CTL的高效扩增。
与常规扩增体系比较：本专利方法制备的目标CTL产量高，CTLCM比例高，杀伤靶细胞能力较强。见附图4-5。
本发明的有益效果：
本发明联合采用高效、简捷的单采和磁珠分选法获得比常规方法较多数量的CD8+T作为目标CTL前体细胞；用HLA-A0201限制性抗HPV抗原负载的树突状细胞作为致敏原，联合rhIL-2和rhIL-7诱导CTL前体克隆向目标CTL分化和第一轮扩增；再经四聚体（tetramer）标记和流式细胞分选技术从致敏的混合CD8+T淋巴细群中分离出目标CTL即HLA-A0201限制性抗HPV抗原特异性CTL，通过采用固相CD3-mAb，γ射线辐照的PBMC作为饲养细胞，联合IL-2和IL-15对目标CTL进行第二轮高效扩增。采用本发明方法制备得到的HLA-A0201限制性抗HPV抗原特异性CTL具备高纯度，高增殖能力，高杀伤活性，高比例CTL-CM特点，可用于HPV相关恶性肿瘤和/或感染相关疾病的免疫治疗。
本发明采用不同方法通过对目标CTL的二次纯化与富集，通过不同扩增体系对富集的目标CTL进行二轮扩增和功能的诱导，使目标CTL在纯度上、数量上和功能上均优于现有技术中的几种CTL获得方法，特别体现在以下几个方面：
1、本发明提供了天然的、高效的激活T细胞双信号
①抗原特异信号：DCs是公认的体内功能最强的专职抗原递呈细胞，本体系模仿、复制抗原在体内被DC捕获递呈的过程，选择显性抗原肽负载活体DC作为致敏原，提供最接近人体免疫应答过程中的MHC-多肽复合物空间结构，为T细胞活化提供特异性第一信号。
②共刺激信号：DC同时表达丰富的共刺激分子，为T细胞活化提供天然的第二信号。
2、本发明提供了高效、简捷的CTL前体与目标CTL富集与纯化方法
①CTL前体细胞的富集：采用单采和临床级阴性磁珠分选CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞，操作简便，起始数量充足，获得的CD8+T细胞纯度达到90％以上，为制备足够量、足够纯度目标CTL提供了基本保证。
②目标CTL细胞的纯化：采用Tetramer标记与流式分选技术，对目标CTL即Tetramer+CD8+T进行分离纯化，简捷、高效、省时（4-5小时），纯度高达95％以上。
3、本发明提供了二轮、高效目标CTL扩增系统，以保证提供足够数量目标CTL
①第一轮诱导与扩增：采用多肽负载的DC，联合二种细胞因子IL-2和IL-7扩增体系，在二周内扩增倍数达30-50倍。
②第二轮目标CTL扩增：采用固相鼠抗人CD3单克隆抗体，联合细胞因子IL-15和自体PBMC扩增体系，10天左右扩增倍数平均40倍，最高达60倍。可获得109个目标CTL细胞，达到临床应用的需要，而常规方法（背景技术提到三种方法体外诱导达到同样数量的CTL需要3-4周）。
4、本发明制备的目标CTL体外杀伤活力较高
本发明制备的CTL体外能特异性识别和杀伤表达相应抗原的靶细胞，且杀伤率高天常规方法，效靶比相同时杀伤率平均高出15％左右。见附图5。
M1为常规方法一：目标CTL第一轮扩增和分选纯化同本专利方法，目标CTL第二轮扩增时，用含10％灭活混合正常人AB血清的RPMI1640完全培养基重悬细胞，细胞密度为2×106/ml，接种至75cm2细胞培养瓶中，每瓶30ml，加入终浓度为50ng/ml的鼠抗人CD3单克隆抗体（液相）和终浓度为500IU/ml的rhIL-2，轻轻混匀置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培育。每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基含10％灭活混合正常人AB血清、200IU/ml rhIL-2的RPMI1640完全培养基，细胞增殖到一定量扩瓶。培养至第10天收获细胞。用生理盐水洗涤2次和重悬，计算获得的细胞数量。取3×105个左右细胞，加入抗人CD8、CD45RO、CD62L、CCR7单抗进行标记CTL，用流式细胞仪进行检测分析CD8+CD45RO+CD62L+CCR7+T的比例。以及对靶细胞的杀伤能力。平均获得CTL细胞总量为（1.1±0.2）×109，CTLCM比例平均为：35.1±3.9％，效靶比为30∶1时CTL杀伤力平均为26.0±2.1％。
M2为常规方法二：目标CTL第一轮扩增和分选纯化同本专利方法，目标CTL第二轮扩增时，用含10％灭活混合正常人AB血清的RPMI1640完全培养基重悬细胞，细胞密度为2×106/ml，接种至75cm2细胞培养瓶中，每瓶30ml，加入1.5×107/ml抗CD3/28磁珠和终浓度为500IU/ml的rhIL-2，轻轻混匀置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培育。每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基含10％灭活混合正常人AB血清、200IU/ml rhIL-2的RPMI1640完全培养基，细胞增殖到一定量扩瓶。培养至第10天收获细胞。用生理盐水洗涤2次和重悬，计算获得的细胞数量。取3×105个左右细胞，加入抗人CD8、CD45RO、CD62L、CCR7单抗进行标记CTL，用流式细胞仪进行检测分析CD8+CD45RO+CD62L+CCR7+T的比例。以及对靶细胞的杀伤能力。平均获得CTL细胞总量为（1.3±0.2）×109，CTLCM比例平均为：37.6±2.1％，效靶比为30∶1时CTL杀伤力平均为31.1±3.5％。
M3为本专利方法，平均获得CTL细胞总量为（3.5±0.5）×109，CTLCM比例平均为：73.4±6.3％，效靶比为30∶1时CTL杀伤力平均为42.5±4.1％。
5、本发明制备的目标CTL细胞中CTLCM比例高
本发明制备的CTLs中表达CD3+CD45RO+CD62L+CCR7+表型的中心型记忆CTL比例高于常规方法，见附图4。
比较三种扩增体系制备的目标CTL的扩增能力、表型和杀伤力，结果显示：本专利诱导体系诱导的CTL扩增能力最强，细胞总量可达（3.5±0.5）×109，其中CTLCM比例可达73.4％，在效靶比为30∶1时，对于靶细胞（负载HLA-A2-HPV多肽的T2细胞株）的杀伤能力平均可达42.5％。
附图说明：
图1：CTL前体细胞纯化前后纯度的比较。
图A：单采PBMC流式细胞检测图谱（纯化前）
方法：分别取50μlPBMC(约3×105个细胞)加入3支流式管内，第一管内再加入5μl FITC标记的抗人CD4抗体，5μl PE标记的抗人CD8抗体，5μl PerCP标记的抗人CD3抗体和5μl APC标记的抗人CD56抗体；第二管内加入5μl APC标记的抗人CD14抗体；第三管加入5μl APC标记的抗人CD19抗体，充分混匀，4℃避光孵育30分钟，取出后每管加入1ml预冷的含2％（V/V）新生牛血清的生理盐水洗涤两遍并重悬后，用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，采用Cellquest软件分析CD3+CD4+T％、CD3+CD8+T％、CD14+％、CD19+％、CD3-CD56+％比例。结果：
CD14+％（Mo）：7.06％    CD19+％（B）：8.52％
CD3+CD4+T％：51.17％     CD3+CD8+T％：35.35％
CD3-CD56+％（NK）：0.54％
图B  磁珠阴性选择后CTL前体细胞流式细胞检测图谱（纯化后）
方法：单采PBMC用CD4+CD19+CD16/56+T分选磁珠阴性选择，剔除CD4+T细胞、NK细胞和B细胞后，收集未结合磁珠细胞按照纯化前的流式染色方法进行染色，分析CD3+CD4+T％、CD3+CD8+T％、CD14+％、CD19+％、CD3+CD56+％、CD3-CD56+％比例的变化。结果显示，经过磁珠阴性选择后，CD3+CD8+T％比例达到96.29％，纯度提高了近三倍。
结果：
CD3+CD4+T％：1.85％      CD3+CD8+T％：96.29％
CD14+％（Mo）：0.33％    CD19+％（B）：0.04％
CD3-CD56+％（NK）：0.05％
图2：两种不同方法诱导的DC表型比较
方法：分别取50μl rhGM-CSF+rhI FN-α诱导3天的DC（约3×105个细胞）加入4支流式管中，第一管加入5μlPE标记的CD40、5μl PerCP标记的HLA-DR和5μl APC标记的抗人CD11c抗体，第二管加入5μl PE标记的抗人CD80抗体、5μl PerCP标记的抗人HLA-DR抗体和5μl APC标记的抗人CD11c抗体，第三管加入5μl PE标记的抗人CD83抗体、5μl PerCP标记的抗人HLA-DR抗体和5μl APC标记的抗人CD11c抗体，第四管加入5μl PE标记的抗人CD86抗体、5μl PerCP标记的抗人HLA-DR抗体和5μl APC标记的抗人CD11c抗体，充分混匀，4℃避光孵育30分钟，取出后每管加入1ml预冷的含2％（V/V）新生牛血清的生理盐水洗涤两遍并重悬后，用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，采用Cellquest软件分析HLA-DR+CD11c+％、CD40+HLA-DR+CD11c+％、CD80+HLA-DR+CD11c+％、CD83+HLA-DR+CD11c+％、CD86+HLA-DR+CD11c+％比例。rhGM-CSF+rhIL-4诱导7天的DC用同样方法进行检测。结果显示，本专利采用的rhGM-CSF+rhIFN-α诱导3天的DC纯度表型（HLA-DR+CD11c+）为80.77％，成熟度表型（CD83+）为81.12％。rhGM-CSF+rhIL-4诱导7天的DC纯度表型为81.83％，成熟度表型为83.98％，两者无明显差异。
结果：
图A：rhGM-CSF+rhIFNα诱导3天DC表型流式检测图谱：
HLA-DR+CD11c+％：80.77％         CD40+HLA-DR+CD11c+％：91.65％
CD80+HLA-DR+CD11c+％：95.09％    CD83+HLA-DR+CD11c+％：81.12％
CD86+HLA-DR+CD11c+％：85.27％
图B：rhGM-CSF+rhIL-4诱导7天DC表型流式检测图谱：
HLA-DR+CD11c+％：81.83％         CD40+HLA-DR+CD11c+％：91.01％
CD80+HLA-DR+CD11c+％：96.64％    CD83+HLA-DR+CD11c+％：83.98％
CD86+HLA-DR+CD11c+％：88.26％
图3：目标CTL第一轮扩增后流式检测图谱
图A：目标CTL第一轮扩增后细胞流式检测图谱（纯化前）
图B：目标CTL第一轮扩增后细胞流式检测图谱（纯化后）
方法：CTL第一轮扩增后用PE标记HLA-A201+HPV16E711-20Tetramer和FITC标记的抗人CD8抗体对扩增的CTL进行标记，采用流式细胞仪分选Tetramer+CD8+CTL细胞，分选前Tetramer+CD8+T纯度为13.89％，分选后达到95.32％。
图4三种不同方法制备的CTL表型的比较
图A（M1）：液相鼠抗人CD3单克隆抗体+IL-2扩增体系制备的CTL表型流式检测图谱
图B（M2）：液相CD3/28磁珠，IL-2扩增体系制备的CTL表型流式检测图谱
图C（M3）：固相鼠抗人CD3单克隆抗体，I L-2，IL-7，IL-15，自体PBMC扩增体系制备的CTL表型流式检测图谱
方法：纯化后的目标CTL分为3份，第一份加入终浓度50ng/ml鼠抗人CD3单克隆抗体和500IU/ml IL-2进行扩增培养，第二份加入终浓度10μg/ml CD3/28磁珠和250IU/ml IL-2进行扩增培养，第三份加入鼠抗人CD3单克隆抗体2μg/ml预包被过夜的培养瓶，按照目标CTL：PBMC=1∶2的比例加入经γ射线辐照的PBMC，并加入终浓度500IU/ml的IL-2和终浓度250ng/ml IL-15进行扩增培养。培养至第7天收获CTL。取50μlCTL(约3×105个细胞)加入2管流式管内，第一管加入5μl FITC标记的抗人CD62L抗体，5μlPE标记的抗人CCR7抗体，5μlAPC标记的抗人CD45RO抗体，第二管加入5μlPerCP标记的抗人CD3抗体和5μlPE标记的抗人CD8抗体，充分混匀，4℃避光孵育30分钟，取出后每管加入1ml预冷的含2％（V/V）新生牛血清的生理盐水洗涤两遍并重悬后，用FACS Calib ur流式细胞仪进行检测，采用Cellquest软件分析CD3+CD8+T％、CD45RO+CD62L+％和CCR7+CD62L+％比例。获得CTL的表型流式图，实施例1制备的CTL的CD3+CD8+T％为96.41％，其中CD45RO+CD62L+％达到89.17％，CCR7+CD62L+％达到70.48％，明显高于方法1和2。
图5不同方法制备的HPV CTL杀伤能力的比较。
图A(M1)液相鼠抗人CD3单克隆抗体+IL-2扩增体系制备的CTL杀伤能力
图B(M2)液相CD3/28磁珠，IL-2扩增体系制备的CTL杀伤能力
图C(M3)固相鼠抗人CD3单克隆抗体，IL-2，IL-7，IL-15，自体PBMC扩增体系制备的CTL杀伤能力
方法：靶细胞1：为负载HPV16E711-20多肽的HLA-A2+T2细胞株，靶细胞2：为HLA-A2+T2空载细胞株，靶细胞3：K562(NK敏感细胞株)。
实施例1制备的CTL分别与上述3种靶细胞按照效靶比3：1、10：1和30：1的比例混合，MTT法检测CTL杀伤活性。结果显示，本发明方法制备的CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10∶1时，达到21.2％，明显高于方法1和2。
具体实施方法
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：HPV16E711-20抗原特异性CTL制备
1、HLA-A201+HPV16+宫颈癌患者准备
抽取患者外周抗凝血1ml，加入FITC标记的HLA-A2-mAb（美国BD公司，货号551285，下同），经流式检测HLA-A2(HLA-A201的简称，下同)表达情况；宫颈癌患者进行HPV检测，选择HPV16型阳性患者。HLA-A2和HPV16型表达同时的宫颈癌患者入选。
2、抗原多肽合成
HPV16E7多肽，位点为11-20，序列为YMLDLQPETV（SEQ ID NO.1）10肽（以下简称HPV16E711-20多肽），化学合成（上海吉尔生化有限公司），以无菌双蒸水充分溶解，多肽浓度为5mg/ml，分装保存于-80℃。
3、PBMC采集
用单采仪采集患者外周PBMCs，经Ficoll密度梯度离心法后纯化PBMCs，部分用于DC诱导，部分用于CTL前体细胞富集与纯化，部分经γ射线照射并冻存于-80℃。
4、DC诱导与抗原负载
贴壁法制备DC：将PBMCs悬浮于RPMI1640培养基中，细胞密度为3×106/ml，接种细胞于75cm2培养瓶中，于5％CO2，37℃培养箱内孵育90分钟，用预温生理盐水洗轻轻洗涤2-3次，贴壁细胞用于DC诱导。
DC诱导：于培养瓶中加入30ml DC诱导培养基：含5％（V/V）灭活的混合正常人AB血清、终浓度200ng/ml rhGM-CSF、终浓度500ng/ml rhIFN-α的RPMI1640完全培养基。诱导第3天收获DCs。rhGM-CSF+rhIFNα诱导3天DC表型流式检测图谱见图2A。
多肽DC负载：将收获的DC悬浮于RPMI1640培养基中，细胞密度为1×106/ml并接种于细胞培养6孔板内，每孔3ml，于孔内加入HPV16E711-20多肽至终浓度为10μg/ml，放置于37℃，5％CO2培养箱内共育2小时后收获，用RPMI1640培养基洗涤DC二次，再用RPMI1640培养基重悬，细胞密度为1×106/ml，用于目标CTL的刺激。
用于目标CTL扩增的γ射线辐照的自体PBMC是通过下列方法制备得到的：留取部分单采获得的PBMC，经30-50GY（平均40GY）的γ射线辐照后保存；保存液：含20％（V/V）DMSO和20％（V/V）正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度：-80℃超低温保存。
5、CTL前体细胞分离与纯化
于DC收获当天复苏冻存的PBMC，用预冷的含2％灭活混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，并重悬细胞，调整细胞密度为2×107/ml，于细胞中加入临床级CD4+CD19+CD16/56+T分选磁珠（Miltenyi CliniMACS），共育30分钟后过柱，收集流出的CD8+T淋巴细胞，用预冷的RPMI 1640培养基洗涤2次，将细胞重悬于含10％灭活混合正常人AB血清RPMI1640完全培养基中，细胞密度为1×106/ml。
6、目标CTL第一轮扩增
将纯化的CD8+T接种于细胞培养6孔板中，每孔加入3ml，再加入0.6ml已负载HPV16E711-20多肽的DC（步骤4制备），加入IL-2和IL-7使终浓度分别达到500IU/ml和50ng/ml，轻轻混匀后放入5％CO2，37℃细胞培养箱内培育；每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基（含10％灭活混合正常人AB血清RPMI1640完全培养基，500IU/ml IL-2和50ng/ml IL-7）。第七天，于每孔中再加入0.6ml已负载HPV16E711-20多肽的DC（同前）再次刺激。每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基（同前），细胞密度过大时进行扩瓶，细胞增殖到一定量后可移至75cm2培养瓶中继续扩增培育。
7、目标CTL分选纯化
负载HPV16E711-20多肽的DC与CD8+T共育12-14天，收获细胞，用预冷的含2％灭活混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，并重悬细胞，调整细胞密度为1×107/ml，于细胞悬液中加入PE标记的HLA-A201+HPV16E711-20Tetramer和FITC标记的CD8mAb，轻轻混匀后，于4℃冰箱中共育20分钟。用预冷的含2％灭活混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，重悬细胞，调整细胞密度为1×107/ml，将细胞进行流式分选，收获CD8+Tetramer+T淋巴细胞，离心后弃上清，用含10％灭活混合正常人AB血清的RPMI1640完全培养基重悬细胞，细胞密度为2×106/ml。目标CTL第一轮扩增后流式检测图谱见图3。
8、目标CTL第二轮扩增
细胞培养瓶包被：在步骤7前一天，取75cm2细胞培养瓶，于其中加入2ml鼠抗人CD3单克隆抗体（浓度2μg/ml，厂家：美国R&D公司，目录号：59-MAB100，克隆号：C1UCHT1，下同），密封后置4℃冰箱包被过夜。
在接种细胞前，取出包被培养瓶，吸弃培养瓶中多余CD3mAb，每瓶加入30ml已分选CD8+Tetramer+T淋巴细胞，加入经γ射线辐照的PBMC（数量2倍于目标CTL），加入终浓度500IU/ml IL-2和终浓度250ng/ml IL-15，轻轻混匀置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培育。每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基（含10％人灭活混合正常人AB血清，200IU/mlIL-2，100ng/ml IL-15的RPMI 1640完全培养基）控制细胞密度；细胞增殖到一定量扩瓶。
9、目标CTL收获与表型检测
第二轮目标CTL扩增10天左右，收获细胞。用生理盐水洗涤2次，重悬于100ml生理盐水中，细胞密度为107/ml左右，用于免疫治疗。
取3×105个左右细胞，加入抗人CD8、CD45RO、CD62L、CCR7单抗进行标记CTL，用流式细胞仪进行检测分析CD8+CD45RO+CD62L+CCR7+T的比例，结果见附图4。
各步骤操作后细胞数量和表型特征见表1。
10、目标CTL杀伤能力
将制备的目标CTL分别与负载HPV16E711-20多肽的HLA-A2+T2细胞株、HLA-A2+T2空载细胞株及K562(NK敏感细胞株)三种靶细胞按照效靶比3：1、10：1和30：1的比例混合，MTT法检测CTL杀伤活性。结果显示，本发明方法制备的CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10∶1时，达到21.2％，见图5C。

Claims (5)

1.HLA-A0201限制性抗HPV抗原特异性CTL制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤： 
a.CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化： 
以单采收集的外周单个核细胞作为CTL前体细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从收集外周单个核细胞中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞； 
b.目标CTL诱导与第一轮扩增： 
用负载HLA‐A0201限制性HPV抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，同时加入rhIL‐2和rhIL‐7两种细胞因子联合促进T细胞生长；第二周再重复刺激一次，完成第一轮扩增；所述的HPV抗原多肽序列如SEQ ID NO.1所示；其中负载HLA‐A0201限制性HPV抗原多肽的成熟树突状细胞是通过下列方法制备得到的：将外周单个核细胞贴壁后加入含rhGM‐CSF、rhIFNα、灭活的混合正常人AB血清和RPMI1640培养基培养三天，收获的DC再加入目标抗原孵育即得；
c.目标CTL纯化方法： 
采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL，即选择Tetramer+CD8+T淋巴细胞； 
d.目标CTL第二轮扩增： 
采用固相包被的anti‐human‐CD3mAb和IL‐2刺激目标CTL的生长；加入经γ射线辐照后的自体外周单个核细胞增强对目标CTL的活化；加入rhIL‐15继续培育，完成第二轮扩增，收集鉴定； 
各步骤中刺激分子或细胞的用量分别为： 
a.目标CTL第一轮扩增每次加入量：rhIL‐2终浓度为500‐750IU/ml，rhIL‐7终浓度为50‐75ng/ml，DC与起始CD8+T细胞数量比为1:5; 
b.目标CTL第二轮扩增：rhIL‐2终浓度为200‐500IU/ml，rhIL‐15终浓度为100‐250ng/ml，CD3单克隆抗体包被浓度为1.0‐2.5μg/ml，γ射线辐照的外周单个核细胞与起始CTL数量比为2:1。 
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c中用于目标CTL扩增的γ射线辐照的自体外周单个核细胞是通过下列方法制备得到的：留取部分权利要求1中单采获得外周单个核细胞，经30‐50GY的γ射线辐照后保存；保存液：含20%（V/V）DMSO和20%（V/V）正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度：‐80℃超低温保存。 
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤d中用于目标CTL扩增的anti‐human‐CD3mAb是如下操作的：将anti‐human‐CD3mAb固相包被于用于扩增细胞的容 器表面，anti‐human‐CD3mAb可与多个CTL表面的CD3分子结合，促进CTL细胞克隆的形成，促进细胞接触，快速进入增殖周期。 
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于目标CTL是指表达识别HPV病毒抗原多肽TCR的CD8+T，即Tetramer+CD8+T淋巴细胞。 
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于各步骤操作后细胞数量与表型特征分别为： 
CN201210233136.8A 2012-07-05 2012-07-05 Hla-a0201限制性抗hpv抗原特异性ctl的制备方法 Active CN102719402B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210233136.8A CN102719402B (zh) 2012-07-05 2012-07-05 Hla-a0201限制性抗hpv抗原特异性ctl的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210233136.8A CN102719402B (zh) 2012-07-05 2012-07-05 Hla-a0201限制性抗hpv抗原特异性ctl的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102719402A CN102719402A (zh) 2012-10-10
CN102719402B true CN102719402B (zh) 2014-05-14

Family

ID=46945275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210233136.8A Active CN102719402B (zh) 2012-07-05 2012-07-05 Hla-a0201限制性抗hpv抗原特异性ctl的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102719402B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104830794A (zh) * 2015-05-05 2015-08-12 杨光华 基于hpve7抗原的dc细胞、靶向性免疫细胞群及其制备方法和用途
CN106929473A (zh) * 2017-03-08 2017-07-07 广州可伴咨询中心（普通合伙） 用于hpv‑ctl细胞的体外培养试剂盒
EA202090149A1 (ru) * 2017-06-28 2020-05-31 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антигенсвязывающие белки против вируса папилломы человека (hpv) и способы их применения
CN108815186A (zh) * 2018-06-14 2018-11-16 上海鸣大生物科技有限公司 一种治疗hpv持续感染引起疾病的药物及制备方法与应用
CN109825474A (zh) * 2019-01-11 2019-05-31 深圳市双科生物科技有限公司 一种恢复细胞性能的方法
CN115960828A (zh) * 2023-02-01 2023-04-14 青岛海尔生物科技有限公司 一种靶向hpv16 e7的hla-a*0201限制性cd8毒性t细胞的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102618498A (zh) * 2012-03-26 2012-08-01 时宏珍 Hla-a0201限制性抗原特异性ctl制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102618498A (zh) * 2012-03-26 2012-08-01 时宏珍 Hla-a0201限制性抗原特异性ctl制备方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A single amino acid substitution improves the in vivo immunogenicity of the HPV16 oncoprotein E7(11-20) cytotoxic T lymphocyte epitope;Marco W.J. Schreurs等;《Vaccine》;20050411;第23卷;4005-4010 *
Cassian Yee等.Isolation of High Avidity Melanoma-Reactive CTL from Heterogeneous Populations Using Peptide-MHC Tetramers.《Journal of immunology》.1999,第162卷2227-2234.
IL-15-induced human DC efficiently prime melanomaspecific naive CD8+ T cells to differentiate into CTL;Peter dubsky 等;《Eur. J. Immunol.》;20071231;第37卷;1678-1690 *
Isolation and expansion of cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes to clinical scale from a single blood draw using dendritic cells and HLA-tetramers;Susann Szmania等;《Blood》;20010801;第98卷;505-512 *
Isolation of High Avidity Melanoma-Reactive CTL from Heterogeneous Populations Using Peptide-MHC Tetramers;Cassian Yee等;《Journal of immunology》;19991231;第162卷;2227-2234 *
Marco W.J. Schreurs等.A single amino acid substitution improves the in vivo immunogenicity of the HPV16 oncoprotein E7(11-20) cytotoxic T lymphocyte epitope.《Vaccine》.2005,第23卷4005-4010.
Peter dubsky 等.IL-15-induced human DC efficiently prime melanomaspecific naive CD8+ T cells to differentiate into CTL.《Eur. J. Immunol.》.2007,第37卷1678-1690.
Susann Szmania等.Isolation and expansion of cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes to clinical scale from a single blood draw using dendritic cells and HLA-tetramers.《Blood》.2001,第98卷505-512.
人乳头状瘤病毒1l型E7抗原HLA-A*020l限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的功能鉴定;徐妍等;《中华微生物学和免疫学杂志》;20080331;第28卷(第3期);239-243 *
徐妍等.人乳头状瘤病毒1l型E7抗原HLA-A*020l限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的功能鉴定.《中华微生物学和免疫学杂志》.2008,第28卷(第3期),239-243.

Also Published As

Publication number Publication date
CN102719402A (zh) 2012-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102618498B (zh) Hla-a0201限制性抗原特异性ctl制备方法
CN109294985B (zh) 一种用于nk细胞体外扩增的培养基体系及nk细胞体外扩增的方法
CN102719402B (zh) Hla-a0201限制性抗hpv抗原特异性ctl的制备方法
CN101302491B (zh) 高效扩增活化淋巴细胞的方法和培养系统
JP2019504632A (ja) Ｎｋ細胞培養用培地添加キット、及びキットを用いるｎｋ細胞培養方法
CN107929727A (zh) 一种新的树突状细胞疫苗的制备方法
CN109161527A (zh) 一种高效的nk细胞扩增方法
CN105524884A (zh) Hla-a0201限制性抗afp抗原特异性ctl的制备方法
JP5856025B2 (ja) 単球またはｎｋ細胞を入手する方法
CN102719400B (zh) Hla-a0201限制性抗cea抗原特异性ctl的制备方法
CN110564683A (zh) 一种γδT细胞和NK细胞共培养诱导扩增的方法
CN102719401B (zh) Hla-a0201限制性抗mage抗原特异性ctl的制备方法
CN112662625B (zh) 一种t细胞培养基及其用于t细胞的扩增培养方法
CN109957543A (zh) 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法
CN109535241B (zh) Dc-cik共培养细胞及其制备方法、致敏抗原和应用
US20220177839A1 (en) Composition, culture medium and method for inducing and/or amplifying tscm in vitro
CN105505873A (zh) HLA-A0201限制性抗Her2-neu抗原特异性CTL的制备方法
CN113521270B (zh) 一种ebv复合抗原、树突状细胞疫苗及其应用
CN110628717B (zh) 一种浸润性t细胞的培养方法
CN115678845A (zh) 肿瘤特异性ctl细胞的培养方法及细胞治疗产品
CN105219727A (zh) 一种用于激活结直肠癌特异性免疫反应的试剂盒
CN105219728A (zh) 一种用于激活乳腺癌特异性免疫反应的试剂盒
WO2022061811A1 (zh) 药物组合物及其制备方法和应用
CN105624110A (zh) Hla-a0201限制性抗psa抗原特异性ctl的制备方法
CN103911341B (zh) Th1细胞亚群的制备方法及其在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: JIANGSU DECON BIO-SCI-TECHNOLOGY CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: SHI HONGZHEN

Effective date: 20150119

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20150119

Address after: 5 floor, building 1, new building, No. 28 Pu Pu Road, Pukou District, Jiangsu, Nanjing

Patentee after: Jiangsu Kang Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: Jiangning District of Nanjing City, Jiangsu province 211100 General Road No. 10, Tsinghua Yuan 58 Room 201

Patentee before: Shi Hongzhen

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20180914

Address after: 210000 B-6, Jiangsu science and Technology Park, 9 Wei Di Road, Qixia District, Nanjing, Jiangsu.

Patentee after: De Kang cell bioengineering Center (Jiangsu) Co.,Ltd.

Address before: 210000 room 208, block A, building 10, Spark Road, Pukou District, Nanjing, Jiangsu.

Patentee before: Lu Anjun

Effective date of registration: 20180914

Address after: 210000 room 208, block A, building 10, Spark Road, Pukou District, Nanjing, Jiangsu.

Patentee after: Lu Anjun

Address before: Building 5, new mileage 1, 28 Tianpu Road, Pukou District, Nanjing

Patentee before: Jiangsu Kang Biotechnology Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230111

Address after: Building B6-1, Jiangsu Life Science and Technology Innovation Park, No. 9, Weidi Road, Qixia District, Nanjing, Jiangsu, 210000

Patentee after: Jiangsu Kang Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 210000 B-6, Jiangsu science and Technology Park, 9 Wei Di Road, Qixia District, Nanjing, Jiangsu.

Patentee before: De Kang cell bioengineering Center (Jiangsu) Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right